Name: 大豆毛根转化基因功能分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: 学习大豆毛根转化技术，利用CRISPR-Cas9和RNA干扰等方法同时研究多个基因功能，解析多基因网络互作机制，为功能基因组学研究提供高效平台。

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本研究由加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）资助，资助编号为 RGPIN-2020-06111，并获得 Brad Lace 的慷慨捐赠。我们感谢 Georgia 大学的 Wayne Parrott 提供 K599 Agrobacterium 菌株及初步实验方案，同时感谢 Shimane 大学 Nakagawa &amp;#38; Hachiya 实验室提供 pGWB2、pGWB6 和 pANDA35HK 空载体。

注意：建议所有后续步骤均在无菌条件下进行。
1. 大豆种子灭菌
<ol>
	<li>在生物安全柜中，将16-20粒处于原始状态的威廉姆斯82号大豆种子（即无裂纹或瑕疵）放入50 mL离心管中。</li>
	<li>加入30 mL 70%异丙醇，轻轻摇晃30秒，然后倾倒出酒精。</li>
	<li>轻轻摇动种子，用30 mL 10%次氯酸钠溶液处理10秒，然后将种子在室温（RT，25 °C）下静置5分钟。5分钟后，倒掉次氯酸钠溶液。</li>
	<li>重复振荡三次，每次使用30 mL无菌超纯水2每次冲洗1分钟，弃去H2每次洗涤之间留出 O。</li>
	<li>将灭菌后的种子置于无菌培养皿中，培养皿内铺有经5 mL萌发与共培养（GC）培养基浸润的滤纸（GC培养基为含1%蔗糖[pH = 5.8]的半倍浓度液体MS培养基[Murashige and Skoog]，经高压灭菌后添加2.5 mL/L维生素）。</li>
	<li>将培养皿置于暗处室温（25 °C）下培养3天，随后将培养皿转移至22 °C、16小时冷白T5荧光灯（100 µE m⁻² s⁻¹）光照条件下培养-2·s-1）培养4天，以使种子萌发。 
	&#8203;注意：丢弃皱缩或开裂的种子。最佳种子应较大且呈均匀黄色。为确保种子质量，需对至少两倍于实验所需数量的种子进行灭菌，因为部分种子可能因损伤、病害或无法萌发而不适合使用。</li>
</ol>
2. 使用K599感染子叶
注意：使用 pGWB 系列载体，因为其双重筛选可确保整个 T-DNA 盒的基因组整合。采用电穿孔法将含有目的基因的双元载体转化至 A. rhizogenes pRi265918 中。
<ol>
	<li>根据序列的 A. rhizogenes pRi2659 质粒18，设计引物以检测Ti质粒基因 VirD2 (VirD2 正向：5'-CCCGATCGAGCTCAAGTTAT-3'； VirD2 反向引物：5'-TCGTCTGGCTGACTTTCGT-3'；预期扩增片段大小：221 bp。转化后，进行检测 农杆菌 保留菌落的 VirD2 通过聚合酶链式反应（PCR）使用PCR试剂盒（参见 材料表）PCR循环：94 °C 预变性3 min；35个循环（94 °C 变性1 min，58 °C 退火30 sec，72 °C 延伸1 min）；最后72 °C 延伸10 min。</li>
	<li>在完成选择后 A. rhizogenes 含有两者的菌落 VirD2 以及目的基因（GOI），划线接种一些&#160;接种至含有相应抗生素（50 mg/L）的Luria-Bertani（LB）培养基平板上，针对目标质粒进行培养，并于30 °C过夜培养。若使用壮观霉素，则添加浓度为100 mg/L。</li>
	<li>使用 P200 移液器吸头刮取约 1.5 cm 长的 K599 农杆菌 从LB平板上挑取菌落，用1 mL磷酸盐缓冲液（PB；0.01 M Na2HPO4，0.15 M NaCl，pH 7.5）</li>
	<li>稀释 农杆菌 在无菌的超纯H2O（体积比 v/v = 1:1）和乙酰丁香酮（AS；二甲基亚砜[DMSO]中100 mM储备液，v/v = 1:1000）。使用比色皿在600 nm波长处测定光密度（OD600），预期最佳范围为0.5至0.8。</li>
	<li>在生物安全柜中，将已灭菌的手术刀浸入 K599 农杆菌 溶液，并在子叶内表面（近轴面，扁平侧）进行数道深约1 mm的切口。接种过程中，使用灭菌镊子固定子叶。</li>
	<li>将约6-8片子叶切面朝下放置于含有经GC培养基和乙酰丁香酮（AS）饱和的滤纸的培养皿中。 
	注意：制备6块平板时，使用50 mL GC培养基和50 µL 100 mM的AS溶液即可，终浓度为100 µM。</li>
	<li>将培养板置于室温（25 °C）下，16小时光照周期（约65 µE）条件下孵育3天。</li>
	<li>将感染的子叶转移至毛状根生长培养基（HRG）平板（含半倍浓度MS、3%蔗糖［pH = 5.8］和2.6 g/L Gelzan，经高压灭菌后，加入2.5 mL/L维生素混合液和500 mg/L替门汀）。 
	注意：某些替代供应商提供的替门汀存在一些问题，其中K599未被排除。建议在HRG培养基中使用较高的培养皿（100 mm × 25 mm）。</li>
	<li>在22 °C的培养室中，以100 µE光照、16小时光周期的条件培养HRG平板，直至观察到具有2-3 cm长侧根的主根（约3-4周）。</li>
</ol>
3. HRs 的筛选与收获
<ol>
	<li>使用无菌手术刀和镊子采集从愈伤组织生长出的主根（长度为 5–7 cm），主根上应带有侧根（长度为 2–3 cm）。将采集的材料转移至含有适当抗生素的选择性 HRG 平板上。让毛状根在选择性 HRG 平板上继续生长 5 天。 
	注：通常使用卡那霉素（50 mg/L）、潮霉素（50 mg/L）或草铵膦（10 mg/L）进行筛选。对于表达载体，pGWB2 用于过表达，pANDA35HK 用于 RNAi 沉默，pGWB6 用于亚细胞定位，pMDC7 用于诱导型表达。</li>
	<li>第 5 天时，采集带有长度为 3–6 cm 侧根的转基因毛状根。若需观察荧光蛋白，应选择侧根自身荧光较弱的样本。若进行诱导子或化学处理，将侧根切成 1 cm 长的小段，取约 100 mg 堆放于 HRG 琼脂上，然后用 80 µL 相应处理液充分浸润样本堆，并将平板置于室温（25 °C）下培养。</li>
	<li>在完成所需处理时间后，进行 RNA 或代谢物提取。</li>
	<li>提取 RNA 时，先用无菌纸巾迅速吸干根部表面水分，然后直接将根转入 2 mL 微量离心管中。</li>
	<li>立即用封口膜密封管口，用尖头镊子在封口膜上刺两个小孔，随后将离心管浸入液氮中。冷冻干燥 3 天后，将样品储存于 -80 °C。 
	注：必须选择呈白色的毛状根。在选择性平板上生长 5 天后，转基因毛状根仍保持白色，而非转基因根则会变为褐色。</li>
</ol>

High-Efficiency Production of Transgenic Soybean Hairy Roots

<ol><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transformation+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Optimization of Agrobacterium-mediated transformation in soybean.</a> Frontiers in Plant Science. 8, 246(2017).</li>
<li>Elhady, A., Hallmann, J., Heuer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symbiosis+of+soybean+with+nitrogen+fixing+bacteria+affected+by+root+lesion+nematodes+in+a+density-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Symbiosis of soybean with nitrogen fixing bacteria affected by root lesion nematodes in a density-dependent manner.</a> Scientific Reports. 10, 1619(2020).</li>
<li>Huang, X. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhizosphere+interactions%3A+root+exudates%2C+microbes%2C+and+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Botany%22%5BJournal%5D)">Rhizosphere interactions: root exudates, microbes, and microbial communities.</a> Botany. 92 (4), 267-275 (2014).</li>
<li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+genetic+transformation+and+applications+in+citrus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Highly efficient Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation and applications in citrus.</a> Frontiers in Plant Science. 13, 1039094(2022).</li>
<li>Hwang, H. -H., Yu, M., Lai, E. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+plant+transformation%3A+biology+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22The+Arabidopsis+Book%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated plant transformation: biology and applications.</a> The Arabidopsis Book. 15, e0186(2017).</li>
<li>Gutierrez-Valdes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hairy+root+cultures-a+versatile+tool+with+multiple+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Hairy root cultures-a versatile tool with multiple applications.</a> Frontiers in Plant Science. 11, 33(2020).</li>
<li>Ono, N. N., Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multiplicity+of+hairy+root+cultures%3A+prolific+possibilities%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">The multiplicity of hairy root cultures: prolific possibilities.</a> Plant Science. 180 (3), 439-446 (2011).</li>
<li>Kereszt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation+of+soybean+to+study+root+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology.</a> Nature Protocols. 2 (4), 948-952 (2007).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soybean+hairy+roots+produced+in+vitro+by+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Crop+Journal%22%5BJournal%5D)">Soybean hairy roots produced in vitro by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation.</a> The Crop Journal. 6 (2), 162-171 (2018).</li>
<li>Song, J., Tóth, K., Montes-Luz, B., Stacey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soybean+hairy+root+transformation%3A+a+rapid+and+highly+efficient+method%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Soybean hairy root transformation: a rapid and highly efficient method.</a> Current Protocols. 1 (7), e195(2021).</li>
<li>Fattahi, F., Shojaeiyan, A., Palazon, J., Moyano, E., Torras-Claveria, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methyl-%CE%B2-cyclodextrin+and+coronatine+as+new+elicitors+of+tropane+alkaloid+biosynthesis+in+Atropa+acuminata+and+Atropa+belladonna+hairy+root+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Physiologia+Plantarum%22%5BJournal%5D)">Methyl-β-cyclodextrin and coronatine as new elicitors of tropane alkaloid biosynthesis in Atropa acuminata and Atropa belladonna hairy root cultures.</a> Physiologia Plantarum. 172 (4), 2098-2111 (2021).</li>
<li>Farrell, K., Jahan, M., Kovinich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+mechanisms+of+biotic+and+chemical+elicitors+enable+additive+elicitation+of+the+anticancer+Phytoalexin+Glyceollin+I%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Distinct mechanisms of biotic and chemical elicitors enable additive elicitation of the anticancer Phytoalexin Glyceollin I.</a> Molecules. 22 (8), 1261(2017).</li>
<li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+hairy+root+transformation+for+gene+functional+and+gene+editing+analysis+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly efficient Agrobacterium rhizogenes-mediated hairy root transformation for gene functional and gene editing analysis in soybean.</a> Plant Methods. 17 (1), 73(2021).</li>
<li>Arora, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+proximity-dependent+biotinylation+approaches+in+different+plant+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems.</a> Plant Cell. 32 (11), 3388-3407 (2020).</li>
<li>Gomes, C., Dupas, A., Pagano, A., Grima-Pettenati, J., Paiva, J. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hairy+root+transformation%3A+a+useful+tool+to+explore+gene+function+and+expression+in+Salix+spp.+recalcitrant+to+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Hairy root transformation: a useful tool to explore gene function and expression in Salix spp. recalcitrant to transformation.</a> Frontiers in Plant Science. 10, 1427(2019).</li>
<li>Ahmed, S., Kovinich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+phytoalexin+biosynthesis+for+agriculture+and+human+health%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Regulation of phytoalexin biosynthesis for agriculture and human health.</a> Phytochemistry Reviews. 20, 483-505 (2021).</li>
<li>Walker, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glyceollins+trigger+anti-proliferative+effects+in+hormone-dependent+aromatase-inhibitor-resistant+breast+cancer+cells+through+the+induction+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Glyceollins trigger anti-proliferative effects in hormone-dependent aromatase-inhibitor-resistant breast cancer cells through the induction of apoptosis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (5), 2887(2022).</li>
<li>Tong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+genome+sequence+of+cucumopine-type+Agrobacterium+rhizogenes+strain+K599+%28NCPPB2659%29%2C+a+nature%27s+genetic+engineer+inducing+hairy+roots%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Agriculture+Biology%22%5BJournal%5D)">The complete genome sequence of cucumopine-type Agrobacterium rhizogenes strain K599 (NCPPB2659), a nature's genetic engineer inducing hairy roots.</a> International Journal of Agriculture Biology. 20 (5), 1167-1174 (2018).</li>
<li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+dissects+incomplete+activation+of+phytoalexin+biosynthesis+by+the+soybean+transcription+factors+GmMYB29A2+and+GmNAC42-1%5BTitle%5D)+AND+%22Plants%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq dissects incomplete activation of phytoalexin biosynthesis by the soybean transcription factors GmMYB29A2 and GmNAC42-1.</a> Plants. 12 (3), 545(2023).</li>
<li>Jahan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glyceollin+transcription+factor+GmMYB29A2+regulates+soybean+resistance+to+Phytophthora+sojae%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Glyceollin transcription factor GmMYB29A2 regulates soybean resistance to Phytophthora sojae.</a> Plant Physiology. 183 (2), 530-546 (2020).</li>
<li>Jahan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NAC+family+transcription+factor+GmNAC42-1+regulates+biosynthesis+of+the+anticancer+and+neuroprotective+glyceollins+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">The NAC family transcription factor GmNAC42-1 regulates biosynthesis of the anticancer and neuroprotective glyceollins in soybean.</a> BMC Genomics. 20, 149(2019).</li>
<li>Nguyen, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+for+uricase+and+xanthine+dehydrogenase+in+soybean+nitrogen+fixation+and+nodule+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Genome%22%5BJournal%5D)">Critical role for uricase and xanthine dehydrogenase in soybean nitrogen fixation and nodule development.</a> The Plant Genome. , e20171(2021).</li>
<li>Brear, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GmVTL1a+is+an+iron+transporter+on+the+symbiosome+membrane+of+soybean+with+an+important+role+in+nitrogen+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">GmVTL1a is an iron transporter on the symbiosome membrane of soybean with an important role in nitrogen fixation.</a> New Phytologist. 228 (2), 667-681 (2020).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+transcription+factor+GmTGA15+enhances+drought+tolerance+in+transgenic+soybean+hairy+roots+and+Arabidopsis+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Agronomy%22%5BJournal%5D)">Overexpression of transcription factor GmTGA15 enhances drought tolerance in transgenic soybean hairy roots and Arabidopsis plants.</a> Agronomy. 11 (1), 170(2021).</li>
<li>Savka, M., Ravillion, B., Noel, G., Farrand, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+hairy+roots+on+cultivated+soybean+genotypes+and+their+use+to+propagate+the+soybean+cyst+nematode%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Induction of hairy roots on cultivated soybean genotypes and their use to propagate the soybean cyst nematode.</a> Phytopathology. 80 (5), 503-508 (1990).</li>
<li>Subramanian, S., Graham, M. Y., Yu, O., Graham, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+of+soybean+isoflavone+synthase+genes+leads+to+silencing+in+tissues+distal+to+the+transformation+site+and+to+enhanced+susceptibility+to+Phytophthora+sojae%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">RNA interference of soybean isoflavone synthase genes leads to silencing in tissues distal to the transformation site and to enhanced susceptibility to Phytophthora sojae.</a> Plant Physiology. 137 (4), 1345-1353 (2005).</li>
<li>Sharma, A. R., Gajurel, G., Ahmed, I., Roedel, K., Medina-Bolivar, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+the+prenylated+stilbenoids+arachidin-1+and+arachidin-3+and+their+semi-preparative+separation+and+purification+from+hairy+root+cultures+of+peanut+%28Arachis+hypogaea+l.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Induction of the prenylated stilbenoids arachidin-1 and arachidin-3 and their semi-preparative separation and purification from hairy root cultures of peanut (Arachis hypogaea l.).</a> Molecules. 27 (18), 6118(2022).</li>
<li>Lozovaya, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflavonoid+accumulation+in+soybean+hairy+roots+upon+treatment+with+Fusarium+solani%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isoflavonoid accumulation in soybean hairy roots upon treatment with Fusarium solani.</a> Plant Physiology Biochemistry. 42 (7-8), 671-679 (2004).</li>
<li>Rahimi Khonakdari, M., Rezadoost, H., Heydari, R., Mirjalili, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+photoperiod+and+plant+growth+regulators+on+in+vitro+mass+bulblet+proliferation+of+Narcissus+tazzeta+L.+%28Amaryllidaceae%29%2C+a+potential+source+of+galantamine%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%2C+Tissue%2C+and+Organ+Culture%22%5BJournal%5D)">Effect of photoperiod and plant growth regulators on in vitro mass bulblet proliferation of Narcissus tazzeta L. (Amaryllidaceae), a potential source of galantamine.</a> Plant Cell, Tissue, and Organ Culture. 142 (1), 187-199 (2020).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在过去的十年中，大豆高通量转化（HR）方法已被开发为一种强大的工具，用于研究参与固氮22,23、生物和非生物胁迫耐受性24,25以及代谢物生物合成途径26,27的基因。了解植物如何产生代谢物对农业生产及制药行业具有广泛的应用价值，因为该知识可用于研究参与介导针对病原体生化防御的基因网络28。
为提高生产效率并降低成本，本方案对实验流程进行了简化。例如，不再使用成本较高的含凝固剂的固体培养基，而是采用工业级纸巾浸润液体培养基并在无菌条件下萌发大豆种子。由于多种微生物（如真菌和酵母）可能造成污染，因此无菌操作技术和无菌工作环境的维持对于发根（HR）转化实验至关重要。 体外 ...

大豆（Glycine max）是农业中最具价值的作物之一。它拥有数千种商业和工业用途，例如用于食品、动物饲料、油脂，以及作为制造业原材料的来源1。大豆能够与固氮土壤微生物（即根瘤菌）形成共生关系，这一特性进一步提升了研究大豆遗传学的重要性2。例如，精确调控大豆根部的固氮特性可减少碳排放，并显著降低对氮肥的需求3。因此，深入了解控制大豆根部生物学特性的遗传机制，在农业和工业领域具有广泛的应用前景。鉴于这些优势，建立一种可靠的分析大豆基因功能的实验方案显得尤为重要。
Agrobacterium tumefaciens 可能是植物遗传转化中最常用的工具，因为它能够将转移DNA（T-DNA）整合到多种植物物种的核基因组中。当Agrobacterium侵染植物时，会将其肿瘤诱导（Ti）质粒转移到宿主染色体中，导致侵染部位形成肿瘤。Agrobacterium介导的转化技术已被广泛使用数十年，用于基因功能分析以及改良作物性状4。尽管通过A. tumefaciens介导的转化可将任何目的基因轻松转入宿主植物细胞，但该方法存在若干缺点：耗时长、成本高，并且对许多植物物种（如大豆）需要丰富的专业技术。尽管少数大豆品种可通过子叶节途径利用A. tumefaciens进行转化，但该方法效率低下，因此迫切需要一种快速且高效替代的遗传转化技术4,5。即使是非专业人员，也可使用这种由Agrobacterium rhizogenes介导的毛根（HR）转化方法来克服上述缺点。
发根（HR）转化是一种相对较快的工具，不仅可用于分析基因功能，还可用于生物技术应用，例如生产特化代谢物和精细化学品，以及复杂的生物活性糖蛋白6。大豆发根的制备无需 extensive 的专业技术，只需对子叶表面进行创伤处理，随后接种Agrobacterium rhizogenes7即可诱导生成。A. rhizogenes 表达由其Ti质粒编码的毒力（Vir）基因，这些基因能够转移、携带并将T-DNA片段整合到植物细胞基因组中，同时刺激异位根的生长8。
与其他大豆基因&#160;表达系统（如基因枪法或基于A. tumefaciens的组织、细胞和器官培养转化）相比，毛状根（HR）表达系统具有多项优势。首先，毛状根具有遗传稳定性，且可在不含激素的培养基上快速生成1,9,10。此外，毛状根产生的特化代谢物含量相当于甚至高于天然根系11,12。这些优势使毛状根成为一种理想的生物技术工具，适用于那些与A. tumefaciens不相容或需要特殊组织培养条件才能形成相容组织的植物物种。毛状根方法是一种高效的技术手段，可用于分析蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质亚细胞定位、重组蛋白生产、植物修复、诱变以及通过RNA测序研究全基因组效应13,14,15。该方法还可用于研究具有工业价值的特化代谢物的生产，例如甘草素类物质（glyceollins），这类物质介导大豆对重要微生物病原体Phytophthora sojae的防御反应，并在人类中表现出显著的抗癌和神经保护活性16,17。
本报告展示了一种简便高效的制备大豆毛状根（HR）的实验方案。与以往的毛状根转化方法相比，该方案通过在接种大豆子叶前对根瘤农杆菌（A. rhizogenes）转化子进行Ti质粒存在的预筛选，使毛状根形成率显著提高了33%至50%。我们通过转化多个过表达或沉默大豆转录因子基因的双元载体，验证了该方案的适用性。

<table><tbody><tr><td>乙酰丁香酮</td><td>Cayman</td><td>23224</td><td></td></tr><tr><td>漂白剂</td><td>lavo</td><td>21124</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher bioreagents</td><td>195679</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖凝胶</td><td>Phytotech</td><td>HYY3251089A</td><td></td></tr><tr><td>潮霉素</td><td>Phytotech</td><td>HHA0397050B</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Fisher chemical</td><td>206462</td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>Phytotech</td><td>SQS0378007G</td><td></td></tr><tr><td>LB 粉末</td><td>Fisher bioreagents</td><td>200318</td><td></td></tr><tr><td>MS 粉末</td><td>Caisson labs</td><td>2210001</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher bioreagents</td><td>194171</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher chemical</td><td>192946</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Fisherbrand</td><td>08-757-11</td><td>100 mm × 25 mm</td></tr><tr><td>草铵膦</td><td>Cedarlane</td><td>P034-250MG</td><td></td></tr><tr><td>REDExtract-N-Amp PCR 试剂盒</td><td>Sigma</td><td>R4775</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Bioshop</td><td>2D76475</td><td></td></tr><tr><td>特美汀</td><td>Caisson labs</td><td>12222002</td><td></td></tr><tr><td>维生素</td><td>Caisson labs</td><td>2211010</td><td></td></tr></tbody></table>

大豆毛状根转化用于基因功能分析

Soybean Hairy Root Transformation for the Analysis of Gene Function

大豆（Glycine max）是农业中一种具有重要价值的作物，拥有数千种工业用途。大豆根部是与土壤微生物相互作用的主要部位，这些微生物既包括可固氮的共生菌，也包括致病菌，因此大豆根部遗传学研究对于提高其农业生产具有重要意义。大豆毛状根（HRs）的遗传转化由根癌农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）菌株NCPPB2659（K599）介导，是一种研究大豆根中基因功能的高效工具，从开始到完成仅需两个月。本文提供了一项详细的操作方案，阐述了在大豆毛状根中过表达或沉默目标基因的方法。该方法包括大豆种子的灭菌、子叶接种K599菌株、筛选与收获遗传转化的毛状根，并进行RNA提取，必要时还可进行代谢物分析。该方法通量较高，可同时研究多个基因或基因网络，有助于在开展耗时较长的稳定遗传转化之前确定最优的基因工程策略。

代表性结果来自已发表的数据19,20转化菌株K599的菌落PCR（cPCR）结果 农杆菌 如图所示 图1。如阳性菌落所示 图1，通过巢式PCR检测目的基因（图1A）。然而，有三分之一到一半的菌落对该检测呈阴性 VirD2 基因筛选图1B），表明Ti质粒已丢失，无法形成愈伤组织或毛状根。 图2 展示了大豆毛状根的总体制备流程及基因表达分析。 图3 展示GFP-GmJAZ1-6的亚细胞定位。 图4 是一种基因表达分析，显示甘草素转录因子的过表达 GmHSF6-1</em...

本文介绍了一种高效生产转基因大豆毛状根的实验方案。

大豆（Glycine max）是农业中一种具有重要经济价值的作物，拥有数千种工业用途。大豆根部是其与环境相互作用的主要部位……

我们的大豆毛状根转化方法足以同时研究多个基因或基因网络的功能，并可在进行长期稳定的转化方法之前确定最优的基因工程策略。大豆毛状根转化是分析大豆植株中基因功能的有效工具。目前使用的技术包括CRISPR-Cas9基因组编辑、RNA干扰、转录组学和蛋白质组学，以及成像技术。在功能基因组学的现代时代，主要挑战是充分分析大量基因的功能。大多数性状是多基因的，由许多基因的相互作用共同实现。我们的毛状根实验方案将促进基因功能的分析，并具备足够的通量，从而开始解析多基因调控网络。我们已确定了Ti质粒在根癌农杆菌菌株中的重要性。研究发现，若不进行Ti质粒筛选，其转化的大豆子叶将面临无法产生任何颜色的风险。因此，在转化前进行质粒筛选已成为一个至关重要的步骤。与其他基因表达技术相比，我们的毛状根表达系统操作简便、耗时短且成本低廉。此外，通过在子叶转化前检测农杆菌中的Ti质粒，我们新建立的实验方案已将毛状根转化率提高至50%。通过对十余个转录因子基因功能的表征，我们近期的研究结果为多基因工程研究奠定了基础，旨在揭示植物中重要植源性化合物和代谢物的生物合成途径。未来，我们将利用这种毛根转化方法解析调控植物抗毒素生物合成的转录因子基因网络。该方法可用于提高这些特化代谢产物的产量，以满足制药和农业产业的需求。首先，在生物安全柜内，将16至20粒完好的圆形威廉姆斯82号大豆种子放入一个50毫升离心管中。向试管中加入 30 毫升 70% 异丙醇，振荡 30 秒。倾去酒精。接着，用 30 毫升 10% 次氯酸钠溶液轻轻振荡种子 10 秒，然后将种子在室温下静置于该溶液中 5 分钟。五分钟后，倒掉次氯酸钠溶液。随后用30毫升无菌超纯水清洗种子三次，每次清洗一分钟，并在每次清洗后弃去清洗液。将灭菌后的种子置于无菌培养皿中的滤纸上，滤纸需用5毫升发芽与共培养培养基浸润。将培养皿置于室温黑暗环境中三天，随后转移至22摄氏度、配备16小时冷白色T5荧光灯的条件下培养四天，以促进种子萌发。为利用根癌农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）感染大豆子叶，需根据根癌农杆菌pRI2659质粒的Ti质粒基因virD2序列设计引物。转化后，使用PCR试剂盒通过PCR检测农杆菌菌落是否保留virD2基因。在筛选出含有 virD2 和目的基因的根癌农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）菌落后，将部分菌落划线接种至含有每升100毫克壮观霉素的LB平板上，用于保存目的质粒。次日，使用P200移液器枪头从LB平板上刮取约1.5厘米长的农杆菌菌体，悬浮于1毫升磷酸缓冲液中。将重悬的菌液稀释后，用乙酰丁香酮处理并灭菌至超纯水中。使用比色皿在600纳米波长下测定吸光度。随后在生物安全柜中，将灭菌的手术刀浸入农杆菌溶液，沿子叶内表面切出深度为1毫米的切口。将6至8片子叶切面朝下放置于含有滤纸的培养皿中，滤纸上需用含乙酰丁香酮的萌发与培养基饱和浸润。将平板在室温下、16小时光照周期条件下孵育三天。三天后，将感染的子叶转移至毛状根生长（HRG）平板中。将平板置于设定为22°C、光照强度为100 µmol、16小时光照周期的生长室中孵育，直至观察到具有长度为2至3厘米侧根的主根。三到四周后，使用无菌解剖刀和镊子收获从愈伤组织生长出并带有侧根的初生根。将根转移至含有适当抗生素的筛选HRG平板，继续培养五天。第五天时，收获带有长度为三至六厘米侧根的转基因毛状根。若观察荧光蛋白，需确保侧根的自发荧光较弱。接下来，进行诱导剂化学处理时，将侧根切成1厘米长的片段，取约100毫克堆放在HRG琼脂培养基上。然后用80微升相应的处理溶液充分浸润该堆，将培养皿置于室温下孵育。24小时后，进行RNA提取时，将根部在无菌纸巾上迅速吸干，并直接采集至一个2毫升的微量离心管中。立即用封口膜密封管口，并用尖头镊子扎两个小孔。转化后的农杆菌菌落PCR结果如下所示。PCR 中的阳性菌落表明含有目的基因。然而，在 virD2 基因筛选中，有 1/3 至 1/2 的菌落呈阴性。荧光显微镜观察显示了 GFP-GmJAZ 1-6 的亚细胞定位。基因表达分析证实，在Williams 82毛状根中，甘氨酸转录因子GmHSF6-1过表达，同时GmMYB29A2被RNAi沉默。

soybean-hairy-root-transformation-for-the-analysis-of-gene-function

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

大豆毛根转化基因功能分析

启动子表达分析对于深入理解基因调控机制以及目标基因在时空上的表达模式至关重要。本文介绍了一种用于鉴定、分离和克隆植物启动子的实验方案，并进一步描述了在菜豆毛状根中对根瘤特异性启动子的表征方法。...

植物启动子分析：菜豆根瘤特异性启动子的鉴定与表征

我们开发了一种简单高效的方案，用于制备大量大豆原生质体，以研究活细胞中复杂的调控和信号传导机制。...

一种简易的大豆原生质体分离方法及其在瞬时基因表达分析中的应用

我们描述了一种通过根癌农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）介导的遗传转化方法，用于在苦荞（Fagopyrum...

诱导毛状根 根癌农杆菌-介导的苦荞转化Fagopyrum tataricum)

在此，我们提供了一种由介导的一步法转化详细实验方案 根癌农杆菌...

一种高效且可重复的复合植株制备方法 根癌农杆菌基于发根农杆菌的毛状根转化

本方案描述了利用Arabidopsis主花序茎和Brassica...

拟南芥和甘蓝型油菜中的毛状根转化与再生

本指南逐步介绍了新型重力力谱仪的原理、操作方法及典型实验结果。...

展示新型重力力谱仪在拉伸和测量纤维状蛋白质中的应用

本文提供了一种在RootChip中培养拟南芥幼苗的实验方案。RootChip是一种微流控成像平台，可自动控制生长条件，同时实现根部的显微监测以及基于FRET的细胞内代谢物水平检测。...

利用RootChip快速调控根际环境对拟南芥根生长进行延时荧光成像

本文描述了一种用于评估聚合物基因递送纳米颗粒的纳米颗粒追踪分析（NTA）和高通量流式细胞术的实验方案。NTA...

通过纳米颗粒追踪分析与高通量流式细胞术评估聚合物基因递送纳米颗粒

本方案综述了电细胞基底阻抗传感技术，该方法用于记录和分析贴壁细胞的阻抗谱，以定量检测细胞黏附、增殖、运动性以及细胞对药理和毒性刺激的反应。重点强调内皮细胞通透性的检测以及细胞间和细胞-基底相互作用的评估。...

用于定量分析内皮细胞增殖、屏障功能及迁移活性的细胞电阻传感技术

采用双链RNA干扰（dsRNAi）技术下调玉米肉桂酰辅酶A还原酶（ZmCCR1）基因，以降低植株木质素含量。通过显微分析观察细胞壁中木质素的下调情况，并采用克拉森法进行定量测定。同时分析半纤维素和结晶纤维素的组分变化。...

木质素下调 Zea mays 通过dsRNAi和Klason木质素分析

学习大豆毛根转化技术，利用CRISPR-Cas9和RNA干扰等方法同时研究多个基因功能，解析多基因网络互作机制，为功能基因组学研究提供高效平台。

大豆毛状根转化用于基因功能分析

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