Name: 基于脱细胞的骨骼肌脂肪浸润定量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-09T13:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: 了解基于脱细胞技术的骨骼肌脂肪浸润定量方法，用于研究小鼠模型中肌肉与脂肪组织的相互作用。该技术通过Oil Red O染色和光谱分析实现精准可视化与定量，为肌肉生物学研究提供全面工具。

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本工作由R01AR075773基金资助给GAM。

小鼠的饲养和处死均依照美国国立卫生研究院《实验动物饲养和使用指南》进行。所有实验操作均经圣路易斯华盛顿大学医学院动物研究委员会批准。本方案中所包含的示例图像均使用2-3个月大的雄性C57BL/6J小鼠（见材料表）制备。以下所述所有步骤均在室温下进行。
1. 肌肉脱细胞
<ol>
	<li>在磷酸盐缓冲液（PBS）中配制1% w/v的十二烷基硫酸钠（SDS；参见材料表）溶液。搅拌至完全溶解。 
	注：1% SDS可批量配制，在室温下可保存1个月。</li>
	<li>按照先前描述的方法解剖目标肌肉38,39。
	<ol>
		<li>用70%乙醇溶液润湿毛发和皮肤，暴露目标肌肉，然后进行约2 cm的经皮切口，再用镊子和弹簧剪除去覆盖的皮肤。 
		注：此处的目标肌肉包括胫骨前肌（TA）、趾长伸肌（EDL）和膈肌。某些肌肉可能深藏于其他肌肉组织中，需先解剖其他肌肉（例如，解剖EDL需先去除TA）。</li>
		<li>使用锋利的剪刀或刀片（参见材料表）解剖目标肌肉，确保获取肌肉的完整范围，且边缘平滑。 
		注：建议在解剖显微镜下操作，以提高可视性。</li>
		<li>检查肌肉，确保无骨碎片或不规则边缘，必要时用锋利剪刀修剪去除。</li>
		<li>使用分析天平称量肌肉，并记录重量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将解剖好的肌肉置于每毫克组织至少0.1 mL的1% SDS溶液中；对于小鼠膈肌、TA和EDL肌肉，分别使用6孔、12孔或24孔板较为合适。典型体积分别为6 mL、3 mL和1.5 mL。 
	注：SDS溶液有时会导致肌肉变形，因此在初始浸入时应确保肌肉平展。</li>
	<li>将培养板（或其他容器）置于设定为50–80 Hz的摇床上。</li>
	<li>定期肉眼观察SDS溶液。当溶液变浑浊时，用移液器吸除溶液（注意不要吸走肌肉），并替换为等体积的新鲜1% SDS溶液。当溶液在24小时内保持澄清时，表明脱细胞已完成。 
	注：溶液更换频率因肌肉大小和初始溶液体积而异。较大的肌肉（如TA）可能在数小时内就需要更换新SDS，而较小的肌肉（如EDL）可在原溶液中过夜。</li>
	<li>用移液器小心吸除脱细胞后肌肉中的最终SDS溶液（注意不要吸走肌肉），并替换为等体积的PBS。</li>
	<li>在解剖显微镜下肉眼检查脱细胞后的肌肉，使用镊子和剪刀去除附着在肌肉上的毛发或碎屑。 
	注：同时注意观察此步骤中脱细胞肌肉的透明度。若脱细胞后的肌肉未完全透明，且SDS溶液在24小时内未出现浑浊增加，则表明脱细胞效率不足。这将在定性和定量评估中产生假象，因此在正式实验前，务必先在练习样本上优化脱细胞条件。</li>
	<li>小心吸除PBS，替换为等体积的3.7%甲醛或4%多聚甲醛溶液，并将培养板放回摇床继续处理24小时。 
	&#8203;注：确保甲醛溶液完全覆盖脱细胞后的肌肉，否则会导致染色不均。</li>
</ol>
2. 使用油红O对IMAT进行可视化
<ol>
	<li>配制 ORO 溶液。
	<ol>
		<li>将 0.5 g ORO 粉末（见材料表）溶于 100 mL 异丙醇中，配制储备液。 
		注意：可轻微加热溶液以使其完全溶解。该储备液可在室温下保存 1 个月。</li>
		<li>将 ORO 储备液与去离子水按 60:40 的比例混合，得到适用于所有肌肉组织的工作液，使用量至少为每毫克肌肉重量 0.1 mL。通常情况下，6 孔板、12 孔板和 24 孔板所需体积分别为 6 mL、3 mL 和 1.5 mL。 
		注意：混合前应检查储备液状态。若储备液中含有大量颗粒物，则需重新配制新鲜储备液。</li>
		<li>静置工作液 10 分钟，使颗粒物充分沉降。</li>
		<li>先用 40 µm 滤网过滤工作液，再用 0.22 µm 注射式滤器过滤。 
		注意：0.22 µm 注射式滤器容易迅速堵塞，若工作液难以通过，需及时更换滤器。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>移除甲醛或多聚甲醛溶液，并用等体积的 PBS 溶液洗涤脱细胞肌肉组织，共更换三次溶液。</li>
	<li>用等体积的 60% 异丙醇溶液替换 PBS，置于摇床中孵育 5 分钟。</li>
	<li>用 ORO 工作液替换 60% 异丙醇溶液，置于摇床中孵育 10 分钟。 
	注意：确保 ORO 工作液完全覆盖脱细胞肌肉组织，否则染色将不均匀。</li>
	<li>用等体积的 1% SDS 溶液替换 ORO 工作液。定期目视检查 SDS 溶液，当溶液明显变为粉红色时，用移液器吸除溶液（注意避免吸走肌肉组织），并更换为新鲜的 1% SDS 溶液。</li>
	<li>当溶液在连续 24 小时内保持澄清时，将 1% SDS 溶液替换为 PBS，并在体视/立体显微镜下以 4 倍放大倍数观察染色后的肌肉组织。清除附着在肌肉组织外表面的明显碎屑或颗粒物。若碎屑较多，可将脱细胞肌肉组织在洁净纸巾上轻轻滚动，以去除碎屑或颗粒物。</li>
	<li>若染色效果满意（明亮的红色球状结构悬浮于透明基质中），可根据需要使用连接至体视显微镜的相机获取染色图像（见材料表）。 
	&#8203;注意：若体视显微镜未配备相机，可使用手机摄像头通过目镜拍摄照片。</li>
</ol>
3. 使用 BODIPY 可视化 IMAT 脂滴
注意：共聚焦成像最适合用于如趾长伸肌或膈肌等较薄的肌肉（厚度约 2 mm）。或者，也可使用厚度相近的肌肉条带，例如胫骨前肌。
<ol>
	<li>用 PBS 配制荧光染料 BODIPY 493/503（参见材料表）的 1:200 溶液，工作液体积至少为每毫克肌肉重量 0.1 mL。对于 6 孔、12 孔和 24 孔板，典型体积分别为 6 mL、3 mL 和 1.5 mL。</li>
	<li>去除甲醛、多聚甲醛或 1% SDS，用与样品等体积的 PBS 换液三次，洗涤脱细胞肌肉。</li>
	<li>将 PBS 替换为 BODIPY 工作液，在摇床上孵育 20 分钟。</li>
	<li>用与样品等体积的 PBS 换液三次，洗涤脱细胞肌肉。</li>
	<li>将肌肉置于适合共聚焦显微镜成像的透明底容器中。理想情况下，培养皿应具有凹陷底部，以便在肌肉上方放置盖玻片而不使其变形（参见材料表）。</li>
	<li>使用标准共聚焦显微镜（参见材料表）和 488 激光器获取图像堆栈。对于 EDL 肌肉，典型的堆栈厚度为 0.5–1 mm，切片厚度为 10 µm，每堆栈可获得 50–100 张图像。 
	注意：为定量总脂质体积、IMAT 脂滴总数以及聚类的最近邻指数，需对整个肌肉体积进行成像，并注意保留部分图像重叠以用于图像配准。若仅需定量平均脂滴体积，单个堆栈图像可能已足够。</li>
	<li>如需要，可按照第 2 节方法用 ORO 对肌肉染色，以获得 IMAT 分布的互补性全肌肉图像。 
	&#8203;注意：由于 BODIPY 具有荧光特性，在获取 ORO 的明场图像时无法观察到 BODIPY 信号。</li>
</ol>
4. 通过脂质提取法估算总脂质体积
<ol>
	<li>图像采集完成后，将肌肉转移至96孔板的各个孔中，每孔加入200 µL异丙醇；若肌肉过大无法放入孔中，可调整孔板规格或增加体积。</li>
	<li>通过轻敲孔板、用移液器反复吹打溶液和/或使用移液器吸头机械性压碎肌肉，使溶液震荡，直至在显微镜下观察脱细胞肌肉中无红色/荧光小球残留。 
	注意：为保证最佳可重复性，所有肌肉应采用相同的轻敲、吹打和压碎组合方式进行处理。同时需注意控制轻敲、吹打和压碎操作的时间，避免异丙醇快速挥发。</li>
	<li>通过移液器反复吹打混匀各孔中的溶液，然后将75 µL转移至孔板中的两个洁净孔中。</li>
	<li>盖上孔板，使用分光光度计或酶标仪检测两个重复孔中75 µL溶液的吸光度。若样品经油红O（ORO）染色，则在500 nm波长下读数；若样品经BODIPY 493/503染色，则在493 nm波长下读数。 
	注意：若样品同时使用BODIPY和ORO染色，建议在500 nm波长下读数，因为500 nm读数在仅用ORO染色和ORO联合BODIPY染色的样品间结果相近。</li>
	<li>如需校正样品间大小差异，可将吸光度读数除以记录的肌肉重量。</li>
</ol>
5. 从共聚焦图像中量化肌内脂肪组织（IMAT）脂滴参数
注意：本节需要访问 ImageJ 1.47 版（参见材料表）或更高版本，并具备基本的 ImageJ 操作技能40。
<ol>
	<li>在 ImageJ 中打开共聚焦图像序列。 
	注意：不同的共聚焦显微镜可能以不同格式保存图像。ImageJ 可能需要额外的插件或变体（例如 Fiji）才能打开这些图像序列41。所使用的算法属于 ImageJ 软件包的一部分。</li>
	<li>在 ImageJ 中运行阈值化算法以识别 BODIPY 阳性像素。此操作将当前图像转换为二值图像。
	<ol>
		<li>通过选择 图像 &#62; 调整 &#62; 阈值 打开阈值用户界面。在界面中选择 Intermodes 作为阈值化类型，并确保选中 暗背景。无需选择其他选项，然后点击 应用。</li>
		<li>将弹出一个对话框，用于将图像序列转换为二值图像。请确保选择以下选项：方法：Intermodes；背景：暗。计算每张图像的阈值以及二值掩膜的黑色背景。这将生成一个二值图像序列，其中白色表示 BODIPY 阳性像素，黑色表示 BODIPY 阴性像素。 
		注意：Intermodes 阈值化算法可能并不适合所有用户。通过主观检查 ImageJ 内置的阈值化选项，有助于选择最佳算法以区分 BODIPY 阳性和阴性像素。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 ImageJ 中运行分水岭算法以分离相互接触的脂滴。选择 处理 &#62; 二值 &#62; 分水岭。将弹出一个对话框，询问是否处理序列中的所有图像。选择 是。此操作将在大片连续白色区域之间添加细黑线以进行分割。</li>
	<li>使用 ImageJ 中的“分析粒子”算法识别感兴趣区域（ROI）。
	<ol>
		<li>选择 分析 &#62; 分析粒子。将弹出一个对话框用于设置选择参数。 
		注意：选择合适的尺寸范围对于准确估计脂滴 ROI 至关重要。下限用于排除可能过小而不属于 IMAT 来源脂滴的区域（背景伪影），上限用于排除可能过大而不属于单个 IMAT 来源脂滴的区域（未被分水岭算法成功分离的接触脂滴）。</li>
		<li>为设定这些值，打开原始图像，并使用椭圆工具圈出视野中最小和最大的脂滴。然后，通过按下 &#34;t&#34; 将这些形状添加到 ROI 管理器中。选择 分析，然后选择 设置测量值。将弹出一个对话框用于选择设置。
		<ol>
			<li>仅勾选 面积 并点击 确定。然后，在 ROI 管理器中选择 测量。使用结果窗口中的两个面积测量值作为“分析粒子”中的尺寸范围。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>确保勾选 添加至管理器。无需选择其他选项。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过在 ROI 管理器中勾选 显示全部，将 ROI 叠加到共聚焦图像序列上。使用滑动条逐层检查每个切片，并使用椭圆工具（位于 ImageJ 工具栏中）手动添加遗漏的区域。</li>
	<li>输出 ROI 的测量结果。选择 分析 &#62; 设置测量值，并选择 面积、质心、拟合椭圆 和 堆栈位置。点击 确定。然后，在 ROI 管理器中选择 测量。结果表中的数据可被选中并复制到 Matlab 或 Excel 中进行进一步分析。</li>
	<li>使用 Refine.m Matlab 代码37 或类似算法，将每个堆栈中的 ROI 精炼为单一 ROI。 
	注意：此步骤是必要的，因为步骤 5.2–5.4 会将相邻切片中同一脂滴识别为多个不同的 ROI。然而，也可完全手动识别 ROI，或在 ImageJ 中手动删除重复的 ROI，从而避免使用 Matlab。</li>
	<li>使用 Matlab 或 Excel 获取 ROI 的汇总统计信息。
	<ol>
		<li>将 ROI 的总数估计为脂滴的总数量。</li>
		<li>将每个二维 ROI 拟合椭圆的体积估计为脂滴体积，假设该形状的深度为椭圆长轴与短轴的平均值。</li>
		<li>将各个脂滴体积的总和估计为总脂质体积。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration via Decellularization

作者无任何利益冲突需披露。

本论文描述了在小型动物模型中定性可视化和定量分析骨骼肌脂肪浸润的方法，可用于进一步理解肌内脂肪组织（IMAT）形成及病理性扩张的发病机制。通过全肌肉去细胞化结合脂溶性染色技术，可实现一种经济、可重复且操作简便的方法，全面评估整块肌肉中IMAT的存在情况。
本方案的原理在于，使用SDS对肌肉进行脱细胞处理可去除肌纤维的细胞成分，包括肌内甘油三酯（IMCL）中的小脂滴，但保留肌内脂肪细胞中的大脂滴。SDS已在组织工程中被广泛用于基质脱细胞42。对于脂肪组织和骨骼肌等组织，通常需要额外的机械解离和/或醇类提取步骤以去除脂肪细胞中残留的脂质42,43。我们先前的研究表明，其原因是SDS脱细胞可清除IMCL，但保留脂肪细胞中的大脂滴37。通过四氧化锇染色后对完整肌肉在脱细胞前后进行显微CT（µCT）成像，证实IMAT的空间分布模式在脱细胞过程中未受破坏。此外，在IMAT含量可忽略的脱细胞肌肉中，肌内甘油三酯的定量结果约为完整肌肉的5%，进一步验证了IMCL已被有效去除。因此，该方法可在半透明的肌肉基质中保留IMAT脂滴原有的解剖分布。
充分的脱细胞处理是本方案中最关键的步骤。如果脱细胞不完全，将难以观察到肌间脂肪组织（IMAT）中的脂滴，且残留的肌内脂质（IMCL）会导致油红O（ORO）或BODIPY染色出现较高的背景信号（图2）。初学者常见的错误包括：每块肌肉所用的十二烷基硫酸钠（SDS）溶液覆盖不充分（即每个孔中的肌肉未被完全浸没于SDS溶液中）、脱细胞过程中未使用摇床进行振荡混匀，以及溶液更换频率不足。本文已推荐每单位肌肉质量所需的SDS用量，但使用者仍需确保每块肌肉均被溶液完全覆盖，因为每块肌肉具有独特的几何形状。建议使用者频繁更换溶液（每天最多两次），以确保脱细胞彻底。高质量的IMAT脂滴染色可在SDS处理长达4天后实现。要获得高质量的油红O染色结果，充分的固定以及油红O溶液的正确配制也至关重要。与上述SDS处理类似，每份肌肉样本均需被3.7%甲醛溶液充分覆盖。若肌肉过早从固定液中取出，脂滴的油红O染色将非常微弱。通常1–2小时的固定时间已足够，但建议过夜固定，以确保固定液充分渗透至肌肉中心，完全固定所有脂滴。油红O染色的另一挑战在于，当酒精浓度降低至60%时，溶液中开始出现颗粒状沉淀。这些颗粒可能沉降在肌肉表面，并附着于肌肉边缘。避免该问题的最佳方法是每次染色时均配制新鲜的工作液，并使用40目µm滤膜和0.22 µm滤膜进行过滤。此外，在染色过程中保持摇床振荡，并将染色时间控制在10分钟以内，有助于防止形成的颗粒沉降。若问题仍然存在，重新配制油红O储备液可能有所帮助。若仍有部分人工假象附着在脱细胞后的肌肉表面，可使用体视显微镜、镊子和手术剪将其去除。若未能清除这些假象，将影响肌肉成像质量，并在后续进行光密度（OD）读数前的脂质提取步骤中导致IMAT含量被高估。
总体而言，该技术操作简便，相较于用于可视化和定量骨骼肌脂肪浸润的金标准方法具有多项优势。在人类中广泛应用且有时用于动物模型的无创技术（如CT、MRI和超声）空间分辨率有限，无法区分脂滴与肌纤维。因此，信号强度介于中间的像素或体素被判定为“肌肉”或“脂肪”，而实际上很可能是肌纤维与脂肪细胞的混合物。更常见的方法是通过组织学评估动物肌肉中的脂肪浸润，最常用的是对肌肉冷冻切片进行油红O（ORO）染色。然而，这种方法通常仅在单个代表性切片上进行，且由于脂质在切片中的散在分布，难以实现准确定量。相比之下，对整块去细胞化肌肉进行油红O染色可全面评估肌内脂肪组织（IMAT），其成本和工作量与完整形态学分析相当。此外，除了增强可视化效果外，对去细胞化组织进行油红O染色还可通过脂质提取实现脂肪浸润的定量分析。若需进一步深入分析脂肪浸润的特征，可结合使用荧光染料BODIPY与共聚焦显微镜。该方法能够重建单个IMAT脂滴，从而描绘出三维分布图景，而传统组织学方法除非对整段肌肉的连续切片进行分析，否则无法实现此目标。尽管共聚焦显微镜并非标准实验室设备，但在大学或工业环境中，其可及性通常高于小动物MRI或CT设备。此外，该流程的大部分步骤可实现自动化，从而显著缩短时间成本，优于连续组织切片分析。使用BODIPY染色时需特别优化共聚焦显微镜的设置，不同显微镜的参数设置各不相同。其中关键参数为激光强度，必须足够高以检测肌肉远端表面的脂滴，同时避免近端脂滴信号过饱和。因此，建议将BODIPY染色结合共聚焦显微镜主要用于较薄的肌肉，如趾长伸肌（EDL）或膈肌。
该方法存在若干局限性，需加以讨论。首先，尽管预计该技术不仅适用于本文所述的小鼠损伤模型（如 cardiotoxin 和甘油模型），还具有更广泛的应用前景，但新应用（例如 mdx 模型）可能需要进行优化，因为肌肉的大小和组成（如纤维化程度）可能影响脱细胞效果，需要提高 SDS 浓度或延长孵育时间。其他伴有肌肉质量改变的疾病模型，也需要同时分析绝对值和归一化（相对于肌肉质量）的脂肪浸润指标，以确定脂质的绝对含量或相对于肌肉体积的脂质百分比，从而提供更有意义的结果度量。此外，预计该技术可广泛应用于更大的动物模型和人类活检样本，但每种新应用可能都需要相应的优化。第二，在本策略中，整块肌肉必须专用于该检测，无法再用于评估其他病理特征。对于旨在评估肌内脂肪组织（IMAT）纵向变化的研究，非侵入性成像技术更为适用；而对于主要研究目的需要将肌肉用于其他用途（如组织学、定量聚合酶链式反应、Western 印迹）的研究，则更适合采用组织学评估，因为剩余的冷冻肌肉组织仍可用于其他检测。然而，该检测非常适合与 in vivo 功能测试（如跑步机跑步）或 ex vivo 收缩功能测试联合使用，因为这些测量可在脱细胞化之前完成44。第三，尽管使用 BODIPY 染色结合共聚焦显微镜能够实现脂滴的高分辨率可视化和定量，但由于细胞膜已被去除且内源性脂肪细胞蛋白丢失，该方法无法明确将脂滴识别为单个脂肪细胞。多房脂肪细胞（代表未成熟脂肪细胞或“棕色/米色”表型）可能被识别为多个脂滴。最后，该方案在先前已冷冻的肌肉组织上效果不佳。这些局限性在人类活检样本中可能尤为显著，因为尽管整个活检样本均可进行脱细胞处理，但其内部 IMAT 的空间分布未必比组织学切片更能代表整块肌肉的情况。然而，由于该技术对未冷冻活检样本的处理条件（如在 PBS 中冰上放置数小时）相对不敏感，因此可在后续将活检样本分割用于多种检测，包括部分用于脱细胞化处理，从而更清晰地分辨单个脂滴。
综上所述，通过染色和成像脱细胞支架中保留的脂质，已开发出一种用于骨骼肌脂肪浸润定性与定量分析的新方法。该方法相较于金标准技术具有优势，能够实现对肌肉内三维脂肪浸润的全面成像，并利用油红O染色进行快速、低成本的定量分析。对于更精细的测量，第二种脂溶性BODIPY染色可借助共聚焦显微镜对脂滴的数量、体积及分布模式提供更为详细的量化信息。上述两种方法相结合，使研究人员能够在单个脂滴水平上精确测量骨骼肌脂肪浸润，而无需取样或依赖昂贵的无创成像技术。

在骨骼肌肌纤维之间脂肪细胞的积聚是多种不同疾病的显著特征，从2型糖尿病、肌肉减少症到肌肉骨骼损伤均可见此现象1,2,3,4,5,6,7。对这种肌内脂肪组织（IMAT）进行全面评估，对于理解这些疾病的发病机制至关重要，因为IMAT的沉积与胰岛素抵抗3,8,9,10以及骨骼肌功能下降11,12,13,14,15密切相关。尽管这些关联已被认识数十年，但与IMAT相关的机制及其来源仍是当前深入研究的领域。部分原因在于，大多数评估骨骼肌脂肪浸润的研究是在人类中进行的，而人类的机制性研究存在局限性16,17。然而，近年来，包括小鼠在内的小型动物模型已被用于帮助明确IMAT发育和信号传导的细胞调控机制18,19,20。本研究旨在提供一种适用于小型动物模型的新工具，用于定性观察和定量分析骨骼肌脂肪浸润。
在临床的人群研究中，脂肪浸润通过包括计算机断层扫描（CT）在内的非侵入性方法进行评估6,21，磁共振成像（MRI）16,17,22,23和超声（US）17,24这些成像技术通常在肌肉中确定一个特定的兴趣区域（ROI），并在该区域内获取图像切片，尽管也有采用全面性方法的情况。25,26,27这些图像切片需进行定性分级6 并进行定量 通过 像素阈值分割28类似的方法此前已在动物中得到应用29,30；然而，这些方法成本较高，且需要使用小动物成像系统。空间分辨率 通过 CT和MRI的使用也存在重大问题，因为它们无法在一个体素内区分IMAT脂肪细胞与骨骼肌纤维，而是依赖于对主要为肌肉区域和主要为IMAT区域的主观划分31,32因此，无法准确识别脂肪或肌肉组织也会导致这些组织代表性含量的量化不准确。
由于这些局限性，目前在小型动物模型中评估骨骼肌脂肪浸润的常用技术主要依赖组织学方法，因其成本低廉且易于获取33,34。常规染色方法，包括苏木精和伊红（H&amp;#38;E）、油红O（ORO）以及针对脂滴包被蛋白（perilipin）等脂肪细胞标志物的免疫染色，可实现对肌肉内脂肪浸润所含脂肪细胞的简便检测与可视化。然而，组织学方法通常并不全面，对肌内脂肪组织（IMAT）的定性或定量评估往往局限于单个切片34。此外，脂质提取法也被用于定量总肌肉脂质含量35；但该技术无法区分肌内脂滴（IMCL）与肌内脂肪组织（IMAT）的储存36。综上所述，当前用于可视化和定量肌肉脂肪的方法仍存在局限，或受限于经济成本，或难以特异性检测IMAT。
本文介绍了一种通过定性可视化和多尺度定量方法评估骨骼肌脂肪浸润的详细技术。该方法采用一种简单的去细胞化技术，可去除包括肌内脂滴（IMCL）在内的肌细胞结构，同时完整保留较大的由肌内脂肪组织（IMAT）来源的脂滴。该技术特异性的验证已在先前研究中发表37，包括使用脂质提取法证明去细胞化后IMCL被清除，采用显微CT（µCT）显示去细胞化后IMAT分布模式得以保留，以及通过组织学方法显示去细胞化所识别的IMAT脂滴大小分布与传统方法结果相似。去细胞化处理后，肌肉可使用脂溶性染料进行染色，以实现脂肪浸润模式和程度的定性可视化，或对单个IMAT脂滴进行定量成像。随后可用异丙醇提取染料，测定所得溶液的光密度（OD），以估算IMAT脂质体积。该技术的严格验证已在其他文献中发表37。本文提供了将该方法应用于小鼠肌肉的详细实验方案，并给出了故障排除建议，以支持该技术在其他应用场景中的推广，例如其他物种的肌肉或其他组织。

<table><tbody><tr><td>0.22 &amp;micro;m 注射器滤器</td><td>Fisher Scientific</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 鲁尔锁注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>14823434</td><td></td></tr><tr><td>12 mm 盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12545F</td><td></td></tr><tr><td>12 孔板</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-29</td><td></td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1H</td><td></td></tr><tr><td>2-丙醇（异丙醇）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9516</td><td>0.5 mg/mL 储存液可在室温下保存1个月。&amp;nbsp; 工作液必须现配现用。</td></tr><tr><td>37% 甲醛溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>8187081000</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m 网格滤器</td><td>Fisher Scientific</td><td>87711</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-2C</td><td></td></tr><tr><td>BODIPY 493/503</td><td>Fisher Scientific</td><td>D-3922</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J 小鼠</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦成像皿</td><td>VWR</td><td>734-2905</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td>TCS SPEII</td><td></td></tr><tr><td>解剖/体视显微镜</td><td>Zeiss</td><td>4107009123001000</td><td></td></tr><tr><td>解剖剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>033361.K2</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>油红O粉末</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>Bio-tek</td><td>Synergy II&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>摇床/振荡器</td><td>Reliable Scientific</td><td>55D</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td>1% 溶液可在室温下保存1个月</td></tr><tr><td>移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>137119D</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 弹簧剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr></tbody></table>

基于脱细胞技术的骨骼肌脂肪浸润定量分析

Decellularization-Based Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration

脂肪浸润是指脂肪细胞在骨骼肌肌纤维之间积聚，是多种肌病、代谢紊乱和肌营养不良症的显著特征。在临床人群中，通常采用无创方法评估脂肪浸润，包括计算机断层扫描（CT）、磁共振成像（MRI）和超声（US）。尽管一些研究已使用CT或MRI来定量小鼠肌肉中的脂肪浸润，但成本较高且空间分辨率不足仍是挑战。其他小型动物研究方法利用组织学技术来观察单个脂肪细胞；然而，这种方法在异质性病理情况下容易产生取样偏差。本实验方案描述了一种通过去细胞化技术，对完整小鼠肌肉以及单个脂肪细胞水平上的脂肪浸润进行全面定性观察和定量测量的方法。该方案不限于特定肌肉或物种，亦可扩展应用于人类肌肉活检。此外，仅需使用常规实验室设备即可进行宏观的定性和定量评估，成本低廉，使该方法更易于在各类科研实验室中推广使用。

骨骼肌脂肪浸润的定性可视化 
经过适当脱细胞处理的肌肉呈白色且半透明（第1节；图1）。当使用油红O（ORO）染色脱细胞肌肉以显示肌内脂肪组织（IMAT）时（第2节），可在清晰的肌肉结构内观察到呈红色球形的IMAT脂滴（图1）。健康小鼠后肢肌肉中天然存在的IMAT极少，表现为几乎没有红色的ORO阳性脂质（图1A）。相比之下，在脱细胞处理前14天注射了心脏毒素（CTX；图1B）或甘油（GLY；图1C）的小鼠后肢肌肉中，IMAT积累明显增加，且CTX诱导的IMAT浓度高于GLY，与先前报道一致37。
脱细胞不完全的情况可在初次SDS处理后或油红O（ORO）染色洗脱后立即观察到，表现为半透明的浅粉色纤维（图2B 与 图2A 相比）。ORO清除不完全则在洗脱后表现为均匀的粉红色或红色背景，而非清晰的纤维条纹（图2C）。图2A、B 中还可见肌外脂肪组织（星号标注），即位于脱细胞肌肉外的一团脂滴。图2C 还展示了若在脱细胞过程中未将肌肉充分铺展而可能发生的肌肉折叠现象。脱细胞不完全、ORO清除不完全以及残留的肌外脂肪组织均会人为地增加提取脂质的光密度（OD）值，但只要识别出这些为人工假象，则不一定影响对脂肪浸润的定性评估。
骨骼肌脂肪浸润的定量成像 
BODIPY 荧光标记的脂滴可进行成像 通过 共聚焦显微镜以更详细地评估单个脂滴的参数及其分布（图3）。此过程为半自动化，如前所述，包括Matlab代码37良好的BODIPY染色结果在平面成像时呈现明亮的椭圆形结构，且与邻近结构界限清晰图3A）。阈值分割与形态分割可为每个脂滴生成感兴趣区域（ROI）提供良好的初步结果图3B），但需要进行手动编辑以纠正错误。最常见的错误是位于组织深层的脂滴，因此在任何切片中均不明显发亮图3B；粉色双箭头）。可通过在 ImageJ 中使用椭圆工具手动添加 ROI 来纠正。图 3C）。第二个是将一组脂滴识别为单个 ROI（感兴趣区域）图3B；红色星号）。可通过删除原始 ROI 并用多个新 ROI 替代来校正此问题（图3D）。最后，在多个切片中识别出的单个脂滴应被确定为唯一的感兴趣区域（ROI），因此必须将重复的ROI合并为一个单一的ROI（图3E；蓝色箭头）。此步骤使用数据处理工具（如Matlab）最为简便，但也可通过手动识别最大ROI并删除其余部分来完成。C57BL6/J和129Sv小鼠各指标的平均值可参见Biltz等人的研究。37.
<img alt="组织学分析、肌肉组织、处理组、显微镜图像、红色染色比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65461/65461fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：脱细胞肌肉组织油红O（ORO）染色示例。 在注射生理盐水（SAL）、心脏毒素（CTX）或甘油（GLY）后14天进行ORO染色的肌肉组织。小鼠趾长伸肌（EDL）和胫骨前肌（TA）在SAL处理下几乎无肌内脂肪组织（IMAT，红色球状物）（A），而在CTX（B）和GLY（C）处理后出现IMAT积聚。完全脱细胞及ORO洗脱表现为透明白色肌肉背景中清晰可见的ORO阳性脂滴。比例尺 = 500 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65461/65461fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="组织脱细胞和ORO清除的组织学分析，显微镜图像比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65461/65461fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：ORO染色结果不佳的示例。 脱细胞不完全或ORO清除不完全会导致半透明的粉红色/红色背景。与完全脱细胞的小鼠膈肌呈现的透明白色背景相比（A），脱细胞不完全表现为浅粉红色/红色的纤维痕迹（B），而ORO清除不完全则表现为弥散的粉红色/红色背景（C）。比例尺：上排图板 = 1 mm；下排图板 = 500 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65461/65461fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示细胞切片的荧光显微镜示意图，比例尺为100μm，用于结构分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65461/65461fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：通过荧光BODIPY染色和共聚焦显微镜识别单个脂滴的示例 在脱细胞肌肉中，可通过共聚焦显微镜识别并定量单个BODIPY染色的脂滴。共聚焦图像堆栈中的各个切片将平面内的脂滴显示为明亮的绿色椭圆，而平面外的脂滴则呈现为较暗淡的形状（A；蓝色箭头）。结合阈值分割、分水岭对象分割和感兴趣区域（ROI）识别，可绘制出BODIPY染色的ROI（B）。阈值分割可能遗漏部分较暗淡的脂滴（B；粉色双箭头），需手动识别补充（C）。分水岭分割可能将多个脂滴合并为一个区域（B；红色星号），需删除该ROI并手动重新估算（D）。同一脂滴可能在多个切片中被识别，需通过图像配准（E）删除重复的ROI。比例尺 = 100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65461/65461fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本研究描述了基于脱细胞的方法，用于通过完整的肌肉体积来可视化和量化肌内脂肪组织（IMAT）的沉积，以及量化构成IMAT的单个脂肪细胞的各项指标。

脂肪浸润是指脂肪细胞在骨骼肌肌纤维间的积聚，是多种肌病、代谢性疾病……的显著特征

我们关注的是收缩肌与在损伤和疾病过程中于肌纤维间形成的脂肪细胞（称为肌内脂肪组织，或IMAT）之间的相互作用。在细胞和小鼠中进行基因工程是深入解析脂肪与肌肉间相互作用机制的有力工具。通过转录组学和蛋白质组学分析信号传导通路可鉴定出介导因子，随后可利用基于生物材料的药物递送系统对这些通路进行干预。其中一个主要挑战是分离和定量 IMAT 脂肪细胞。尤其是在小型动物模型中，通过转录组学或脂质组学等全肌肉分析方法会使 IMAT 信号被淹没。而通过非侵入性成像技术对 IMAT 进行定量也面临类似的信号混杂问题，因为大多数体素包含肌肉和 IMAT 的混合物。我们最近使用本文所述技术证明，肌内脂肪组织（IMAT）会直接损害肌肉收缩功能。通过精确测量IMAT的沉积量，我们发现IMAT不仅会取代收缩性肌肉组织，还会阻碍剩余瘦肌的收缩能力。本方案针对IMAT定量过程中的挑战进行了优化。目前测量小动物IMAT的标准方法是单切片组织学，该方法不具备全面性，而非侵入性成像技术则成本高昂且分辨率较低。我们认为这些局限性阻碍了对IMAT与肌肉之间相互作用的深入理解。本技术提供了一种全面且经济的方法，可通过定性可视化和多尺度定量分析来评估IMAT。我们希望这种技术的简便性能够鼓励更多研究人员在动物模型中测量肌内脂肪组织（IMAT）。此外，该技术将为关注IMAT的研究人员提供一种更高精度的工具，以揭示IMAT脂肪细胞与其他细胞之间更细微的关系。首先，检查从处死的小鼠中分离出的目标肌肉，确保无骨碎片或不规则边缘；如有需要，可用锋利的剪刀将其修剪干净。使用分析天平称量已清洗的肌肉组织，并记录其重量。按照每毫克组织至少加入0.1毫升1% SDS的比例，将肌肉组织置于溶液中，然后将孔板放置在摇床振荡器上，频率设定为50至80赫兹。定期肉眼观察SDS溶液的状态。当溶液变浑浊时，用移液器吸除溶液，注意不要吸走肌肉组织，并加入等体积的新鲜1% SDS溶液。当溶液在24小时内保持澄清时，移除脱细胞肌肉中的最终SDS溶液，并替换为等体积的PBS。在体视显微镜下检查脱细胞肌肉，使用镊子小心去除附着在肌肉上的任何毛发或碎片。小心吸除 PBS，并加入等体积的 3.7% 多聚甲醛，然后将培养板放回摇床上固定 24 小时。通过将 0.5 克 ORO 粉末溶解于 100 毫升异丙醇中配制 ORO 储存液。通过将 ORO 储存液与去离子水按 60:40 的比例混合，为所有肌肉组织配制工作液。将工作液覆盖并静置10分钟，使颗粒物沉淀。先通过40微米滤网过滤，再用0.22微米针头滤器过滤。接着，从培养板中的脱细胞肌肉中移除甲醛溶液，并用等体积的PBS洗涤肌肉三次。然后，用等体积的60%异丙醇溶液替换PBS，并在摇床上孵育5分钟。完成后，在摇床上孵育10分钟之前，将60%异丙醇溶液替换为ORO工作液。接着，用等体积的1%SDS溶液替换ORO工作液，并定期观察SDS溶液的变化。当溶液明显变为粉红色后，将SDS溶液更换为新鲜的1% SDS。当溶液在24小时内保持澄清时，将1% SDS更换为PBS。在体视显微镜下以4倍放大倍数观察，清除附着在染色肌肉外部的任何明显碎屑或颗粒物。如果染色效果满意，可见明亮的红色球状物悬浮于透明基质中，则使用连接在体视显微镜上的相机采集染色图像。充分去细胞化的肌肉呈白色且半透明。当去细胞化肌肉经油红O（ORO）染色以显示肌内脂肪组织（IMAT）时，IMAT脂滴在清晰的肌肉结构内表现为红色球状物。健康小鼠后肢肌肉仅显示少量天然肌内脂肪组织（IMAT），表现为油红O（ORO）阳性脂质极少或无，相比之下，注射了心脏毒素或甘油的后肢肌肉则表现出更明显的脂质沉积。在初始SDS处理后或油红O染色洗脱后，脱细胞不完全的表现为半透明的浅粉色纤维。油红O洗脱后，若出现粉红色或红色的均匀背景，而非清晰分明的肌纤维线条，则提示油红O清除不完全。首先，将经油红O染色的脱细胞骨骼肌转移至96孔板各孔中的200微升异丙醇中。通过轻敲培养板使溶液振荡，并在显微镜下用移液器吸头机械性碾压肌肉组织，直至脱细胞肌肉悬液中不可见红色球状物为止。随后，再次通过反复吹打混匀各孔中的细胞悬液，然后将75微升转移至该板中的两个洁净孔中。用盖子覆盖酶标板，使用分光光度计或酶标仪读取双份75微升孔的吸光度。为开始对染色的IMAT脂滴指标进行定量分析，请在ImageJ中打开共聚焦图像序列。依次选择“图像”、“调整”、“阈值”，以打开阈值用户界面。在用户界面中，选择“Intermodes”作为阈值类型，并确保选中“Dark background”。然后点击“Apply”以运行阈值算法。通过选择“Process”→“Binary”→“Watershed”来运行分水岭算法，以分离相互接触的脂滴。在对话框中选择“是”，以处理堆栈中的所有图像，添加细黑线来分割大面积的纯白色区域。要设置粒子的最大和最小尺寸，请打开原始图像，使用椭圆工具标出视野中最小和最大的脂滴轮廓。然后按 T 键将这些区域添加到 ROI 管理器中，选择“分析”，然后选择“设置测量值”。在对话框中，选择设置，勾选“仅面积”（Area only），然后点击“确定”。接着，从 ROI 管理器中选择“测量”（Measure）。使用此“结果”（Results）窗口中的两个面积测量值作为“分析颗粒”（Analyze Particles）中的尺寸范围。为了通过“分析颗粒”算法识别感兴趣区域（ROIs），请选择“分析”（Analyze），然后选择“分析颗粒”（Analyze Particles）。打开一个对话框以设置选择参数。要输出感兴趣区域（ROI）的测量结果，请选择“分析”（Analyze），然后选择“设置测量值”（Set Measurements），并勾选“面积”（Area）、“质心”（Centroid）、“拟合椭圆”（Fit ellipse）和“堆栈位置”（Stack position）。单击“确定”（OK）。然后，从 ROI 管理器中选择“测量”（Measure）。结果表格中的数据可被选中并复制到 Excel 中以进行进一步分析。为了对单个脂滴的测量指标和分布情况进行详细评估，通过共聚焦显微镜对 BODIPY 荧光标记的脂滴进行成像。阈值分割和形态分割为生成每个脂滴的感兴趣区域（ROI）提供了良好的初步处理方法。然而，需要进行手动编辑以纠正错误。在图像上显示较暗的深层脂滴可通过 ImageJ 中的椭圆工具手动添加。一组被错误识别为单个 ROI 的脂滴，也可通过删除原始 ROI 并用多个新的 ROI 替代来进行校正。当单个脂滴在多个切片中被识别为多个独立的感兴趣区域（ROI）时，这些重复的ROI将被合并为一个单一的ROI。

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