Name: 具有不同唾液酸化表型的单核细胞来源的树突状细胞的生成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T14:10:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: 学习使用唾液酸酶处理从人外周血单个核细胞生成去唾液酸化单核细胞来源树突状细胞的方法。该方案通过酶促处理促进细胞成熟，同时保持细胞活力，为糖免疫学研究提供可靠技术。

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作者感谢欧洲委员会 GLYCOTwinning GA 101079417 和 EJPRD/0001/2020 EU 825575 项目资助；葡萄牙科学技术基金会（FCT）在&#160;基金项目 FCT 2022.04607.PTDC、UIDP/04378/2020、UIDB/04378/2020（UCIBIO）以及 LA/P/0140/2020（i4HB）下的资助。FCT-NOVA 和 Stemmatters 还通过“北部区域运营计划”（Norte 2020）获得欧洲区域发展基金（FEDER）对 SI I&amp;#38;amp;DT DCMatters 项目（NORTE-01-0247-FEDER-047212）的资助。我们感谢 FCT-NOVA 的 Biolabs 设施以及 GLYCOVID NOVA Saude。

细胞来自健康匿名献血者的血沉棕黄层，这些献血者由葡萄牙国家血库和移植研究所（Instituto Português do Sangue e da Transplantação, IPST）提供，并在获得书面知情同意后采集（IMP.74.52.4）。血液使用已获得伦理委员会批准（IPST 30072015），符合欧盟关于人体组织和细胞捐献、采集、检测、处理、保存、储存和分发的质量与安全标准的第2004/23/EC号指令（葡萄牙法律22/2007，6月29日）。IPST生物样本库使用含有柠檬酸盐磷酸盐葡萄糖（CPD）的专用塑料采血袋收集和储存血液，CPD是一种保存和抗凝溶液，可维持血液在处理前的完整性。为评估生物材料是否适合操作，需进行血清学检测，包括梅毒螺旋体（Treponema pallidum）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）和人类免疫缺陷病毒（HIV），所有检测结果必须为阴性。本研究中，血沉棕黄层由IPST提供用于研究目的，并附有采集日期、血清学检测结果、血型及献血者年龄等信息32。血沉棕黄层在室温下最多可保存1天。
1. 获取单核细胞来源的树突状细胞
注意：需要特别说明的是，在操作人外周血时，应考虑采取特定的通用安全预防措施以及适当的材料处理方式。在开始实验前，需确认所有必要的试剂和材料均已准备妥当并可随时使用。
<ol>
	<li>外周血单个核细胞的分离
	<ol>
		<li>获取人血沉棕黄层 
		注意：血沉棕黄层是从采集的血液中获得的副产品 通过 白细胞单采术32，通过离心富集白细胞。所有步骤均在垂直气流式生物安全柜（BSC）中进行。</li>
		<li>用手术刀剪开密封的输出管，打开血沉棕黄层包装，将内容物转移至一个50 mL离心管中。将7 mL血沉棕黄层样品分装至每个无菌的15 mL锥形管中，并加入6 mL磷酸盐缓冲液（PBS）进行初步洗涤。此初步洗涤步骤是必要的，以去除样品中大量存在的红细胞（RBC）和血浆，从而使样品更适合用于密度梯度介质进行梯度分离（参见 材料表).</li>
		<li>在室温下以 1,100 x g 离心 10 分钟 g 使用带有摆动转子且刹车关闭的离心机（参见 材料表).</li>
		<li>离心后，用巴斯德吸管收集白细胞悬液（位于血浆与红细胞之间的白色环状层），并转移至一个新的无菌15 mL锥形管中。</li>
		<li>用PBS将白细胞悬液补至10 mL，以利于后续分离步骤，并通过轻柔吹打混匀。</li>
		<li>准备密度梯度介质（密度：1.077 g/mL）溶液：将3 mL密度梯度介质加入新的无菌15 mL锥形管中，置于室温预热。</li>
		<li>将5 mL稀释后的白细胞悬液（来自步骤1.1.5）加入含有密度梯度介质（5:3）的锥形管中，进行密度梯度分离。使用管壁缓慢逐滴加入样本，避免扰动密度梯度介质。</li>
		<li>梯度分离：将密度梯度介质悬液在室温下以1,100 x g离心30分钟 g 使用带有摆动转子且关闭刹车的离心机。</li>
		<li>离心后，小心地从离心机中取出锥形管。此步骤后可观察到一系列界限清晰的分层，自下而上依次为：红色层（红细胞和粒细胞）、密度梯度介质、一层薄而浅的外周血单个核细胞（PBMC）层，以及血浆。</li>
		<li>使用巴斯德吸管收集单个核细胞（PBMC）的薄层，注意避免吸取下方的密度梯度介质或上方过多的血浆。将PBMC样品转移至新的50 mL锥形管中，加入PBS至25 mL，轻轻吹打混匀样品。</li>
		<li>在室温下以 600 x 转速离心样品 10 分钟 g （正常制动）以洗去残留细胞和碎片，然后小心倒置离心管弃去上清液。 
		注意：如果红细胞污染过多，可观察到细胞沉淀或白膜层未完全分离或呈红色，则建议裂解残留的红细胞。在此情况下，加入 5 mL 红细胞裂解缓冲液（参见 材料表），充分混匀，孵育5分钟。用PBS定容至40 mL，于室温下以900 × g离心10分钟 g （正常离心），然后小心倒置离心管以弃去上清液。</li>
		<li>用 PBS 将样品补至 10 mL，取一份等分试样进行细胞计数。为去除血小板，在室温下以 400 × g 离心 5 分钟 g （正常制动），然后小心倒置离心管以弃去上清液。 
		注意：若血小板数量较多，需在室温下以200 x g离心10分钟 g （正常制动）两次。通过观察样本并在计数细胞的同时进行可视化来识别血小板。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过免疫磁珠分离法分离单核细胞
	<ol>
		<li>通过在 PBS 中添加 0.5% 牛血清白蛋白（BSA）和 2 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）来制备磁珠缓冲液。用滤器（0.2 µm）过滤溶液以灭菌，并将缓冲液冷藏保存（2–8 °C）。</li>
		<li>进行单核细胞CD14检测+ 磁珠激活细胞分选法（MACS）分离
		<ol>
			<li>使用自动细胞计数器进行细胞计数后（步骤 1.4.1），计算所需微珠缓冲液和 CD14 免疫磁珠的适当体积（参见 材料表)。确保将这些溶液置于冰上。每 1 × 10⁶ 个细胞加入 80 µL 微珠缓冲液7 细胞和每1×10⁶个细胞使用20 µL CD14磁珠7 细胞</li>
			<li>将细胞沉淀重悬于先前确定体积的溶液中，于 4 °C（2-8 °C）孵育 15 分钟。 
			注意：如果需要验证PBMC样本中的单核细胞水平，可使用染色抗体（如CD14［单克隆TÜK4］）进行流式细胞术分析。流式细胞术分析的具体操作详见步骤3.2。</li>
			<li>每 1 × 10⁶ 个细胞加入 1–2 mL 微珠缓冲液7 细胞，在室温下以600 x g离心10分钟 g （正常刹车）以去除未结合的磁珠，并通过小心倒置离心管弃去上清液。</li>
			<li>准备LS柱。LS柱中含有铁磁性微球，当其置于磁铁上时，可轻柔且有效地保留磁标记的细胞。33使用前立即放置一个LS柱（参见 材料表将样品置于磁铁上，用3 mL微珠缓冲液冲洗，注意不要完全干燥，并立即进行下一步操作。 
			注意：操作过程中切勿让层析柱干燥，以免影响得率。</li>
			<li>将细胞沉淀重悬于每 1 × 10⁶ 个细胞 500 µL 微珠缓冲液中8 细胞。如果细胞数量高于 4 x 108使用40 µm细胞筛网以防止细胞聚集。</li>
			<li>将细胞悬液加入柱子入口，在柱子出口下方放置一个15 mL锥形管以收集阴性细胞组分，并用3 mL磁珠缓冲液洗涤柱子三次。阴性组分包含未被CD14磁珠捕获的细胞（即CD14⁻细胞）。− 细胞）</li>
			<li>最后一次洗涤后，将柱子从磁铁上取下，置于无菌的15 mL锥形管上，用移液器向柱子入口加入5 mL微珠缓冲液，并立即插入注射器推杆至柱子入口，推动推杆以洗脱目标细胞。</li>
			<li>收集磁标记细胞（CD14+ 细胞），并取一份 aliquot 进行细胞计数，具体操作如步骤 1.4.1 所述。</li>
			<li>离心收集两个细胞组分CD14− 和 CD14+ 细胞，室温下，600 × g，孵育10分钟 g （正常刹车）。弃去上清液，保留CD14+ 用于后续步骤的组分，并储存CD14− 必要时可将细胞用于后续实验，如共培养实验。如有需要，可从CD14分选获得的细胞− 该组分可在-80 °C条件下用含20% FBS和10% DMSO的RPMI-1640冻存。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>单核细胞向树突状细胞的分化
	<ol>
		<li>通过向 RPMI-1640 基础培养基（含 11.1 mM 葡萄糖）中添加 10% 胎牛血清（FBS）、1% 的 2 mM L-谷氨酰胺、1% 非必需氨基酸（NEAA）、1% 丙酮酸钠以及 1% 的 100 µg/mL 青霉素/链霉素，配制完全 RPMI-1640 培养基（见 材料表).</li>
		<li>将单核细胞分化为mo-DCs，该过程持续约5-6天。
		<ol>
			<li>计算培养基所需体积，以满足CD14细胞数量的需求+ 获取细胞，并根据以下实验设计将细胞接种于培养板中。 
			注意：在本实验方案中，细胞以 1.3 x 106 细胞/mL，以考虑细胞死亡和测量误差，培养基中添加了1,000 U/mL的GM-CSF和750 U/mL的IL-4（见 材料表) 加入完全培养基并充分混匀。</li>
			<li>加入适量培养基至CD14+ 细胞，并用巴斯德移液管上下吹打重悬。将细胞悬液接种至24孔板中（每孔：1.3 × 10⁵ 个细胞）。6 细胞/mL），并在37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育2.</li>
			<li>更换培养基，并每隔2-3天（通常在整个分化过程中仅一次）补充新鲜细胞因子。操作时，小心移除一半的培养基，注意不要扰动细胞。按照步骤1.3.2.1注释中所述，加入等量含适当浓度细胞因子的新鲜培养基，继续孵育至分化过程结束。 
			注意：当树突状细胞（DCs）由单核细胞分化而来时，为弱贴壁细胞。完全分化的未成熟单核细胞来源的树突状细胞（mo-DCs）呈纺锤形，悬浮生长，且为弱贴壁细胞。这些细胞还可能形成玫瑰花环结构，尤其是在成熟状态下。34.</li>
			<li>收集分化后的细胞时，使用微量移液器将整个细胞悬液转移至无菌锥形管中，并用 PBS 洗涤培养板孔两次，轻轻敲击板底图1A). 
			注意：避免收集贴壁性很强的细胞，这些细胞可能是巨噬细胞。为避免细胞发生异常成熟或活化，操作过程中须格外小心。</li>
			<li>在室温下以 180 x g 离心细胞 10 分钟 g （正常刹车）以去除残留物或死细胞，并在适当的培养基/缓冲液中重悬，用于实验设置。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>进行mo-DCs的成熟处理。
		<ol>
			<li>如果需要促进mo-DC的成熟，可使用培养板或培养瓶，并参考此前使用的细胞浓度示例（1.3 x 106 细胞/mL），并通过在培养基中添加含IL-1β（10 ng/mL）、IL-6（1,000 U/mL）、前列腺素E2（PGE2；1 µg/mL）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α；10 ng/mL）的细胞因子混合物进行处理（参见 材料表）。将细胞在37 °C、5% CO₂条件下孵育2 24 小时或 48 小时。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞计数与活力检测
	<ol>
		<li>进行细胞计数和台盼蓝染色。
		<ol>
			<li>为确定细胞悬液中的细胞数量和细胞活力，取10 µL细胞悬液，与10 µL台盼蓝混合（1:1稀释）。</li>
			<li>取10 µL上述混合液，按照制造商说明书使用自动细胞计数器对细胞数量进行计数。 
			注意：如果细胞浓度过高，需稀释样品；在细胞计数后，计算时应考虑稀释倍数。</li>
			<li>根据实验设计调整细胞数量及培养基/缓冲液体积。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>测定细胞活力与细胞凋亡30. 
		注意：本实验中，在唾液酸酶处理（第2节）后进行了细胞活力检测。
		<ol>
			<li>用 5 µg/mL 7-氨基放线菌素 D（7-AAD）和 V 型膜联蛋白（annexin V）对 mo-DCs 进行染色，并根据制造商说明书检测细胞凋亡（参见 材料表).</li>
			<li>使用流式细胞术分析结果29,30.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 用唾液酸酶处理细胞
注意：在分化为 mo-DC 后的第六天，细胞已准备好进行唾液酸酶处理实验。
<ol>
	<li>根据所需的实验设计，从24孔板的10个孔中收集约10 × 106个mo-DC细胞（每孔含1.3 × 106个细胞），并将其转移至一个新的无菌15 mL锥形管中。 
	注意：需考虑细胞损失；通常在此阶段，细胞浓度约为1.3 × 106个/mL，因为mo-DC及其前体细胞不增殖，且在向mo-DC分化过程中会有约20%的细胞活力损失。</li>
	<li>在室温下以300 × g离心5–7分钟（使用正常刹车），弃去上清液以去除死细胞和碎片。</li>
	<li>加入10 mL RPMI-1640培养基（含11.1 mM葡萄糖），在室温下以300 × g离心4分钟（使用正常刹车），弃去上清液，再加入2 mL RPMI-1640培养基，并充分混匀。</li>
	<li>将1 mL含细胞的RPMI-1640培养基分别加入两个新的无菌微量离心管（编号为#1和#2）中；每个微量离心管中约含5 × 106个细胞。</li>
	<li>向微量离心管#1中加入500 mU来自Clostridium perfringens&#160;的神经氨酸酶（见材料表）；向&#160;微量离心管#2中加入模拟处理的神经氨酸酶作为阴性对照，以确认所观察到的效应是否直接与唾液酸的去除相关，而非由实验假象引起。模拟处理的神经氨酸酶是指经热灭活的酶，通过将酶在100 °C下煮沸20分钟获得。</li>
	<li>在37 °C下孵育60分钟。</li>
	<li>孵育结束后，将细胞转移至编号相同的新的无菌15 mL锥形管（#1和#2），并向两管中各加入约4 mL完全RPMI-1640培养基（含10% FBS），以终止酶反应。</li>
	<li>在室温下以300 × g离心4分钟（使用正常刹车），弃去上清液。</li>
	<li>向每管中加入5 mL完全RPMI-1640培养基，并将每孔接种1 mL细胞悬液。</li>
</ol>
3. 唾液酸谱的测定
<ol>
	<li>凝集素染色
	<ol>
		<li>在室温下以 300 × g 离心 5 分钟（正常刹车）收集并洗涤细胞。</li>
		<li>将细胞重悬于 RPMI-1640 + 10% FBS 中，并将细胞（100,000/100 µL）分配至微量离心管中。</li>
		<li>在含 10% FBS 的 RPMI-1640 中进行流式细胞术染色，每种凝集素使用 0.01 mg/mL 的浓度：Sambucus nigra（SNA）凝集素、花生凝集素（PNA）凝集素和 Maackia amurensis（MAA）凝集素（参见材料表）。4 °C 下孵育 30 分钟。</li>
		<li>用含 10% FBS 或 10% BSA 的 1 mL PBS 洗涤细胞，并在室温下以 300 × g 离心 4 分钟（正常刹车）。</li>
		<li>向经生物素化凝集素染色的细胞中加入 0.0005 mg/mL 链霉亲和素-PE（参见材料表），室温避光孵育 15 分钟。用 1 mL PBS 洗涤细胞，并在室温下以 300 × g 离心 4 分钟（正常刹车）。</li>
		<li>弃去上清液，向每管中加入 300 µL 2% 多聚甲醛（PFA 2%）。避光保护，如需延迟检测，可在 4 °C 下保存至数据采集。</li>
		<li>在样本制备后 1 周内使用流式细胞仪采集数据29,30。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>流式细胞术
	<ol>
		<li>将细胞重悬于 1 mL PBS 中，并立即使用流式细胞仪进行样本检测和数据采集。</li>
		<li>若需延迟数据采集，则将细胞重悬于 300 µL 2% PFA 中，并在 1 周内完成数据采集。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>共聚焦激光扫描显微镜
	<ol>
		<li>将细胞接种于直径为 12 mm 的多聚赖氨酸包被的玻璃盖玻片上，室温孵育 5 分钟。</li>
		<li>在室温下以 100 × g 离心盖玻片 1 分钟（正常刹车），以促进细胞贴附。</li>
		<li>用 4% PFA 在室温下固定 30 分钟，随后用含 1% BSA 的 PBS 洗涤。</li>
		<li>使用 FITC 标记的 SNA 凝集素（0.01 mg/mL）染色细胞表面的 α2,6-连接唾液酸（参见材料表）。</li>
		<li>在共聚焦显微镜上采集图像（参见材料表）。</li>
		<li>经 Z 轴层扫处理后，选取代表性共聚焦横截面图像。</li>
		<li>使用校正总细胞荧光强度（CTCF）对染色强度进行定量分析。 
		&#8203;注：CTCF = 积分密度 −（选定细胞面积 × 背景荧光平均值）29。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. mo-DCs 的成熟过程分析
<ol>
	<li>抗体染色与流式细胞术
	<ol>
		<li>收集感兴趣的细胞新样本以进行抗体染色。在室温下以300 × g（正常刹车）离心5分钟，洗涤细胞，并将细胞分装至微量离心管中（每管100,000个细胞）。</li>
		<li>使用目标抗体（ab）、MHI-I、MHC-II、CD80和CD86进行流式细胞术染色（参见材料表）。</li>
		<li>在室温避光条件下孵育荧光标记抗体15分钟。</li>
		<li>用1 mL PBS洗涤细胞，并在室温下以300 × g（正常刹车）离心5分钟。 
		注意：若使用未标记的一抗，需加入荧光标记的二抗，按照生产商说明书在避光条件下孵育15分钟。随后用1 mL PBS洗涤细胞，并在室温下以300 × g（正常刹车）离心5分钟。</li>
		<li>向所有微量离心管中加入最多100 µL PBS，将细胞重悬于300 µL 2%多聚甲醛（PFA 2%）中，并将管子置于4 °C避光保存，直至获取数据。</li>
		<li>使用流式细胞仪获取数据。 
		注意：染色和固定后，样本可立即进行流式检测，或在1周内完成检测。在此期间，应将样本管置于4 °C避光保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 酶联免疫吸附测定（ELISA）
注意：本研究中，按照制造商说明书（参见材料表），采用ELISA法检测IFN-γ的产生。
<ol>
	<li>使用包被缓冲液稀释捕获抗体（1:100，将捕获抗体稀释于PBS中），每孔加入100 µL该工作液，于室温孵育过夜。</li>
	<li>彻底弃去捕获抗体溶液。</li>
	<li>加入封闭缓冲液（例如PBS + 2% BSA + 0.05% Tween20），室温孵育1小时后弃去封闭缓冲液。</li>
	<li>加入标准品和样品，按相应混合方式和稀释比例添加，室温孵育2小时，随后用洗涤缓冲液洗涤五次。</li>
	<li>加入生物素标记的检测抗体，室温孵育2小时，之后用洗涤缓冲液洗涤五次。</li>
	<li>加入多聚-HRP-链霉亲和素-HS，室温孵育30分钟，随后用洗涤缓冲液洗涤五次。</li>
	<li>加入TMB底物（参见材料表），根据所用检测系统的具体情况，室温孵育最长60分钟，随后用洗涤缓冲液洗涤五次。</li>
	<li>使用酶标仪在450 nm波长下读取样品吸光值。</li>
</ol>

De-Sialylated Monocyte-Derived-DCs from Isolated PBMCs Using Sialidase Treatment

作者声明不存在竞争性财务利益或其他利益冲突。

单核细胞分离 
本论文描述了一种从人源分离的CD14+单核细胞生成mo-DC的方案（图1A），随后进行唾液酸酶处理，以降低这些细胞表面的唾液酸含量。
获取人树突状细胞（DC）的方法有多种，例如直接从外周血或组织中分离，或通过干细胞或单核细胞等前体细胞分化获得。其中，从外周血中分离单核细胞并诱导其分化为DC的方法更为简便，因为与其他DC来源相比，更容易获得大量单核细胞41。然而，为了获得高纯度的单核细胞，必须严格遵循实验方案的每一步操作。例如，密度梯度介质可能对细胞具有毒性，为防止细胞死亡，应避免细胞与密度梯度介质长时间接触，并需彻底清洗细胞。细胞操作应尽可能迅速，以避免细胞活力下降。从外周血单个核细胞（PBMCs）中，可通过磁珠激活细胞分选（MACS）法进行阳性选择来分离单核细胞，该技术能够获得较高数量的单核细胞。此外，与其他单核细胞分离方法相比，由MACS法分离的单核细胞所衍生的mo-DC在刺激抗肿瘤T细胞活性方面能力更强42。在本实验方案中，分离后的单核细胞经IL-4和GM-CSF诱导培养5–6天，以实现向未成熟mo-DC的分化（图1）。结果显示，无论是在形态学（图1A）还是表型特征上（图1B），分离的单核细胞均已成功分化为未成熟mo-DC。此外，在整个分化过程中，mo-DC逐渐失去CD14标志物的表达，同时获得CD1a和MHC-II的表达（图1B），而后者是向T细胞呈递抗原所必需的分子。
将单核细胞分离并分化为mo-DC是本方案的局限性所在。分离过程是一个敏感步骤，必须谨慎且迅速地进行，以避免细胞死亡，且每次实验需要mo-DC时都必须重复该步骤。分化过程需耗时5至6天，这在应用于高通量分析时存在困难。尽管如此，该分离方法结合细胞因子诱导分化mo-DC的方式，仍可用于生成大量具有功能活性的mo-DC。 体外 出于实验目的。本方案生成的mo-DCs可进行唾液酸酶处理、流式细胞术、ELISA、共聚焦显微镜等分析，从而凸显了该方法的重要性和实用性30.
未成熟单核细胞来源的树突状细胞（mo-DCs）与唾液酸酶处理 
唾液酸酶在唾液酸化调控中起关键作用，负责从细胞表面糖链上移除唾液酸。在单核细胞来源的树突状细胞（mo-DCs）中，唾液酸酶介导的唾液酸去除可诱导这些细胞成熟，从而增强抗原交叉提呈能力，进而促进T细胞活化及抗肿瘤活性30。
与成熟的mo-DCs相比，未成熟的mo-DCs细胞表面含有较高水平的α(2,6)-和α(2,3)-连接唾液酸27，而成熟的mo-DCs则较低31,43。此外，通过唾液酸酶处理去除mo-DCs表面的唾液酸可促进DC的成熟过程28,30,31。本实验选用的唾液酸酶来源于细菌Clostridium perfringens。然而，其他生物体也能产生唾液酸酶，例如细菌Streptococcus pneumoniae、Vibrio cholerae或Salmonella typhimurium44，水蛭Macrobdella decora45，甚至人类Homo sapiens46，这些来源的唾液酸酶也常被用于实验研究。但每种唾液酸酶具有不同的底物特异性。此外，使用唾液酸酶可能存在一定局限性；例如，在处理过程中对mo-DCs的操作可能进一步激活这些细胞。同时，唾液酸酶的用量和孵育时间必须根据所用细胞类型及其唾液酸组成进行优化。唾液酸的去除并非永久性效应，而是一种短暂现象，因为细胞会自行恢复其细胞表面的唾液酸含量。除唾液酸酶外，还有其他方法可用于减少细胞表面的唾液酸分子，例如使用唾液酸转移酶抑制剂、敲除唾液酸转移酶基因，或利用唾液酸类似物进行唾液酸代谢阻断47,48,49。然而，这些方法可能对细胞产生不同的影响，因此除去唾液酸化作用之外，还需考虑细胞活力。唾液酸酶处理是一种在维持细胞活力的同时，有效且短暂地去除细胞表面唾液酸的实用方法。
在本研究中，将神经氨酸酶以500 mU/5 × 106 个细胞/mL的浓度加入未成熟的mo-DCs中，在37 °C下孵育60分钟。处理过程使用无血清的RPMI-1640培养基，以维持细胞活力，并避免血清中含唾液酸分子可能产生的相互作用30。神经氨酸酶处理也可在其他缓冲液中进行，例如50 mM醋酸钠缓冲液（pH 5.1，适用于C. perfingens神经氨酸酶）或PBS50,51,52。然而，RPMI-1640是树突状细胞最常用的培养基，因其可在操作过程中维持稳定的实验条件，避免诱导细胞成熟，并减少神经氨酸酶缓冲液或PBS可能引起的任何应激反应53,54,55,56。在神经氨酸酶孵育后，必须使用含血清的培养基彻底洗涤细胞，以确保酶反应已完全终止。血清中存在的唾液酸化分子可作为神经氨酸酶的竞争性底物，从而保证反应迅速停止。
通过流式细胞术和共聚焦显微镜进行表面标志物表征 
为了确定唾液酸谱，在方案第3部分中，我们采用了凝集素染色，随后进行流式细胞术和共聚焦激光扫描显微镜分析。在两种情况下，细胞染色步骤中的凝集素浓度和孵育条件均经过优化，以避免细胞凝集和死亡。关键是要在含有至少2% FBS或BSA的缓冲液中于4 °C进行孵育，以防止凝集素的非特异性结合。在本方案中，使用含10% FBS的RPMI-1640培养基，以保持实验条件恒定并避免细胞应激。对于共聚焦显微镜分析，染色前对细胞进行固定至关重要，以保持细胞形态、防止自溶并维持抗原性。
通过流式细胞术分析mo-DC表型显示，经神经氨酸酶处理的mo-DC细胞表面结合的PNA凝集素显著高于MMA和SNA凝集素，而MMA和SNA凝集素的结合在神经氨酸酶处理后下降（图2A）。正如预期，PNA染色增强，因为PNA识别非唾液酸化的抗原，而MAA和SNA则分别直接结合α2,3-和α2,6-唾液酸（30）。该染色结果证实本方案可有效去除细胞表面的唾液酸。另一种可用于验证处理效果并分析细胞表面唾液酸含量的方法是凝集素染色结合共聚焦显微镜观察，如图2B所示。
除了上述示例外，还存在其他评估和表征唾液酸含量的方法，例如通过蛋白质印迹法进行凝集素探针检测。也可使用其他特异性识别唾液酸的凝集素，例如Siglecs，这是一类对唾液酸类型和连接方式具有独特偏好的凝集素57。除了在流式细胞术、显微镜或蛋白质印迹技术中使用凝集素外，还可利用抗体来表征唾液酸含量；例如，α2,8-唾液酸可通过特异性识别多聚唾液酸的克隆735抗体进行检测58。此外，在唾液酸酶处理后，可通过评估细胞的表型及其激活T细胞的能力，对其生物学功能或治疗效能进行功能性测试40。事实上，如示例所示，经唾液酸酶处理的mo-DCs表现出更高的成熟表型，以及抗原呈递分子和共刺激分子的表达水平升高。
此外，经唾液酸酶处理的mo-DC可负载抗原，并与T细胞或其他细胞共培养，进而可对其表型、细胞因子分泌谱或其他特征进行研究。在所提供的示例中，数据显示，经唾液酸酶处理的mo-DC可负载肿瘤抗原，并用于激活T细胞。事实上，所获得的T细胞显示出IFN-γ分泌增加，这与先前关于唾液酸缺乏可增强mo-DC激活T细胞能力的报道一致27,28,29,30,31。
总之，本方案展示了一种可行、有效且实用的方法，即通过唾液酸酶处理来调控单核细胞来源的树突状细胞（mo-DCs）中的唾液酸含量。该方案提供了一种可适用于多种目的和应用场景的方法学。该方法不仅在理解唾液酸在免疫细胞成熟与应答中的作用方面具有关键意义，还可作为一种免疫调节工具使用。

携带唾液酸的聚糖（唾液酸聚糖）因其免疫调节作用而受到广泛关注。单糖唾液酸在人体中最常见的形式是N-乙酰神经氨酸，它是凝集素的重要配体，这类凝集素在免疫学中具有明确作用，例如选择素（Selectins）和唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素（Siglecs）。这些凝集素可识别同一细胞表面的唾液酸聚糖（cis作用）或相邻细胞表面的唾液酸聚糖（trans作用），从而介导细胞间相互作用，在炎症、自身免疫和肿瘤免疫逃逸等生理与病理过程中发挥关键调控功能。 

关键词：唾液酸聚糖，唾液酸，N-乙酰神经氨酸，凝集素，选择素，Siglec，免疫调节，细胞间相互作用顺式）或在不同的细胞上（转并在宿主-病原体相互作用以及多种生理和病理性的细胞活动中发挥重要作用1,2,3此外，由于唾液酸位于细胞表面糖缀合物的末端位置，可遮蔽其下方的结构，从而抑制细胞间的直接接触 通过 非特异性排斥效应或阻碍其他凝集素的检测4细胞内多种唾液酸转移酶（负责转移唾液酸）和唾液酸酶（负责切割唾液酸键）的活性决定了细胞表面唾液酸的含量。此外，宿主或病原体表达的可溶性唾液酸转移酶和唾液酸酶可对外源性调节细胞表面唾液酸的含量5,6.
异常唾液酸化是多种病理状态的特征。在自身免疫性疾病中，唾液酸化水平降低可导致免疫系统过度活化和器官损伤，因为唾液酸有助于区分自身抗原并调节炎症反应7。相反，唾液酸化水平升高会导致唾液酸糖链（如唾液酸-Tn、唾液酸-Lewis抗原、多聚唾液酸和神经节苷脂）的过度表达，这是某些癌症的标志性特征8,9。唾液酸化水平升高还依赖于特定酶（如N-乙酰葡萄糖胺基转移酶（GNT-V））的表达上调，该酶可生成高度唾液酸化的三叉和/或四叉N-连接聚糖，这些聚糖与肿瘤生长和转移相关10。唾液酸含量还调控蛋白质的稳定性和功能，这对关键致癌因子的作用至关重要11。因此，唾液酸化水平升高可促进肿瘤发生、转移、耐药性及免疫逃逸。此外，唾液酸糖链的上调使肿瘤能够与免疫细胞上的抑制性Siglec受体相互作用，从而逃避免疫监视。基于此，唾液酸糖链现被视为糖-免疫检查点，并成为有前景的治疗靶点。例如，针对Siglec-免疫轴的抑制剂目前已进入早期临床试验阶段，因为免疫细胞表面的Siglec受体（唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素）具有免疫抑制功能12。
酶已被用作研究工具或治疗策略，以调控糖链谱型13,14。由于唾液酸化糖链（如唾液酸路易斯X）在细胞迁移和癌症转移中具有关键作用，神经氨酸酶已被用于改变癌细胞的恶性特征15。与此同时，能够抑制唾液酸裂解的神经氨酸酶抑制剂已进入临床，用于治疗依赖唾液酸的病毒感染16。近年来，由于唾液酸在Siglec-免疫轴中作为配体发挥关键作用，因而可通过调控唾液酸来抑制肿瘤逃避免疫应答，这一领域受到更多关注。2022年诺贝尔奖得主Bertozzi及其团队提出了多种可选择性裂解不同唾液酸糖链并增强抗肿瘤免疫应答的策略，进一步推动了该领域的研究进展17。因此，基于神经氨酸酶的策略代表了一种有前景的糖-免疫检查点治疗方式。免疫系统细胞的糖型特征取决于细胞类型及其活化状态。就T细胞而言，糖链在T细胞发育和胸腺细胞筛选、T细胞活性、分化与增殖等病理生理过程中发挥关键作用18。例如，糖蛋白上的多聚乳糖胺结构可影响B淋巴细胞和T淋巴细胞的基础水平以及巨噬细胞的活化19。在巨噬细胞中，特定的糖链表达模式在巨噬细胞向肿瘤微环境（TME）募集过程中具有重要作用20。因此，免疫细胞表达的O-连接和N-连接糖链可作为癌症及自身免疫性疾病治疗中潜在的糖生物学标志物。
树突状细胞（DCs）是一类特殊的抗原呈递细胞，具有启动免疫应答的独特能力，例如抗肿瘤免疫21。DCs 必须上调其抗原呈递分子 MHC，以将抗原呈递给 T 细胞（信号 1），同时上调共刺激分子以激活 T 细胞（信号 2），并分泌促炎性细胞因子（如 IL-12），以触发 1 型辅助性 T 细胞的增殖（信号 3）22。所形成的免疫应答受到严密调控，免疫检查点对于防止健康细胞被攻击至关重要。由于 DCs 能够刺激针对肿瘤细胞的多种免疫应答，因此被用作细胞疫苗，大量临床研究已证实其潜在益处23,24。自 2010 年美国食品药品监督管理局（FDA）批准首个基于 DC 的疫苗以来25,26，已开发出多种其他基于 DC 的疫苗。基于 DC 的疫苗主要在体外（ex vivo）制备，随后给予患者，以诱导针对肿瘤的免疫应答。然而，目前 DCs 成熟不充分或短暂是限制其临床疗效的因素之一，这也意味着必须使用昂贵的细胞因子混合物。在临床条件下，若缺乏充分成熟，DCs 无法有效激活 T 细胞；相反，这些 DCs 会表达免疫检查点分子，引发耐受性免疫应答，从而抑制细胞毒性 T 细胞对肿瘤细胞的攻击作用。
人类树突状细胞（DCs）表面具有高度唾液酸化修饰，而这种唾液酸化水平在细胞成熟及整体免疫应答过程中会下降27。通过神经氨酸酶去除这些唾液酸可诱导树突状细胞成熟。去唾液酸化显著上调多种细胞因子（包括IL-12）的表达，这是由于NF-kB转录因子向细胞核转位所致6,28。此外，去唾液酸化还能增强通过MHC-I分子的抗原交叉提呈能力以及抗肿瘤免疫应答29,30。相应地，敲除在树突状细胞唾液酸化过程中起主要作用的唾液酸转移酶ST3Gal.l和ST6Gal.l，可在小鼠树突状细胞中诱导出更成熟的表型31。
唾液酸酶处理提供了一种刺激树突状细胞（DC）成熟各个方面的有效方法，包括增强抗原提呈能力、上调共刺激分子表达以及促进细胞因子分泌，从而克服上述局限性，使DC能够引发有效的免疫应答。本文介绍了一种利用细菌来源的唾液酸酶制备具有活性的去唾液酸化人源DC的实验方案。去唾液酸化的DC表现出更优的成熟特征，可作为细胞模型用于增强抗肿瘤免疫反应。 体外. 树突状细胞由血液单核细胞获得，随后进行分化 体外 在细胞因子白细胞介素-4（IL-4）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）存在条件下进行。本研究还描述了基于凝集素的方法，用于分析细胞表面的唾液酸，以及用于免疫表型鉴定树突状细胞成熟水平的方法。此处所述方案也可用于其他细胞类型的去唾液酸化，从而为研究唾液酸化糖链（作为关键的糖免疫检查点，在免疫调节中具有重要意义）的功能提供一种途径。

<table><tbody><tr><td>15 mL 圆锥形离心管</td><td>AstiK&amp;rsquo;s</td><td>CTGP-E15-050</td><td>获取单核细胞来源的树突状细胞；使用神经氨酸酶处理细胞</td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>Greiner Bio-one</td><td>662 160</td><td>获取单核细胞来源的树突状细胞；使用神经氨酸酶处理细胞</td></tr><tr><td>50 mL 圆锥形离心管</td><td>AstiK&amp;rsquo;s</td><td>CTGP-E50-050</td><td>获取单核细胞来源的树突状细胞</td></tr><tr><td>7-氨基放线菌素 D（7-AAD）</td><td>BioLegend</td><td>420404</td><td>获取单核细胞来源的树突状细胞</td></tr><tr><td>Annexin V</td><td>Immunotools</td><td>31490013</td><td>获取单核细胞来源的树突状细胞</td></tr><tr><td>Attune 声学聚焦流式细胞仪</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td></td><td>唾液酸谱型测定；mo-DCs 的成熟表型分析</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A3294-100G</td><td>获取单核细胞来源的树突状细胞；唾液酸谱型测定</td></tr><tr><td>CD14（单克隆 T&amp;Uuml;K4）</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-080-701</td><td>获取单核细胞来源的树突状细胞</td></tr><tr><td>CD80</td><td>Immunotools</td><td>21270803</td><td>mo-DCs 的成熟表型分析</td></tr><tr><td>CD86</td><td>Immunotools</td><td>21480863</td><td>mo-DCs 的成熟表型分析</td></tr><tr><td>细胞计数板和台盼蓝</td><td>EVE</td><td>EVS-050</td><td>获取单核细胞来源的树突状细胞</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5430 R</td><td>获取单核细胞来源的树突状细胞；使用神经氨酸酶处理细胞；唾液酸谱型测定；mo-DCs 的成熟表型分析</td></tr><tr><td>密度梯度介质（Histopaque）</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>10771-100ML</td><td>获取单核细胞来源的树突状细胞</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Gibco, ThermoFisher</td><td>15400054</td><td>获取单核细胞来源的树突状细胞</td></tr><tr><td>ELISA 试剂盒（IFN-&amp;gamma;）</td><td>Immunotools</td><td>31673539</td><td>mo-DCs 的成熟表型分析</td></tr><tr><td>EVE 自动细胞计数仪</td><td>NanoEntek</td><td>10027-452</td><td>获取单核细胞来源的树突状细胞</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco</td><td>10500064</td><td>获取单核细胞来源的树突状细胞；使用神经氨酸酶处理细胞；唾液酸谱型测定</td></tr><tr><td>粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>&amp;nbsp; 130-093-864</td><td>获取单核细胞来源的树突状细胞</td></tr><tr><td>人 CD14 微珠（免疫磁珠）</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td>获取单核细胞来源的树突状细胞</td></tr><tr><td>白细胞介素（IL）-1&amp;beta;</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>I9401</td><td>获取单核细胞来源的树突状细胞</td></tr><tr><td>白细胞介素（IL）-4</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-919</td><td>获取单核细胞来源的树突状细胞</td></tr><tr><td>白细胞介素（IL）-6</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>SRP3096</td><td>获取单核细胞来源的树突状细胞</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>A2916801</td><td>获取单核细胞来源的树突状细胞</td></tr><tr><td>LS 柱和推杆</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>获取单核细胞来源的树突状细胞</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Maackia amurensis&lt;/em&gt;&amp;nbsp;（MAA）凝集素（生物素标记的 MAA 凝集素）</td><td>Vector labs</td><td>B-1265-1</td><td>唾液酸谱型测定</td></tr><tr><td>MHC-I（HLA-ABC）</td><td>Immunotools</td><td>21159033</td><td>mo-DCs 的成熟表型分析</td></tr><tr><td>MHC-II（HLA-DR）</td><td>Immunostep</td><td>HLADRA-100T</td><td>mo-DCs 的成熟表型分析</td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>AstiK&amp;rsquo;s</td><td>PCRP-E015-500</td><td>获取单核细胞来源的树突状细胞；使用神经氨酸酶处理细胞；唾液酸谱型测定；mo-DCs 的成熟表型分析</td></tr><tr><td>神经氨酸酶（唾液酸酶）</td><td>Roche</td><td>11585886001</td><td>使用神经氨酸酶处理细胞</td></tr><tr><td>非必需氨基酸（NEAA）</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td>获取单核细胞来源的树突状细胞</td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA 2%）</td><td>Polysciences Europe</td><td>25085-1</td><td>唾液酸谱型测定；mo-DCs 的成熟表型分析</td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA 4%）</td><td>Biotium</td><td>22023</td><td>唾液酸谱型测定</td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>Labbox</td><td>PIPP-003-500</td><td>获取单核细胞来源的树突状细胞</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;花生（Arachis hypogaea）凝集素&lt;/em&gt;&amp;nbsp;（PNA）凝集素（FITC 标记的 PNA 凝集素）</td><td>Vector labs</td><td>FL-1071</td><td>唾液酸谱型测定</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140163</td><td>获取单核细胞来源的树突状细胞</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>NZYTech</td><td>&amp;nbsp; MB18201</td><td>获取单核细胞来源的树突状细胞；使用神经氨酸酶处理细胞；唾液酸谱型测定；mo-DCs 的成熟表型分析</td></tr><tr><td>前列腺素 E2（PGE2）</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P0409</td><td>获取单核细胞来源的树突状细胞</td></tr><tr><td>红细胞裂解缓冲液</td><td>BioLegend</td><td>420302</td><td>获取单核细胞来源的树突状细胞</td></tr><tr><td>RPMI-1640 培养基&amp;nbsp;（含 11.1 mM 葡萄糖）</td><td>Gibco</td><td>31870074</td><td>获取单核细胞来源的树突状细胞；使用神经氨酸酶处理细胞；唾液酸谱型测定</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Sambucus nigra &lt;/em&gt;凝集素（生物素标记的 SNA 凝集素）</td><td>Vector labs</td><td>&amp;nbsp; B-1305-2</td><td>唾液酸谱型测定</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Sambucus nigra &lt;/em&gt;凝集素（FITC 标记的 SNA 凝集素）</td><td>Vector labs</td><td>FL-1301-2</td><td>唾液酸谱型测定</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Thermofisher</td><td>11360-070</td><td>获取单核细胞来源的树突状细胞</td></tr><tr><td>SpectroMax190</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>mo-DCs 的成熟表型分析</td></tr><tr><td>链霉亲和素-PE</td><td>BioLegend</td><td>&amp;nbsp; 405203</td><td>唾液酸谱型测定；mo-DCs 的成熟表型分析</td></tr><tr><td>四甲基联苯胺（TMB）</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>T0440</td><td>mo-DCs 的成熟表型分析</td></tr><tr><td>肿瘤坏死因子-&amp;alpha;（TNF-&amp;alpha;）</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>H8916</td><td>获取单核细胞来源的树突状细胞</td></tr><tr><td>Zeiss LSM710 共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td>唾液酸谱型测定</td></tr></tbody></table>

生成具有不同唾液酸化表型的单核细胞来源树突状细胞

Generation of Monocyte-Derived Dendritic Cells with Differing Sialylated Phenotypes

唾液酸是一类带负电荷的单糖，通常位于细胞表面聚糖的末端。由于其亲水性和生物物理特性，唾液酸参与多种生物学过程，例如免疫应答的调节、自身与非自身抗原的识别、糖-蛋白相互作用等。细胞中唾液酸的含量由唾液酸酶（sialidase）调控，该酶催化唾液酸残基的去除。多项研究表明，唾液酸聚糖通过与免疫细胞上的cis和trans抑制性Siglec受体相互作用，在监控免疫监视中发挥关键作用。同样，癌症中的糖-免疫检查点正成为开发免疫疗法的重要靶点。此外，树突状细胞（DCs）因其作为专业抗原呈递细胞（APC）的独特角色，以及启动适应性免疫应答和产生免疫记忆的能力，被视为免疫疗法（尤其是癌症研究）中的重要组成部分。然而，DCs的功能依赖于其完全成熟。未成熟DCs的功能与成熟DCs相反，且具有较高的唾液酸含量，这进一步抑制了其成熟程度。这种状态会下调未成熟DCs激活T细胞的能力，导致免疫应答受损。因此，从人DCs细胞表面去除唾液酸可诱导其成熟，从而增加MHC分子的表达和抗原呈递能力。此外，它还能恢复共刺激分子和IL-12的表达，使DCs更有效地将T细胞极化为Th1表型，并特异性激活细胞毒性T细胞以杀伤肿瘤细胞。因此，唾液酸已成为调控DCs的关键调节因子，并被用作提升其治疗应用潜力的新靶点。本研究提供了一种独特的方法，使用唾液酸酶处理in vitro来源的单核细胞衍生DCs，旨在生成具有不同细胞表面唾液酸表型以及定制化成熟和共刺激特征的DC群体。

单核细胞的分离及向mo-DCs的分化 
根据实验方案，采用密度梯度分离介质通过密度梯度离心法从血沉棕黄层中分离人外周血单个核细胞（PBMCs），并充分洗涤。如步骤1.4.1所述，在分离当天使用台盼蓝进行活细胞计数。随后通过阳性选择法进行CD14+单核细胞的分离。具体操作为：将PBMCs与连接有识别CD14抗体的磁珠共同孵育。分离所得的CD14+单核细胞在添加了GM-CSF和IL-4的培养基中培养5-6天27，以诱导其分化为未成熟mo-DCs（图1A）。通过使用包含IL-6、IL-1β、TNF-α和PGE2的细胞因子混合物刺激，可诱导mo-DCs成熟35（图1A）。
在分化过程中，由于IL-4和GM-CSF的刺激，细胞表型预期会发生变化。数据显示，单核细胞来源的树突状细胞（mo-DCs）会失去主要由单核细胞表达的表面标志物CD14（图1B），并显著获得CD1a的表达，后者是人树突状细胞表达的标志物36,37。此外，mo-DCs还会获得更高的MHC-II（HLA-DR）表达水平，这是一种由人树突状细胞及其他抗原呈递细胞表达的抗原呈递分子38（图1B）。
细胞表面唾液酸含量 
使用神经氨酸酶处理 mo-DC 可降低其细胞表面的唾液酸含量，该效果可通过凝集素染色进行验证，凝集素是一类能够结合碳水化合物的蛋白质39。由于所用酶可从细胞表面去除 α2,3 和 α2,6 连接的唾液酸，因此对 mo-DC 进行了 PNA 染色（识别 T 抗原-Galβ1-3GalNAcα1-Ser/Thr）以及 MAA 和 SNA 凝集素染色（分别结合 α2,3- 和 α2,6- 唾液酸）。通过流式细胞术和共聚焦显微镜分析评估神经氨酸酶处理的效果（图 2）。如 图 2A 所示，神经氨酸酶处理显著降低了 MAA 和 SNA 的结合，同时增强了 PNA 染色。共聚焦显微镜分析进一步证实，神经氨酸酶处理后细胞表面 SNA 染色明显减少（图 2B）。
唾液酸酶处理后 mo-DCs 的功能表征 
为了评估唾液酸酶处理对 mo-DC 功能的影响，在唾液酸酶处理后检测了 mo-DCs 的成熟水平。如图 3A所示，唾液酸酶处理显著提高了抗原呈递分子 MHC I 和 MHC II 以及共刺激分子 CD80 和 CD86 的表达水平。为了评估去除唾液酸对 mo-DCs 诱导 T 细胞应答能力的影响，使用负载肿瘤细胞裂解物的唾液酸酶处理 mo-DCs 来启动自体 T 细胞（图 3）。随后，根据 T 细胞分泌 Th1 型细胞因子 IFN-γ 的能力对其表型进行表征。如图 3B所示，与完全唾液酸化的 mo-DCs 启动的 T 细胞相比，经唾液酸酶处理的 mo-DCs 启动的 T 细胞分泌的 IFN-γ 水平显著更高。这些结果表明，唾液酸酶处理的 mo-DCs 在启动自体 T 细胞方面具有更强的能力。
细胞活力 
唾液酸酶处理后，进行细胞活力检测，以确保该处理对细胞无细胞毒性。处理后，使用 7-AAD 和 Annexin V 对 mo-DC 细胞进行染色，以检测非活细胞和凋亡细胞，并通过流式细胞术进行分析（图 4）。数据显示，未处理组（图 4，左图）与唾液酸酶处理组（图 4，右图）之间的细胞活力无显著差异。
<img alt="单核细胞分化、显微镜图像、流式细胞术图谱；CD14、CD1a、HLA-DR分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65525/65525fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1单核细胞分离后向mo-DCs的分化 (ACD14+ 单核细胞从血沉棕黄层中分离，并以1.3 x 106 细胞/mL 于 37 °C单核细胞在添加了750 U/mL IL-4和1,000 U/mL GM-CSF的培养基中进行分化。显微镜下观察从人血沉棕黄层分离的单核细胞在第0天的形态（上图）；未成熟单核细胞来源的树突状细胞（mo-DCs），通过IL-4和GM-CSF诱导分化5天获得（中图）；成熟mo-DCs通过IL-6、IL-1β、TNF-α和PGE2细胞因子刺激24小时获得（下图）。比例尺： 100 µm. (B在分化期间的第0天、第2天和第5天通过流式细胞术对细胞进行分析。用于表征细胞表面标志物的抗体如下：a-cCD14；（d-f) CD1a，以及(g-i) HLA-DR（MHC II类分子）。该图显示了至少三次独立实验的代表性直方图。图示（B) 已根据 Videira 等人的研究进行了修改。40，专利 WO2017002045A1。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65525/65525fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图示：唾液酸酶处理对糖链凝集素结合的影响；图像：荧光显微镜，细胞分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65525/65525fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图2：对人源mo-DCs进行唾液酸酶处理以去除细胞表面的α2,6-和α2,3-连接唾液酸。（A）通过凝集素染色结合流式细胞术分析mo-DCs，以检测唾液酸酶处理的效果。人源mo-DCs经唾液酸酶处理（灰色柱）或未处理（白色柱），并用SNA凝集素（识别[2,6]-唾液酸）、MAA凝集素（识别[2,3]-唾液酸）和PNA凝集素（识别T抗原-Galβ1-3GalNAcα1-Ser/Thr）染色。数值表示至少三次独立实验的平均荧光强度（MFI）。采用双尾配对t检验确定统计学显著性（*P &lt; 0.05 或 ***P &lt; 0.0001），比较未处理组与唾液酸酶处理组DC之间的差异。唾液酸酶处理降低了MAA结合能力，并增强了PNA染色，这是由于α(2,3)-连接唾液酸被去除所致；通过SNA染色信号减弱可检测到α(2,6)-连接唾液酸在唾液酸酶处理后的去除。（B）经唾液酸酶处理并接种于盖玻片上的人源mo-DCs共聚焦显微镜观察结果。采集多个细胞的不同z轴层图像，并进行平均染色强度处理。比例尺：20 µm。图版（A）经修改自Silva等30；图版（B）经修改自Silva等29。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65525/65525fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质表达柱状图；MHC-I、MHC-II、CD80、CD86、细胞因子分析；实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65525/65525fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：神经氨酸酶处理单核细胞来源的树突状细胞（mo-DCs）可诱导成熟标志物的更高表达。（A）经神经氨酸酶处理的mo-DCs表现出比完全唾液酸化的mo-DCs更高的成熟表型。采用流式细胞术评估多种成熟标志物的表达水平。mo-DCs在37 °C下用神经氨酸酶处理1小时；图中数据表示至少三次独立实验的平均荧光强度（MFI）（平均值±标准误，SEM）。使用t检验计算统计学显著性差异（*P &lt; 0.05，**P &lt; 0.01），比较未处理组与神经氨酸酶处理组之间的差异。（B）去唾液酸化的人mo-DCs负载全肿瘤抗原后可诱导特异性T细胞应答。mo-DCs在37 °C下用神经氨酸酶处理1小时或不做处理，随后加载MCF-7裂解物（TL）作为全肿瘤细胞抗原来源。将mo-DCs与自体T细胞共培养4–8天，并在培养体系中加入IL-2（10 U/mL）。经去唾液酸化mo-DCs引发的T细胞分泌Th1型细胞因子IFN-γ的水平显著升高。在mo-DCs刺激T细胞后，通过ELISA检测共培养上清液中分泌的细胞因子水平（n = 7）。图中数据表示细胞因子浓度（pg/mL）（平均值±标准误，SEM）。使用t检验计算统计学显著性差异（*P &lt; 0.05）。该图改编自Silva等人的研究30。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65525/65525fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术图谱，Annexin-V/7-AAD 检测，比较未处理与神经氨酸酶处理的细胞。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65525/65525fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图4：神经氨酸酶处理对人源 mo-DC 细胞活力无显著影响。 对未处理的 mo-DC（左图）和神经氨酸酶处理的 mo-DC（右图）进行 Annexin V 与 7-AAD 双染色，并通过流式细胞术分析染色结果。数据显示，未处理组与神经氨酸酶处理组之间的细胞活力无显著差异，表明 mo-DC 可耐受神经氨酸酶处理并保持活性，从而发挥其免疫学功能。该图经 Silva 等人30 修改而来。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65525/65525fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种独特的综合性方案，可通过唾液酸酶处理，从分离的外周血单个核细胞（PBMCs）制备去唾液酸化的人单核细胞来源树突状细胞（mo-DCs）。此外，还描述了对mo-DCs进行表型和功能特征分析的方法，并评估唾液酸酶处理如何提高mo-DCs成熟水平的实验流程。

唾液酸是一类带负电荷的单糖，通常位于细胞表面聚糖的末端。由于其亲水性和生物物理特性……

糖免疫学研究组的研究范围是探讨聚糖在人类健康与疾病中免疫学功能的作用。本研究旨在解析由糖基化介导的生物学机制，并发现基于聚糖的癌症及先天性糖基化障碍疾病的新疗法。我们的研究重点是唾液酸化聚糖，这类聚糖可影响关键细胞表面分子的功能，尤其在免疫应答过程中发挥重要作用。我们开发了用于调控唾液酸含量的技术，以及一个高通量的多模式平台，用于开发具有潜在临床应用价值的糖结合蛋白。为了推动该领域的研究进展，我们采用了多种技术，包括糖组学分析、筛选或抗体染色、质谱分析和免疫组织化学，利用细胞系作为疾病模型进行体外实验，并通过酶工程和代谢工程手段调控唾液酸含量。当前实验面临的主要挑战在于解析唾液酸化聚糖与凝集素之间复杂的相互作用。它们在多种免疫反应中具有机制性和功能性的后果。唾液酸可调节树突状细胞的活性以及MHC-I的转换。这一发现揭示了新的生物学和病理学机制，并推动了创新疗法的开发。该研究还发现了新的免疫通路及其治疗性调控策略。在体外生产用于治疗用途的人源单核细胞来源树突状细胞时，一个关键问题在于这些细胞无法完全成熟。本方案表明，通过使用唾液酸酶对细胞表面进行酶处理，可在维持细胞活力的同时实现疾病的成熟。该方法具有成本效益高和节省时间的优点。与唾液酸代谢抑制剂相比，神经氨酸酶处理提供了一种快速、有效且稳定的去除细胞表面唾液酸的方法，同时能够维持细胞活力。深入理解含唾液酸聚糖的作用，将前所未有地揭示这种聚糖在癌症中的重要性，并有助于发现新的疾病机制和新的治疗策略。通过获取人血沉棕黄层，开始分离外周血单个核细胞，将七毫升转移至无菌的15毫升锥形管中。加入六毫升磷酸盐缓冲液进行初步洗涤。在室温下，使用带有摆动转子且关闭刹车的离心机，以1,100 ×g离心10分钟。使用巴斯德移液管收集白细胞悬液，并转移至一个新的无菌15毫升锥形管中。向白细胞悬液中加入PBS溶液，直至总体积达到10毫升，然后通过上下吹打轻轻混匀。接下来，取3毫升密度梯度介质加入一个新的无菌15毫升锥形管中，以制备密度梯度溶液。静置至室温。沿含有密度梯度介质的锥形管管壁缓慢加入5 mL稀释后的白细胞悬液，形成5:3的密度梯度分离。注意避免扰动介质。使用带有摆动转子且刹车关闭的离心机，对密度梯度培养基中的悬液进行离心，以实现梯度分离。接下来，用巴斯德吸管小心地将最多25毫升的PBMC薄层转移至已装有PBS的新50毫升锥形管中，并充分混匀。为去除残留细胞和碎片，将样品在室温下以600 ×g 离心10分钟，使用正常刹车。弃去上清液，并用 PBS 将样品补至 10 毫升。取一份等分试样用于细胞计数。为去除血小板，以正常刹车速度离心，然后小心倒置离心管以弃去上清液。采用磁性激活细胞分选法进行单核细胞CD14+分离时，将细胞沉淀重悬于微珠缓冲液和CD14免疫磁性微珠中。在4摄氏度下孵育细胞悬液15分钟。为去除未结合的微珠，每1×10⁷个细胞加入一至二毫升微珠缓冲液，然后在室温下以600 ×g离心10分钟。随后，小心倒置离心管以弃去上清液。使用前将LS柱置于磁铁上并进行准备。用3毫升微珠缓冲液冲洗，并立即每1×10⁸个细胞用500微升微珠缓冲液重悬细胞沉淀。将细胞悬液加入LS柱入口，并在柱出口下方的15毫升锥形管中收集阴性细胞组分。用三毫升微珠缓冲液洗涤层析柱三次。最后一次洗涤后，将层析柱从磁铁上取下，置于一个无菌的15毫升锥形管上。用移液器将五毫升微珠缓冲液加入层析柱入口。立即将装有目标细胞的注射器活塞插入柱入口，并将细胞注入柱中。随后，离心CD14-和CD14+细胞组分，并弃去上清液。为将单核细胞分化为人单核细胞来源的树突状细胞，通过向CD14+细胞中加入适量分化培养基，制备细胞密度为每毫升1.3 × 10⁶个细胞的细胞悬液。用巴斯德移液管吹打重悬单核细胞。将每毫升含1.3 × 10⁶个细胞的悬液接种至24孔板的每个孔中，于37°C、含5% CO₂的培养箱中孵育。每两到三天更换一次培养基，并补充新鲜的细胞因子。为收集已分化细胞，使用微量移液器将全部细胞悬液转移至无菌锥形管中，并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤培养瓶两次。将锥形管在室温下以180 ×g离心10分钟，随后将沉淀重悬于适合实验设计的培养基或缓冲液中。在单核细胞分化过程中，白细胞介素-4和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的刺激改变了细胞表型。数据显示，人单核细胞来源的树突状细胞失去了主要由单核细胞表达的表面标志物CD14，同时显著获得了人树突状细胞标志物CD1a的表达。人单核细胞来源的树突状细胞还表现出更高的MHC-II、HLA-DR表达水平，后者是人树突状细胞及其他抗原呈递细胞所表达的抗原呈递分子。从24孔板的10个孔中（每孔约含1.3×10⁶个细胞）收集约10×10⁶个人单核细胞来源的树突状细胞，这些细胞由单核细胞分化而来。将它们转移至一个新的无菌15毫升锥形管中。在室温下以300 G离心5到7分钟（使用正常刹车），弃去上清液以去除死细胞和碎片。向管中加入10毫升含11.1毫摩尔/升葡萄糖的RPMI 1640培养基。在室温下以300 G离心4分钟（使用常规刹车）后，再次弃去上清液。向细胞沉淀中加入2毫升RPMI 1640培养基，将1毫升细胞悬液均分至两个新的无菌微量离心管中，分别标记为1号和2号。向1号微量离心管中加入500毫单位来自产气荚膜梭菌的神经氨酸酶。将两个试管在37摄氏度下孵育60分钟。孵育结束后，将两个微量离心管中的细胞转移至相应的新15毫升锥形管中，分别标记为1号和2号。然后，向每个锥形管中加入约4毫升含10% FBS的完全RPMI 1640培养基。将离心管在室温下以300 G的离心力离心4分钟（使用常规刹车），然后向沉淀中加入5毫升完全RPMI 1640培养基。每孔接种1毫升细胞。通过流式细胞术和共聚焦显微镜评估唾液酸酶处理降低人单核细胞来源的树突状细胞表面唾液酸含量的效果。唾液酸酶处理显著降低了紫藤刀豆凝集素和黑接骨木凝集素的结合，同时增强了花生凝集素染色。唾液酸酶处理后，黑接骨木凝集素染色的减少表明细胞表面的黑接骨木凝集素染色显著降低。通过在室温下以300 G离心5分钟并使用正常刹车洗涤细胞，开始收集用于抗体染色的新一批目标细胞样本。将细胞分装至微量离心管中。使用所需抗体进行染色时，将荧光标记的抗体在室温下避光孵育15分钟。用一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，随后在室温下以300 ×g离心五分钟。向所有微量离心管中加入最多 100 µL 的 PBS。然后将细胞重悬于 300 µL 的 2% 多聚甲醛中，并将离心管置于 4°C 避光保存，直至进行流式细胞术检测。由于唾液酸酶处理，抗原呈递分子 MHC-I 和 MHC-II 以及共刺激分子 CD80 和 CD86 的表达均显著增加。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

具有不同唾液酸化表型的单核细胞来源的树突状细胞的生成

本视频展示了如何从人单核细胞诱导生成未成熟、成熟及耐受性树突状细胞（DC）。通过将单核细胞与生长因子和细胞因子共同孵育，可获得未成熟DC。在免疫调节分子的作用下，未成熟DC可进一步分化为耐受性DC和成熟DC。...

从单核细胞生成未成熟、成熟及耐受性树突状细胞

不成熟树突状细胞可被选择性地分化为耐受性或成熟树突状细胞，以调节免疫与耐受之间的平衡。本研究提供了一种从不成熟单核细胞来源的树突状细胞（moDCs）生成的方法 体外...

具有不同代谢表型的未成熟、成熟及耐受性树突状细胞的制备

本文展示了如何通过密度梯度离心法从人抗凝全血中分离外周血单个核细胞，再利用磁珠分选技术从中分离单核细胞。经过5天的培养后，人单核细胞可分化为未成熟树突状细胞，可用于非临床实验操作。...

从全血中生成人单核细胞来源的树突状细胞

本文提供了一种利用高速细胞分选技术鉴定并分离大量由GM-CSF驱动的髓系细胞的方法。根据Ly6C和CD115的表达情况，可鉴定出五种不同的细胞群体（共同髓系祖细胞、粒细胞/巨噬细胞祖细胞、单核细胞、单核细胞来源的巨噬细胞以及单核细胞来源的树突状细胞）。...

利用新型细胞分选策略从鼠骨髓中大量生成髓系祖细胞和树突状细胞前体

树突状细胞摄取抗原后迁移至免疫器官，将加工后的抗原呈递给T细胞。量子点纳米晶体标记可提供持久且稳定的荧光信号，从而可通过荧光显微镜追踪树突状细胞在不同器官中的分布。...

小鼠骨髓来源树突状细胞的制备及其使用Qdot纳米晶体的标记用于示踪研究

本文介绍了一种高度纯化的小鼠肺树突状细胞的制备方法。重点在于分离传统的树突状细胞亚群。...

小鼠肺树突状细胞的分离

在同源免疫活性宿主中评估，基于肿瘤干细胞（CSC）的树突状细胞（DC）疫苗相较于使用异质性整体肿瘤细胞致敏的传统DC疫苗，显示出显著更强的抗肿瘤免疫反应。...

利用黑色素瘤和鳞状细胞癌干细胞生成一种新型树突状细胞疫苗

树突状细胞（DCs） 在Toll样受体8（TLR8）识别合成嘌呤类物质R848后，经黑素菌素（nigericin）激活NLRP3炎性小体，进而分泌IL-1β，因此IL-1β可用于检测NLRP3炎性小体的活性。通过细胞内细胞因子染色、免疫印迹和ELISA方法，可准确检测IL-1β的表达水平，从而评估NLRP3炎性小体的启动和激活状态。...

利用人单核细胞来源的树突状细胞中IL-1β检测NLRP3炎性小体的激活与活性测定

本文介绍了一种巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）诱导分化的人单核细胞来源巨噬细胞的细胞培养方案。该方案采用单核细胞的冷冻保存，并将其大规模分化为巨噬细胞。随后，收获的巨噬细胞可根据实验需求以特定的细胞密度接种至培养孔中进行后续实验。...

集落刺激因子培养分化的人单核细胞来源巨噬细胞

本研究比较了两种不同的人单核细胞分离方法，以获得 体外...

通过成像流式细胞术表征人单核细胞来源的树突状细胞：两种单核细胞分离方案的比较

学习使用唾液酸酶处理从人外周血单个核细胞生成去唾液酸化单核细胞来源树突状细胞的方法。该方案通过酶促处理促进细胞成熟，同时保持细胞活力，为糖免疫学研究提供可靠技术。

生成具有不同唾液酸化表型的单核细胞来源树突状细胞

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