大豆毛状根转化用于基因功能分析

我们的大豆毛状根转化方法足以同时研究多个基因或基因网络的功能，并可在进行长期稳定的转化方法之前确定最优的基因工程策略。大豆毛状根转化是分析大豆植株中基因功能的有效工具。目前使用的技术包括CRISPR-Cas9基因组编辑、RNA干扰、转录组学和蛋白质组学，以及成像技术。

在功能基因组学的现代时代，主要挑战是充分分析大量基因的功能。大多数性状是多基因的，由许多基因的相互作用共同实现。我们的毛状根实验方案将促进基因功能的分析，并具备足够的通量，从而开始解析多基因调控网络。

我们已确定了Ti质粒在根癌农杆菌菌株中的重要性。研究发现，若不进行Ti质粒筛选，其转化的大豆子叶将面临无法产生任何颜色的风险。因此，在转化前进行质粒筛选已成为一个至关重要的步骤。

与其他基因表达技术相比，我们的毛状根表达系统操作简便、耗时短且成本低廉。此外，通过在子叶转化前检测农杆菌中的Ti质粒，我们新建立的实验方案已将毛状根转化率提高至50%。通过对十余个转录因子基因功能的表征，我们近期的研究结果为多基因工程研究奠定了基础，旨在揭示植物中重要植源性化合物和代谢物的生物合成途径。

未来，我们将利用这种毛根转化方法解析调控植物抗毒素生物合成的转录因子基因网络。该方法可用于提高这些特化代谢产物的产量，以满足制药和农业产业的需求。首先，在生物安全柜内，将16至20粒完好的圆形威廉姆斯82号大豆种子放入一个50毫升离心管中。

向试管中加入 30 毫升 70% 异丙醇，振荡 30 秒。倾去酒精。接着，用 30 毫升 10% 次氯酸钠溶液轻轻振荡种子 10 秒，然后将种子在室温下静置于该溶液中 5 分钟。

五分钟后，倒掉次氯酸钠溶液。随后用30毫升无菌超纯水清洗种子三次，每次清洗一分钟，并在每次清洗后弃去清洗液。将灭菌后的种子置于无菌培养皿中的滤纸上，滤纸需用5毫升发芽与共培养培养基浸润。

将培养皿置于室温黑暗环境中三天，随后转移至22摄氏度、配备16小时冷白色T5荧光灯的条件下培养四天，以促进种子萌发。为利用根癌农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）感染大豆子叶，需根据根癌农杆菌pRI2659质粒的Ti质粒基因virD2序列设计引物。转化后，使用PCR试剂盒通过PCR检测农杆菌菌落是否保留virD2基因。

在筛选出含有 virD2 和目的基因的根癌农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）菌落后，将部分菌落划线接种至含有每升100毫克壮观霉素的LB平板上，用于保存目的质粒。次日，使用P200移液器枪头从LB平板上刮取约1.5厘米长的农杆菌菌体，悬浮于1毫升磷酸缓冲液中。将重悬的菌液稀释后，用乙酰丁香酮处理并灭菌至超纯水中。

使用比色皿在600纳米波长下测定吸光度。随后在生物安全柜中，将灭菌的手术刀浸入农杆菌溶液，沿子叶内表面切出深度为1毫米的切口。将6至8片子叶切面朝下放置于含有滤纸的培养皿中，滤纸上需用含乙酰丁香酮的萌发与培养基饱和浸润。

将平板在室温下、16小时光照周期条件下孵育三天。三天后，将感染的子叶转移至毛状根生长（HRG）平板中。将平板置于设定为22°C、光照强度为100 µmol、16小时光照周期的生长室中孵育，直至观察到具有长度为2至3厘米侧根的主根。

三到四周后，使用无菌解剖刀和镊子收获从愈伤组织生长出并带有侧根的初生根。将根转移至含有适当抗生素的筛选HRG平板，继续培养五天。第五天时，收获带有长度为三至六厘米侧根的转基因毛状根。

若观察荧光蛋白，需确保侧根的自发荧光较弱。接下来，进行诱导剂化学处理时，将侧根切成1厘米长的片段，取约100毫克堆放在HRG琼脂培养基上。然后用80微升相应的处理溶液充分浸润该堆，将培养皿置于室温下孵育。

24小时后，进行RNA提取时，将根部在无菌纸巾上迅速吸干，并直接采集至一个2毫升的微量离心管中。立即用封口膜密封管口，并用尖头镊子扎两个小孔。转化后的农杆菌菌落PCR结果如下所示。

PCR 中的阳性菌落表明含有目的基因。然而，在 virD2 基因筛选中，有 1/3 至 1/2 的菌落呈阴性。荧光显微镜观察显示了 GFP-GmJAZ 1-6 的亚细胞定位。

基因表达分析证实，在Williams 82毛状根中，甘氨酸转录因子GmHSF6-1过表达，同时GmMYB29A2被RNAi沉默。