Name: 用于小鼠胰腺活体成像的稳定窗口 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: 学习SWIP技术用于小鼠胰腺活体成像，实现亚细胞分辨率长期观察。该方法通过稳定窗口和微定位技术，支持胰腺腺癌、胰腺炎及健康胰腺的纵向研究，为疾病机制和治疗策略提供重要见解。

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伊芙琳·利珀慈善基金会、格鲁斯-利珀生物光子学中心、癌症研究综合成像项目、美国国立卫生研究院 T-32 奖学金（CA200561）以及美国国防部胰腺癌研究计划（PCARP）资助项目 PA210223P1。

本方案中描述的所有操作均遵循脊椎动物使用相关的指南和法规，并已事先获得阿尔伯特·爱因斯坦医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 窗口钝化
注意：不锈钢的钝化处理可清除金属表面的污染物，并形成一层薄氧化层，从而显著提高金属与软组织的生物相容性，甚至超过钛的生物相容性16。
<ol>
	<li>通过使用1%（w/v）具有酶活性的洗涤剂溶液清洗光学窗口框，开始钝化过程。</li>
	<li>将框体浸入玻璃瓶中的5%（w/v）氢氧化钠溶液，在70 °C下处理30分钟。</li>
	<li>取出框体，并用去离子水冲洗。</li>
	<li>将框体浸入新玻璃瓶中的7%（w/v）柠檬酸溶液，在55 °C下处理10分钟。</li>
	<li>取出框体，并再次用去离子水冲洗。</li>
	<li>重复步骤1.2，最后再用去离子水对窗口框进行一次彻底冲洗。</li>
</ol>
2. 肿瘤移植或窗口手术的准备工作
注意：对于胰腺肿瘤的研究，必须先将肿瘤细胞植入并使其生长形成明显的肿瘤。为了在活体中可视化肿瘤细胞，建议使用经过基因改造、可表达荧光蛋白（如 Dendra2）的细胞。&#160;选择亮度高的荧光蛋白标记有助于减轻组织自发荧光可能带来的干扰。其他可用的荧光蛋白、染料以及基因编码的荧光小鼠模型已在其他文献中讨论过17,18。为防止手术区域污染，应在生物安全柜或层流柜中进行手术操作，并确保分别设置准备区、手术区和恢复区。
<ol>
	<li>手术前，将所有手术器械在高压灭菌器中灭菌，必要时在后续操作中使用热珠灭菌器。确保手术采用仅更换尖端的技术。</li>
	<li>打开加热手术垫和热珠灭菌器，并等待其达到适当的运行温度。应使用表面温度计监测加热垫温度，以避免可能的烫伤。若温度无法充分控制，可在加热垫上覆盖一层无菌布。 
	注意：在使用加热手术垫的情况下，短时间手术（≤20 分钟），如肿瘤或窗口植入术，对小鼠体温影响较小。然而，在长时间麻醉过程中，例如进行延时成像时，需将小鼠置于加热舱内以维持其体温。</li>
	<li>在麻醉舱中使用 5% 异氟烷对小鼠进行麻醉。</li>
	<li>关键步骤：当小鼠失去意识后，将麻醉浓度降低至 2%。密切监测麻醉深度及小鼠的生命体征（例如，使用脉搏血氧仪）19。</li>
	<li>在小鼠每只眼睛上各滴一小滴眼用润滑剂，以防止角膜干燥。</li>
	<li>手术前，在小鼠左上腹部充分涂抹脱毛膏以去除毛发。20 秒后，用湿润的纸巾用力擦去毛发和脱毛膏。根据需要重复该过程，直至手术区域的所有毛发被清除。</li>
	<li>皮下注射 10 µL 布托啡诺（0.1 mg/kg），用 90 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）稀释，以确保术前镇痛。</li>
</ol>
3. 胰腺肿瘤移植
<ol>
	<li>根据肿瘤细胞倍增时间，制备所需浓度的肿瘤细胞分装液。将细胞悬液置于胰岛素注射器中，并置于冰上保存。按照本方案操作时，使用 106 个同源 KPC 肿瘤细胞20，悬浮于最多 50 µL 的 PBS 中，具体操作参照 Erstad 等人改编的原位注射方案21。 
	注意：以该浓度注射此细胞系通常可在 10–14 天内形成可触及或大小合适的肿瘤。其他胰腺癌细胞系或该细胞系的亚克隆需另行评估合适的注射浓度和成瘤时间，以获得适当大小的肿瘤。</li>
	<li>使用抗菌皂洗手。</li>
	<li>每次新手术前，佩戴新的无菌手套。</li>
	<li>将小鼠转移至无菌手术罩内，并置于部分右侧卧位。</li>
	<li>用纸胶带固定四肢。 
	注意：在整个操作过程中，正确使用器械至关重要。持镊子、Castroviejo 剪刀和真空拾取工具的示例见图 2A–C。</li>
	<li>使用抗菌剂对腹部进行消毒（图 2D）。</li>
	<li>通过脚趾夹捏试验确认动物已完全麻醉。</li>
	<li>使用镊子和 Castroviejo 剪刀在皮肤上做一条 10–15 mm 的左侧肋下切口（图 2E）。</li>
	<li>根据需要，使用棉签或电凝笔控制止血。</li>
	<li>使用镊子和 Castroviejo 剪刀小心切开下方肌肉组织，进入腹膜腔（图 2F）。</li>
	<li>使用无菌棉签无创地将胰腺和脾脏外置。</li>
	<li>将胰腺展开，确保无皱褶（图 2G）。</li>
	<li>在胰腺体部或尾部选择理想的肿瘤注射部位（避开血管）。</li>
	<li>关键步骤：在仔细调整胰腺位置后，使用镊子牵拉组织以提供张力，将胰岛素注射器针尖（斜面朝上）插入胰腺目标部位，深度为 4–5 mm（图 2H）。</li>
	<li>缓慢注射肿瘤细胞悬液。观察是否出现小气泡，以确认注射成功（图 2I）。</li>
	<li>小心地将胰腺复位至腹腔内，避免扰动肿瘤细胞注射形成的气泡（图 2J）。</li>
	<li>使用可吸收的 5-0 聚二氧杂环己酮缝线，先缝合肌肉层，&#160;然后用&#160;间断缝合&#160;关闭皮肤（图 2K–N）。</li>
	<li>用氰基丙烯酸酯胶水覆盖切口（图 2O），然后将小鼠放回清洁笼具中，并置于加热灯下恢复。在饮水中给予抗生素以预防感染。密切监测小鼠状态，直至其完全从手术中恢复。 
	注意：抗生素的使用需符合 IACUC 协议要求。所有动物均单独饲养。</li>
	<li>让肿瘤发育 10–14 天，直至可通过腹壁触诊到肿瘤。</li>
</ol>
4. 胰腺窗手术
<ol>
	<li>当动物准备就绪进行成像时，开始窗口植入手术。首先，使用抗菌皂洗手。</li>
	<li>每次新手术前，均需戴上新的无菌手套。</li>
	<li>将小鼠置于加热的手术台上，呈右侧卧位，以暴露左侧腹部。</li>
	<li>使用纸胶带将小鼠的前肢和后肢分别固定在加热手术台的头端和尾端。确保脾脏（位于皮肤下方）在手术视野内可见（图3A）。</li>
	<li>为保持无菌环境，所有手术器械均应在生物安全柜内拆包。</li>
	<li>用足量的抗菌剂擦拭小鼠皮肤，对手术区域进行消毒。</li>
	<li>通过脚趾夹捏测试确认动物已完全麻醉。</li>
	<li>关键步骤：用镊子提起腹部左上象限的皮肤，使用Castroviejo剪刀在皮肤和肌肉层上做一个约10 mm的环形切口（图3B、C）。</li>
	<li>根据需要，使用棉签或电凝笔控制出血并维持止血状态。</li>
	<li>定位与脾脏相连的胰腺，并确定胰腺在切口内的走向，以决定支撑用十字缝合线的放置位置。</li>
	<li>使用5-0丝线缝合，在肌肉层的预定位置打第一针，末端打3–5个结（图3D、E）。</li>
	<li>继续在切口正上方直接缝合，剪断线头并留出约5 cm的尾线（图3F）。</li>
	<li>在与第一针垂直的方向重复步骤4.11和4.12（图3G、H）。</li>
	<li>关键步骤：轻柔地提起并调整胰腺位置，使其覆盖在十字缝合线上（图3I、J）。操作过程中注意避免损伤胰腺。</li>
	<li>关键步骤：使用5-0丝线，在距离孔洞约1 mm处围绕切口边缘进行荷包缝合，贯穿皮肤和肌肉层（图3K）。</li>
	<li>放置窗口框架，使圆形切口的边缘嵌入窗口的凹槽内（图3L）。</li>
	<li>通过牢固打结固定5-0丝线，将植入的窗口固定到位。</li>
	<li>将100 µL液体氰基丙烯酸酯粘合剂装入1 mL注射器中。</li>
	<li>用轻柔的压缩空气吹拂组织约10秒，使其干燥。</li>
	<li>用镊子夹住窗口框架的外缘，轻轻抬起，确保胰腺与窗口框架底面分离。</li>
	<li>关键步骤：沿窗口的凹槽均匀挤出一层薄薄的液体氰基丙烯酸酯粘合剂（图3M）。注意切勿将粘合剂沾到胰腺组织上。</li>
	<li>使用真空拾取器提起5 mm盖玻片。</li>
	<li>小心地将盖玻片放置在光学窗口框架中心的凹槽内，轻轻按压固定，使氰基丙烯酸酯粘合剂固化（约25秒）。</li>
	<li>用镊子将盖玻片从真空拾取器上分离。</li>
	<li>收紧十字缝合线，将胰腺牢固地贴附在盖玻片上（图3N、O）。注意：切勿过度收紧十字缝合线，以免造成胰腺损伤或缺血。</li>
	<li>剪断缝线末端。</li>
	<li>从小鼠身上移除胶带。</li>
	<li>关闭异氟烷蒸发器。</li>
	<li>将小鼠转移至清洁的笼盒，或直接送至活体显微镜进行成像。</li>
	<li>手术后将动物单独饲养，并持续监测直至完全恢复&#160;&#160;。</li>
	<li>随后使用双激光多光子显微镜进行成像，具体方法如我们先前所述22、23、24。对于长时间成像，小鼠应置于加热腔室内以维持体温，并根据IACUC标准提供支持性液体。</li>
</ol>
5. 采用雨蛙素处理诱导胰腺炎
<ol>
	<li>为研究胰腺炎的发病机制，在植入SWIP后，对健康小鼠给予雨蛙素（cerulein）处理。确保小鼠禁食14–18小时，并给予 随意摄取 在给予胆囊收缩素前给予水。</li>
	<li>每小时腹腔注射一次50 µg/kg的雨蛙素（cerulein），每次注射体积为100 µL无菌1x DPBS，共注射八次。对照组小鼠以相同体积的1x DPBS单独腹腔注射。</li>
	<li>成像后，根据IACUC标准，在首次注射后24小时通过颈椎脱位处死小鼠。</li>
	<li>在双激光多光子显微镜上进行成像，操作步骤如前所述22,23,24对于长时间成像实验，应将小鼠置于加热舱内以维持其体温，并根据IACUC标准为其提供支持性液体。</li>
</ol>

Murine Pancreatic Imaging Using Implanted Stabilized Window

<ol><li>Peery, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+and+cost+of+gastrointestinal%2C+liver%2C+and+pancreatic+diseases+in+the+United+States%3A+Update+2021%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Burden and cost of gastrointestinal, liver, and pancreatic diseases in the United States: Update 2021.</a> Gastroenterology. 162 (2), 621-644 (2022).</li>
<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2023%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2023.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 73 (1), 17-48 (2023).</li>
<li>Adamska, A., Domenichini, A., Falasca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+ductal+adenocarcinoma%3A+Current+and+evolving+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pancreatic ductal adenocarcinoma: Current and evolving therapies.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1338(2017).</li>
<li>Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+techniques+for+biomedical+and+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging techniques for biomedical and clinical research.</a> Cytometry A. 97 (5), 448-457 (2020).</li>
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<li>Harney, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+reveals+local%2C+transient+vascular+permeability%2C+and+tumor+cell+intravasation+stimulated+by+TIE2hi+macrophage-derived+VEGFA%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging reveals local, transient vascular permeability, and tumor cell intravasation stimulated by TIE2hi macrophage-derived VEGFA.</a> Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).</li>
<li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+permanent+window+for+the+murine+lung+enables+high-resolution+imaging+of+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis.</a> Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).</li>
<li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+through+an+abdominal+imaging+window+reveals+a+pre-micrometastasis+stage+during+liver+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis.</a> Science Translational Medicine. 4 (158), 158ra145(2012).</li>
<li>Park, K., You, J., Du, C., Pan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cranial+window+implantation+on+mouse+cortex+to+study+microvascular+change+induced+by+cocaine%5BTitle%5D)+AND+%22Quantitative+Imaging+in+Medicine+and+Surgery%22%5BJournal%5D)">Cranial window implantation on mouse cortex to study microvascular change induced by cocaine.</a> Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 5 (1), 97-107 (2015).</li>
<li>Beerling, E., Oosterom, I., Voest, E., Lolkema, M., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+characterization+of+tumor+cell+migration+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Intravital%22%5BJournal%5D)">Intravital characterization of tumor cell migration in pancreatic cancer.</a> Intravital. 5 (3), e1261773(2016).</li>
<li>Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+to+study+cancer+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging to study cancer progression and metastasis.</a> Nature Reviews: Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).</li>
<li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((time-lapsed%2C+large-volume%2C+high-resolution+intravital+imaging+for+tissue-wide+analysis+of+single+cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics.</a> Methods. 128, 65-77 (2017).</li>
<li>Park, I., Hong, S., Hwang, Y., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+pancreatic+imaging+window+for+stabilized+longitudinal+in+vivo+observation+of+pancreatic+islets+in+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+%26+Metabolism+Journal%22%5BJournal%5D)">A novel pancreatic imaging window for stabilized longitudinal in vivo observation of pancreatic islets in murine model.</a> Diabetes & Metabolism Journal. 44 (1), 193-198 (2020).</li>
<li>Du, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWIP-a+stabilized+window+for+intravital+imaging+of+the+murine+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology+Journal%22%5BJournal%5D)">SWIP-a stabilized window for intravital imaging of the murine pancreas.</a> Open Biology Journal. 12 (6), 210273(2022).</li>
<li>DeBold, T. A. M., James, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDeBold%2C+TAM+%22How+To+Passivate+Stainless+Steel+Parts%22">How To Passivate Stainless Steel Parts</a>. , https://www.mmsonline.com/articles/how-to-passivate-stainless-steel-parts (2003).</li>
<li>Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+absorption+properties+of+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon absorption properties of fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 8 (5), 393-399 (2011).</li>
<li>Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+two-photon+imaging+of+in+vivo+cellular+pathophysiology+upon+influenza+virus+infection+using+the+two-photon+IMPRESS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS.</a> Nature Protocols. 15 (3), 1041-1065 (2020).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

本文所述的SWIP技术通过采用十字缝合篮式方法，改进了胰腺组织的稳定方式。早期的腹部成像窗口（AIW）虽实现了腹腔内器官的活体成像（IVI），但未能有效限制胰腺等软组织的移动。为此，Park等人开发了一种胰腺成像窗口（PIW），该窗口包含一个水平金属支架，可在保持与玻璃盖玻片接触的同时，更好地稳定胰腺组织。尽管该方法改善了侧向稳定性，但由于实体胰腺肿瘤的尺寸通常超过支架与盖玻片之间的狭窄空间，因而限制了对这类肿瘤的成像。SWIP技术通过使用十字缝合篮式结构固定胰腺，有效限制了组织的轴向和侧向移动，同时能够容纳较大尺寸（≤10 mm）的实体肿瘤，从而解决了这一问题。
此前已对SWIP与先前的成像窗（如AIW和PIW）进行了直接比较15。这一点在图1中有所展示，该图改编自Du等人的研究15，其中通过追踪细胞解剖特征（如细胞核或血管）来量化横向和轴向位移。所有成像窗在成像开始后的约第一个小时内均表现出一定的稳定期需求。在此期间，AIW...

良性和恶性胰腺疾病均可能危及生命，目前对其病理生理学的理解仍存在显著空白。胰腺炎（即胰腺的炎症）是美国因胃肠道疾病导致住院和再入院的第三大主要原因，与较高的发病率、死亡率以及社会经济负担密切相关1。胰腺导管腺癌（PDAC）是癌症相关死亡的第三大主要原因2，占绝大多数胰腺恶性肿瘤病例3，其5年生存率仅为11%2。PDAC患者癌症相关死亡的主要原因是严重的转移性负担。遗憾的是，大多数患者在初诊时已处于转移阶段。因此，深入理解PDAC中转移的动态过程，是当前癌症研究领域亟待解决的关键科学问题。
胰腺炎性反应及转移级联过程的机制目前尚不明确。造成这一知识空白的主要原因是无法在活体（in vivo）条件下观察胰腺细胞的动态变化。对这些细胞动态进行直接观察，有望揭示关键的干预靶点，从而提升胰腺疾病患者的诊断与治疗水平。
活体成像（IVI）是一种显微技术，可使研究人员实时观察和研究活体动物中的生物学过程。IVI 能够在生物过程所处的天然环境中，以高分辨率直接可视化细胞内和微环境动态的 in vivo 过程。因此，IVI 实现了对生理和病理过程的 in vivo 观察。
目前的全身成像技术，如磁共振成像（MRI）、正电子发射断层扫描（PET）和计算机断层扫描（CT），能够清晰显示整个器官，并可在临床症状出现之前发现病理变化4。然而，这些技术无法达到单细胞分辨率，也无法揭示疾病（如胰腺炎或恶性肿瘤）的最早期阶段。
既往研究已采用单细胞分辨率的活体成像技术（IVI）观察了皮肤5,6、乳腺7、肺8、肝9、脑10以及胰腺肿瘤11中的良性和恶性疾病，从而揭示了疾病进展的机制12。然而，小鼠胰腺由于其深部内脏位置和高顺应性，使用IVI实现单细胞分辨率面临显著障碍。此外，胰腺是位于肠系膜内的一种分支状、弥散分布的器官，与脾脏、小肠和胃相连，因此难以接近。该组织还对邻近器官的蠕动和呼吸所引起的运动高度敏感。为了实现单细胞分辨率显微成像，必须最大限度减少胰腺的移动，因为即使仅有数微米的运动伪影也会导致图像模糊和失真，使单个细胞动态的追踪成为不可能13。
为了进行活体成像（IVI），必须通过手术植入腹部成像窗（AIW）9,11。手术植入AIW时，需将一个金属窗框缝合至腹壁。随后，使用氰基丙烯酸酯胶将目标器官固定在窗框上。虽然这种方法适用于某些结构较坚硬的内脏器官（如肝脏、脾脏、坚硬的肿瘤），但在对健康小鼠胰腺进行成像时，由于胰腺组织质地柔软且结构复杂，其侧向和轴向稳定性不佳，导致成像效果不理想14。为克服这一局限性，Park等人14开发了一种专用于健康胰腺的成像窗。这种胰腺成像窗（PIW）在窗框内、盖玻片正下方设置了一个水平金属支架，可减少肠道运动和呼吸带来的干扰，从而稳定组织并维持其与盖玻片的接触。尽管PIW提高了侧向稳定性，但我们发现该装置仍存在轴向漂移问题，并且由于金属支架与盖玻片之间的间隙较窄，无法用于大体积实性肿瘤的成像15。
为了解决这些局限性，我们开发了 S稳定的 W窗口为 我活体成像小鼠 PSWIP（胰腺成像窗），一种可植入的成像窗口，能够实现对健康与病变胰腺的稳定长期成像图1)15在此，我们提供了一套完整的SWIP植入手术操作方案。尽管该技术的主要目的是研究转移过程中的动态机制，但也可用于探索胰腺生物学与病理学的多个方面。

<table><tbody><tr><td>1% (w/v) 酶活性去垢剂溶液</td><td>Alconox Inc</td><td>NA</td><td>浓缩型阴离子去垢剂，含蛋白酶，适用于手工和超声波清洗</td></tr><tr><td>5% (w/v) 氢氧化钠溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>钝化试剂</td></tr><tr><td>5 mm 盖玻片</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72296-05</td><td>圆形玻璃盖玻片&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>7% (w/v) 柠檬酸溶液</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>251275</td><td>钝化试剂</td></tr><tr><td>28G 1 mL BD 胰岛素注射器</td><td>BD</td><td>329410</td><td>用于细胞注射的注射器</td></tr><tr><td>Baytril 100 (enrofloxacin)</td><td>Bayer (Santa Cruz Biotechnology)</td><td>sc-362890Rx</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>台式加热灯</td><td>McMaster-Carr</td><td>3349K51</td><td>加热灯</td></tr><tr><td>布托啡诺 0.3 mg/mL</td><td>Covetrus North America</td><td>059122</td><td>布托啡诺镇痛剂</td></tr><tr><td>Castroviejo 弯头剪刀</td><td>World Precision Instruments</td><td>WP2220</td><td>用于组织切割的剪刀</td></tr><tr><td>C57BL/6J 小鼠</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000664&amp;nbsp;</td><td>C57BL/6J 小鼠</td></tr><tr><td>氯己定溶液</td><td>Durvet</td><td>7-45801-10258-3</td><td>氯己定消毒液</td></tr><tr><td>压缩空气罐</td><td>Falcon</td><td>DPSJB-12</td><td>用于干燥组织的压缩空气</td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯 - 凝胶型超级胶水</td><td>Staples</td><td>234790-6</td><td>皮肤粘合胶</td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯 - 液体型超级胶水</td><td>Staples</td><td>LOC1647358</td><td>盖玻片粘合胶</td></tr><tr><td>DPBS 1x</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>用于cerulein/细胞注射的DPBS</td></tr><tr><td>Gemini 电凝套装</td><td>Harvard Apparatus</td><td>726067</td><td>电凝笔</td></tr><tr><td>Germinator 500</td><td>CellPoint Scientific</td><td>GER&amp;nbsp;5287-120V</td><td>珠式灭菌器</td></tr><tr><td>Graefe 微型解剖镊；带齿；轻微弯曲；0.8 mm 尖端宽度；4&quot; 长度</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5135&amp;nbsp;</td><td>Graefe 微型解剖镊</td></tr><tr><td>成像显微镜</td><td>NA</td><td>NA</td><td>参见 Entenberg 等，2011 [27]</td></tr><tr><td>成像软件</td><td>NA</td><td>NA</td><td>参见 Entenberg 等，2011 [27]</td></tr><tr><td>Isoethesia (异氟烷)</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>50033</td><td>异氟烷麻醉剂</td></tr><tr><td>Kim Wipes 擦拭纸</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A&amp;nbsp;</td><td>Kim Wipes 擦拭纸</td></tr><tr><td>实验室胶带</td><td>Fisher Scientific</td><td>159015R</td><td>实验室胶带</td></tr><tr><td>小鼠解剖工具包</td><td>World Precision Instruments</td><td>MOUSEKIT</td><td>外科器械</td></tr><tr><td>小鼠足垫脉搏血氧传感器</td><td>Kent Scientific Corpo</td><td>MSTAT Sensor-MSE</td><td>脉搏血氧仪</td></tr><tr><td>Mouse Surgisuite</td><td>Kent Scientific</td><td>SURGI-M04</td><td>加热平台</td></tr><tr><td>Nair 脱毛乳液</td><td>Amazon</td><td>B001RVMR7K</td><td>脱毛剂乳液</td></tr><tr><td>氧气</td><td>TechAir</td><td>OX TM</td><td>氧气</td></tr><tr><td>PERMA-HAND 黑色编织丝线缝合线，ETHICON 5-0 规格</td><td>VWR</td><td>95056-872</td><td>丝线缝合线</td></tr><tr><td>1× 磷酸盐缓冲液</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td>PBS</td></tr><tr><td>PhysioSuite 系统</td><td>Kent Scientific</td><td>PhysioSuite</td><td>加热平台控制器</td></tr><tr><td>Puralube</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>008897</td><td>眼用润滑剂</td></tr><tr><td>Puritan 非无菌棉签&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>867WCNOGLUE</td><td>棉签</td></tr><tr><td>SHARP 精密屏障吸头，适用于 P-100，100 &amp;micro;L</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>P1125</td><td>100 &amp;micro;L 移液吸头</td></tr><tr><td>四甲基罗丹明异硫氰酸酯&amp;ndash;葡聚糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1287-500MG</td><td>血管标记物</td></tr><tr><td>窗式固定板</td><td>NA</td><td>NA</td><td>专用于将观察窗固定在显微镜载物台上的定制板。该板由厚度为 0.008 英寸的不锈钢薄片制成。具体尺寸参见 Entenberg 等，2018 [8]。</td></tr><tr><td>窗式框架</td><td>NA</td><td>NA</td><td>观察窗由一个带中央开口的钢制框架构成，可容纳一个 5 mm 盖玻片。框架周围绕有一圈 1.75 mm 的凹槽，为腹膜肌肉和皮肤层提供附着空间。参见 Entenberg 等，2018 [8]。</td></tr></tbody></table>

小鼠胰腺活体成像的稳定窗口技术

Stabilized Window for Intravital Imaging of the Murine Pancreas

胰腺的生理学与病理生理学十分复杂。胰腺疾病（如胰腺炎和胰腺导管腺癌（PDAC））具有较高的发病率和死亡率。活体成像（IVI）是一种强大的技术，能够在健康和疾病状态下对组织进行高分辨率成像，实现对细胞动态的实时观察。由于小鼠胰腺位于腹腔深处且组织柔软，极易受到损伤并产生运动伪影，因此对其进行活体成像面临重大挑战。
本文描述了用于小鼠胰腺活体成像的稳定窗植入技术（Stabilized Window for Intravital imaging of the murine Pancreas, SWIP）的操作流程。SWIP 可实现对小鼠胰腺在正常健康状态、由胆囊收缩素诱导从健康胰腺向急性胰腺炎转变的过程，以及胰腺肿瘤等恶性状态下的活体成像。结合遗传标记细胞或荧光染料注射，SWIP 能够检测单细胞及亚细胞水平的动态过程（包括单个细胞和集体迁移行为），并支持对同一感兴趣区域进行连续多日的重复成像。
捕获肿瘤细胞迁移能力具有重要意义，因为胰腺导管腺癌（PDAC）相关死亡的主要原因是严重的转移负担。了解PDAC中转移的生理动态是目前尚未满足的关键需求，对于改善患者预后至关重要。总体而言，SWIP提供了更优的成像稳定性，拓展了活体成像技术（IVI）在健康胰腺及恶性胰腺疾病中的应用范围。

图1 改编自 Du 等人的研究15，展示了小鼠胰腺时间推移体内成像（IVI）视频中的图像帧。在初始稳定期（成像的前一小时，图1A）内可观察到一定程度的组织运动。然而，在此稳定期之后继续成像（>75 分钟），我们观察到横向和轴向稳定性有所提高（图1B）。将 SWIP 与先前的 AIW 和 PIW 成像窗口的稳定性进行比较后发现，所有窗口均需要一段初始稳定时间。但总体而言，SWIP 表现出最低的漂移水平，最适合长期成像（图1C-K）。图像采集使用自行搭建的双光子显微镜24，激发波长为 880 nm，以每帧间隔 1.7 分钟获取 z 轴堆栈时间序列（视野 [FOV] 大小 = 340 × 340 µm，像素大小 0.67 µm），共 11 层切片...

我们介绍一种用于小鼠胰腺亚细胞分辨率成像的稳定植入式光学窗口的外科手术植入方案，可实现对健康和病变胰腺的连续性及纵向研究。

胰腺的生理与病理生理机制十分复杂。胰腺疾病，如胰腺炎和胰腺导管腺癌（PDAC），具有……

通过采用高分辨率活体成像技术以及改进的胰腺稳定方法，我们旨在加深对胰腺导管腺癌、胰腺炎及正常胰腺生理动态的理解。该方法有助于弥补当前在病理生理学认知上的空白，有望推动这些高危疾病治疗策略的发展。单细胞分辨率的活体成像已揭示了多种组织中疾病进展的生理机制。然而，由于胰腺位置较深、组织顺应性高且易受运动伪影影响，无论是良性还是恶性病变，对其有效观察均存在独特挑战。我们的SWIP技术相较于以往的腹部成像窗口，显著增强了镜体与胰腺的稳定性。该框架采用独特设计，表面刻有用于微尺度定位的标线，可在多次成像过程中实现特定区域的一致性重新定位。这有助于在数天内测量亚细胞动态，提供有价值的见解。SWIP 方案能够实现对正常和疾病状态下小鼠镜像胰腺的稳定、高分辨率单细胞活体成像。该方法特别适用于长期的三维（3D）和四维（4D）成像，可深入揭示细胞间相互作用及疾病发生机制。该技术对于揭示胰腺生理学和病理学机制具有重要价值，可实现活体中单个细胞及其微环境的可视化。首先，将同源KPC肿瘤细胞配制成所需浓度的等分试样。将细胞悬液置于冰上，并保存在胰岛素注射器中。接下来，将麻醉后的小鼠转移至无菌手术罩内，并置于右侧轻度侧卧位。用纸胶带固定四肢。使用消毒剂对小鼠腹部进行消毒。使用镊子和Castroviejo剪刀在左侧肋缘下做一长度为10至15毫米的皮肤切口。必要时用棉签控制止血。使用电凝笔电凝血管。接下来，切开底层肌肉以进入腹膜腔。使用无菌棉签将胰腺和脾脏移出体外，以防止组织损伤。将胰腺展开，避免折叠。确定胰腺体部或尾部的肿瘤注射位点。仔细定位胰腺后，用镊子夹住组织，将胰岛素注射器针尖斜面向上插入约4至5毫米，然后缓慢注入肿瘤细胞悬液。成功的注射可通过形成一个小气泡来判断。操作结束时，小心地将胰腺放回腹腔，注意不要扰动气泡。缝合切口后，将小鼠放回置于加热灯下的清洁笼中。通过饮水给予抗生素，以预防任何感染。让肿瘤发育10至14天，直至可通过腹壁触诊感知。首先将麻醉后的小鼠置于加热的手术台上，右侧朝下，以暴露其左侧腹部。用纸胶带固定小鼠的前肢和后肢，确保脾脏可见。接着，充分涂抹消毒剂对术区皮肤进行消毒。通过脚趾夹捏测试确认小鼠已完全麻醉。使用镊子提起左上腹部的皮肤，用卡斯特罗维耶霍剪刀在皮肤和肌肉层上做一个10毫米的环形切口。找到附着于脾脏的胰腺，以确定十字缝合的方向。在已确定的位置，使用5-0丝线在肌肉层缝入第一针。用三到五个结固定末端。继续沿切口直接缝合，然后剪断缝线，留出约五厘米的线尾。重复缝合操作，此次缝合方向与原始缝线垂直。接着，小心提起胰腺并将其放置于交叉缝线上方。在距离孔洞约一毫米处的皮肤与肌肉层交界处，缝合一圈荷包缝线。将窗框放置到位，使圆形切口边缘位于窗框的凹槽内。接着，用5-0丝线紧密结扎，固定植入的窗片。将100微升液态氰基丙烯酸酯粘合剂装入10毫米注射器中。用压缩空气以柔和的气流对组织吹约10秒，使其干燥。使用镊子夹住玻窗框架的外缘，小心提起，确保胰腺与玻窗框架底部完全分离。沿玻窗的凹槽处滴加一层薄薄的液态氰基丙烯酸酯胶水，注意避开胰腺组织。然后，使用真空吸笔提起5毫米的盖玻片。轻轻将盖玻片置于光学窗口框架的中央，并保持轻微压力约25秒，使粘合剂固化。使用镊子将盖玻片从真空吸笔上取下。接下来，收紧十字缝合线以将胰腺固定在盖玻片上，并剪去缝合线末端。最后，移除小鼠身上的胶带。关闭异氟烷蒸发器，将小鼠转移至清洁的笼子中。在沉降期后，观察到胰腺组织的侧向和轴向稳定性增强。使用SWIP成像时，其漂移程度较腹部和胰腺成像窗口更低。在给予雨蛙素处理后，对小鼠胰腺进行了连续成像。连续两天观察到唇部重定位现象。SWIP还可用于长期成像，能够实现对液泡运动的可视化和定量分析。例如，与PBS处理相比，经胆囊收缩素处理后，小鼠胰腺中液泡的平均运动速度提高了约10%。胆囊收缩素处理还使亚细胞结构的平均转向频率增加了10%。然而，不同处理组之间的净速度、方向性或累积距离均无显著差异。SWIP技术可实现对肿瘤细胞迁移的可视化和捕获。在较短时间内观察到肿瘤细胞的集体簇状迁移。还观察到肿瘤细胞和巨噬细胞的单细胞迁移。

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癌症研究

用于小鼠胰腺活体成像的稳定窗口

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在本视频中，我们介绍了通过稳定窗口对小鼠胰腺进行活体成像，以实现对细胞动态的长期可视化观察。...

活体成像：通过稳定成像窗口在细胞水平观察小鼠胰腺的方法

利用胰腺活体成像窗实现了对胰腺的体内高分辨率成像。...

在小鼠模型中通过胰腺活体成像窗口实现胰腺的稳定纵向体内细胞水平可视化

本文介绍了一种利用光学透明硅胶窗进行长期活体成像的方法，该窗口可直接粘接于目标组织/器官及皮肤上。 与其他目前常用的方法相比，这些窗口成本更低且更具灵活性，且手术植入过程对动物造成的炎症反应和不适程度较轻。...

通过透明硅胶窗进行纵向活体成像

本方案描述了使用真空稳定成像窗口，通过多光子显微镜对完整肺组织进行长期、高分辨率、单细胞水平的实时成像技术。...

利用真空稳定成像窗实现肺部长期高分辨率活体显微成像

我们描述了一种利用靶向外周照射在小鼠中诱导类似疲劳行为的方法。选定的非致死照射剂量可导致小鼠自主转轮跑动活动减少，持续约一周时间。...

一种由外周照射诱导疲劳的小鼠模型

本方案描述了一种新建立的将病毒递送至小鼠前列腺的方法。该技术可通过CRISPR/Cas9技术、基因过表达或Cre重组酶递送，实现基因表达的原位调控，并建立一种新型的小鼠前列腺癌模型。...

病毒递送CRISPR向导RNA至小鼠前列腺以实现基因改造

使用N-丁基-N-(4-羟丁基)亚硝胺（BBN）致癌物诱导小鼠膀胱肿瘤。由于膀胱肿瘤的生成具有异质性，因此在将动物随机分配至实验治疗组之前，需要对肿瘤负荷进行准确评估。本文介绍了一种快速、可靠的磁共振成像（MRI）方案，用于评估肿瘤大小和分期。...

磁共振成像评估致癌物诱导的小鼠膀胱肿瘤

本文介绍了一种在同一只活体动物体内，对脑肿瘤细胞在侵入性外科手术干预（例如活检）前后进行高分辨率时间序列多光子成像的方法。该方法能够在单细胞水平上研究此类侵入性外科操作对肿瘤细胞迁移、侵袭和增殖行为的影响。...

对侵入性手术活检后脑肿瘤细胞行为的纵向活体成像

本方案概述了一种快速方法，可从出生0至4天的小鼠皮肤中同时建立黑色素细胞和成纤维细胞培养物。这些原代培养物可在体外进行维持和操作，用于研究多种生理相关过程，包括皮肤细胞生物学、色素沉着、伤口愈合以及黑色素瘤。...

快速建立原代小鼠黑色素细胞和成纤维细胞培养

学习SWIP技术用于小鼠胰腺活体成像，实现亚细胞分辨率长期观察。该方法通过稳定窗口和微定位技术，支持胰腺腺癌、胰腺炎及健康胰腺的纵向研究，为疾病机制和治疗策略提供重要见解。

小鼠胰腺活体成像的稳定窗口技术

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