Name: 在自动化细胞处理器上制造嵌合抗原受体T细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T14:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: 了解利用自动化细胞处理器进行CAR T细胞半自动化制备的完整流程。该方法通过计算机控制实现病毒转导与细胞培养，在封闭系统中以更低成本生产临床级CAR T细胞，适用于多种细胞与基因治疗研究。

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作者谨此感谢多位个人和机构对本研究工作的贡献。细胞与基因治疗实验室以及宾夕法尼亚大学转化与相关研究实验室在工艺开发及新药临床试验申请（IND）准备工作方面提供了宝贵的支持。Melissa Varghese 和 Amanda DiNofia 为本论文所依托的工艺开发及 IND 申报准备工作做出了贡献。本研究得到了费城儿童医院细胞与基因治疗协作项目加速资助计划（Acceleration&#160;Grant）的支持。作者还感谢 Miltenyi Biotec 在技术和科研方面提供的支持。图1的版权属于 © 2023 Miltenyi Biotec B.V. &amp;#38; Co. KG；保留所有权利。

Automated Processor for Clinical-Scale CAR-T Cell Manufacturing

<ol><li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tisagenlecleucel+in+children+and+young+adults+with+B-cell+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).</li>
<li>Shah, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bispecific+anti-CD20%2C+anti-CD19+CAR+T+cells+for+relapsed+B+cell+malignancies%3A+A+phase+1+dose+escalation+and+expansion+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bispecific anti-CD20, anti-CD19 CAR T cells for relapsed B cell malignancies: A phase 1 dose escalation and expansion trial.</a> Nature Medicine. 26 (10), 1569-1575 (2020).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+sustained+remissions+in+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).</li>
<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+humanized+CD19-targeted+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29-modified+T+cells+in+children+and+young+adults+with+relapsed%2Frefractory+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficacy of humanized CD19-targeted chimeric antigen receptor (CAR)-modified T cells in children and young adults with relapsed/refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 128 (22), 217(2016).</li>
<li>Mock, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+manufacturing+of+CAR-T+cells+for+adoptive+immunotherapy+using+CliniMACS+Prodigy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Automated manufacturing of CAR-T cells for adoptive immunotherapy using CliniMACS Prodigy.</a> Cytotherapy. 18 (8), 1002-1011 (2016).</li>
<li>Fernández, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GMP-compliant+manufacturing+of+NKG2D+CAR+memory+T+cells+using+CliniMACS+Prodigy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">GMP-compliant manufacturing of NKG2D CAR memory T cells using CliniMACS Prodigy.</a> Frontiers in Immunology. 10 (10), 2361(2019).</li>
<li>Zhu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closed-system+manufacturing+of+CD19+and+dual-targeted+CD20%2F19+chimeric+antigen+receptor+T+Cells+using+CliniMACS+Prodigy+device+at+an+academic+medical+center%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Closed-system manufacturing of CD19 and dual-targeted CD20/19 chimeric antigen receptor T Cells using CliniMACS Prodigy device at an academic medical center.</a> Cytotherapy. 20 (3), 394-406 (2018).</li>
<li>Zhang, W., Jordan, K. R., Schulte, B., Purev, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+clinical+grade+CD19+chimeric+antigen+receptor+T+cells+produced+using+automated+CliniMACS+prodigy+system%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Design%2C+Development+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Characterization of clinical grade CD19 chimeric antigen receptor T cells produced using automated CliniMACS prodigy system.</a> Drug Design, Development and Therapy. 12 (12), 3343-3356 (2018).</li>
<li>Abou-El-Enein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+manufacturing+of+CAR+T+cells+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy.</a> Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).</li>
<li>Miltenyi Biotec. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22CliniMACS+Prodigy+User+Manual%22">CliniMACS Prodigy User Manual</a>. , https://static.miltenyibiotec.com/asset/150655405641/document_h0fd9i4al17q32uhfuf4h7lu25?content-disposition=inline (2021).</li>
<li>Ghassemi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+manufacturing+of+non-activated+potent+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Rapid manufacturing of non-activated potent CAR T cells.</a> Nature Biomedical Engineering. 6 (2), 118-128 (2022).</li>
<li>U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Chemistry%2C+manufacturing%2C+and+control+%28CMC%29+information+for+human+gene+therapy+investigational+new+drug+applications+%28INDs%29+guidance+for+industry%22">Chemistry, manufacturing, and control (CMC) information for human gene therapy investigational new drug applications (INDs) guidance for industry</a>. , https://www.fda.gov/media/113760/download (2020).</li>
<li>U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Considerations+for+the+development+of+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+T+cell+products+draft+guidance+for+industry%22">Considerations for the development of chimeric antigen receptor (CAR) T cell products draft guidance for industry</a>. , https://www.fda.gov/media/156896/download (2022).</li>
</ol>

S.K.、S.G. 和 Y.W. 已获得 Miltenyi Biotec 的科研资助。

CAR-T细胞疗法已成为治疗B细胞及其他恶性肿瘤的一种前景广阔的治疗策略。然而，传统的CAR-T细胞制备方法存在若干局限性，例如成本高昂、生产过程劳动密集，以及开放式操作步骤增加了污染风险。近年来，已出现多种半自动化平台，包括Miltenyi CliniMACS Prodigy（ &#34;处理器&#34;)，已应运而生以解决这些局限性。T细胞转导（TCT）过程被整合至本文所述的处理器中，涵盖在封闭系统内完成T细胞富集、激活、病毒转导、培养扩增及收获等步骤。目前，其他竞争性的自动化细胞处理平台使用范围较窄，但可能在培养参数的实时监测方面更具优势。&#160;有利的设备或材料成本，或更小的占用空间，这可能使其能够在生物安全柜中使用，而无需专用的洁净室空间。选择最适合特定应用和环境的平台至关重要。
细胞和基因治疗（如CAR-T细胞治疗）的一个显著局限性在于商业产品的高成本，这限制了患者获得挽救生命的治疗。这种情况在资源匮乏的地区和非发达国家尤为突出。我们发现，当在具备现有符合现行药品生产质量管理规范（cGMP）的洁净室设施的学术型医院环境中，结合干细胞实验室的条件，并由可执行部分中间过...

表达嵌合抗原受体（CAR）的T细胞经体外改造后进行过继性转移，在治疗难治性B细胞恶性肿瘤患者中已显示出显著疗效1,2,3,4,5。然而，传统的CAR-T细胞制备方法劳动强度大、耗时长，且需要由经验丰富的技术人员执行高度专业化的操作步骤。例如，自体CAR-T细胞产品的传统制备流程包括：通过密度梯度离心、离心淘析&#160;或磁性分离富集T细胞，随后在无菌培养瓶中使用病毒载体进行细胞活化与转导，再于生物反应器中扩增，最后收获并制剂。近年来已出现多种旨在部分实现该流程自动化的系统。例如，Miltenyi CliniMACS Prodigy（下文简称“处理器”）是一种自动化细胞处理装置，可自动完成上述多个步骤6,7,8,9。有关传统与自动化CAR-T细胞制备方法的深入讨论，可参见近期发表的一篇综述文章10。
该处理器在CliniMACS Plus功能基础上进行拓展，CliniMACS Plus为经美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于造血祖细胞处理的医疗器械。该处理器包含一个细胞培养单元，可实现&#160;细胞的自动化洗涤、分馏与培养图1）。T细胞转导（TCT）过程是处理器设备中的一个预设程序，可大体复制人工CAR-T细胞制备流程。TCT允许通过图形用户界面（ &#34;活性矩阵，&#34; 图2）。由于该处理器可自动完成多个步骤，并将多种设备的功能整合到一台机器中，因此对技术人员的培训要求和专业故障排除能力的需求较低。由于所有步骤均在封闭的一次性管路系统中进行，该处理器可在空气处理设施要求低于开放式生产工艺所需标准的环境中运行。例如，我们正在ISO 8级（相当于欧盟C级）洁净室认证的设施中操作该处理器。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65488/65488fig01.jpg" /> 
图1：使用T细胞转导系统制备CAR-T细胞。 图中显示的是已安装管路系统的处理器&#160;。该管路系统可通过无菌焊接连接其他组件，例如含有处理缓冲液、培养基和慢病毒载体的袋子。当将白细胞分离产物加入应用袋后，可使用T细胞分选磁珠对其进行标记，随后通过分离柱，并转移至再应用袋中。分选出的细胞随后被引导至仪器的培养单元进行培养，并用活化试剂进行活化（见材料表）。最终产物被收集在目标细胞袋中。在整个过程中，可无菌方式取出样品用于质量控制。圆圈内的灰色数字代表处理器上编号的阀门，用于控制液体在管路系统中的流向。经11许可转载。&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65488/65488fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65488/65488fig02.jpg" /> 
图2：操作矩阵。 在T细胞筛选与激活后，CAR-T细胞制备过程的其余步骤均可完全自定义。可添加或删除操作&#160;，并为其安排适当的日期和时间，同时可设定操作完成后的培养体积（体积）。例如，“转导”操作被设定为在第1天上午10:00开始，操作结束时的培养体积设为100 mL。操作矩阵可在整个培养期间随时编辑。该过程的状态可通过加工设备的集成屏幕进行实时监控。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65488/65488fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
本文旨在详细介绍使用该仪器制造CAR-T细胞的完整流程，并提供关于过程控制和产品放行检测的指导，这些检测很可能是监管机构批准新药临床试验申请（IND）所要求的。本方案基本遵循供应商推荐的方法，是目前处于单中心研究者发起的I/II期临床试验中评估的IND 28617号申请的基础方案。该临床试验旨在评估使用该仪器制备靶向CD19的人源化自体CAR-T细胞治疗B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）或B系淋巴母细胞淋巴瘤（B-Lly）患者的安全性和有效性[NCT05480449]。试验始于2022年9月，计划招募最多89名年龄在0至29岁之间的B-ALL或B-Lly患者。本文报告了该试验中部分细胞制备的结果。
需要指出的是，尽管本文以可遵循的操作步骤形式呈现为一份实验方案，但应将其视为供他人启动优化自身CAR-T细胞生产工艺的起点。本方案可能存在的部分变异包括：使用新鲜T细胞而非冻存T细胞作为起始材料；采用不同的T细胞富集方法或完全省略富集步骤；使用不同的培养基和细胞因子组合（例如IL7/IL15替代IL2）；调整人AB血清的浓度或完全省略；改变转导时间点；采用“多重转导”（multi-hit transductions）；调整振荡条件、培养体积和换液频率；采用不同的基因转移方法，包括核酸电穿孔或非慢病毒载体；使用不同的终末配制缓冲液和/或冷冻保护剂；以及直接输注新鲜CAR-T细胞，而非冻存后择期回输。这些变异可能对治疗产品的细胞组成和生物学活性产生显著影响。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>总体流程步骤</td>
			<td>操作日期</td>
			<td colspan="4">技术细节</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>细胞富集</td>
			<td rowspan="2">第0天</td>
			<td colspan="4">CD4+/CD8+ T细胞筛选&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>细胞激活</td>
			<td colspan="4">T细胞培养接种与激活</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>细胞转导</td>
			<td>第1天</td>
			<td colspan="4">慢病毒转导（100 mL培养体积）&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="12">细胞扩增（随后进行细胞制剂制备）</td>
			<td>第2天</td>
			<td colspan="4">--</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>第3天</td>
			<td colspan="4">培养物洗涤（1个循环）；启动摇床；培养体积增加至200 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>第4天</td>
			<td colspan="4">--</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>第5天</td>
			<td colspan="4">补料（50 mL）；培养体积达到最终体积250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>第6天</td>
			<td colspan="4">过程取样；换液（-125 mL / +125 mL）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>第7天</td>
			<td colspan="4">换液（-150 mL / +150 mL）或收获细胞&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>第8天</td>
			<td colspan="4">过程取样；换液（-150 mL / +150 mL）或收获细胞</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>第9天</td>
			<td colspan="4">换液（-180 mL / +180 mL）或收获细胞</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>第10天</td>
			<td colspan="4">过程取样；换液（-180 mL / +180 mL）或收获细胞</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>第11天</td>
			<td colspan="4">换液（-180 mL / +180 mL）或收获细胞</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>第12天</td>
			<td colspan="4">换液（-180 mL / +180 mL）或收获细胞</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>第13天</td>
			<td colspan="4">收获细胞</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：工艺时间线及概述。 本表格总结了当前一项临床试验 [NCT05480449] 中采用的T细胞转导（TCT）工艺步骤。该工艺从第0天开始，首先通过&#160;CD4+/CD8+ 选择&#160;进行T细胞富集，&#160;接种培养并激活；第1天进行转导。细胞静置48小时后，进行培养液洗涤，将培养体积增加至200 mL，并采用摇动机制进行振荡培养。第6天采集第一个过程中的样品。当获得的细胞数量足以提供至少三个完整剂量的CAR-T细胞（若患者体重&lt;50 kg，则为5 × 106 CAR-T细胞/kg；否则为2.5 × 108 CAR-T细胞）并完成质量控制检测（约需2 × 106 CAR-T细胞）；或当培养总细胞数达到4-5 × 109 个时，即可收获细胞。缩写：TCT = T细胞转导；CAR-T = 嵌合抗原受体T细胞；MACS = 磁珠激活细胞分选。

<table><tbody><tr><td>12 x 75 硼硅酸盐管</td><td>查尔斯河实验室</td><td>TL1000</td><td></td></tr><tr><td>20 mL 试剂袋</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-631</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 一次性离心管</td><td>Fisher</td><td>05-539-10</td><td></td></tr><tr><td>150 mL 转移套装</td><td>Fenwal</td><td>4R2001</td><td></td></tr><tr><td>2,000 mL 转移套装</td><td>Fenwal</td><td>4R2041</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>Fisher Scientific</td><td>BDB559925</td><td></td></tr><tr><td>酒精消毒</td><td>泰科/医疗</td><td></td><td></td></tr><tr><td>袋通路</td><td>Medline</td><td>2300E-0500</td><td></td></tr><tr><td>CD19 APC-Vio770 REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-113-643</td><td></td></tr><tr><td>CD19 CAR 检测试剂 生物素</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-129-550</td><td></td></tr><tr><td>CD19 PE</td><td>BD</td><td>555413</td><td></td></tr><tr><td>CD3 APC</td><td>BD</td><td>340440</td><td></td></tr><tr><td>CD4 VioBright FITC REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-113-229</td><td></td></tr><tr><td>CD45 VioBlue REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-637</td><td></td></tr><tr><td>CD8 APC-Vio770 REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-681</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer 10微米参考微球</td><td>Nexcelom</td><td>B10-02-020</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer 15微米参考微球</td><td>Nexcelom</td><td>B15-02-010</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer 5微米参考微球</td><td>Nexcelom</td><td>B05-02-050</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer 载玻片</td><td>Nexcelom</td><td>CHT4-SD100-002</td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS CD4 GMP 微珠</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>276-01</td><td>CD4试剂</td></tr><tr><td>CliniMACS CD8 GMP 微珠</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>275-01</td><td>CD8试剂</td></tr><tr><td>CliniMACS PBS/EDTA缓冲液</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-021-201</td><td>缓冲液</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>奥里根</td><td>CP-10</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 冻存袋</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>200-074-400</td><td></td></tr><tr><td>冻存管，1.8 mL</td><td>Nunc</td><td>12565171N</td><td></td></tr><tr><td>冻存管，4.5 mL</td><td>Nunc</td><td>12565161N</td><td></td></tr><tr><td>人AB型血清</td><td>Valley Biomedical</td><td></td><td>经无菌过滤、热灭活</td></tr><tr><td>人血清白蛋白 25%</td><td>Grifols</td><td>68516-5216-1</td><td></td></tr><tr><td>人血清白蛋白 5%</td><td>Grifols</td><td>68516-5214-1</td><td></td></tr><tr><td>MACS GMP 重组人 IL-2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-148</td><td>细胞因子</td></tr><tr><td>MACS GMP T细胞激活剂</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>200-076-202</td><td>激活试剂</td></tr><tr><td>MycoSeq 支原体检测试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>4460623</td><td></td></tr><tr><td>针头，皮下注射用 14G</td><td>Medline</td><td>SWD200573</td><td></td></tr><tr><td>针头，SlideSafe 18G</td><td>BD</td><td>B-D305918</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头，2-200 &amp;mu;L，独立包装</td><td>Eppendorf</td><td>022492209</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头，50-1000 &amp;mu;L，独立包装</td><td>Eppendorf</td><td>022492225</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 移液管</td><td>Fisher</td><td>13-678-27F</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 移液管</td><td>Fisher</td><td>13-675-30</td><td></td></tr><tr><td>移液管 5 mL</td><td>Fisher</td><td>13-678-27E</td><td></td></tr><tr><td>Plasmalyte-A</td><td>巴克斯特</td><td>2B2544X</td><td>电解质溶液</td></tr><tr><td>Prodigy TS520 管路套装</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076- 600</td><td>管路套装</td></tr><tr><td>无菌区域</td><td>Medline</td><td>NON21001</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素 PE-Vio770</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-106-793</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 注射器</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>3 mL 注射器</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>30 mL 注射器</td><td>BD</td><td>302832</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 注射器</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>TexMACS GMP 培养基</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-306</td><td>培养基</td></tr><tr><td>三重采样适配器</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-609</td><td></td></tr><tr><td>病毒载体</td><td>CHOP 临床载体中心</td><td></td><td>huCART19</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td>The Baker Co</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellometer Auto 2000</td><td>Nexcelom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS Prodigy</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>200-075-301</td><td>处理器</td></tr><tr><td>程序降温仪</td><td>普拉纳/克里奥保存</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Endosafe nexgen-PTS150K</td><td>查尔斯河实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>梅特勒天平</td><td>Mettler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷藏离心机</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷藏离心机</td><td>Fisher Sci</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SCD 无菌管路焊接仪</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塞布拉试管封口机</td><td>Sebra</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Varitherm</td><td>巴克</td><td></td><td>干燥解冻装置</td></tr><tr><td>XN-330 血液分析仪</td><td>希森美康</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

自动化细胞处理器上的嵌合抗原受体t细胞制备

Chimeric Antigen Receptor T Cell Manufacturing on an Automated Cell Processor

嵌合抗原受体（CAR）-T细胞是一种有前景的免疫治疗策略，可用于治疗多种恶性与非恶性疾病。CAR-T细胞是经过基因改造的T细胞，可表达一种嵌合蛋白，该蛋白能够识别并结合细胞表面靶标，从而导致靶细胞被杀伤。传统的CAR-T细胞制备方法劳动强度大、成本高昂，且可能存在污染风险。CliniMACS Prodigy是一种自动化细胞处理系统，可在封闭环境中实现临床规模的细胞治疗产品制备，最大限度降低污染风险。整个处理过程在计算机控制下半自动进行，从而&#160;显著减少人为干预，节省时间，并降低操作变异性与错误率。
本文及视频描述了使用该设备制备CAR-T细胞的T细胞转导（TCT）过程。TCT过程包括CD4+/CD8+ T细胞富集、激活、用病毒载体进行转导、扩增以及收获。通过使用“操作矩阵”（Activity Matrix）功能，可对这些步骤的顺序和时间进行安排，从而对TCT过程进行广泛定制。我们逐步展示了符合现行药品生产质量管理规范&#160;(cGMP) 的CAR-T细胞制备流程，并讨论了支持新药临床试验申请（Investigational New Drug, IND）所需的放行检测和非临床实验。我们演示了&#160;采用&#160;半自动化工艺进行临床级CAR-T细胞制备的可行性，并讨论其优缺点。最后，我们介绍了一项正在进行的由研究者发起的临床试验，该试验针对儿童B细胞恶性肿瘤 [NCT05480449]，用以说明该制备工艺在临床环境中的实际应用。

NCT05480449 试验前三次 CAR-T 细胞制备运行的结果如下表 3 所示。每次运行的起始材料、载体、培养细胞因子以及 AB 血清浓度均保持一致。产物在第 7 或第 8 天收获。平均每日细胞增长率为 46%（总细胞数增加），表明 TCT 工艺在促进细胞扩增方面是有效的。这些结果提示，该处理器能够生产出一致且可重复的 CAR-T 细胞产品。
最终产品检测结果汇总于表4，表明CAR-T细胞符合质量控制标准。细胞活力介于88%至94%之间，CD3 T细胞纯度为89%-93%。重要的是，内毒素、支原体、无菌性、复制型慢病毒以及残留白血病细胞均未检出。这些结果证实TCT工艺可生产出符合临床应用监管标准的高质量CAR-T细胞。
本实验建立了三个流式细胞术检测方案（图3）。其中包括用于检测富集前后CD4+和CD8+ T细胞百分比的CD4/CD8检测方案，用于评估转导效率的CD19 CAR-T检测方案，以及用...

本文详细介绍了用于临床的嵌合抗原受体T细胞的制备工艺，特别是使用能够进行病毒转导和T细胞培养的自动化细胞处理设备。我们提供了相关建议，并描述了在早期临床试验的工艺开发与实施过程中应注意的潜在问题。

自动化细胞处理器上的嵌合抗原受体T细胞制备

嵌合抗原受体（CAR）-T细胞是一种具有前景的免疫治疗策略，可用于治疗多种恶性及非恶性疾病。

本方案的优势在于它是一个半自动化的封闭系统，同时仍具有灵活性。劳动密集型步骤由计算机控制的自动化系统完成，由于由计算机运行，用户可自定义其操作流程。所有步骤均在封闭系统中进行。我们发现，医院中常见的干细胞实验室具备以显著低于商业替代方案的成本生产临床级CAR-T细胞的能力。我们认为，我们的工艺可轻松适应于制备针对其他靶点的CAR-T细胞，并可用于生产其他类型的细胞与基因治疗产品。我们的团队正准备探索其他CAR-T细胞靶点以及新型基因疗法。从更广泛的角度来看，细胞与基因治疗领域正在迅速发展，我们期待继续在这一充满前景的领域中提供支持并推动创新。首先打开仪器，然后从触摸屏界面中选择T细胞转导流程。单击“运行”以启动程序，并按照屏幕上的提示操作。在周长输入界面，输入操作员姓名缩写、管路套装批号和有效期。接下来，在流程设置界面选择“完整流程”。然后为CD4 CD8选择方法选择两瓶选择试剂。安装管路套件，确保所有下方连接处均紧密连接，并按照触摸屏上的说明完成上下部分的完整性测试。然后根据屏幕提示连接培养基和处理缓冲液袋，开始管路套件的自动预充。当“转移细胞产物”屏幕出现时，将解冻的T细胞产物转移至150毫升转移袋中，并以无菌焊接方式将其连接至管路套件的应用袋。接下来，使用质控袋从应用袋中获取样本，并使用血液分析仪进行细胞计数。将 CD4 和 CD8 试剂瓶连接至管路装置，启动 T 细胞富集的选择过程。富集完成后，从再应用袋的质控袋中取出部分已选细胞样本。输入所需的细胞浓度和起始数量。现在根据屏幕上的说明连接一瓶激活试剂，然后将培养箱中的二氧化碳浓度设置为5%，温度设置为39摄氏度。以增强喂养方案为起点建立操作矩阵，并根据您特定的优化方案修改各个步骤。在此情况下，将转导活性时间设置为接种后24小时，培养洗涤设置为转导后48小时。将激活摇床时间设置为培养洗涤开始后30分钟。删除任何培养基袋更换和废液袋更换操作，因为这些步骤已不再需要。然后在屏幕上按“确定”以启动培养。让仪器自动将重应用袋中所需体积的液体泵入培养室。将计算好的载体体积加入20毫升试剂袋中，并加入冷培养基，使最终体积达到10毫升。调整操作矩阵，将转导时间设置为未来两分钟，然后按“确定”以启动转导操作。根据屏幕上的指示，将病毒载体袋与管路组件进行无菌焊接。根据实际的转导开始时间修改操作矩阵，安排在转导后48小时进行培养物洗涤。将激活摇床的时间设定为培养物清洗后30分钟。最后，确保在第六天下午2:00 PM进行培养基更换。按下“取样”按钮，并按照屏幕提示从活跃培养物中获取质量控制样品。将样品分为三份，每份一毫升，用于不同的分析。制备最终配方缓冲液，并保留一部分用于后续的冷冻保护剂制备。接下来，调整活性矩阵，将培养结束时间设定为两分钟后。将最终配制缓冲液连接至管路系统，并开始收集。封闭并取下目标细胞袋。此袋中含有可供输注或冷冻保存的CAR T细胞。临床试验中CAR-T细胞的扩增率达到46%，表明TCT工艺能有效促进细胞扩增。终产品细胞活力为88%至94%，CD3 T细胞纯度为89%至93%。内毒素、支原体、无菌性、复制型慢病毒以及残留白血病细胞均未检出。

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在自动化细胞处理器上制造嵌合抗原受体T细胞

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