Name: 设计和构建用于细胞骨架网络可视化的可定制、单物镜、光片荧光显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 学习构建单物镜光片荧光显微镜，用于细胞骨架网络的三维可视化成像。该方法可实现厚样本长时间低光毒性成像，为研究远离平衡态材料的力学特性提供可行方案。

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本工作由美国国家科学基金会（NSF）RUI 奖项（DMR-2203791）对 J.S. 的资助支持。我们感谢杨斌博士和Manish Kumar博士在光路准直过程中提供的指导。我们感谢Jenny Ross博士和K. Alice Lindsay提供驱动蛋白分子的制备说明。

Customizable Fluorescence Microscope to Visualize Cytoskeleton Networks

<ol><li>Girkin, J. M., Carvalho, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+light-sheet+microscopy+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Optics%22%5BJournal%5D)">The light-sheet microscopy revolution.</a> Journal Optics. 20 (5), 053002(2018).</li>
<li>You, R., McGorty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy+illuminating+soft+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy illuminating soft matter.</a> Frontiers in Physics. 9, 760834(2021).</li>
<li>Fuchs, E., Jaffe, J. S., Long, R. A., Azam, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin+laser+light+sheet+microscope+for+microbial+oceanography%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Thin laser light sheet microscope for microbial oceanography.</a> Optics Express. 10 (2), 145-154 (2002).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Dunsby, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optically+sectioned+imaging+by+oblique+plane+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Optically sectioned imaging by oblique plane microscopy.</a> Optics Express. 16 (25), 20306-20316 (2008).</li>
<li>Bouchard, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swept+confocally-aligned+planar+excitation+%28SCAPE%29+microscopy+for+high-speed+volumetric+imaging+of+behaving+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">Swept confocally-aligned planar excitation (SCAPE) microscopy for high-speed volumetric imaging of behaving organisms.</a> Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).</li>
<li>Smith, C. W., Botcherby, E. J., Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+oblique-plane+images+in+sectioning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Resolution of oblique-plane images in sectioning microscopy.</a> Optics Express. 19 (3), 2662-2669 (2011).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epi-illumination+SPIM+for+volumetric+imaging+with+high+spatial-temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Epi-illumination SPIM for volumetric imaging with high spatial-temporal resolution.</a> Nature Methods. 16 (6), 501-504 (2019).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+multiview+capture+and+fusion+improves+spatial+resolution+in+wide-field+and+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optica%22%5BJournal%5D)">Simultaneous multiview capture and fusion improves spatial resolution in wide-field and light-sheet microscopy.</a> Optica. 3 (8), 897-910 (2016).</li>
<li>Sahasrabudhe, A., Vittal, V., Ghose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peeping+in+on+the+cytoskeleton%3A+Light+microscopy+approaches+to+actin+and+microtubule+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Science%22%5BJournal%5D)">Peeping in on the cytoskeleton: Light microscopy approaches to actin and microtubule organization.</a> Current Science. 105 (11), 1562-1570 (2013).</li>
<li>Kumar, M., Kishore, S., Nasenbeny, J., McLean, D. L., Kozorovitskiy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+one-+and+two-photon+scanned+oblique+plane+illumination+%28SOPi%29+microscopy+for+rapid+volumetric+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Integrated one- and two-photon scanned oblique plane illumination (SOPi) microscopy for rapid volumetric imaging.</a> Optics Express. 26 (10), 13027-13041 (2018).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oblique-plane+single-molecule+localization+microscopy+for+tissues+and+small+intact+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Oblique-plane single-molecule localization microscopy for tissues and small intact animals.</a> Nature Methods. 16 (9), 853-857 (2019).</li>
<li>Sapoznik, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+oblique+plane+microscope+for+large-scale+and+high-resolution+imaging+of+subcellular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A versatile oblique plane microscope for large-scale and high-resolution imaging of subcellular dynamics.</a> eLife. 9, e57681(2020).</li>
<li>Bernardello, M., Marsal, M., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+the+in+vivo+study+of+microtubule+dynamics+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Light-sheet fluorescence microscopy for the in vivo study of microtubule dynamics in the zebrafish embryo.</a> Biomedical Optics Express. 12 (10), 6237-6254 (2021).</li>
<li>Shelden, E. A., Colburn, Z. T., Jones, J. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focusing+super+resolution+on+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Focusing super resolution on the cytoskeleton.</a> F1000Res. 5, F1000 Faculty Rev-998 (2016).</li>
<li>Wulstein, D. M., Regan, K. E., Garamella, J., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topology-dependent+anomalous+dynamics+of+ring+and+linear+DNA+are+sensitive+to+cytoskeleton+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Topology-dependent anomalous dynamics of ring and linear DNA are sensitive to cytoskeleton crosslinking.</a> Science Advances. 5 (12), (2019).</li>
<li>Sheung, J. Y., Garamella, J., Kahl, S. K., Lee, B. Y., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor-driven+advection+competes+with+crowding+to+drive+spatiotemporally+heterogeneous+transport+in+cytoskeleton+composites%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Motor-driven advection competes with crowding to drive spatiotemporally heterogeneous transport in cytoskeleton composites.</a> Frontiers in Physics. 10, 1055441(2022).</li>
<li>Zeiss Lightsheet 7. Light-Sheet Multiview Imaging of Living and Cleared Specimens. Zeiss. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html">https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html</a> (2023).</li>
<li>Zeiss Lattice Lightsheet 7. Long-Term Volumetric Imaging of Living Cells. Zeiss. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lattice-lightsheet-7.html">https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lattice-lightsheet-7.html</a> (2023).</li>
<li>Kumar, M., Kishore, S., McLean, D. L., Kozorovitskiy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossbill%3A+An+open+access+single+objective+light-sheet+microscopy+platform%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Crossbill: An open access single objective light-sheet microscopy platform.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Olarte, O. E., Andilla, J., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+microscopy%3A+A+tutorial%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Optics+and+Photonics%22%5BJournal%5D)">Light-sheet microscopy: A tutorial.</a> Advances in Optics and Photonics. 10 (1), 111-179 (2018).</li>
<li>Pitrone, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OpenSPIM%3A+An+open-access+light-sheet+microscopy+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">OpenSPIM: An open-access light-sheet microscopy platform.</a> Nature Methods. 10 (7), 598-599 (2013).</li>
<li>Sheung Lab, Single Objective Light Sheet Microscope (SOLS) Guide. Sheung Lab. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://sites.google.com/view/sheunglab/microscopy/single-objective-light-microscope-sols">https://sites.google.com/view/sheunglab/microscopy/single-objective-light-microscope-sols</a> (2023).</li>
<li>Lamb, J. R., Ward, E. N., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-source+software+package+for+on-the-fly+deskewing+and+live+viewing+of+volumetric+lightsheet+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Open-source software package for on-the-fly deskewing and live viewing of volumetric lightsheet microscopy data.</a> Biomedical Optics Express. 14 (2), 834-845 (2023).</li>
<li>Harvard University. Mitchison Lab. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://mitchison.hms.harvard.edu/home">https://mitchison.hms.harvard.edu/home</a> (2023).</li>
<li>Research at Dogic Lab. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://dogiclab.physics.ucsb.edu/research/">http://dogiclab.physics.ucsb.edu/research/</a> (2023).</li>
<li>Watkins, S. C., St. Croix, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+imaging+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Light sheet imaging comes of age.</a> Journal of Cell Biology. 217 (5), 1567-1569 (2018).</li>
<li>Ndlec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+microtubules+and+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organization of microtubules and motors.</a> Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).</li>
<li>Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+motion+in+hierarchically+assembled+active+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spontaneous motion in hierarchically assembled active matter.</a> Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).</li>
<li>Berezney, J., Goode, B. L., Fraden, S., Dogic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensile+to+contractile+transition+in+active+microtubule-actin+composites+generates+layered+asters+with+programmable+lifetimes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Extensile to contractile transition in active microtubule-actin composites generates layered asters with programmable lifetimes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (5), e2115895119(2022).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isomorphic+coalescence+of+aster+cores+formed+in+vitro+from+microtubules+and+kinesin+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Isomorphic coalescence of aster cores formed in vitro from microtubules and kinesin motors.</a> Physical Biology. 13 (5), 056002(2016).</li>
<li>Millett-Sikking, A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMillett-Sikking%2C+A+%22High+NA+single-objective+lightsheet%22">High NA single-objective lightsheet</a>. , (2019).</li>
<li>Bourgenot, C., Saunter, C. D., Taylor, J. M., Girkin, J. M., Love, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+adaptive+optics+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">3D adaptive optics in a light sheet microscope.</a> Optics Express. 20 (12), 13252-13261 (2012).</li>
<li>Bernardello, M., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+multimodal+platform+for+classical+and+high+throughput+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Modular multimodal platform for classical and high throughput light sheet microscopy.</a> Scientific Reports. 12 (1), 1969(2022).</li>
<li>Crombez, S., Leclerc, P., Ray, C., Ducros, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+hyperspectral+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Computational hyperspectral light-sheet microscopy.</a> Optics Express. 30 (4), 4856-4866 (2022).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。所有研究均在不存在可能被解释为利益冲突的商业或财务关系的情况下进行。

关于本方案，有两个重要细节：系统的总体成本以及预计的搭建与调试时间。尽管确切成本会有所变动，但我们可较为准确地估计，该系统 整体上 该SOLS或类似DIY系统的成本约为85,000美元。需指出的是，此估算基于所有组件的零售价格，若采购二手组件，总体成本可大幅降低。在组装时间方面，若所有组件均已备齐并可立即使用，即使缺乏光学经验的操作者，也通常可在1至2个月内完成整个SOLS系统的搭建与光路校准。尽管本实验方案篇幅较长且操作复杂，但我们认为，结合详尽的文字描述与配套视频协议，该方案应能被快速、顺利地实施。
本方案中有两个关键步骤。首先，由于振镜参与了三个独立的4f透镜组，其位置决定了多个透镜的布局。必须确保振镜与物镜O1和O2的后焦平面共轭，并且正确居中，以实现倾斜不变的扫描。其次，成像质量对O2与O3之间的相对对准极为敏感。在此过程中，必须注意以下三点：第一，O3相对于O2的对准角度必须与激发光片的倾斜角度相匹配，从而在整个同样倾斜的视场（FoV）内提供尽可能平坦的照明；第二，O3必须放置在合适的轴向距离上，以维持一个尽可能大面积的平坦视场；第三，O3必须与O2保持适当的横向距离，以最大化通过O2-O3界面的信号。

在可用视场（FoV）方面，该系统在80 µm × 80 µm区域内实现了平坦且可靠的视场，照明均匀一致。该区域小于相机提供的最大视场，因此可用视场由图13中的黄色框标示。在分辨能力方面，该系统在x轴方向达到的最小可分辨距离为432 nm，在y轴方向为421 nm，该数值是通过对良好视场内点扩散函数（PSFs）的高斯拟合得到的平均sigma x和y值乘以2计算得出的。需要指出的是，该系统的总数值孔径（NA）并未进行优化，这意味着如果用户需要高于本系统当前水平的分辨能力，则仍有显著的提升空间。针对此类单物镜光片显微镜（SOLS）的构建，存在多种兼容的物镜选项，其中许多物镜可提高系统分辨率，但代价是成本更高、视场更小，或在中继界面处需要更复杂的对准技术8,11,13,20。此外，若用户希望获得更大的视场，可通过引入第二个振镜实现二维扫描以达成此目标，但这需要在设计中集成额外的光学元件和控制机械结构32。我们已在网站页面上提供了有关系统改进的更多详细信息，并附有与设计过程相关的其他有用资源链接23。

除了改进该特定设计的各个组件外，将其他高分辨率显微技术或功能模式整合到此系统中也是完全可行的。其中一项改进是引入多波长激发照明，这需要将额外的激发激光器与原始激发光路进行准直8。此外，由于此类单物镜光片显微镜（SOLS）设计可保持样品的可及性，因此向显微镜中添加其他功能——包括但不限于光镊、微流控和流变测量——相对简便2,33。

与已发表的众多光片显微镜指南相比，本方案提供的说明更为详尽，即使缺乏光学经验的用户也能轻松理解。通过向更广泛的用户群体提供一种用户友好且支持传统样品载玻片安装的单物镜光片显微镜（SOLS）构建方法，我们希望进一步拓展SOLS技术在各类研究领域中的应用前景，无论这些领域当前是否已使用或尚未引入该仪器。尽管SOLS仪器的应用正迅速增加2,34,35，但我们认为，SOLS类仪器的诸多优势和潜在用途仍有待探索，并对这类仪器未来的发展前景充满期待。

光片荧光显微镜（LSFM）是一类高分辨率荧光成像技术，其激发光被塑造成一个薄片状光平面1,2，包括选择性平面照明显微镜（SPIM）、扫描共焦对准平面激发显微镜（SCAPE）以及斜面显微镜（OPM）3,4,5,6,7。与其他显微技术（如落射荧光显微镜、全内反射荧光显微镜（TIRFM）或共聚焦显微镜）不同，LSFM的光毒性极低，仅对正在成像的样本平面进行照明，因此可实现长时间尺度的样本观测8,9,10。因此，LSFM技术特别适用于对三维样本进行长时间动态成像，甚至可对共聚焦显微镜难以穿透的较厚样本进行成像。基于上述优势，自2004年首次提出以来，LSFM已成为许多生理学家、发育生物学家和神经科学家的首选成像技术，广泛用于对完整生物体（如活体斑马鱼和Drosophila胚胎）的可视化研究3,4,6,11。在过去的二十年中，LSFM的优势被不断拓展，用于在越来越小的尺度上解析结构与动态过程，涵盖组织11,12、细胞乃至亚细胞水平，并广泛应用于活体（in vivo）和体外（in vitro）研究13,14,15,17。
尽管文献中已有成功应用的报道，但商用LSFM系统的高昂成本（撰写本文时约为25万美元）18,19限制了该技术的广泛应用。为了使DIY构建成为研究人员可行的替代方案，已有多个构建指南被发表8,13,20,21，其中包括开放获取项目OpenSPIM22。然而，迄今为止，光学经验有限的研究人员只能使用早期的LSFM设计，而这些设计与传统的载玻片装载样品不兼容（图1A）。近期的单物镜光片成像（SOLS）实现方式使用同一个物镜完成激发和检测（图1C），从而克服了兼容性方面的限制5,6,8,13,20。然而，SOLS设计在获得多功能性的同时，也因需要额外两个物镜将物平面中继、去倾斜并重新成像到相机上进行成像（图1D），导致构建复杂性显著增加。为了便于研究人员使用复杂的SOLS类系统，本文提供了一套逐步指南，涵盖一种兼容载玻片的SOLS系统的整体设计、构建、光路准直过程及使用方法，即使仅具备基础光学课程知识的研究人员亦可受益。
尽管该实验方案本身简洁明了，但在准备步骤中，读者必须参考其他资源，以深入了解设计或硬件相关的具体细节。然而，如果读者打算遵循本设计的具体参数，则可能无需理解如何选择特定的光学元件。
<img alt="图 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65411/65411fig01.jpg" /> 
图 1：不同 LSFM 配置的特点。（A）早期 LSFM 设计中常见的双正交物镜装置。在此配置中，样品被置于毛细管或凝胶圆柱体内，无法与传统的载玻片封片技术兼容。（B）SOLS 光片设计的示意图，显示以下部分：（C）在样品平面（O1）处同时用于激发和发射光收集的单个物镜；该设计允许将传统载玻片置于上方，以及（D）SOLS 发射光路中的中继物镜系统。O2 收集发射光并缩小图像，O3 将成像平面以正确的倾斜角度投射到相机传感器上。缩写：LSFM = 光片荧光显微镜；SOLS = 单物镜光片系统；O1–O3 = 物镜。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65411/65411fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

<table><tbody><tr><td>1&quot; 平凹透镜 f = -50 mm</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>LC1715-A-ML</td><td>用于激光准直&lt;br/&gt; 预估成本：49.5美元</td></tr><tr><td>1&quot; 消色差双胶合透镜 f = 100 mm（x3）</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-100-A-ML</td><td>L2、L4 和校准激光器&lt;br/&gt; 预估成本：342.42美元</td></tr><tr><td>1&quot; 消色差双合透镜 f = 125 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-125-A-ML</td><td>SL2&lt;br/&gt; 预估成本：114.14 美元</td></tr><tr><td>1&quot; 消色差双合透镜 f = 150 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td>L3&lt;br/&gt; 预估成本：114.14 美元</td></tr><tr><td>1&quot; 消色差双合透镜 f = 150 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td>TL2&lt;br/&gt; 预估成本：114.14美元</td></tr><tr><td>1&quot; 消色差双合透镜 f = 45 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-045-A-ML</td><td>L1&lt;br/&gt; 预估成本：114.14 美元</td></tr><tr><td>1&quot; 消色差双胶合透镜 f = 75 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-075-A-ML</td><td>SL1&lt;br/&gt; 预估成本：114.14美元</td></tr><tr><td>1&quot; 柱面透镜 f = 100 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1567RM</td><td>CL3&lt;br/&gt; 预估成本：117.62美元</td></tr><tr><td>1&quot; 柱面透镜 f = 200 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1653RM</td><td>CL2&lt;br/&gt; 预估成本：111.22 美元</td></tr><tr><td>1&quot; 柱面透镜 f = 50 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1695RM</td><td>CL1&lt;br/&gt; 预估成本：117.62美元</td></tr><tr><td>1&quot; 安装式针孔， 30 &amp;micro;m 针孔直径</td><td>Thorlabs</td><td>P30K</td><td>预估成本：77.08美元</td></tr><tr><td>1&quot; 银镜（x3）</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td><td>M1、M2，各一个，用于准直&lt;br/&gt; 预估成本：168.78 美元</td></tr><tr><td>2&quot; 椭球面反射镜</td><td>Thorlabs</td><td>PFE20-P01</td><td>M3&lt;br/&gt; 预估成本：179.98 美元</td></tr><tr><td>2&quot; 支架杆（x11）</td><td>Thorlabs</td><td>PH2</td><td>用于定制激光安装架、中性密度滤光轮和安全屏蔽屏&lt;br/&gt; 预估成本：98.45美元</td></tr><tr><td>2&quot; 帖子（x47）</td><td>Thorlabs</td><td>TR2</td><td>用于定制激光安装架和光学元件&lt;br/&gt; 预估成本：277.3美元</td></tr><tr><td>3&quot; 支柱（x4）&amp;nbsp;</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>TR3</td><td>用于 M3 支架及其他安装部件&lt;br/&gt; 预估成本：24.6美元</td></tr><tr><td>3&quot; 支架座（x4）</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>PH3</td><td>预估成本：38.48 美元</td></tr><tr><td>30 至 60 毫米笼式适配器&amp;nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>LCP33</td><td>用于安装 O1&lt;br/&gt; 预估成本：45.42美元</td></tr><tr><td>30 mm笼式滤光轮</td><td>Thorlabs</td><td>CFW6</td><td>安装中性密度滤光片&lt;br/&gt; 预估成本：172.36美元</td></tr><tr><td>30 mm笼板（x6）</td><td>Thorlabs</td><td>CP33</td><td>搭建准直笼式系统与准直激光器&lt;br/&gt; 预估成本：$114.54</td></tr><tr><td>30毫米直角运动学镜片安装座（x3）</td><td>Thorlabs</td><td>KCB1</td><td>用于安装 M1 和 M2 以及校准激光器&lt;br/&gt; 预估成本：463.95美元</td></tr><tr><td>4&quot; 支架座（x30）</td><td>Thorlabs</td><td>PH4</td><td>预估成本：320.1 美元</td></tr><tr><td>561 nm 激光器与电源&amp;nbsp;</td><td>Opto Engine LLC</td><td>MGL-FN-561-100mW</td><td>激发激光器&lt;br/&gt; 预估成本：6000美元</td></tr><tr><td>60毫米笼式板（x2）</td><td>Thorlabs</td><td>LCP01</td><td>安装 TL1 和 M3 支架&lt;br/&gt; 预估成本：88.52美元</td></tr><tr><td>60 mm 直角运动学镜片支架</td><td>Thorlabs</td><td>KCB2</td><td>安装 M3&lt;br/&gt; 预估成本：187.26 美元</td></tr><tr><td>90&amp;deg; 翻转安装</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>TRF90</td><td>用于激光准直&lt;br/&gt; 预估成本：95.5美元</td></tr><tr><td>带外置C型接口螺纹和内置SM1螺纹的转接器</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>SM1A9</td><td>连接镜头筒与相机&lt;br/&gt; 预估成本：20.96美元</td></tr><tr><td>带外置SM1螺纹和内置C型接口螺纹的转接器</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>SM1A10</td><td>将管镜连接至透镜支架&lt;br/&gt; 预估成本：21.82 美元</td></tr><tr><td>带外SM1螺纹和内M25螺纹的转接头（x2）</td><td>Thorlabs</td><td>SM1A12</td><td>安装物镜 O1 和 O2&lt;br/&gt; 预估成本：47.06美元</td></tr><tr><td>带外SM1螺纹和内M26螺纹的转接器</td><td>Thorlabs</td><td>SM1A27</td><td>用于安装 O3&lt;br/&gt; 预估成本：22.38 美元</td></tr><tr><td>对齐圆盘</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>SM1A7</td><td>预估成本：20.45 美元</td></tr><tr><td>对准激光器</td><td>BISKEE</td><td></td><td>https://www.amazon.com/Tactical-Presentation-Teaching-Interactive-Adjustable/dp/B09B1VXPNM&lt;br/&gt; 预估成本：16.98 美元</td></tr><tr><td>自荧光塑料载玻片，红色&amp;nbsp;</td><td>Chroma</td><td>92001</td><td>预估成本：$20</td></tr><tr><td>光束快门&amp;nbsp;</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>SM1SH1</td><td>用于阻断激光光束&lt;br/&gt; 预估成本：65.8美元</td></tr><tr><td>笼式旋转支架（x3）</td><td>Thorlabs</td><td>CRM1T</td><td>安装 CL1-3&lt;br/&gt; 预估成本：282.15 美元</td></tr><tr><td>笼式系统杆 1&quot; (x8)</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>ER1</td><td>安装 M3 和 O1&lt;br/&gt; 预估成本：44.8美元</td></tr><tr><td>笼式系统杆 3&quot; (x2)</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>ER3</td><td>用于安装 O3&lt;br/&gt; 预估成本：14.28 美元</td></tr><tr><td>笼式系统杆 4&quot; (x4)</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>ER4</td><td>安装狭缝&lt;br/&gt; 预估成本：30.76美元</td></tr><tr><td>笼式系统杆 8&quot; (x2)</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>ER8</td><td>用于管镜对准&lt;br/&gt; 预估成本：25.3美元</td></tr><tr><td>笼式系统杆 12&quot; (x8)</td><td>Thorlabs</td><td>ER12</td><td>用于对准笼架&lt;br/&gt; 预估成本：145.36美元</td></tr><tr><td>相机</td><td>Andor</td><td>Zyla 4.2 sCMOS</td><td>预估成本：约 14,000 美元</td></tr><tr><td>夹紧叉（x35）</td><td>Thorlabs</td><td>CF125</td><td>用于固定后置支架&lt;br/&gt; 预估成本：338.8美元</td></tr><tr><td>盖玻片，22 × 22 mm&amp;nbsp;</td><td>康宁</td><td>2850-22</td><td>用于载玻片样品&lt;br/&gt; 预估成本：265美元</td></tr><tr><td>二向色镜&amp;nbsp;</td><td>AVR</td><td>DI01-R405/488/561/635-25x36</td><td>用于分离激发/发射光路&lt;br/&gt; 预估成本：965美元</td></tr><tr><td>dovetail 平移台</td><td>Thorlabs</td><td>DT12</td><td>针孔&lt;br/&gt; 预估成本：90.55美元</td></tr><tr><td>发射滤光片</td><td>Thorlabs</td><td>FELHO600</td><td>预估成本：140.99 美元</td></tr><tr><td>磨砂玻璃校准盘（x2）</td><td>Thorlabs</td><td>DG10-1500-H1</td><td>用于对准笼式系统和中间像平面&lt;br/&gt; 预估成本：75.14美元</td></tr><tr><td>函数发生器</td><td>Hewlett-Packard</td><td>HP 33120A 15 MHz</td><td>控制振镜扫描器&lt;br/&gt; 预估成本：900美元</td></tr><tr><td>检流计 - 一维大光束直径系统</td><td>Thorlabs</td><td>GVS011</td><td>预估成本：1715.78美元</td></tr><tr><td>振镜电源</td><td>Siglent</td><td>SPD3303C</td><td>预估成本：300美元</td></tr><tr><td>Gelrite</td><td>Research Products International</td><td>G35020-100.0</td><td>用于3D微球样品的结冷胶&lt;br/&gt; 预估成本：68.25美元</td></tr><tr><td>FIJI 软件</td><td>开源</td><td></td><td>从 https://imagej.net/software/fiji/downloads 下载&lt;br/&gt; 预估成本：免费</td></tr><tr><td>加热板/搅拌器</td><td>康宁</td><td>6795-220</td><td>用于配制样品溶液&lt;br/&gt; 预估成本：550美元</td></tr><tr><td>K-Cube 有刷电机控制器</td><td>Thorlabs</td><td>KDC101</td><td>Drives Z825B&lt;br/&gt; 预估成本：757.51美元</td></tr><tr><td>运动学支架</td><td>Thorlabs</td><td>KM100S</td><td>安装二向色镜&lt;br/&gt; 预估成本：92.01美元</td></tr><tr><td>Kinesis Software</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td></td><td>从 https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=10285 下载&lt;br/&gt; 预估成本：免费</td></tr><tr><td>激光光束阻断器&amp;nbsp;</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>LB1</td><td>用于中性密度滤光片的反射&lt;br/&gt; 预估成本：$57.65</td></tr><tr><td>激光器支架</td><td>定制</td><td></td><td>3D打印&lt;br/&gt; 预估成本：不适用</td></tr><tr><td>激光安全屏（x2）</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>TPS4</td><td>用于阻断杂散激光&lt;br/&gt; 预估成本：92.02美元</td></tr><tr><td>激光扫描管镜</td><td>Thorlabs</td><td>TTL200MP</td><td>TL1&lt;br/&gt; 预估成本：1491美元</td></tr><tr><td>透镜支架（x10）&amp;nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>LMR1</td><td>用于安装所有透镜及额外的对准反射镜。&lt;br/&gt; 预估成本：164.7 美元</td></tr><tr><td>磁性标尺</td><td>Thorlabs</td><td>BHM4</td><td>检查对齐&lt;br/&gt; 预估成本：52.74美元</td></tr><tr><td>Micro-Manager 软件&amp;nbsp;</td><td>开源</td><td></td><td>从 https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release 下载&lt;br/&gt; 预估成本：免费</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>12550400</td><td>适用于载玻片样品&lt;br/&gt; 预估成本：123.9美元</td></tr><tr><td>显微镜载物台&amp;nbsp;</td><td>ASI</td><td>FTP-2000 及定制部件</td><td>用于精细平移样品&lt;br/&gt; 预估成本：约 16,000 美元</td></tr><tr><td>迷你涡旋混匀器&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>10153-688</td><td>用于样品制备&lt;br/&gt; 预估成本：152.64美元</td></tr><tr><td>电动执行器</td><td>Thorlabs</td><td>Z825B</td><td>精细调节 M1&lt;br/&gt; 预估成本：729.07美元</td></tr><tr><td>安装式标准光圈（x2）</td><td>Thorlabs</td><td>ID20</td><td>至少 2 个用于对齐&lt;br/&gt; 预估成本：118.02 美元</td></tr><tr><td>中性密度滤光片组&amp;nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>NDK01&amp;nbsp;</td><td>为降低激发光强度&lt;br/&gt; 预估成本：726.73美元</td></tr><tr><td>物镜 1</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>Plan Apo 60X/1.20 WI</td><td>O1&lt;br/&gt; 预估成本：约 15,000 美元</td></tr><tr><td>物镜 2</td><td>Nikon</td><td>TU Plan Fluor 100X/0.90&amp;nbsp;</td><td>O2&lt;br/&gt; 预估成本：约 6,000 美元</td></tr><tr><td>物镜 3</td><td>Mitutoyo</td><td>Plan Apo HR 50X/0.75</td><td>O3&lt;br/&gt; 预估成本：约 6,800 美元</td></tr><tr><td>OPM 去倾斜软件</td><td>开源</td><td></td><td>用于图像处理。从 https://github.com/QI2lab/OPM 下载&lt;br/&gt; 预估成本：免费</td></tr><tr><td>光电二极管功率传感器</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>S121C</td><td>用于测量激光强度&lt;br/&gt; 预估成本：379.68 美元</td></tr><tr><td>正向网格畸变标靶</td><td>Thorlabs</td><td>R1L3S3P</td><td>明场校准&lt;br/&gt; 预估成本：267.87美元</td></tr><tr><td>数字功率计控制台</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>PM100D</td><td>用于测量激光强度&lt;br/&gt; 预估成本：1245.48 美元</td></tr><tr><td>罗丹明 6G</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>J62315.14</td><td>用于荧光标记的载玻片样品&lt;br/&gt; 预估成本：27.7美元</td></tr><tr><td>用于支架的直角夹</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>RA90</td><td>用于 M3 支撑和翻转镜&lt;br/&gt; 预估成本：32.46美元</td></tr><tr><td>RMS螺纹笼板（x2）&amp;nbsp;</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>CP42</td><td>用于激光准直&lt;br/&gt; 预估成本：70.56美元</td></tr><tr><td>剪切板 2.5-5.0 mm</td><td>Thorlabs</td><td>SI050P&amp;nbsp;</td><td>预估成本：182.85 美元</td></tr><tr><td>剪切板 5.0-10.0 mm</td><td>Thorlabs</td><td>SI100P</td><td>预估成本：201.47美元</td></tr><tr><td>剪切板 10.0-25.4 mm</td><td>Thorlabs</td><td>SI254P</td><td>预估成本：236.42美元</td></tr><tr><td>剪切板观察屏</td><td>Thorlabs</td><td>SIVS</td><td>预估成本：337.74 美元</td></tr><tr><td>1–3 mm 板的剪切干涉仪</td><td>Thorlabs</td><td>SI035</td><td>用于检查准直&lt;br/&gt; 预估成本：465.85美元</td></tr><tr><td>滑套式柱套（x35）</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>R2</td><td>为保持支架高度&lt;br/&gt; 预估成本：208.25美元</td></tr><tr><td>狭缝</td><td>Thorlabs</td><td>VA100</td><td>预估成本：294.64美元</td></tr><tr><td>带槽透镜管，3&quot;</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>SM1L30C</td><td>用于激光准直&lt;br/&gt; 预估成本：77.45美元</td></tr><tr><td>方形镜，1 x 1&quot;</td><td></td><td></td><td>https://www.amazon.com/Small-Square-Mirror-Pieces-Mosaic/dp/B07FBNMDC1/ref=asc_df_B07FBNMDC1/?tag=hyprod-20&amp;amp;链接代码=df0&amp;amp;hva&lt;br/&gt; did=642191768069&amp;amp;hvpos=&amp;amp;hvne&lt;br/&gt; tw=g&amp;amp;hvrand=1336734911900437&lt;br/&gt; 4691&amp;amp;hvpone=&amp;amp;hvptwo=&amp;amp;hvqmt=&lt;br/&gt; &amp;amp;hvdev=c&amp;amp;hvdvcmdl=&amp;amp;hvlocint&amp;amp;&lt;br/&gt; hvlocphy=9031212&amp;amp;hvtargid=pla-1&lt;br/&gt; 943952718742&amp;amp;gclid=Cj0KCQiA6L&lt;br/&gt; yfBhC3ARIsAG4gkF_AYBpn5EdGL&lt;br/&gt; q3mc-RU-nanT5vM4ac9r3-obbzqJoWKPkIPIJU6e1caAjWmEA&lt;br/&gt; Lw_wcB&amp;amp;th=1&lt;br/&gt; 预估成本：14.76美元</td></tr><tr><td>可堆叠透镜管 1/2&quot; (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L05</td><td>安装 CL1-3&lt;br/&gt; 预估成本：40.86美元</td></tr><tr><td>可堆叠透镜管 1&quot;</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L10</td><td>用于安装 O3&lt;br/&gt; 预估成本：15.41美元</td></tr><tr><td>可堆叠透镜管 2&quot; (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L20</td><td>用于相机光路&lt;br/&gt; 预估成本：35.7美元</td></tr><tr><td>带齿底座适配器（x37）</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>BE1</td><td>将支架安装到平台上&lt;br/&gt; 预估成本：400.71美元</td></tr><tr><td>平移透镜架（x3）</td><td>Thorlabs</td><td>LM1XY</td><td>用于微调针孔，O2 和 O3&lt;br/&gt; 预估成本：441美元</td></tr><tr><td>带标准千分尺的平移台（x2）</td><td>Thorlabs</td><td>PT1/M</td><td>TS1-2&lt;br/&gt; 预估成本：647.54美元</td></tr><tr><td>旅行手册翻译阶段</td><td>Thorlabs</td><td>CT1A</td><td>O3 笼式平移架&lt;br/&gt; 预估成本：497.3美元</td></tr><tr><td>管镜</td><td>尼康</td><td>MXA20696</td><td>TL3&lt;br/&gt; 预估成本：359美元</td></tr><tr><td>白色安装式LED</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>MNWHL4</td><td>明场光源&lt;br/&gt; 预估成本：171.28 美元</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>总估算成本：$84,858.98</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>作者指出，许多部件是购买的二手货。本文中，我们已尽量反映所有物品的零售价格，因此通过购买二手物品（尤其是较昂贵的物品）可大幅降低总成本。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>可选组件</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grasshopper3 USB3</td><td>FLIR</td><td>&amp;nbsp;GS3-U3-23S6C-C</td><td>用于对准过程中的诊断检查。也可使用采集相机，但之后需要重新对准。&lt;br/&gt; 预估成本：1089美元</td></tr></tbody></table>

可定制单物镜光片荧光显微镜的设计与构建用于细胞骨架网络的可视化

Design and Building of a Customizable, Single-Objective, Light-Sheet Fluorescence Microscope for the Visualization of Cytoskeleton Networks

重建的细胞骨架复合物已成为研究非平衡态软物质的有价值模型系统。要准确捕捉这些三维致密网络的动力学行为，需要进行光学切片，这通常与荧光共聚焦显微镜相关联。然而，近年来光片荧光显微镜（LSFM）的发展使其成为一种成本较低且有时性能更优的替代方案。为了使对光学技术不太熟悉的细胞骨架研究人员也能使用LSFM，我们提供了一步一步的初学者指南，介绍如何利用现成组件构建一台多功能的光片荧光显微镜。为了能够使用传统的载玻片样品进行样品装载，该LSFM采用单物镜光片（SOLS）设计，即使用同一个物镜完成激发光照射和发射光收集。我们对SOLS各个组件的功能进行了足够详细的描述，以便读者能够修改仪器并根据自身特定需求进行设计。最后，我们通过可视化驱动蛋白驱动的微管网络中的星状结构，展示了该定制SOLS仪器的应用。

我们对嵌入在结冷胶中的1 µm微珠进行了体扫描。图14展示了沿x、y和z方向去倾斜体扫描的最大强度投影。
<img alt="图14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65411/65411fig14.jpg" /> 
图14：明胶糖中1 µm荧光微珠的体积成像。 显示的是去倾斜校正后的体积扫描最大强度投影图像。比例尺 = 30 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65411/65411fig14large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
我们已展示了使用单物镜光片显微镜通过对微管星状体样品进行三维扫描，来表征重建的细胞骨架网络。简言之，将罗丹明标记的、紫杉醇稳定的微管通过GTP从重建的二聚体中聚合而成；随后，在聚合完成后，将基于链霉亲和素的驱动蛋白马达簇与ATP一同加入样品中，终浓度分别为6 µM微管、0.5 µM驱动蛋白二聚体和10 mM ATP。有关紫杉醇稳定微管和驱动蛋白马达簇制备的详细方案与指南，可参见Mitchson实验室和Dogic实验室网站25,26。样品被轻柔地移入显微镜载玻片中，密封后静置8小时再进行成像，以确保马达活性停止，使样品达到类似星状体的稳定结构状态。
重建细胞骨架系统的研究最常采用共聚焦或落射荧光显微镜对标记的纤维进行成像。然而，这两种技术在成像高密度三维样品方面的能力均存在局限性27. 尽管在该领域已取得诸多进展 体外 通过将样品限制在准二维条件下进行基于细胞骨架的活性物质研究28,29，细胞骨架网络本质上是三维的，而当前许多研究致力于理解那些仅在三维样本中才会出现的效应29,30因此需要高分辨率的三维成像。
<img alt="图15" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65411/65411fig15.jpg" /> 
图15：单物镜光片显微镜促进重建细胞骨架样本的三维可视化。（A）在Leica DMi8激光扫描共聚焦显微镜上获取的荧光微管星状体图像。图像显示了z轴扫描中不同焦平面的视图。比例尺 = 30 µm。（B）同一样本在单物镜光片显微系统上进行三维扫描后经去卷积和去倾斜校正的图像。比例尺 = 30 µm。此处的去倾斜图像区域对应于图13B中所示的有效视场（黄色框）。尽管共聚焦显微镜在盖玻片附近单个焦平面的成像方面表现优异，但由于成像平面上方存在来自下方的额外荧光信号，当对较高z平面成像时，荧光样本的密度会引发成像干扰。光片显微技术通过仅照亮成像平面，避免了这一问题，从而实现了在不同z平面内均一清晰的成像效果。缩写：SOLS = 单物镜光片显微（single-objective light-sheet）；FoV = 视场（field of view）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65411/65411fig15large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
在图15中，我们展示了由驱动蛋白马达簇将重建的微管网络收缩成星状结构后的三维成像结果。如先前研究28,31所示，这些三维结构往往向中心区域变得更加致密，导致荧光信号在中心区域占主导地位，呈现明亮的荧光区域。在靠近盖玻片的成像平面（较低的z层面），共聚焦显微镜（图15A）能够分辨出星状结构边缘的单根微丝，但由于来自上方的离焦荧光信号，在中心区域会附加产生背景信号。然而，当z方向移动数微米后，由于成像平面上下密集部分的离焦信号在成像平面中占主导地位，图像质量迅速下降。光片的单平面照明（图15B）消除了成像平面上下方星状结构致密区域的离焦信号，从而在不同成像平面之间实现了可比的图像质量。光片成像技术生成高质量、可靠的三维扫描数据的能力，为可视化和表征重建细胞骨架系统中的三维现象提供了可能。

本方案详细描述了如何构建单物镜光片荧光显微镜，并用于观察细胞骨架网络。

重建的细胞骨架复合物已成为研究非平衡态软物质的有价值模型系统。准确捕捉这些三维密集网络的动态过程需要光学切片技术，而该技术通常与荧光共聚焦显微镜相关联。然而，光片荧光显微镜（LSFM）的最新进展已使其成为一种成本效益高且有时更优越的替代方案。为了使不熟悉光学技术的细胞骨架研究人员也能便捷使用LSFM，本文提供了一套逐步入门指南，介绍如何利用市售组件构建一台多功能的光片荧光显微镜。为实现传统载玻片样品的装载，该LSFM采用单物镜光片（SOLS）设计，即使用同一物镜完成激发光照明和发射光收集。我们对SOLS中各组件的功能进行了足够详细的描述，以便读者能够根据自身特定需求对仪器进行修改和定制设计。最后，我们通过可视化驱动蛋白驱动的微管网络中的星状结构，展示了该定制SOLS仪器的应用。

我们的研究旨在增进对远离平衡态材料中转运工作动力学、局部结构与力学性能之间关系的认识。对远离平衡态的材料（如细胞骨架网络）进行可视化，需要具备成像密集三维样品的能力，并在整个样品体积内保持一致的图像质量，同时尽量减少光漂白造成的损伤，这是一项技术上具有挑战性的任务，而荧光狭缝光片显微镜尤为适合完成此项任务。荧光光片显微镜系统具备优异的光学切片能力，可在长时间尺度下对这类较厚的三维样品进行成像，同时将光漂白效应降至最低。特别是，我们将介绍的单物镜光片系统可兼容传统的载玻片固定样品，使其成为一种非常多功能的工具。目前绝大多数单物镜光片系统的指南，都是为具备深厚光学经验的用户编写的。为了使复杂的单物镜光片系统搭建过程更易于掌握，本详细指南提供了入门级光学课程知识水平的用户也能遵循的操作步骤。首先，确保在光学平台上准备好显微镜的布局，并准确测量所有距离。然后，将激发激光器安装在平台上。将两个光阑调整至激光器的预定高度，并利用这两个光阑确保光束水平且居中。将平移台（TS1）放置在反射镜一（M1）位置的下方。使用一对高度精确设定的指示物来确定期望的出射光路，并引导每个反射元件的放置与对准。接下来，将 M1 安装在 TS1 的顶部。然后，在平台上安装并调整二向色镜的位置。同样，安装振镜并将其与光阑对齐。完成对齐后，放置二号反射镜，然后将三号反射镜固定在平台上。调整其高度和位置，直到光束大致位于两片磨砂玻璃对准盘的中心。然后在M3处添加支撑。接下来，开始将透镜1安装到平台上。调节其倾斜角度和横向位置，直至光束位于M3上方毛玻璃板的中心。放置第二片透镜，并使用镜子将光束反射到远处表面以检查准直情况。使用索引卡或靶标追踪光束，确保光束尺寸不发生变化。然后，通过XY安装座调节针孔的X、Y位置，并通过一维位移台调节其轴向距离，以最大化透射率。沿轴向调整透镜四，将激发光束聚焦在检流计镜面表面，随后将透镜三放置于光学平台上，接着放置SL1。调整SL1的轴向距离，使其与透镜四构成一个准直的望远镜系统。然后使TL1与SL1保持平行。调节笼式系统上物镜一的高度，直到光束在天花板上形成艾里斑。然后继续调节，直至艾里斑的尺寸最小。将方形镜放置在物镜一的样品台上，并沿轴向调节镜面，直到经过二向色镜后的光束轮廓尺寸最小。通过将笼杆插入两个笼板的空孔中来安装校准激光器。使用一个运动学镜架和一个下反射镜来校准校准光束与激发光束的光路。将方形反射镜轴向放置在物镜一的样品台上，以在二向色镜后最小化光束轮廓。在发射光路中相应位置插入 SL2 和 TL2，调节第二个物镜的倾斜旋钮（X、Y），使红色对准光束穿过光圈和磨砂玻璃盘。调节第二个平移台，直至光束在表面形成一个微小的艾里斑，然后继续调节第二个平移台以最小化艾里斑的尺寸。为优化检流计的倾斜与可变扫描，按下函数发生器上的 FSK 按钮，为检流计选择三角波信号，并将其设置为低频率，例如 1 Hz。在同一个远处表面或墙壁上观察校准光束。将物镜三安装在物镜二前方约四到五毫米处，角度为零度，并调节高度使其对齐。使用直尺测量，在SL2与TL2共用的焦平面之间放置一个磨砂玻璃校准盘。当发射光充满 oh three 的后焦面后，在相机传感器的大致位置安装一片磨砂玻璃圆盘，并将圆盘中心与从 oh three 射出的发射光对齐。将 TL3 置于物镜三后方，并调节其倾斜角度，使出射光与磨砂玻璃圆盘对齐。将相机放置在距管镜指定距离的位置，并通过笼式位移平台沿轴向调节物镜三，直至相机上成像的孔清晰对焦。以桌面上的刻线为参考，将物镜三调整至相对于物镜二光轴呈30度角的位置。将正交网格测试靶重新安装至相同的轴向高度，并用明场光源照射网格。在保持网格方格大小均匀的同时，使视野中清晰对焦的部分沿水平方向扫过屏幕。为对准倾斜的光片，调整柱面镜或 CL，使光束在 CL3 的焦平面处聚焦成水平片状光束。将狭缝垂直插入并置于 CL3 与第三透镜之间的焦平面位置。在相机传感器上确认零度光片呈现为细而垂直的图像。使用电动平移台控制器，将 M1 向柱面透镜方向移动以调整光片角度。将预先制备的罗丹明标记微管测试样品放置在样品台上，并沿轴向调节，使染料在视场中心与屏幕右侧之间的五个不同深度处被光片照射。然后，保存每幅图像。在 Fiji 中打开图像。对于每幅图像，使用线条工具从视野中心向光片中心绘制一条水平线。然后，依次点击 分析 和 绘制剖面图，以计算光片相对于 oh one 的角度。校准仪器后，安装预先制备好的三维微珠样品，并点击函数发生器上的 FSK 按钮以设置三角波。为找到样品，使用函数发生器设置参数，起始值为 20 毫赫兹频率、400 毫伏峰峰值振幅和 0.4 偏移量。手动调节 Z 轴，直至到达样品平面，并优化 Z 轴设置。在 Micromanager 程序中，选择一个曝光时间，并打开多维采集窗口。将时间间隔设为 30，使用计数框选择帧数。参数设置完成后，对整个体积进行一次完整的扫描并记录时间序列图像。对重组微管网络的三维扫描显示，三维结构向中心区域逐渐变得致密，导致荧光信号在中心区域增强。在靠近盖玻片的成像平面上，共聚焦显微镜能够分辨出星状体外围的单根纤维，但由于来自上方离焦荧光信号的干扰，中心区域存在额外背景信号。然而，当在Z轴方向移动数微米后，由于星状体致密部分的离焦影响，图像质量迅速下降。光片的单平面照明消除了焦外信号，使得各平面之间的图像质量具有可比性。

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生物学

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可定制单物镜光片荧光显微镜的设计与构建用于细胞骨架网络的可视化

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