Name: 聚乙二醇水凝胶中的肿瘤球状体制造和封装用于研究球状体-基质相互作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-22T14:55:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 学习使用聚乙二醇水凝胶封装肿瘤球状体的方法，快速构建模拟肿瘤微环境的体外模型。该技术无需专用设备，成本低且操作简便，适用于研究球状体与基质相互作用及肿瘤生物学机制。

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本工作由圣路易斯大学为 Silviya P Zustiak 博士提供的启动资金，以及由圣路易斯大学 Henry 和 Amelia Nasrallah 神经科学中心授予 Silviya P Zustiak 博士的种子基金资助。

Fabrication Followed by 3D Encapsulation of Tumor Spheroids in PEG Hydrogels

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

基于水凝胶的多细胞肿瘤球模型正被越来越多地用于推动癌症治疗研究11,13,29。这类模型的优势在于能够以受控方式模拟肿瘤微环境的关键参数，尽管结构较为复杂，但相比体内模型更简单、成本更低，且许多体系适用于高通量筛选技术。水凝胶生物材料可被调控以模拟肿瘤的细胞外基质，并促进细胞与基质之间的相互作用；而肿瘤球（相对于分散的单细胞）则可模拟原发肿瘤中的细胞间相互作用。如本研究所示，合成水凝胶具有尤为突出的优势：水凝胶可提供所需的结构支撑以及理想的物理和力学特性，同时可通过引入黏附性配体或可降解序列独立调节其生化材料特性。此外，合成水凝胶还具有更小的批间差异性，并能实现更广泛的材料性能调控范围，可覆盖人体大多数软组织的特性。
本文详细描述了一种基于惰性聚乙二醇（PEG）的水凝胶的使用方法，该水凝胶通过迈克尔加成反应形成，如先前研究所述25,</su...

肿瘤球体已成为研究癌症病因、病理学及药物反应性的有用体外工具1。传统上，肿瘤球体在低黏附培养板或生物反应器等条件下培养，以促进细胞-细胞黏附而非细胞-表面黏附2。然而，目前人们认识到，为了更真实地模拟肿瘤微环境，体外肿瘤球体模型应同时包含细胞-细胞和细胞-基质相互作用。这促使多个研究团队设计出如水凝胶等支架材料，用于包载肿瘤球体3,4。此类基于水凝胶的肿瘤球体模型有助于阐明细胞-细胞和细胞-基质相互作用对多种细胞行为的影响，例如细胞活力、增殖、干性或治疗反应性3。
在此，我们描述了一种将胶质母细胞瘤类球体包埋于聚乙二醇（PEG）水凝胶中的实验方案。已有大量文献报道了将胶质母细胞瘤细胞类球体包埋于水凝胶中的方法。例如，通过将U87细胞包埋于修饰有RGDS黏附配体并以酶可降解肽交联的PEG水凝胶中形成类球体，以研究水凝胶刚度对细胞行为的影响。5U87细胞还已在其他基于聚乙二醇或透明质酸的水凝胶中形成，以扩增肿瘤干细胞群体6 或探索基质介导的化疗耐药机制7,8,9胶质母细胞瘤类球体还被包埋于明胶水凝胶中，以研究小胶质细胞与癌细胞之间的相互作用及其对细胞侵袭的影响10总体而言，这些研究已证明了基于水凝胶的 体外 在理解胶质母细胞瘤病理及制定治疗方案中的模型应用。
此外，肿瘤球体的制备和水凝胶包封存在多种不同的方法11。例如，可将分散的细胞接种到水凝胶中，并使其随时间逐渐形成球体5,12。此类方法的一个缺点是所形成的球体具有多分散性，可能导致细胞反应的差异。为了生成均一的球体，可将细胞包封于微凝胶中并进行长期培养，直至细胞侵入并重塑凝胶13；或者将细胞接种至具有球形“孔洞”的模板化凝胶中，使其自发聚集形成球体14。这些方法的不足之处在于操作相对复杂，需要使用液滴发生器或其他手段来制备微凝胶或凝胶中的“孔洞”，且球体生长和成熟所需时间较长。另一种方法是先在微孔板9,15,16或悬滴培养板17,18中预先形成球体，再将其包封入水凝胶中，类似于本文所述的技术。这些方法更为简便，且可实现较高通量的操作。有趣的是，已有研究表明，球体的形成方法本身可能影响球体中细胞的行为，例如基因表达、细胞增殖或对药物的响应性19,20。
本文以胶质母细胞瘤为研究重点，因为这是一种实体瘤，其天然微环境是柔软且具有纳米孔结构的脑基质21，而这一环境可通过柔软的纳米孔水凝胶进行模拟。胶质母细胞瘤也是目前尚无有效治愈手段的最致命脑癌22。然而，本文所述方案也可用于包封代表任何实体瘤的类球体。我们选择使用通过迈克尔加成反应形成的聚乙二醇（PEG）水凝胶23。PEG是一种合成的、不可降解且生物相容性良好的水凝胶，具有化学惰性，可作为支架和细胞的物理支撑，但本身不支持细胞黏附23。细胞黏附性可通过共价连接完整蛋白或黏附性配体单独引入24，而可降解性则可通过化学修饰PEG聚合物链，或引入可水解或酶解的交联剂来实现25,26。这种方法使得水凝胶的生化特性可独立于其力学或物理特性进行调控，从而在研究细胞-基质相互作用时具有优势。迈克尔型凝胶化反应具有选择性，并可在生理条件下发生，因此只需将类球体与水凝胶前体溶液混合，即可实现类球体的包封。
总体而言，本文介绍的方法具有多个显著特点。首先，在多孔板装置中制备肿瘤类球体效率高、速度快，且所需材料成本较低。其次，该方法能够大规模生产多种尺寸、低多分散性的类球体。最后，仅需使用 commercially available 的材料即可完成。通过研究基底特性对类球体细胞活力、圆形度及细胞干性的影响，展示了该方法的应用价值。

<table><tbody><tr><td>70% 乙醇</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>LC22210-4</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>FALCON</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>24 孔超低吸附培养板</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-602</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 培养皿</td><td>Amazon</td><td>706011</td><td></td></tr><tr><td>四臂聚乙二醇-丙烯酸酯（4-arm PEG-Ac；10 kDa）</td><td>Laysan Bio</td><td>ACRL-PEG-ACRL-10K-5g</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Fisher Scinetific</td><td>3181345107</td><td></td></tr><tr><td>6 孔 AggreWell 400&amp;nbsp;</td><td>StemCell Technologies, Vancouver, Canada</td><td>34421</td><td>方形锥形微孔&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>抗黏附冲洗液</td><td>StemCell Technologies, Vancouver, Canada</td><td>货号：07010</td><td></td></tr><tr><td>天冬氨酸-精氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-缬氨酸-脯氨酸-甲硫氨酸-丝氨酸-甲硫氨酸-精氨酸-甘氨酸-半胱氨酸-精氨酸-天冬氨酸（DRCG-VPMSMR-GCRD）多肽</td><td>Genic Bio, 上海, 中国</td><td>n/a</td><td>定制合成</td></tr><tr><td>化学通风橱</td><td>KEWAUNEE</td><td>99151</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel 基底膜基质，无LDEV&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>356234</td><td>基底膜基质</td></tr><tr><td>去垢剂 - Triton-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td>非离子型表面活性剂</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>一次性移液管（1 mL、2 mL、5 mL、10 mL、25 mL、50 mL）</td><td>Fisher Scinetific</td><td>1 mL: 13-678-11B, 2 mL: 05214038, 5 mL (FALCON): 357529, 10 mL: 13-678-11E, 25 mL: 13-678-11, 50 mL: 13-678-11F</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>HyClone</td><td>SH30073-03</td><td></td></tr><tr><td>甲醛 37% 溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>玻璃板</td><td>Slumpys</td><td>GBS4100SFSL</td><td></td></tr><tr><td>玻璃转移移液管</td><td>Fisher Scinetific</td><td>5 3/4&quot;: 1367820A, 9&quot;:136786B</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸-精氨酸-半胱氨酸-天冬氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸（GRCD-RGDS）多肽</td><td>Genic Bio, 上海, 中国</td><td>n/a</td><td>定制合成</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Bright-Line</td><td>383684</td><td></td></tr><tr><td>疏水溶液 - Repel Silane&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td>17-1332-01</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>NUAIRE</td><td>NU-8500</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜（Axiovert 25）</td><td>Zeiss</td><td>663526</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen DiOC16(3)（3,3'-二己基氧杂羰花青高氯酸盐）</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>D1125</td><td></td></tr><tr><td>Leica 共聚焦 SP8</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>明场与荧光显微镜（Axiovert 200M）</td><td>Zeiss</td><td>3820005619</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>2 mL: 02681258</td><td></td></tr><tr><td>显微镜软件</td><td>Zeiss</td><td>AxioVision Rel. 4.8.2</td><td></td></tr><tr><td>Nestin Alexa Fluor 594&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-23927</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>PARAFILM&amp;nbsp;</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>PBS（1×），pH 7.4</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>MP Biomedicals</td><td>1670046</td><td></td></tr><tr><td>移液器辅助器</td><td>Drummond Scientific Co.</td><td>P-76864</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头（1&amp;ndash;200 &amp;micro;L，101&amp;ndash;1000 &amp;micro;L）</td><td>Fisher Scinetific</td><td>2707509</td><td></td></tr><tr><td>标准一次性塑料转移移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-9D</td><td></td></tr><tr><td>塑料称量舟（100 mL）</td><td>Amazon&amp;nbsp;</td><td>mdo-azoc-1030</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇-二硫醇（PEG-diSH；3.4 kDa）</td><td>Laysan Bio</td><td>SH-PEG-SH-3400-5g</td><td></td></tr><tr><td>聚二甲基硅氧烷（PDMS）[Slygard 182 弹性体试剂盒]</td><td>Elsworth Adhesives</td><td>3097358-1004</td><td>聚二甲基硅氧烷</td></tr><tr><td>无粉检查手套</td><td>Quest</td><td>92897</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶，1 mg/mL 水溶液&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>AAJ66584AB</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 培养基（1×）</td><td>HyClone</td><td>SH30027-02</td><td></td></tr><tr><td>硅胶垫片 - 硅胶片，0.5 mm 厚，13 cm × 18 cm</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>JTR-S-0.5</td><td></td></tr><tr><td>SOX2 Alexa Fluor 488&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-365823</td><td></td></tr><tr><td>组织培养操作台</td><td>NUAIRE</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>三乙醇胺，&amp;ge;99.0%（GC）&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>90279</td><td></td></tr><tr><td>U-87 MG 人胶质母细胞瘤细胞</td><td>American Type Culture Collection&amp;nbsp;</td><td>HTB-14</td><td></td></tr></tbody></table>

肿瘤类球体的制备及其在聚乙二醇水凝胶中的包封用于研究类球体-基质相互作用

Tumor Spheroid Fabrication and Encapsulation in Polyethylene Glycol Hydrogels for Studying Spheroid-Matrix Interactions

三维（3D）包封类球体对于充分模拟肿瘤微环境以实现细胞的最佳生长至关重要。在此，我们设计了一种 体外 用于模拟肿瘤细胞外微环境的胶质母细胞瘤三维球体包封模型。首先，我们采用聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane）制备方形锥形微孔模具。利用这些微孔模具可形成尺寸精确可控（50–500 μm）的肿瘤球体。球体形成后，将其收集并包封于聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）基水凝胶中。PEG水凝胶是一种适用于球体包封的多功能平台，因其水凝胶特性（如刚度、可降解性和细胞黏附性）可独立调控。本研究中，我们采用一种典型的软性水凝胶（~8 kPa）对胶质母细胞瘤球体进行包封。最后，建立了一种对球体进行染色和成像的方法，以通过共聚焦显微镜获取高质量图像。由于球体核心致密而外围相对稀疏，成像可能存在困难，但使用透明化溶液结合共聚焦光学切片可有效缓解此类成像难题。综上所述，我们展示了一种制备均一球体、将其包封于PEG水凝胶中，并对包封后的球体进行共聚焦显微成像的方法，用于研究球体生长行为及多种细胞-基质相互作用。

基于类球体的药物筛选平台因强调在模拟天然组织的生物材料中包封类球体以调控肿瘤微环境，正受到越来越多关注。本文中，我们开发了一种多细胞肿瘤类球体的制备方法，并进一步实现其在三维水凝胶中的包封与成像。类球体在微孔模具中制备（图 3A,B），可形成球形且多分散性严格可控的球状体。例如，对于每个微孔中含有 3,300 个细胞的球状体，其平均大小约为250 µm，以及圆形度 &gt;0.8，其中1为完美球形（图3C,D）。类球体直径的变异系数（%CV）为19.3%，圆度的变异系数（%CV）为4.5%。类球体直径取决于每个微孔中的细胞数量，如图所示。 表1请注意，微孔中的一些细胞可能未被纳入球状体，在球状体收获步骤中会被洗去。
可通过不同Z轴层析深度对类球体进行成像，从而获得Z轴各位置的细胞活力信息（图4）。需要注意...

在此，我们介绍一种可实现肿瘤类球体快速、稳定且低成本制备并进行水凝胶包封的实验方案。该方法无需特殊设备，具有广泛的适用性，尤其适用于研究类球体与基质间的相互作用以及构建 体外 组织生理学或病理学模型

三维（3D）包封类球体对于充分模拟肿瘤微环境以实现细胞的最佳生长至关重要。这里，我们……

本实验室致力于设计用于胶质母细胞瘤类球体包封的体外水凝胶模型，以模拟肿瘤的细胞外微环境。利用此类模型，可研究基质的力学和生化特性对类球体细胞活力、圆形度、干性及扩散行为的影响。目前肿瘤模型开发中的实验挑战主要集中于两个方面：一方面希望具备足够的复杂性，以模拟肿瘤微环境的各个层面，从而确保生理相关性；另一方面又希望模型尽可能简化，以使其易于获取、稳健、低成本且操作简便，并适用于多重筛选方法。我们提出了一种可实现肿瘤类球体快速、稳定且低成本制备并将其包埋于模拟肿瘤微环境的水凝胶中的实验方案。该模型无需任何专用设备，特别适用于研究类球体与基质间的相互作用，以及构建体外组织生理或病理模型。了解胶质母细胞瘤癌细胞与其微环境之间的相互作用，有助于推动开发更有效治疗该癌症的新疗法。此外，建立胶质母细胞瘤的体外模型，可促进其他癌症疾病模型的进一步开发。首先，将约两克或一毫升的负相PDMS前体溶液倒入六孔方形锥形主模具的一个孔中。将PDMS覆盖在主模具上后，将培养皿放入真空干燥器中脱气。接着，将培养皿置于60摄氏度的烘箱中24小时，使PDMS固化。当PDMS固化但仍保持温热时，使用刮刀小心地将PDMS模具从主模具上剥离下来。然后，使用活检打孔器将其切割成直径为35毫米的片状。将切割好的PDMS模具放入培养皿中，并盖上盖子，在室温下继续固化24小时。为制备正相PDMS模具，将负相PDMS模具切成直径35毫米的片状，放入直径35毫米的培养皿中，使带有微孔结构的一面朝上。在培养皿中的负模上倒入2.5克或约1.2毫升的PDMS前体正模溶液。将前体溶液脱气30分钟，然后置于60摄氏度的烘箱中固化3至4小时。固化后，从培养皿中取出模具。立即将正型模具从负型模具上剥离。使用10毫米活检打孔器将正型模具切割成片状。接着，用镊子轻轻将每个10毫米正型模具的平面一侧浸入预先配制好的PDMS胶前体溶液中。将一个模具小心地放入48孔板的每个孔中。轻轻按压每个模具，使其粘附在孔底。将组装好的板在60摄氏度下孵育4至24小时，以固化胶水。首先，将PDMS微孔模具、抗黏附冲洗液和必要的实验器具放入组织培养罩中。清洗PDMS微孔模具时，使用1,000微升移液器向每个孔中加入300微升抗黏附冲洗液。然后以1,620×g离心3分钟。使用真空泵和巴斯德移液管抽吸溶液。接着，将500 µL处于所需浓度的细胞悬液加入微孔中，并以1,620 ×g离心3分钟。将板置于湿润培养箱中，以促进类球体形成。收集类球体时，使用1,000微升移液器，向每个孔中牢固地加入500微升完全培养基。将加入的培养基在每个象限上下吹打三到四次，以使类球体脱离。然后用移液器轻柔地将含有类球体的培养基吸出，转移至微量离心管中。将50微升类球体悬液转移至微量离心管中。随后，依次加入四臂PEG-丙烯酸酯和PEG-二硫醇。通过移液枪上下吹打约10次，混匀所得溶液，得到100微升浓度为10%（重量/体积）的PEG水凝胶前体溶液。用移液器吸取20微升凝胶前体溶液，滴加到两片经Parafilm包被的玻璃载玻片之间，载玻片之间用1毫米厚的硅胶间隔物隔开，随后将载有凝胶前体溶液的载玻片孵育，以使凝胶形成。一旦水凝胶完成凝胶化，使用刮铲轻轻将凝胶从分离的玻璃载玻片上剥离。将每块凝胶放入24孔板的一个孔中，确保含有球状体的表面朝上。向每个孔中加入 500 µL 完全培养基，以完全浸没水凝胶。将多孔板置于湿润的培养箱中培养细胞。使用微孔模具的所述技术可形成具有球形结构且多分散性严格可控的球状体。对于每个微孔中含有3,300个细胞的球形体，其平均直径约为250微米，圆度大于0.8（以1表示完美的球形）。球形体的直径取决于微孔的大小以及每个微孔中的细胞数量。首先，吸除24孔板中培养水凝胶包封细胞的孔内的培养基。用移液器将500微升PBS直接加入含有水凝胶的每个孔中，冲洗水凝胶，然后轻轻吸除PBS。使用1,000微升移液器，向24孔板中每孔加入500微升固定液，以固定类球体。室温下静置30分钟，使固定液充分浸透凝胶，随后用移液器吸出固定液，并将其弃入指定的废液容器中。接下来，用 PBS 冲洗水凝胶三次，操作方法如前所述。若不立即使用，请将水凝胶以每孔 500 µL PBS 保存于 4 °C，最多可保存一周。对水凝胶包埋的细胞进行染色时，首先配制适当稀释的一抗，靶标分别为 nestin 和 SOX2。吸出孔板中的 PBS 后，向每个孔中加入 50 微升稀释后的抗体。将细胞与抗体共同孵育 24 小时，以实现完全染色。然后，使用 1,000 微升移液器移除染色液，并妥善处理废液。在将水凝胶洗涤三次后，可将其置于4°C的磷酸盐缓冲液（PBS）中保存长达两周后再进行成像，或立即进行成像。为了清除染色类球体以提高成像透明度，首先吸除每个孔中的PBS。随后，依次向每个孔中的类球体加入500微升的20%、40%和80%甲酰胺溶液，每步处理90分钟。最后，在成像前将水凝胶置于100%甲酰胺中孵育24小时。在不同Z轴层深度对类球体进行成像，从而可在Z轴堆叠的每个位置评估细胞活力。通过最大投影法处理类球体的Z轴堆叠图像，将每个位置的最高光强值简化为单张图像。染色类球体的代表性图像显示，自我更新转录因子 SOX2 与 DAPI 在细胞核内共定位。相反，干细胞标志物 nestin 在整个细胞中均有分布。无凝胶的游离类球体与包封类球体之间未见差异，这可能是由于所用 PEG 凝胶的惰性所致。对透明化处理前后类器官约 90 微米深度的光学切片进行代表性成像显示，经过透明化处理后，类器官核心区域的成像深度相比未透明化类器官可增加约 30 微米。

tumor-spheroid-fabrication-encapsulation-polyethylene-glycol

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

聚乙二醇水凝胶中的肿瘤球状体制造和封装用于研究球状体-基质相互作用

来源：Guyon, J.，等．用于胶质母细胞瘤的三维球体模型．J. Vis. Exp.

肿瘤细胞侵袭的三维球体模型构建

粒子追踪微流变学可用于无损地定量分析并空间定位三维肿瘤模型中细胞外基质力学性质的变化。...

利用粒子追踪微流变学对三维肿瘤模型中细胞外基质刚度进行纵向测量

侵袭周围正常组织是恶性肿瘤的一个显著特征。本文提供了一种简单且半自动化的微孔板检测方法，用于检测细胞对天然三维生物基质的侵袭能力，该方法已成功应用于多种人类晚期癌症模型。...

三维（3D）肿瘤球体侵袭实验

本文介绍了一种通过细胞聚集快速形成三维细胞球体的灵活实验方案。该方法可轻松适用于多种细胞类型，适用于细胞迁移、侵袭或失巢凋亡检测，以及细胞-基质相互作用的成像与定量分析等多种应用。...

一种高效且灵活的细胞聚集法用于三维球状体的制备

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基于完全人源肿瘤基质的三维球体侵袭实验

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一种用于研究肝细胞癌中肿瘤-间质相互作用的三维球状模型

本研究描述了在多功能装置内，使类球体和类器官保持在水凝胶中完整状态的情况下，对其进行培养、冷冻、解冻、处理、染色、标记以及在各种显微镜下观察的方法学。...

在水凝胶中完整培养、冻存、处理及成像类器官与球状体

本文展示了一种构建三维肿瘤球体的标准化方法。同时介绍了一种利用自动化成像系统对球体进行观察及基于图像的深度学习分析的策略。...

用于药物评价研究的三维肿瘤球体的生成

迫切需要能够模拟异质细胞间串扰的三维癌症模型来研究癌症转移。本研究展示了在有支架和无支架环境中构建异质多细胞间质-上皮模型的方法，可用于研究细胞侵袭行为及空间分布特征。...

无支架三维上皮癌细胞培养中异源多细胞间质细胞驱动侵袭

学习使用聚乙二醇水凝胶封装肿瘤球状体的方法，快速构建模拟肿瘤微环境的体外模型。该技术无需专用设备，成本低且操作简便，适用于研究球状体与基质相互作用及肿瘤生物学机制。

肿瘤类球体的制备及其在聚乙二醇水凝胶中的包封用于研究类球体-基质相互作用

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