Name: 筛分果肉以检测田间未成熟的破蝇果蝇 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 21 s
Description: 学习通过捣碎和筛分果肉来检测实蝇幼虫的方法，该方法比传统切割检查更快更准确。利用红糖水溶液漂浮技术可提高早期幼虫的检出率，适用于田间应急处理大量果实。

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我们感谢佛罗里达大学的 Silvia Durand、Teri Allen、Jose Alegria 和 Alejandra Canon 在番石榴样品处理方面的协助，感谢夏威夷的 Rick Kurashima、Jean Auth 和 Bruce Inafuku 在评估人工接种果实方面的帮助，以及感谢 Michael Stulberg 对本稿件早期版本提出的宝贵意见。本项目部分由美国农业部动植物卫生检验局（USDA APHIS）与佛罗里达大学合作协议资助，并部分得到美国农业部农业研究局（USDA-ARS，项目编号 2040-22430-027-00D）的支持。本初步出版物中所述的研究结果与结论尚未由美国农业部正式发布，不应被解释为代表该机构的任何决定或政策。本出版物中提及的贸易名称或商业产品仅为提供具体信息之目的，并不意味着美国农业部对此类产品的推荐或认可。美国农业部是一个提供平等机会的供应商和雇主。

1. 果实选择
<ol>
	<li>确定调查区域内可获得的水果种类。</li>
	<li>根据目标实蝇物种已知寄主列表选择寄主水果。</li>
	<li>选择果肉柔软、成熟的水果，例如芒果、木瓜和番石榴。未成熟或果肉坚硬的水果（如热带杏仁）应采用其他方法检查，例如切果法。</li>
	<li>选择已落地、过熟的水果，或树上成熟但有损伤痕迹、产卵孔和软斑的水果。</li>
	<li>每次处理约 2 L 的水果（例如，5 个番石榴或 5 个中等大小的芒果即为此方法的适当样本量）。单次可处理的水果数量取决于水果的大小（图 1A）。</li>
</ol>
2. 搬运
<ol>
	<li>将水果切成大块，放入一个 4 L 的自封式储存袋中（图 1B）。</li>
	<li>向袋中加水，直至水面高出切碎的水果 25–50 mm（图 1C）。</li>
	<li>用手轻轻揉捏水果，直到果肉完全与果皮分离，并呈现均匀细腻的质地（即无大块残留）（图 1D）。</li>
</ol>
3. 筛选高龄幼虫
<ol>
	<li>将筛子叠放。处理大量果实时（约5个果实同时处理），使用大号筛子（直径457 mm）；处理单个果实或较小样品时（&#60; 5个果实），使用较小的筛子（直径305 mm）。</li>
	<li>将大孔径筛子（No. 8；2.36 mm）置于小孔径筛子（No. 20；0.85 mm）之上叠放。若需检测早期幼虫，可在筛组底部再加一个更细的筛子（No. 45；0.35 mm）（图1E）。</li>
	<li>将果肉倒入最上层的筛子中（图1F）。</li>
	<li>使用来自水龙头、软管或瓶子的水，彻底冲洗果肉，使其通过整组筛子，直至细碎果肉完全穿过筛网（图1G）。</li>
	<li>肉眼检查上层筛子，观察是否有晚期幼虫滞留在果皮或较大的果块中（图1H）。</li>
	<li>仔细检查第二层筛子中的晚期幼虫。若细碎果肉较多，可能需要额外冲洗。</li>
	<li>使用幼虫镊子从筛子中收集幼虫，并将其放入盛有70%乙醇（EtOH）的样品瓶中。</li>
</ol>
4. 糖漂浮法收集早期幼虫
<ol>
	<li>通过将453 g（1盒）深棕色糖溶解于2 L自来水，预先混合糖溶液，所得溶液的糖度读数为19°10。</li>
	<li>用自来水将细网筛（例如No. 20和No. 45）上的果肉冲洗至筛子边缘，然后将物料转移至一个塑料盆（11 L）中。</li>
	<li>加入棕糖溶液，使其覆盖果肉25–50 mm，并加入2滴消泡剂。让果肉在棕糖溶液中静置约5分钟。</li>
	<li>使用幼虫镊子将浮至溶液表面的幼虫收集到含有70%乙醇的样品瓶中。</li>
</ol>
5. 幼虫筛选
<ol>
	<li>用采集地点、日期、水果种类和采集人标记一个样品瓶，以备后续检查和鉴定。</li>
</ol>

The Mushing, Sieving, and Floating Method for Detecting Fruit Fly Larvae

<ol><li>White, I. M., Elson-Harris, M. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWhite%2C+IM+%22Fruit+Files+of+Economic+Significance%3A+Their+Identification+and+Bionomics%22">Fruit Files of Economic Significance: Their Identification and Bionomics</a>. , CAB International. Wallingford, UK. (1992).</li>
<li>Papadopoulos, N. T., Plant, R. E., Carey, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+trickle+to+flood%3A+the+large-scale%2C+cryptic+invasion+of+California+by+tropical+fruit+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">From trickle to flood: the large-scale, cryptic invasion of California by tropical fruit flies.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 280 (1768), 20131466(2013).</li>
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<li>Van Timmeren, S., Davis, A. R., Isaacs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+larval+sampling+method+for+monitoring+Drosophila+suzukii+%28Diptera%3A+Drosophilidae%29+in+blueberries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Economic+Entomology%22%5BJournal%5D)">Optimization of a larval sampling method for monitoring Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae) in blueberries.</a> Journal of Economic Entomology. 114 (4), 1690-1700 (2021).</li>
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</ol>

作者声明不存在利益冲突。

我们的目标是开发一种在野外高效且有效地寻找实蝇幼虫的方法。启动根除计划或建立检疫区的依据是发现交配过的雌虫或幼虫6，这表明存在繁殖种群。目前通过切开果实并进行目视检查来寻找幼虫的方法效率低下，因为实际存在的寄主果实数量通常远超可逐个检查的数量。此外，在新入侵地区，实蝇种群数量通常较低，使得在大量果实中发现幼虫极为困难。例如，在2015年佛罗里达州开展的Bactrocera dorsalis根除项目中，共鉴定出54种不同寄主植物，切检果实超过4,000个。在该项目中，仅在芒果中发现少量幼虫，未发现其他寄主被侵染6。我们发现，在批量处理果肉含量较高的果实（如芒果、番石榴和木瓜）时，与切果法相比，采用制浆筛分法（MSF/MS）检测A. suspensa和B. dorsalis幼虫具有更高的灵敏度和更快的检测速度。通过制浆筛分法可检测更大数量的寄主果实，同时提高对稀有幼虫的检出率，从而增加早期发现侵染的可能性。对繁殖种群的早期发现有助于提高根除成功率，并降低项目成本。
我们的实验表明，工作人员通过切开并目视检查水果所检测到的幼虫数量存在显著差异。在芒果和木瓜中，工作人员切开水果时分别漏检了50%和75%的B. dorsalis幼虫。相比之下，采用捣碎和过筛方法处理芒果和木瓜时，幼虫的漏检率分别仅为5%和15%。类似地，一项针对入境口岸水果切检的研究显示，不同检查人员发现的受害水果和幼虫数量也存在较大差异8。该研究表明，经验丰富的口岸检查人员在切开并目视检查水果时，漏检了64%–99%的A. suspensa幼虫以及16%–82%的受害水果8。我们的研究结果表明，捣碎和过筛方法可降低工作人员漏检受害水果的可能性。
糖液和热水漂浮法是系统性方法中公认的检测技术，用于确保樱桃和蓝莓不携带果蝇14。将一批货物中的部分果实压碎后加入溶液中，由检验人员肉眼观察糖液表面是否存在卵和幼虫。尽管与逐个切开果实相比，该方法可处理更多数量的果实，但使用这些技术发现幼虫的概率仍受检验人员能力、幼虫的发育阶段与数量以及果实种类的影响8。我们发现，与其他实蝇科昆虫类似，B. dorsalis 和 A. suspensa 会从果肉中脱离并浮至溶液表面。有趣的是，我们发现对于较大的末龄幼虫（即应急处理和根除项目中的目标对象，因其可通过形态学进行鉴定），加入糖液漂浮步骤并未提高检测准确性。事实上，添加漂浮步骤使木瓜的处理时间增加了90%，芒果的处理时间增加了48%。处理时间的延长以及额外所需的材料（如水、容器、糖等）使得在野外搜寻大型幼虫时，该步骤在操作上不具备可行性。当检测目标为包括早期幼虫在内的所有发育阶段时，例如在入境口岸或包装厂，糖液漂浮法可能更为适用。使用细网筛过滤糖液最有可能实现对卵和早期幼虫的最准确检出11,12。
MS 和 MSF 技术适用于容易捣碎且果肉体积较大的水果。实蝇幼虫倾向于钻入果肉内部，这使得肉眼检测变得困难。MS 和 MSF 方法的关键环节是将幼虫与果肉分离。通过筛分过程可去除果肉，从而使幼虫暴露在筛网表面。类似地，糖水法利用幼虫上浮而果肉下沉至盆底的原理，实现幼虫与果肉的分离。经 MS 或 MSF 方法分离出的幼虫可清晰观察到其在筛网表面或水面活动。尽管捣碎、筛分并可选结合漂浮的方法显著提高了在重要寄主水果中检测实蝇幼虫的速度与准确性，但该流程可能并不适用于所有类型的水果。例如，果肉较硬的寄主果实（如青鳄梨）或种子/果核较大而果肉相对较少的果实（如热带杏仁果），采用手工切开并进行肉眼检查的方法可能更为简便。
我们发现，当处理相对较少数量的果实（5-10个）时，MS和MSF方法速度更快。如果处理更大数量的果实，这种差异可能会更加明显，而大量处理果实可能正是紧急实蝇防控项目中所必需且典型的情况。去除浮选步骤进一步提高了检测速度，同时并未影响对大型实蝇幼虫（&#62;3 mm）检出的准确性。我们证明了这些技术可应用于野外现场，能够模拟紧急实蝇防控项目中工作人员实际面临的工作条件。我们的研究表明，MS方法可能有助于更及时地检测到末龄幼虫，进而实现对实蝇繁殖种群的根除；而MSF则可用于检测目前尚未被根除项目纳入目标的卵和早期幼虫阶段。

实蝇科果蝇是最具破坏性的农业害虫之一，其中Anastrepha、Bactrocera和Ceratitis属带来的风险最大1。许多地区面临外来果蝇定殖的高风险，依据包括：1）历史上曾发生的入侵事件及相关的定界与根除项目，2）入境口岸携带果蝇寄主材料的输入频率较高，3）气候条件适宜果蝇种群繁殖定殖。美国加利福尼亚州每年都会发生多次实蝇入侵并被监测到2。在过去一个世纪中，全球已开展超过200次针对实蝇的入侵应对与根除行动，且近几十年来此类事件显著增加3。尽管绝大多数根除项目成功消灭了入侵果蝇种群3,4，但这些入侵所造成的经济和环境负担仍然很高，果蝇成功定殖的风险始终存在；最近的一个灾难性案例是Bactrocera dorsalis在非洲大陆的入侵5。
在应急果蝇防控项目中，会集中力量检测并控制入侵物种的繁殖种群。例如，佛罗里达州在应对实蝇科昆虫入侵时，会在结果实寄主植物滴水线范围内的土壤中施用灌根处理，并清除距发现交配雌虫和/或幼虫地点周围200米半径范围内的寄主果实6。这些措施旨在杀死土壤中的幼虫和蛹，并清除该区域内果实中的卵和幼虫。在某些根除项目中，会清除大量寄主果实。2015年，在佛罗里达州开展的B. dorsalis根除项目中，销毁的果实超过100,000公斤6。仅在检疫区内的种植者及相关产业所遭受的经济损失估计就超过1070万美元7。
为了在检疫区域发现实蝇幼虫，一个小型昆虫学团队会在雌蝇诱捕点周围200米半径范围内采集寄主果实，并逐一切开果实，通过肉眼检查是否存在幼虫6。由于人员资源有限，且可能存在数百种寄主植物，这项任务变得十分困难，尤其是在商业种植区和居民庭院中植物多样性较高的地区。此外，在切开寄主果实的过程中可能遗漏幼虫。一项针对入境口岸果实切检方法的评估研究表明，与将受侵染果实存放数周并统计化蛹基质中出现的幼虫和蛹相比，直接切果在检测A. suspensa方面的效果较差8。
存在&#160;除果实切割外的其他方法&#160;用于检测侵染情况9,10,11,12,13。例如，棕糖漂浮法和热水法均为公认的检测采收樱桃中西部樱桃果蝇的方法9,10。棕糖法包括将捣碎的果实置于糖水溶液中，并收集浮至液面的幼虫。棕糖漂浮法的开发专门用于满足出口樱桃的检疫监管要求，该要求规定包装厂必须监测检疫性果蝇害虫。此外，还存在一项经批准的美国-加拿大蓝莓认证计划，其中包含棕糖水漂浮法、盐水漂浮法或煮沸法，以支持植物检疫卫生措施14。在测试糖溶液和热水漂浮法的准确性时，研究人员采用筛分法来确定遗漏幼虫的数量9,10,11,12,13。一项研究表明，将捣碎的蓝莓与盐溶液混合，并通过可重复使用的咖啡滤纸过滤，其对斑翅果蝇（Drosophila suzukii）幼虫的检出效率比目视检查盐溶液和糖溶液表面高出四倍14。此外，气相色谱法已被用于检测柑橘中A. suspensa幼虫15。然而，这些方法尚未在田间调查中验证其适用性。
我们的目标是开发并测试一种利用筛分法和糖水漂浮法在野外查找实蝇幼虫的方法。与传统的果实切割法相比，该方法能够更高效地检测未成熟果实蝇，有助于在实蝇根除项目中及时控制其繁殖种群。

<table><tbody><tr><td>消泡剂</td><td>MicroLubrol</td><td>ML200-50-4</td><td>MicroLubrol 2000 流体 纯硅油，https://www.microlubrol.com</td></tr><tr><td>红糖</td><td>多米诺斯</td><td></td><td>1磅装纸盒&amp;nbsp; 深棕色糖晶体，https://www.dominosugar.com/products/dark-brown-sugar</td></tr><tr><td>砧板</td><td>KitchenAid</td><td>KE703NOSMGA</td><td>KitchenAid 经典防滑塑料砧板，12x18 英寸，https://www.amazon.com/KitchenAid-Classic-Nonslip-Plastic-11x14-Inch/dp/B09117L774/ref=sxin_24_ac_d_mf_brs?ac_md=2-1-S2l0Y2hlbkFpZA%3D%3D-ac_d_mf_brs_brs&amp;amp;content-id=amzn1.sym.1ad31f34-ba12-4dca-be4b-f62f7f5bb10d%3Aamzn1.sym.1ad31f34-ba12-4dca-be4b-f62f7f5bb10d&amp;amp;crid=UXMLNC72BL0&lt;br/&gt; M&amp;amp;cv_ct_cx=切割板&amp;关键词：切割板&lt;br/&gt; &amp;amp;pd_rd_i=B091118V8T&amp;amp;pd_rd_r=&lt;br/&gt; 4c48b4ad-4d4d-4b4b-8799-fc7313&lt;br/&gt; 2. 果实选择 
确定调查区域可获得的果实种类。根据目标实蝇物种的已知寄主列表选择寄主果实。选择果肉柔软、成熟的果实，例如芒果、木瓜和番石榴。未成熟或果肉坚硬的果实（如热带杏仁）应采用其他方法检查，如果实切剖法。选择已落地、过熟的果实，或树上成熟且具有损伤痕迹、产卵孔和软斑的果实。每次处理约2升果实（例如，5个番石榴或5个中等大小的芒果即为该方法的适当样本量）。单次可处理的果实数量取决于果实大小（图1A）。

3. 果肉破碎 
将果实切成大块，放入一个4升的带密封拉链储存袋中（图1B）。向袋中加水，直至水面高出切碎的果肉25–50毫米（图1C）。用手轻轻揉捏果实，直至果肉完全与果皮分离，并形成均匀细腻的浆状物（即无大块残留）（图1D）。

4. 筛选法收集末龄幼虫 
叠放筛具。处理大量果实（约一次5个）时使用大号筛具（直径457毫米），处理单个果实或少量样本（少于5个果实）时使用较小筛具（直径305毫米）。将粗网筛（No. 8；2.36 mm）置于细网筛（No. 20；0.85 mm）之上组成筛组。若需检测早期幼虫，可在底部再加第三个筛（No. 45；0.35 mm）（图1E）。将果浆倒入最上层筛中（图1F）。用自来水、软管或瓶装水彻底冲洗果浆，使细小果肉通过筛组，直至筛上仅剩残渣（图1G）。目视检查上层筛中是否残留有与果皮或大块果肉一同滞留的末龄幼虫（图1H）。仔细检查第二层筛中的末龄幼虫。若细果肉较多，可能需要额外冲洗。使用幼虫镊子从筛中收集幼虫，并放入盛有70% EtOH的样品管中。

5. 糖浮法收集早期幼虫 
预先配制糖溶液：将453克（1盒）深褐色糖溶解于2升自来水中，所得溶液糖度为19°Brix。用自来水将细网筛（如No. 20和No. 45）中的果浆冲洗至筛边缘，然后将残留物转移至一个塑料盆（11升）中。加入棕糖溶液，使液面高出果浆25–50毫米，并加入2滴消泡剂。让果浆在棕糖溶液中静置约5分钟。用幼虫镊子将浮至液面的幼虫捞出，放入盛有70% EtOH的样品管中。

6. 幼虫整理 
在样品管上标注采集地点、日期、果实类型及采集人信息，以供后续检查与鉴定。&amp;amp;pd_rd_w=li862&amp;amp;pd_rd_wg&lt;br/&gt; =KogbB&amp;amp;pf_rd_p=1ad31f34-ba12-4dca-be4b-f62f7f5bb10d&amp;amp;pf_rd_r=9ATJD6W&lt;br/&gt; QBF9DVRY889MP&amp;amp;qid=1673911&lt;br/&gt; 429&amp;amp;refresh=1&amp;切割板&amp;amp;sr=1-2-8b2f235a-dddf-4202-bbb9-592393927392&amp;amp;th=1</td></tr><tr><td>洗果盆</td><td>Sterilite</td><td>06578012</td><td>白色 12 夸脱塑料盆，https://www.amazon.com/STERILITE-06578012-Sterilite-White-Dishpan/dp/B0039V2G5E/ref=sr_1_1?crid=2SMBMLFJF18U&amp;和关键词=&lt;果实选择 
确定调查区域可获得的果实种类。根据目标实蝇物种的已知寄主列表选择寄主果实。选择果肉柔软、成熟的果实，例如芒果、木瓜和番石榴。未成熟或果肉坚硬的果实（如热带杏仁）应采用其他方法检查，如果实切剖法。选择已落地、过熟的果实，或树上成熟且具有损伤痕迹、产卵痕及软斑的果实。每次处理约2升果实（例如，5个番石榴或5个中等大小的芒果即为本方法的适当样本量）。一次可处理的果实数量取决于果实的大小（图1A）。 

捣碎 
将果实切成大块，放入4升密封塑料袋中（图1B）。向袋中加水，直至水面高出切碎的果实25–50毫米（图1C）。用手轻轻揉捏果实，直至果肉完全与果皮分离，并呈均匀细腻状态（即无大块残留）（图1D）。 

筛分收集末龄幼虫 
叠放筛网。处理大量果实（约5个同时处理）时使用大筛网（直径457毫米），处理单个果实或小样本（<5个果实）时使用小筛网（直径305毫米）。将大孔径筛网（No. 8；2.36毫米）置于小孔径筛网（No. 20；0.85毫米）之上叠放。若需检测早期幼虫，可在筛组底部再加第三个筛网（No. 45；0.35毫米）（图1E）。将果浆倒入最上层筛网中（图1F）。用自来水、软管或瓶装水彻底冲洗果浆，使其通过整组筛网，直至细果浆完全通过（图1G）。目视检查最上层筛网，查看是否有末龄幼虫滞留在果皮或较大果块中（图1H）。仔细检查第二层筛网中的末龄幼虫。若细果浆较多，可能需要额外冲洗。使用幼虫镊子从筛网中收集幼虫，并放入含70%乙醇的样品管中。 

糖浮法收集早期幼虫 
预先配制糖溶液：将453克（1盒）深褐色砂糖溶于2升自来水中，所得溶液糖度为19°Brix。用自来水将细筛网（如No. 20和No. 45）中的果浆冲洗至筛网边缘，然后将物料转移至一个塑料盆（11升）中。加入棕糖溶液，使液面高出果浆25–50毫米，并加入2滴消泡剂。让果浆在棕糖溶液中静置约5分钟。用幼虫镊子收集浮至液面的幼虫，放入含70%乙醇的样品管中。 

幼虫整理 
在样品管上标注采集地点、日期、果实类型及采集人，以备后续检查与鉴定。&gt; 白色 12 夸脱 塑料盆 Sterilite&amp;amp;qid=1673911729&amp;amp；s=home&lt;br/&gt; -花园&amp;amp;sprefix=white+12+qr+dishpan+sterlite%2Cgarden%2C184&amp;amp;sr=1-1</td></tr><tr><td>EtOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP8202500</td><td>乙醇溶液 96%，分子生物学级，https://www.fishersci.com/shop/products/ethanol-solution-96-molecular-biology-grade-fisher-bioreagents/BP8202500</td></tr><tr><td>玻璃瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>0333921H</td><td>Fisherbrand&amp;nbsp;B类透明玻璃螺口瓶（带盖，单独包装），https://www.fishersci.com/shop/products/class-b-clear-glass-threaded-vials-with-closures-packaged-separately/0333921H</td></tr><tr><td>刀具</td><td>Zyliss</td><td>31380</td><td>5.25&quot; 美工刀，https://www.amazon.com/ZYLISS-Utility-Kitchen-5-5-Inch-Stainless/dp/B00421ATJK/ref=sr_1_7?crid=2U27KE1HTG5N1&amp;和关键词=&lt;br/&gt; 水果切割刀具&amp;amp;qid=1673911609&amp;和&lt;br/&gt; 家庭果园&amp;amp;sprefix=fruit%2Bcutting%2Bknives%2Cgarden%2C145&amp;amp;sr=1-7&amp;amp;th=1</td></tr><tr><td>20号筛网</td><td>Hogentogler &amp;amp; Co. Inc.</td><td>4221</td><td>美国标准&amp;nbsp;测试筛，https://www.hogentogler.com/sieves/18-inch-sieves.asp</td></tr><tr><td>45号筛网</td><td>Hogentogler &amp;amp; Co. Inc.</td><td>4226</td><td>美国标准&amp;nbsp;测试筛，https://www.hogentogler.com/sieves/18-inch-sieves.asp</td></tr><tr><td>8号网筛</td><td>Hogentogler &amp;amp; Co. Inc.</td><td>4215</td><td>美国标准&amp;nbsp;测试筛，https://www.hogentogler.com/sieves/18-inch-sieves.asp</td></tr><tr><td>软镊子</td><td>DR Instruments</td><td>DRENTF01</td><td>DR Instruments Featherweight 昆虫学镊子，https://www.amazon.com/DR-Instruments-DRENTF01-Featherweight-Entomology/dp/B008RBLO8Q</td></tr><tr><td>自封式密封袋</td><td>Ziploc</td><td>682254</td><td>Ziploc 品牌 2 加仑透明冷冻袋，https://www.amazon.com/Ziploc-Freezer-Bag-Gallon-100/dp/B01NCDWR8A/ref=sr_1_1_sspa?crid=3SQFBT64Z76ES&amp;和关键词=&lt;br/&gt; 2 加仑 Ziploc 冷冻密封袋&amp;amp;qid=1674504602&amp;&</td></tr></tbody></table>

筛除果肉以在田间检测未成熟实蝇

Sieving Fruit Pulp to Detect Immature Tephritid Fruit Flies in the Field

实蝇科（Tephritidae）的果蝇是全球最具破坏性和入侵性的农业害虫之一。许多国家投入大量资金开展根除计划，以清除初期建立的种群。在根除行动期间，需集中努力检测幼虫，因为这强烈提示存在繁殖种群，并有助于确定疫情的空间范围。发现幼虫阶段将触发额外的防控和监管措施，以遏制并防止害虫进一步扩散。传统上，幼虫检测依赖于逐个切开寄主果实并进行肉眼检查。该方法劳动强度大，仅能处理有限数量的果实，且漏检幼虫的概率较高。研究人员测试了一种提取技术，该技术结合以下步骤：i）在塑料袋中将寄主果实压碎，ii）通过一系列筛网过滤果浆，iii）将残留果浆置于红糖水溶液中，iv）收集浮至液面的幼虫。该方法在佛罗里达州利用田间采集的、自然感染Anastrepha suspensa的番石榴进行了评估。为模拟更接近果蝇根除计划中常见的低密度种群，研究人员在夏威夷用已知数量较少的Bactrocera dorsalis幼虫人工感染芒果和木瓜。该方法还在田间条件下，利用自然感染B. dorsalis的番石榴进行测试，以评估其在紧急果蝇防控项目中实际工作条件下的适用性。无论是在田间还是实验室试验中，压碎果实并筛滤果浆的方法均比切开果实更高效（所需时间更短）且更敏感（检出更多幼虫）。将果浆置于红糖水溶液中漂浮有助于检测更早期的幼虫龄期。在紧急防控项目中，对重要实蝇寄主果实的果浆进行压碎和筛滤，可能提高幼虫检出的概率。

从田间采集的果实中提取早期和晚期若虫期的Anastrepha suspensa 
本实验比较了果实切割法与捣碎、过筛和漂浮法（MSF）在检测幼虫比例及检测所需平均时间方面的效果。实验所用番石榴采自佛罗里达州霍姆斯特德市佛罗里达大学食品与农业科学研究所热带研究与教育中心的一株植株，果实受Anastrepha suspensa幼虫严重侵染。将果实随机分为每组5个，分配至两种幼虫提取方法之一：1）手工切割法或2）MSF法。记录使用每种提取方法肉眼可见的所有幼虫的采集时间。
手工切割法遵循了当前根除计划中正在使用的方法。5名工作人员（n=5）每人分配5个果实，通过将果实切成小块并目视检查果肉，以寻找各发育阶段的幼虫。为确定目视检查过程中是否遗漏了幼虫，对手工切割后的果块使用解剖显微镜（10倍）进行了再次检查。
对于MSF方法，将5个果实切成大块（50-80 cm），放入自封袋中，用手轻轻挤压，直至果肉完全与果皮分离，并达到均匀细腻的质地（即无大块残留）。将压碎的果实通过一系列大型（45.7 cm）黄铜筛网进行过滤。最上层放置孔径最大的筛网（No. 8），其下依次为No. 20和No. 45筛网。负责该处理的工作人员使用连接水槽水龙头的软管中的水，将果肉冲洗过筛。高龄幼虫明显滞留在筛网中，而低龄幼虫则混杂在果肉中，难以观察和分离。因此，将筛网中得到的果肉与幼虫混合物放入盛有1 L红糖水溶液的桶中。幼虫立即上浮至液面。轻轻搅拌溶液，5分钟后，从桶中取出幼虫并计数。处理果实所需时间包括压碎、过筛以及从糖水中分离幼虫的全过程。采用Kruskal-Wallis非参数检验（p = 0.05）对通过手工切割、筛分及漂浮法所获得的幼虫数量数据进行分析16。
MSF 方法获得的幼虫数量（图 2A）和单位时间幼虫数量（图 2B）均高于手工切割法。尽管本研究未对不同龄期幼虫的检出情况进行定量分析，但我们观察到使用筛分法可发现所有龄期（一龄、二龄和三龄）的幼虫，而手工切割法仅能发现较晚龄期（二龄和三龄）的幼虫。当对先前已切割并肉眼检查过的样品使用解剖显微镜重新检查时，发现有 40% 的果内晚龄幼虫被遗漏；然而，早期幼虫主要通过重新检查得以发现。
本实验表明，使用MSF方法在高度侵染的果实中检测幼虫更为有效和高效。然而，在根除计划中更可能遇到幼虫数量较少的侵染果实，因为入侵物种在该情况下极为罕见。因此，我们开展了一项实验室研究，其中寄主果实被接种已知的少量幼虫。
人工接种芒果和木瓜以模拟低水平橘小实蝇（Bactrocera dorsalis）侵染 
本实验比较了果实切片法与MSF法在低水平侵染条件下对幼虫检出比例及检测所需时间的差异。由于人工接种可准确控制幼虫数量，因此被用作评估两种检测方法有效性的实验手段。
使用直径为1.0 cm的打孔器在无果蝇幼虫的单个芒果和木瓜果实上各打5个孔。将一只晚期二龄至早期三龄的 B. dorsalis 幼虫放入部分果实的每个孔中。孔洞用从果实上打下的果肉片封住；其余未放入幼虫的果实也以同样方式封孔，以在视觉上模拟人工侵染。果实置于27 °C条件下保持48小时，以允许幼虫发育。实验在中国台湾夏威夷州希洛市的农业研究服务局（ARS）实验室（n = 5 名工作人员）和欧胡岛的动植物卫生检验局-植物保护与检疫处（APHIS-PPQ）实验室（n = 4 名工作人员）进行。
进行水果切割时，每名工作人员分得5个芒果（其中1个被1条幼虫侵染，另外4个未被侵染）和4个木瓜（其中1个被侵染，另外3个未被侵染）。工作人员将每个水果逐一反复切割成越来越小的块，并持续检查果肉中是否存在不成熟的果蝇幼虫。当果肉被彻底检查后，即停止搜索。记录每名工作人员在切割过程中发现的幼虫总数及其处理所有水果所花费的时间（图3）和（图4）。
每位工作人员收到了另一组相同的水果（5个芒果和4个番木瓜），用于捣碎或过筛（不涉及水果切割），其中2个水果按之前所述方式接种了幼虫。将果肉倒入顶层筛子中，用来自水龙头的水冲洗整个筛子堆，冲洗过程中取出幼虫，具体操作如实验方案所述。本实验重复进行了两次，一次采用蔗糖漂浮法，另一次不采用蔗糖漂浮法，以确定省略漂浮步骤是否能在不降低检测灵敏度（即检出全部或大多数幼虫）的前提下提高操作速度（图3）。记录每位工作人员在完成水果切割、MSF或MS方法处理过程中所发现的幼虫数量及所耗时间。
对于芒果和木瓜，完整的MSF方法（包括漂浮步骤）在幼虫检出数量上均高于果实切割法，且检测速度更快（表1）。采用传统果实切割法的工作人员分别漏检了32%和35%被放入芒果和木瓜中的幼虫（表1）。使用MSF技术批量处理果实所需时间比逐个切割芒果减少30%，比逐个切割木瓜减少35%（图3）。与果实切割法相比，采用MSF方法在木瓜（图3C）和芒果（图3D）中每分钟发现的幼虫数量更多。所有检出的幼虫均为活体。
幼虫形态学鉴定仅适用于高龄幼虫。我们重复了上述实验，但省略了漂浮步骤，以确定幼虫回收率是否仍然较高，同时提高果实处理速度。与切割和肉眼检查相比，省略漂浮步骤的MS方法在番木瓜（图4A）和芒果（图4B）中均检测到更多的幼虫。此外，该技术在处理番木瓜（图4C）和芒果（图4D）时也比切割后肉眼检查更快。从MSF方法中去除漂浮步骤后，发现高龄幼虫所需时间在番木瓜中减少了90%，在芒果中减少了48%（表2）。两种方法的幼虫检出率均较高，且MS方法（省略漂浮）的检出率始终更高。在番木瓜中，MSF和MS方法分别回收了80%和85%的幼虫（表1和表2）；在芒果中，相应回收率分别为88%和95%（表1和表2）。
果实切割法与MSF法的田间比较 
本实验旨在田间条件下比较果实切割法和MSF法，模拟实蝇应急防控项目的情景。果实处理在缺乏实验室便利设施和基础设施的环境下进行，以检验两种幼虫提取方法在实地应用中的准备情况。工作在中国台湾Hilo附近美国农业部农业研究局热带植物遗传资源与病害研究单位种质资源圃的番石榴果园中进行。共采集到40个显示有虫害迹象的番石榴果实，并将其分为两组。其中20个果实先进行切割/肉眼检查，随后进行MSF法（包括漂浮步骤），从而可评估切割法相对于MSF法的检测灵敏度。解剖操作按前述方法进行。一旦发现幼虫，即取出并计数。由四名工作人员分别解剖5个果实，并记录每人完成切割与检查所需的时间。切割后的MSF操作同上，但额外增加第三个更细网目的筛子（No. 40，0.420 mm），与No. 8和No. 20筛子一同使用，以便收集更小的幼虫。另一组20个果实则直接放入两个密封拉链袋中（每袋10个果实），仅进行MSF处理（即不进行切割），从而比较果实切割与MSF处理所需时间的差异。该过程同样使用三个筛子。记录所发现的幼虫数量以及处理果实的总时间（包括在袋中捣碎果实、静置5分钟、筛分及在糖溶液中漂浮等步骤）。
实验室研究发现，果实切割法低估了果实的侵染程度，且结果变异较大，与使用MSF方法可回收的幼虫数量相比，检出的幼虫数量减少了25%–83%表3）。此外，在幼虫数量较少的样本中，MSF方法回收的幼虫数量多出500%，提高了检测灵敏度，更有利于鉴定侵染生物。使用MSF方法处理果实的速度远快于切割法；切割并检查5个果实所需时间与处理10个果实的MSF方法相当 通过 MSF
<img alt="柠檬腐烂过程；从新鲜到分解的各个阶段；筛分系统；腐烂评估示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65501/65501fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：果蝇幼虫提取实验步骤。（A）每次处理约2 L体积的水果（例如，5个番石榴或5个中等大小的芒果即可满足本方法所需的样本量）。（B）将水果切成大块，放入一个4 L的密封储存袋中。（C）向袋中加水，直至水面高出切碎的水果25–50 mm。（D）用手轻轻揉捏水果，直到果肉完全与果皮分离，并呈现均匀细腻的质地（即无大块残留）。（E）将筛网堆叠使用，上层为大孔径筛网（No. 8；2.36 mm），下层为小孔径筛网（No. 20；0.85 mm）。若需收集早期幼虫，可在最底层再加第三个筛网（No. 45；0.35 mm）。（F）将果浆倒入最上层的筛网中。（G）用来自水龙头、软管或瓶子的水彻底冲洗果浆，使其通过整套筛网，直至细小果肉完全通过第一层筛网。（H）肉眼检查最上层筛网中是否残留有晚期幼虫，这些幼虫可能随果皮或较大的果块被截留。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65501/65501fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="番石榴幼虫回收分析；柱状图；切割法与MSF法比较；幼虫数量对比。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65501/65501fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：从野外采集的果实中提取早期和晚期若虫期的Anastrepha suspensa。 通过切开并目视检查（切割法：70.4 ± 11.9）或通过三级筛网冲洗果肉，随后将果肉浸泡于糖水溶液中（MSF法：175.6 ± 21.91）从五个番石榴果实中回收的Anastrepha suspensa幼虫平均数量（±均值标准误[SE]）（A）。每分钟从5个番石榴中回收的幼虫平均数量（±SE），切割法为1.21 ± 0.16，MSF法为3.71 ± 0.50（B）。每种方法重复5次，柱状图上方的星号表示幼虫数量（χ2 = 6.81，p &lt; 0.01）和处理时间（χ2 = 6.80，p &lt; 0.01）存在显著差异，基于Kruskal-Wallis检验。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65501/65501fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="木瓜和芒果中幼虫回收率的比较；柱状图；切割法与全果打浆过筛漂浮法的对比。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65501/65501fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：使用人工接种芒果和木瓜果实模拟低水平橘小实蝇（Bactrocera dorsalis）侵染，验证全果打浆过筛漂浮法的有效性。 在木瓜（切割法：3.25 ± 0.51，MSF法：4.0 ± 0.4）（A）和芒果（切割法：3.4 ± 0.51，MSF法：4.4 ± 0.4）（B）果实中检测到的橘小实蝇（Bactrocera dorsalis）幼虫平均数量（±标准误），以及每分钟从木瓜（切割法：0.21 ± 0.1，MSF法：0.4 ± 0.15）（C）和芒果（切割法：0.14 ± 0.01，MSF法：0.21 ± 0.03）（D）中回收的幼虫平均数量（±标准误）。果实经切割法或全果打浆过筛漂浮法（包含漂浮步骤，n = 5）处理，并人工接种5头三龄幼虫。柱状图上方的星号表示，根据Kruskal-Wallis检验，与切割法相比，木瓜（χ2 = 5.39，p = 0.02）和芒果（χ2 = 3.94，p = 0.05）中检测到的幼虫数量差异具有统计学意义。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65501/65501fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="幼虫回收率及方法比较；木瓜和芒果的切割法与MS法柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65501/65501fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：通过人工接种芒果和木瓜果实模拟低水平Bactrocera dorsalis侵染，验证去除了浮选步骤的碾碎-过筛法（mushing-sieving method）。 在木瓜（切割法：1.25 ± 0.48，MS法：4.25 ± 0.48）(A) 和芒果（切割法：2.5 ± 0.5，MS法：4.75 ± 0.25）(B) 果实中检测到的幼虫平均数量（±标准误），以及每分钟回收的幼虫平均数量（±标准误）在木瓜（切割法：0.15 ± 0.05，MS法：0.76 ± 0.15）(C) 和芒果（切割法：0.16 ± 0.04，MS法：0.44 ± 0.04）(D) 中的结果。实验使用5头三龄Bactrocera dorsalis幼虫人工接种果实，并分别采用切割后肉眼检查（切割法）或在袋中碾碎后通过筛网冲洗（仅碾碎和过筛，无浮选步骤，n = 4）两种方法处理。柱状图上方的星号表示与切割法相比，木瓜中检出幼虫数量（χ2 = 5.46，p = 0.02）和芒果中幼虫数量（χ2 = 5.25，p = 0.02），以及处理木瓜（χ2 = 5.39，p = 0.02）和芒果（χ2 = 5.39，p = 0.02）所需时间的差异具有统计学显著性（基于Kruskal-Wallis检验）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65501/65501fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>水果</td>
			<td>处理的水果数量</td>
			<td>添加的幼虫数量</td>
			<td>处理方法</td>
			<td>发现的幼虫数量</td>
			<td>处理时间（分钟）*</td>
			<td>回收率</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mango</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
			<td>切割法</td>
			<td>17</td>
			<td>158</td>
			<td>68%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mango</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
			<td>MSF</td>
			<td>22</td>
			<td>113</td>
			<td>88%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papaya</td>
			<td>16</td>
			<td>20</td>
			<td>切割法</td>
			<td>13</td>
			<td>62</td>
			<td>65%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papaya</td>
			<td>16</td>
			<td>20</td>
			<td>MSF</td>
			<td>16</td>
			<td>40</td>
			<td>80%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">*总时间由5名操作人员累计计算。</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：通过切开并肉眼检查（切开法）或完全捣碎、过筛和漂浮（MSF法）方法回收的幼虫数量及处理水果所需时间。 试验水果为人工接种5头三龄幼虫的水果，包含被蛀食并封口的水果（5个芒果中1个，4个木瓜中1个）。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>水果</td>
			<td>处理的水果数量</td>
			<td>添加的幼虫数量</td>
			<td>处理方法</td>
			<td>发现的幼虫数量</td>
			<td>处理时间（分钟）*</td>
			<td>回收率</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mango</td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
			<td>切割法</td>
			<td>10</td>
			<td>66</td>
			<td>50%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mango</td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
			<td>MS</td>
			<td>19</td>
			<td>44</td>
			<td>95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papaya</td>
			<td>16</td>
			<td>20</td>
			<td>切割法</td>
			<td>5</td>
			<td>38</td>
			<td>25%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papaya</td>
			<td>16</td>
			<td>20</td>
			<td>MS</td>
			<td>17</td>
			<td>25</td>
			<td>85%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">*总时间由4名工作人员累计计算。</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：通过切割或压碎并仅进行筛分（省略漂浮法）回收的幼虫数量及处理水果所需时间（MS）。 试验水果人工接种了五头三龄幼虫，并与已被蛀食且封口的水果混合（每5个芒果中1个，每4个木瓜中1个）。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>工作人员/方法</td>
			<td>处理果实数量</td>
			<td>处理时间（分钟）</td>
			<td>通过切割法发现的幼虫数</td>
			<td>通过MSF*法发现的幼虫数</td>
			<td>通过切割法发现的幼虫占总数的百分比</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>工作人员1：切割法</td>
			<td>5</td>
			<td>18</td>
			<td>33</td>
			<td>14</td>
			<td>70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>工作人员2：切割法</td>
			<td>5</td>
			<td>18</td>
			<td>1</td>
			<td>5</td>
			<td>17%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>工作人员3：切割法</td>
			<td>5</td>
			<td>26</td>
			<td>9</td>
			<td rowspan="2">11**</td>
			<td rowspan="2">75%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>工作人员4：切割法</td>
			<td>5</td>
			<td>20</td>
			<td>24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>工作人员5：MSF法</td>
			<td>10</td>
			<td>22</td>
			<td>NA</td>
			<td>22</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>工作人员6：MSF法</td>
			<td>10</td>
			<td>18</td>
			<td>NA</td>
			<td>37</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="6">* 将切割法及目视检查所得果肉再次用MSF法处理，以确定遗漏的晚期2nd-3rd龄幼虫数量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="6">** 工作人员2和3所处理果实的果肉在使用MSF法前合并</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：通过切开并目视检查果实（切割法）或通过捣碎、过筛和漂浮法（MSF）处理果实后，在田间采集的番石榴中发现的幼虫数量。

提高田间对不成熟实蝇的检出率，可及时采取措施以消除这些破坏性害虫的种群。通过将寄主果实装入袋中捣碎，并将果浆经一系列筛网过筛，比手工切开果实并进行目视检查能更快、更准确地检测到高龄幼虫。

实蝇科（Tephritidae）的果蝇是全球最具破坏性和侵入性的农业害虫之一。许多国家投入巨额资金开展……

我们正在开发一种比目前逐个切开并目视检查果实更快速、更准确的寻找实蝇科果蝇幼虫的方法。我们希望开发一种简单的技术，可在野外用于处理大量果实。本研究的一个挑战是找到低度侵染的果实，这更接近在紧急情况或根除项目期间可能遇到的实际状况。由于无法直接观察果实内部，我们采用人工接种的方法，使主要寄主果实感染少量幼虫。在田间和实验室试验中，捣碎并筛分果肉所需时间少于切开果实，且能发现更多的幼虫。将果肉置于红糖水溶液中漂浮，有助于检测低龄幼虫。在紧急防控项目中，对重要实蝇类害虫寄主果实的果肉进行捣碎和过筛，可提高检测到幼虫的概率。我们将继续优化该操作规程，以确定针对不同种类管制性果蝇的最佳筛网孔径，并建立相关标准，如果实种类、取样数量等，以帮助判断是否需要采用幼虫灭活法或常规果实切检法。

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Research

科研

JoVE Journal

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在本视频文章中，我们描述了一种自动化检测方法，用于测量饥饿或饱腹状态对成年果蝇Drosophila...

一种用于果蝇觅食行为的单体检测方法 果蝇

本文介绍了一种用于量化受胁迫个体回避行为的实验方案。该范式具有强大功能且操作简便，可用于评估基因和环境对黑腹果蝇（Drosophila...

社会回避定量检测的简易实验方法 黑腹果蝇

一种饲养方法 黑腹果蝇 在无菌和已知菌条件下进行培养的方法被介绍。果蝇胚胎在次氯酸钠中脱去卵壳，无菌转移至无菌培养基中，并在密闭容器中饲养。通过将细菌接种至培养基和胚胎，可建立已知菌关联，细菌的存在通过全虫涂板法确认 果蝇...

在无菌和已知菌群条件下培育果蝇 Drosophila melanogaster

本文介绍一种用于检测黑腹果蝇（Drosophila...

一种基于浮力的体脂含量测定方法 果蝇

本文介绍了几种自制工具的使用方法，用于转移、冷却和杀死成虫 果蝇，以及清洁玻璃培养管和收集卵。这些工具易于制作，在操作中效率较高...

简易自制工具处理果蝇——Drosophila melanogaster

本文介绍了一种在田间试验中，通过多个时间点测定作物中蓟马数量及其天敌小花蝽捕食性天敌数量的实验方案。同时展示了如何评估防治蓟马措施的效果，并分析小花蝽捕食作用所带来的生态效益。...

用于田间试验中估算Frankliniella属花蓟马与Orius属捕食性天敌种群的取样方法

本实验方案的目的是测量嗉囊收缩并量化食物在嗉囊中的分布情况 果蝇...

测量作物运动性与食物通过情况 果蝇

我们描述了用于测定蚊虫和果蝇杀虫剂敏感性的局部施用生物测定法的方法学及其重要性。本方法通量高，利用昆虫的总质量——从而能够计算基于质量归一化的致死剂量而非浓度——且相较于其他类似方法可能具有更低的变异性。...

用于量化蚊虫和果蝇杀虫剂毒性的局部施用生物测定法

学习通过捣碎和筛分果肉来检测实蝇幼虫的方法，该方法比传统切割检查更快更准确。利用红糖水溶液漂浮技术可提高早期幼虫的检出率，适用于田间应急处理大量果实。

筛除果肉以在田间检测未成熟实蝇

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