小鼠胰腺活体成像的稳定窗口技术

通过采用高分辨率活体成像技术以及改进的胰腺稳定方法，我们旨在加深对胰腺导管腺癌、胰腺炎及正常胰腺生理动态的理解。该方法有助于弥补当前在病理生理学认知上的空白，有望推动这些高危疾病治疗策略的发展。单细胞分辨率的活体成像已揭示了多种组织中疾病进展的生理机制。

然而，由于胰腺位置较深、组织顺应性高且易受运动伪影影响，无论是良性还是恶性病变，对其有效观察均存在独特挑战。我们的SWIP技术相较于以往的腹部成像窗口，显著增强了镜体与胰腺的稳定性。该框架采用独特设计，表面刻有用于微尺度定位的标线，可在多次成像过程中实现特定区域的一致性重新定位。

这有助于在数天内测量亚细胞动态，提供有价值的见解。SWIP 方案能够实现对正常和疾病状态下小鼠镜像胰腺的稳定、高分辨率单细胞活体成像。该方法特别适用于长期的三维（3D）和四维（4D）成像，可深入揭示细胞间相互作用及疾病发生机制。

该技术对于揭示胰腺生理学和病理学机制具有重要价值，可实现活体中单个细胞及其微环境的可视化。首先，将同源KPC肿瘤细胞配制成所需浓度的等分试样。将细胞悬液置于冰上，并保存在胰岛素注射器中。

接下来，将麻醉后的小鼠转移至无菌手术罩内，并置于右侧轻度侧卧位。用纸胶带固定四肢。使用消毒剂对小鼠腹部进行消毒。

使用镊子和Castroviejo剪刀在左侧肋缘下做一长度为10至15毫米的皮肤切口。必要时用棉签控制止血。使用电凝笔电凝血管。

接下来，切开底层肌肉以进入腹膜腔。使用无菌棉签将胰腺和脾脏移出体外，以防止组织损伤。将胰腺展开，避免折叠。

确定胰腺体部或尾部的肿瘤注射位点。仔细定位胰腺后，用镊子夹住组织，将胰岛素注射器针尖斜面向上插入约4至5毫米，然后缓慢注入肿瘤细胞悬液。

成功的注射可通过形成一个小气泡来判断。操作结束时，小心地将胰腺放回腹腔，注意不要扰动气泡。缝合切口后，将小鼠放回置于加热灯下的清洁笼中。

通过饮水给予抗生素，以预防任何感染。让肿瘤发育10至14天，直至可通过腹壁触诊感知。首先将麻醉后的小鼠置于加热的手术台上，右侧朝下，以暴露其左侧腹部。

用纸胶带固定小鼠的前肢和后肢，确保脾脏可见。接着，充分涂抹消毒剂对术区皮肤进行消毒。通过脚趾夹捏测试确认小鼠已完全麻醉。

使用镊子提起左上腹部的皮肤，用卡斯特罗维耶霍剪刀在皮肤和肌肉层上做一个10毫米的环形切口。找到附着于脾脏的胰腺，以确定十字缝合的方向。在已确定的位置，使用5-0丝线在肌肉层缝入第一针。

用三到五个结固定末端。继续沿切口直接缝合，然后剪断缝线，留出约五厘米的线尾。

重复缝合操作，此次缝合方向与原始缝线垂直。接着，小心提起胰腺并将其放置于交叉缝线上方。在距离孔洞约一毫米处的皮肤与肌肉层交界处，缝合一圈荷包缝线。

将窗框放置到位，使圆形切口边缘位于窗框的凹槽内。接着，用5-0丝线紧密结扎，固定植入的窗片。将100微升液态氰基丙烯酸酯粘合剂装入10毫米注射器中。

用压缩空气以柔和的气流对组织吹约10秒，使其干燥。使用镊子夹住玻窗框架的外缘，小心提起，确保胰腺与玻窗框架底部完全分离。沿玻窗的凹槽处滴加一层薄薄的液态氰基丙烯酸酯胶水，注意避开胰腺组织。

然后，使用真空吸笔提起5毫米的盖玻片。轻轻将盖玻片置于光学窗口框架的中央，并保持轻微压力约25秒，使粘合剂固化。使用镊子将盖玻片从真空吸笔上取下。

接下来，收紧十字缝合线以将胰腺固定在盖玻片上，并剪去缝合线末端。最后，移除小鼠身上的胶带。关闭异氟烷蒸发器，将小鼠转移至清洁的笼子中。

在沉降期后，观察到胰腺组织的侧向和轴向稳定性增强。使用SWIP成像时，其漂移程度较腹部和胰腺成像窗口更低。在给予雨蛙素处理后，对小鼠胰腺进行了连续成像。

连续两天观察到唇部重定位现象。SWIP还可用于长期成像，能够实现对液泡运动的可视化和定量分析。例如，与PBS处理相比，经胆囊收缩素处理后，小鼠胰腺中液泡的平均运动速度提高了约10%。

胆囊收缩素处理还使亚细胞结构的平均转向频率增加了10%。然而，不同处理组之间的净速度、方向性或累积距离均无显著差异。SWIP技术可实现对肿瘤细胞迁移的可视化和捕获。在较短时间内观察到肿瘤细胞的集体簇状迁移。

还观察到肿瘤细胞和巨噬细胞的单细胞迁移。