Name: 大肠杆菌重组蛋白填充囊泡的优化生产和分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-30T12:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 19 s
Description: 了解利用大肠杆菌膜结合囊泡优化生产重组蛋白的方法。该技术可提高难表达蛋白的产量并简化下游纯化流程，适用于生物技术及医学研究。

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作者感谢众多 Twitter 用户提出的问题，这些问题涉及描述 VNp 技术的论文中所介绍的实验方案。图 1A 使用了 flaticon.com 上的图标生成。本工作得到了肯特大学以及生物技术和生物科学研究理事会（BB/T008/768/1 和 BB/S005544/1）的资助。

所开展的细菌实验工作遵循与每种菌株特定生物安全危害等级相适应的本地、国家和国际生物安全防护规定。
1. 不同VNps的选择
<ol>
	<li>确定VNp序列。 
	注意：在本研究中，已鉴定出三种VNp序列1，这些序列可使迄今所检测的蛋白质获得最大产量及囊泡分泌效率：VNp2、VNp6和VNp15。目前尚不清楚为何某些VNp变体在某些蛋白质中表现更高效；因此，建议将新关注的蛋白质分别与每种VNp变体（即VNp2、VNp6或VNp15）构建融合蛋白。 
	VNp2:&#160; &#160;MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEA 
	AGKTKEGVL 
	VNp6:&#160; &#160;MDVFKKGFSIADEGVVGAVEKTDQGVTEA 
	AEKTKEGVM 
	VNp15:&#160; &#160;MDVFKKGFSIADEGVVGAVE 
	已商业化提供可在不同VNp氨基端融合表达目标蛋白的质粒（见材料表）。</li>
	<li>设计克隆策略，将目标基因插入上述载体中编码VNp的cDNA的3'端，或通过在目标蛋白编码基因的第一个ATG密码子上游整合合成的VNp cDNA来改造现有质粒。具体方法参见文献1。</li>
	<li>对于具有毒性的蛋白质，应使用带有可抑制表达启动子或本底表达噪声极低的启动子的载体。</li>
	<li>将VNp序列标签克隆至融合蛋白的氨基端。确保亲和标签、蛋白酶切割序列等以及目标蛋白位于VNp标签的羧基侧。建议在VNp与下游肽段之间插入一段柔性连接序列，例如重复两到三次的-G-G-S-G-多肽序列（图1）。 
	&#8203;注意：应使用抗生素筛选标记时不靶向肽聚糖的质粒，因为靶向肽聚糖会削弱细胞表面结构并降低囊泡产量。本研究中优先选用卡那霉素和氯霉素（见材料表）。</li>
</ol>
2. 细菌细胞培养与蛋白诱导
注意：本方案中通常使用的细菌菌株为 Escherichia coli BL21 (DE3) 或 W3110。E. coli 菌株在溶菌肉汤（LB）（10 g/L 胰蛋白胨；10 g/L NaCl；5 g/L 酵母提取物）或优质肉汤（TB）（12 g/L 胰蛋白胨；24 g/L 酵母提取物；4 mL/L 10% 甘油；17 mM KH2PO4；72 mM K2HPO4，盐溶液需单独高压灭菌）培养基中培养（见材料表）。图2展示了蛋白质诱导及后续分离纯化过程中各步骤的示例图像。
<ol>
	<li>将新鲜的细菌转化子接种于5 mL LB培养基中，在37 °C下培养至饱和，然后以此接种含有适当抗生素的25 mL TB培养基于500 mL三角瓶中。</li>
	<li>表面积与体积之比是优化该系统的重要因素。应尽可能使用大体积的烧瓶（例如，5 L烧瓶中装有1 L培养液）；在优化实验中，可使用500 mL烧瓶装25 mL培养基。</li>
	<li>将较大的摇瓶培养物置于37 °C培养箱中，以200 rpm（≥25 mm轨道振幅）振荡培养，直至600 nm处的光密度值（OD600）达到0.8–1.0。 
	注意：细胞在37 °C下生长时，囊泡化效果最佳。然而，某些重组蛋白需要在较低温度下表达。若目标蛋白属于此类情况，则必须使用VNp6标签，因其可在低至25 °C的温度下实现高效囊泡输出。</li>
	<li>为诱导T7启动子驱动的重组蛋白表达，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），使其终浓度最高达20 µg/mL（84 µM）（参见材料表）。重组蛋白表达的诱导必须在对数生长后期进行（即典型的OD600为0.8–1.0），以利于囊泡的生成。 
	&#8203;注意：不同蛋白的诱导时间可能不同，有些在4小时达到最大产量，而另一些则需过夜（18小时）。迄今为止，过夜培养获得的囊泡输出量最高。</li>
</ol>
3. 重组囊泡的分离
<ol>
	<li>在 4 °C 条件下，以 3,000 x g 离心 20 分钟，收集细胞沉淀。</li>
	<li>为对含囊泡的培养基进行灭菌以长期保存，将澄清的培养基通过无菌且无去污剂的 0.45 µm 聚醚砜（PES）滤膜（见材料表）。 
	注意：为检测滤液中是否排除了活细胞，可将滤液接种至 LB 琼脂平板，并在 37 °C 下过夜培养。</li>
	<li>为将囊泡浓缩至较小体积，将无菌的含囊泡培养基通过无菌且无去污剂的 0.1 µm 混合纤维素酯（MCE）滤膜（见材料表）。</li>
	<li>使用细胞刮刀或塑料涂布棒，加入 0.5–1 mL 无菌 PBS 轻柔冲洗滤膜，小心将囊泡从膜上洗脱下来，转移至新的微量离心管中。 
	&#8203;注意：纯化的囊泡可保存在无菌培养基或磷酸盐缓冲液（PBS）中，置于 4 °C。已有报道显示，重组蛋白在这些囊泡中保存 6 个月后仍无酶活性损失。</li>
</ol>
4. 从分离囊泡中释放可溶性蛋白
<ol>
	<li>将含有蛋白质的囊泡分离至无菌培养基/缓冲液后，使用仪器对应的合适程序对囊泡脂质膜进行超声处理（例如，6次20秒开/关循环），然后在39,000 × g 条件下于4 °C离心20分钟，以去除囊泡碎片。 
	注意：可采用渗透压休克或去垢剂处理作为打开囊泡的替代方法，但必须考虑其对蛋白质功能和/或下游应用的影响。</li>
	<li>若VNp融合蛋白仍保留在胞质中而未释放到培养基中，则使用标准方案进行蛋白提取（例如，用5 mL适当的提取缓冲液（20 mM Tris，500 mM NaCl）重悬细胞沉淀，超声处理，再通过离心去除细胞碎片）。</li>
</ol>
5. 蛋白质浓度测定
<ol>
	<li>通过三份样品的凝胶密度测定分析确定蛋白质浓度1。在考马斯亮蓝染色的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶上，与牛血清白蛋白（BSA）上样标准品一同电泳。使用适当的软件（例如 Image J；参见材料表）对凝胶进行扫描和分析。</li>
</ol>
6. 通过荧光显微镜观察囊泡形成及分离的囊泡
注意：如果细胞含有荧光标记的VNp融合蛋白或膜标记物，可使用活细胞成像技术来追踪囊泡的形成。或者，可使用荧光脂质染料对囊泡进行可视化，以确认其生成与纯化。
<ol>
	<li>细胞固定
	<ol>
		<li>在将细胞接种到盖玻片前，诱导VNp融合蛋白表达数小时。</li>
		<li>琼脂糖垫法（图3A-C）：用移液器将细胞滴加至洁净载玻片上已形成并凝固的薄层（&#60;1 mm）圆形LB-琼脂糖（2%）垫上。让细胞沉降并平衡后，将一块50 mm × 25 mm的盖玻片覆盖在琼脂糖垫和细胞上。使用垫片和胶带固定盖玻片。</li>
		<li>聚乙烯亚胺（PEI）法（图3D-F）：用移液器枪头将20 µL 0.05% PEI（溶于dH2O）均匀涂布于盖玻片表面，静置3–5分钟使其结合至玻璃表面，避免干燥。加入50 µL细胞培养物，静置5–10分钟以确保细菌与PEI包被的表面结合4。在将盖玻片置于载玻片前，用100 µL培养基清洗盖玻片，并使用垫片和胶带固定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>囊泡固定
	<ol>
		<li>将纯化的囊泡用移液器滴加至洁净载玻片上已形成并凝固的薄层（&#60;1 mm）圆形LB-琼脂糖（2%）垫上。待液体干燥后，将一块50 mm × 25 mm的盖玻片覆盖在琼脂糖垫和囊泡上。使用垫片和胶带固定盖玻片。</li>
		<li>荧光脂质染料FM4-64可用于膜结构染色5，因此可用于可视化囊泡。将FM4-64（见材料表）加入纯化囊泡中，终浓度为2 µM（母液为2 mM，溶于二甲基亚砜[DMSO]），孵育10分钟后进行成像。该方法特别适用于识别携带非荧光标记货物的囊泡5。</li>
		<li>用与观察细胞培养时相同的培养基冲洗盖玻片。 
		注意：某些复杂培养基（如TB）可能具有自发荧光，导致背景信号过高。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>囊泡成像 
	&#8203;注意：VNp重组囊泡的显微成像示例见图4。
	<ol>
		<li>将载玻片置于倒置显微镜（见材料表）上，使用油浸物镜，静置2–3分钟以使样品沉降并达到温度平衡。 
		注意：每份样品的所有活细胞成像必须在细胞固定至盖玻片后30分钟内完成，以尽量减少光毒性与厌氧应激的影响。因此，建议优先采用单层平面图像而非z轴层扫图像。</li>
		<li>根据所使用的荧光蛋白/染料选择合适的光源（如发光二极管[LED]或卤素灯；见材料表）及滤光片组合6。</li>
		<li>使用高倍率（即100x或150x）和高数值孔径（即NA ≥1.4）物镜对微生物细胞和囊泡进行成像。</li>
		<li>确定可视化细胞和/或囊泡荧光信号所需的最低光照强度。这可能需要对所用相机的曝光时间和增益设置进行适当调整。 
		注意：当前互补金属氧化物半导体（CMOS）相机的典型曝光时间根据成像系统不同，通常在50–200 ms之间。</li>
		<li>对于单帧图像，采用三帧图像平均法以降低硬件相关的随机背景噪声。</li>
		<li>对于延时成像，每帧之间间隔3–5分钟。 
		注意：根据显微镜配置的不同，在较长时间的延时实验过程中可能需要间歇性调整焦距。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Production and Imaging of Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli

<ol><li>Eastwood, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+vesicle-packaged+recombinant+protein+production+from+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports+Methods%22%5BJournal%5D)">High-yield vesicle-packaged recombinant protein production from E. coli.</a> Cell Reports Methods. 3 (2), 100396(2023).</li>
<li>Makino, T., Skretas, G., Georgiou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+engineering+for+improved+expression+of+recombinant+proteins+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Strain engineering for improved expression of recombinant proteins in bacteria.</a> Microbial Cell Factories. 10, 32(2011).</li>
<li>Peng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+recombinant+protein+secretion+efficiency+in+gram-positive+bacteria%3A+Signal+peptide+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Factors influencing recombinant protein secretion efficiency in gram-positive bacteria: Signal peptide and beyond.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 139(2019).</li>
<li>Lewis, K., Klibanov, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+nature%3A+rational+design+of+sterile-surface+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Surpassing nature: rational design of sterile-surface materials.</a> Trends in Biotechnology. 23 (7), 343-348 (2005).</li>
<li>Betz, W. J., Mao, F., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+exocytosis+and+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Imaging exocytosis and endocytosis.</a> Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 365-371 (1996).</li>
<li>Mulvihill, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging in fission yeast.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (10), (2017).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+monomeric+green+fluorescent+protein+derived+from+Branchiostoma+lanceolatum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum.</a> Nature Methods. 10 (5), 407-409 (2013).</li>
<li>Shen, Y., Chen, Y., Wu, J., Shaner, N. C., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+mCherry+variants+with+long+Stokes+shift%2C+red-shifted+fluorescence%2C+and+low+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Engineering of mCherry variants with long Stokes shift, red-shifted fluorescence, and low cytotoxicity.</a> PloS One. 12 (2), e0171257(2017).</li>
<li>Periz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+dynamic+F-actin+network+regulates+transport+and+recycling+of+micronemes+in+Toxoplasma+gondii+vacuoles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A highly dynamic F-actin network regulates transport and recycling of micronemes in Toxoplasma gondii vacuoles.</a> Nature Communications. 10 (1), 4183(2019).</li>
<li>Qiu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uniform+patchy+and+hollow+rectangular+platelet+micelles+from+crystallizable+polymer+blends%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Uniform patchy and hollow rectangular platelet micelles from crystallizable polymer blends.</a> Science. 352 (6286), 697-701 (2016).</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益或其他利益冲突。

上述用于生产重组蛋白的氨基末端肽标签方法是一种简单的过程，能够稳定地产生大量蛋白，并可高效地分离和/或保存数月。
需要强调本方案中为实现该系统最佳使用效果所必需的关键步骤。首先，VNp标签1必须位于目标蛋白及其任何适当标签的N端。同时，应避免使用靶向肽聚糖层的抗生素，例如氨苄青霉素。
在培养条件方面，需要使用丰富培养基（例如 LB 或 TB 培养基）以及较高的表面积与体积比，以最大化囊泡产量。分泌囊泡产生的最适温度为 37 °C，但也必须同时考虑目标蛋白表达所需的常规条件。若在较低诱导温度下进行表达，必须使用 VNp6。关键的是，在细胞 OD600 达到 0.8–1.0 时，应使用不超过 20 µg/mL（84 µM）的 IPTG 诱导 T7 启动子。利用该系统表达的蛋白在诱导 4 小时或过夜后可达到囊泡产量的最大值。
尽管本方案较为简单，但仍需进行优化。VNp变异体的融合、表达温度以及诱导时间可能因目标蛋白的不同而有所差异。此外，还需要优化从培养基中纯化并后续浓缩细胞外囊泡的步骤。目前的流程难以放大生产，且可能耗时较长。这些是该方法的局限性。
与传统方法相比，VNp技术具有多种优势2。该技术可实现多种蛋白质的囊泡分泌，迄今为止成功表达的最大蛋白尺寸为：保留在细胞内的囊泡可容纳175 kDa，而被分泌出的囊泡可容纳85 kDa。此外，该技术可显著提高具有不同物理特性和活性的重组蛋白的产量。含有目标蛋白的分泌囊泡可通过简单过滤从预清除的培养基中分离，并可在无菌培养基或缓冲液中于4 °C保存数月。
该系统的应用范围广泛，涵盖从发现科学到应用生物技术及医学领域（例如，通过生产功能性治疗药物）3生产简便、下游处理容易且产量高&#160;在这些领域，尤其是在工业界，具有吸引力的特质。

革兰氏阴性菌 E. coli 是工业和学术规模上进行重组蛋白生产的理想体系。它不仅可在高密度下以批处理方式低成本、简便地培养，而且已有大量广谱试剂、菌株、工具和启动子被开发出来，以促进在 E. coli1 中功能性蛋白的表达。此外，合成生物学技术目前正逐步克服与翻译后修饰及复杂蛋白折叠相关的典型难题2。将重组蛋白定向分泌至培养基的能力有助于提高产量并降低生产成本。将用户定义的蛋白可控地包装进膜囊泡中，有助于推动应用生物技术和医学领域内产品与技术的发展。迄今为止，仍缺乏广泛适用的将重组蛋白从 E. coli 分泌出来的有效方法3。
Eastwood 等人&#160;最近开发了一种基于肽标签的方法，用于从含有重组蛋白的细胞中生产并分离囊泡 大肠杆菌1. 该囊泡成核肽（VNp）可用于产生细菌胞外膜囊泡，并将目标重组蛋白靶向至其中，从而简化目标蛋白的纯化与储存过程，且其产量显著高于常规摇瓶培养所能达到的水平。已有报道显示，每升摇瓶培养物可获得接近 3 g 的重组蛋白产量， &#62;比缺乏VNp标签的等效蛋白高出100倍的产量。这些富含重组蛋白的囊泡可从培养基中快速纯化和浓缩，并为储存提供稳定的环境。该技术代表了重大突破 E. coli 重组蛋白生产。这些囊泡以可溶且有功能的形式区室化包裹有毒性及含二硫键的蛋白质，并支持对囊泡包装的功能性蛋白进行简单、高效、快速的纯化，可用于长期保存或直接后续处理1.
该技术相较于现有方法的主要优势在于：（1）适用于多种分子量范围（1 kDa 至 &#62;100 kDa）和蛋白质类型；（2）促进蛋白质间和蛋白质内二硫键的形成；（3）适用&#160;与多蛋白复合物结合；（4）可与多种启动子及标准实验室 E. coli 菌株；（5）在摇瓶培养中即可获得通常仅在发酵培养中才能达到的蛋白质产量；蛋白质被分泌并包裹于膜结合囊泡中，从而（6）为活性可溶性蛋白质的储存提供稳定的环境；以及（7）简化下游处理和蛋白质纯化过程。这一简单且成本效益高的重组蛋白工具，有望对生物技术、医学产业以及发现型科学研究产生积极影响。
本文介绍了一种经过多年优化的详细实验方案，描述了利用VNp技术从细菌中制备富含重组蛋白囊泡的最佳条件。文中展示了该系统在实际应用中的示例图像，其中表达了一种荧光蛋白，从而可在生产、纯化和浓缩的不同阶段直观地观察囊泡的存在。最后，本文提供了如何利用活细胞成像技术验证细菌产生含VNp融合蛋白囊泡的指导方法。

<table><tbody><tr><td>氨苄青霉素</td><td>梅尔福德</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>Acros Organics (Thermofisher Scientific)</td><td>56-75-7</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;大肠杆菌 &lt;/em&gt;BL21 (DE3)</td><td>实验室储备</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; DH10&amp;beta;</td><td>实验室储备</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>显微镜滤光片</td><td>色度</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>分子探针（Invitrogen）</td><td>T-3166</td><td>溶于DMSO，储备液浓度为2 mM</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>开源</td><td></td><td>下载自：https://imagej.net/ij/index.html</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异丙基 &amp;beta;异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）</td><td>梅尔福德</td><td>367-93-1</td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素硫酸盐</td><td>Gibco（赛默飞世尔科技）</td><td>11815-024</td><td></td></tr><tr><td>显微镜用LED光源</td><td>凯恩研究有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB 肉汤 / LB 琼脂</td><td>实验室储备</td><td>N/A</td><td>10 g/L 胰蛋白胨；10 g/L NaCl；5 g/L 酵母提取物（1.5 g/L 琼脂）</td></tr><tr><td>Metamorph 成像软件</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MF-Millipore 膜滤器（0.1 &amp;micro;m, MCE</td><td>默克</td><td>VCWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Millipore Express PLUS 膜滤器（0.45 &amp;micro;m，聚醚砜（PES）</td><td>默克</td><td>HPWP04700</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>实验室储备</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>带有不同VNp氨基末端融合标签的蛋白表达质粒&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td></td><td>https://www.addgene.org/Dan_Mulvihill/</td></tr><tr><td>terrific broth (TB)</td><td>实验室储备</td><td>N/A</td><td>12 g/L 胰蛋白胨；24 g/L 酵母提取物；4 ml/L 10% 甘油；17 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 72 mM K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr></tbody></table>

优化生产与分析重组蛋白填充囊泡的方法 e. coli

Optimized Production and Analysis of Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli

这一创新系统利用短肽标签，通过膜结合囊泡从E. coli中分泌多种重组蛋白，为解决细菌表达重组蛋白过程中存在的一系列问题提供了有效方案。这些重组囊泡将蛋白质分隔在特定的微环境中，有助于从细菌中生产原本难以表达的、具有毒性、不溶性或含二硫键的蛋白质。与未使用囊泡成核肽标签的传统细菌表达相比，蛋白产量显著提高。囊泡包裹的蛋白质可释放至培养基中&#160;，支持从培养液中分离纯化，并实现蛋白质长期保持活性的储存。该技术可提高功能性囊泡包裹蛋白的产量，简化后续处理流程，适用于从应用生物技术到发现性科学研究及医学领域的多种用途。本文及配套视频提供该方法的详细操作方案，重点阐述关键技术步骤，以最大化生产富含重组蛋白的囊泡。

BL21 DE3 E. coli 含有 VNp6-mNeongreen 表达载体的菌株培养至对数生长晚期（图 2A）。通过向培养物中添加 IPTG 诱导 VNp6-mNeongreen 表达（20 µg/mL 或 84 µM 终浓度），随后在过夜培养 37 °C 剧烈振荡（200 rpm，≥25 mm 轨道直径）。次日早晨，培养物显示出 mNeongreen 荧光7 (图2B），在通过离心去除细菌细胞后，该物质在培养基中仍保持可见图 2C). 通过 SDS-PAGE 确认了培养物及澄清培养基中 VNp-mNeongreen 的存在图 2D）。含有mNeongreen的囊泡被分离到一个 0.1 µm MCE 滤膜（图2E) 并重悬于 PBS（图 2F）。纯化的囊泡随后被置于琼脂糖垫上（图3A-C）并使用宽场荧光显微镜成像（图4A）。使用脂溶性荧光染料FM4-64确认囊泡膜的存在（图4B）。 E. coli 表达内膜蛋白CydB与mNeongreen（绿色）融合以及VNp6-mCherry2（洋红色）的细胞8 显示活体细菌细胞中囊泡的产生和货物蛋白的插入（图4C). 图 4A，B 使用宽场荧光显微镜拍摄，而 图4C 采用结构照明显微镜（SIM）获取，所用方法如先前所述9,10.
<img alt="带有VNp、标签、TEV位点、细菌培养、离心、过滤的蛋白质纯化示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65442/65442fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：从克隆策略设计到细胞外囊泡的纯化与保存的VNp技术概要。（A）典型的VNp融合蛋白示意图。VNp位于NH2末端，其后为柔性连接子，以及适当组合的亲和标签和荧光标签（Tag1、Tag2）、蛋白酶切割位点（例如TEV）和目标蛋白。（B）从E. coli表达和纯化重组蛋白填充的膜囊泡的实验流程示意图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65442/65442fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质诱导与纯化；SDS-PAGE 结果；过滤装置；囊泡纯化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65442/65442fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图 2：VNp6-mNg 囊泡的制备与纯化各阶段。 含有 VNp-mNeongreen 表达载体的 E. coli 菌液在蓝光下培养，分别处于 IPTG 诱导融合蛋白表达前（A）和诱导后（B）。将（B）中的菌体通过离心去除，使 VNp-mNeongreen 填充的囊泡保留在上清液中（C）。对来自 A、B 和 C 的等量样品进行 SDS-PAGE 分析并用考马斯亮蓝染色（D）。囊泡被截留在 0.1 µm 滤膜上（E），随后洗脱至适当体积的缓冲液中（F）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65442/65442fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="用于显微镜载玻片制备的琼脂糖垫与PEI包被盖玻片装置示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65442/65442fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3用于成像囊泡及囊泡生成的细胞制备流程 (A-C) 琼脂糖垫法和 (D-F聚乙烯亚胺（PEI）封片法 E. coli 将细胞接种到盖玻片上。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65442/65442fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="VNp 囊泡的荧光显微镜图像；示意图显示 VNp-mNG、FM4-64 染色以及 mCherry2 与 CydB 的相互作用。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65442/65442fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：VNp 重组囊泡的显微镜图像。 在琼脂糖垫上固定的、含 FM4-64 标记的 VNp6-mNeongreen 囊泡的不同视野下获得的绿色（A）和红色（B）发射图像。（C）表达内膜蛋白 CydB 与 mNeongreen（绿色）融合以及 VNp6-mCherry2（品红色）的大肠杆菌（E. coli）细胞成像，显示了活菌细胞中囊泡的生成及货物蛋白的插入。（A,B）使用宽场荧光显微镜成像，而（C）采用结构光照明显微镜（SIM）获取。比例尺：（A,B）= 10 µm；（C）= 1 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65442/65442fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本实验方案详细描述了一种用于在胞外膜结合囊泡内生产重组蛋白（包括通常不溶性蛋白或含二硫键蛋白）的细菌表达方法。该方法有望应用于应用生物技术、医学等多个广泛的科学研究领域。

优化生产与分析重组蛋白填充囊泡的方法 E. coli

这种创新系统利用短肽标签，可将多种重组蛋白以膜结合囊泡的形式从大肠杆菌中分泌出来，提供了一种……

我们正致力于理解活细胞内分子之间的动态相互作用。在进行生物化学分析时，可能需要使用大量重组蛋白。这些蛋白往往极难表达成正确折叠且具有功能的形式。如果某种蛋白质在细菌中表达时被发现发生错误折叠或不溶，研究人员将不得不转而采用哺乳动物细胞进行表达，但这种方法成本高昂且相对耗时，或者使用合成多肽。我们的方案能够实现高产量表达，并可将难以表达的蛋白质从大肠杆菌中有效导出。在目标蛋白的氨基末端添加一段短的可切割肽序列，不仅能够提高迄今为止我们测试过的所有蛋白质的表达量和产量，还能将蛋白质从细胞内转运至培养基中。除了简化蛋白质表达外，还简化了后续的蛋白质纯化步骤。在将囊泡成核肽（vesicle nucleating peptide, VNP）序列标签克隆至融合蛋白的氨基末端后，从新鲜的细菌转化子中接种5毫升溶菌肉汤（lysogeny broth, LB）培养基，在37摄氏度下培养至饱和。随后用此菌液接种含有适当抗生素筛选剂的25毫升超丰富肉汤（terrific broth, TB），置于500毫升锥形瓶中，在37摄氏度的摇床中以每分钟200转或不低于25毫米轨道直径的振荡速度进行培养，直至菌液在600纳米处的光密度值（OD600）达到0.8至1.0。然后，通过加入IPTG至终浓度最高为20微克/毫升（即84微摩尔），诱导T7启动子驱动的重组蛋白表达。诱导反应进行足够时间后，在4摄氏度、3000 × g条件下离心20分钟，收集菌体沉淀。将上清液通过无菌且不含去污剂的0.45微米PES滤膜过滤，以对含有囊泡的培养基进行除菌，便于长期保存。为了将囊泡浓缩至更小体积，将含有囊泡的无菌培养基通过无菌且无去污剂的0.1微米MCE滤膜。然后，用0.5至1毫升无菌磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻洗涤滤膜，并使用细胞刮刀或塑料涂布器小心地将囊泡从膜上剥离。使用移液器将囊泡浓缩液转移至新的微量离心管中。纯化的囊泡可在4摄氏度下保存。在无菌培养基中，采用适当的程序对含有蛋白质的囊泡进行超声处理，以破坏囊泡脂质膜并释放蛋白质。将超声处理后的悬液在39,000 × g、4摄氏度条件下离心20分钟，以去除囊泡碎片。含有VNP 6 mNeonGreen表达载体的BL21 DE3 大肠杆菌经IPTG过夜诱导后，显示出mNeonGreen荧光。在通过离心去除细菌细胞后，培养物中仍可见荧光。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳证实了澄清的培养基中存在携带 mNeonGreen 的 VNP。用 PBS 重悬的纯化囊泡也显示出荧光。为了染色囊泡膜，将荧光脂质染料 FM4-64 以终浓度 2 微摩尔加入纯化的囊泡中，孵育 10 分钟后进行成像。从大肠杆菌（Escherichia coli）培养物中分离出装载蛋白质的囊泡后，用移液器将纯化的囊泡滴加到厚度小于 1 毫米的圆形 2% LB 琼脂糖凝胶垫上，该凝胶垫已预先在洁净的玻璃载片上形成并固化。待液体干燥后，将一块 50 毫米 × 25 毫米的盖玻片覆盖在凝胶垫上的囊泡区域。用垫片和胶带固定盖玻片。然后将载玻片置于倒置显微镜上，使用油浸物镜观察，并让样品静置 2 至 3 分钟，使其沉降并达到温度平衡。对于单帧图像，采用三次图像平均法以减少由硬件引起的随机背景噪声。进行延时成像时，每帧图像之间间隔 3 至 5 分钟。宽场荧光显微镜成像显示，羊膜来源的绿色物质存在于囊泡中。脂溶性荧光染料 FM4-64 证实了囊泡膜的存在。表达内膜蛋白CydB与mNeonGreen融合以及VNp6-mCherry2的活细菌细胞的结构照明显微镜成像显示了囊泡的产生和货物的插入。

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科研

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生物学

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来源：Streather, B. R., et al. 大肠杆菌来源的重组蛋白填充囊泡的优化制备与分析。J. Vis. Exp.

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本方案描述了一种利用小麦无细胞系统和脂质体，通过双层透析法高效制备高质量蛋白脂质体的无细胞方法。该方法为膜蛋白的功能分析、药物靶点筛选以及抗体开发提供了适宜的技术手段。...

无细胞合成蛋白脂质体用于膜蛋白的功能分析及抗体开发

了解利用大肠杆菌膜结合囊泡优化生产重组蛋白的方法。该技术可提高难表达蛋白的产量并简化下游纯化流程，适用于生物技术及医学研究。

优化生产与分析重组蛋白填充囊泡的方法 E. coli

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