Name: 利用显微计算机断层扫描血管造影成功对小鼠进行原位肝移植 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-22T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 学习小鼠原位肝移植手术技术，利用显微计算机断层扫描血管造影评估移植肝血管通畅性。该方法结合心脏门控技术，为移植生物学研究提供高分辨率成像方案。

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SMB 由美国国家糖尿病与消化和肾脏疾病研究所（NIDDK）资助项目 R01DK1234750 支持。BAW 由美国国立卫生研究院国家心脏、肺和血液研究所资助项目 R01HL143000 支持。

雄性C57BL/6J小鼠（体重30 g）饲养于全美儿童医院动物设施的无病原体环境中。所有操作均依照美国国立卫生研究院（NIH）和国家研究委员会《实验动物人道照护与使用指南》的规定进行，并经全美儿童医院机构动物照护与使用委员会（IACUC方案编号AR17-00045）批准。有关本实验方案中使用的所有材料、仪器和设备的详细信息，请参见材料表。
1. 移植手术的初始准备
<ol>
	<li>准备手术器械。
	<ol>
		<li>设置手术监测设备（例如心率监测仪、脉搏血氧仪、模块化监护系统）和麻醉机。</li>
		<li>如有条件，将手术加热板预热至 42 °C。</li>
		<li>开启通气机和麻醉机以预热异氟烷蒸发器。向麻醉剂储液罐中加入 30 mL 液态异氟烷，并确保呼吸机已连接氧气。 
		注意：本方案中不进行动物气管插管，仅使用鼻罩供氧。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>记录受体和供体小鼠的体重。</li>
	<li>打开高倍外科显微镜，并根据术者习惯调节高度和焦距。确保其他手术设备已开启（例如电凝器）。</li>
	<li>准备并摆放好手术器械，以及 10-0 尼龙缝线（图 2）。 
	注意：所有手术器械均已在 121 °C 下高压灭菌 30 分钟。此外，不同配置的手术器械也可能具有同等效果。</li>
	<li>准备门静脉（PV）和胆总管（CBD）支架用套管（图 3）。将套管针和 PE10 管置于高倍显微镜下的无菌操作台上。使用 #11 手术刀片切割套管针，制成长度为 1.5 mm 的套管，套管顶部保留约 0.75 mm 的凸缘；将聚乙烯管（PE10）切成 2.5 mm 长。将制备好的套管和支架保存于无菌生理盐水中，待用时取出。 
	&#8203;注意：本移植模型使用 20 G 套管针制作门静脉重建用套管，使用聚乙烯管 10（PE10）制作胆总管重建用支架。其余所有吻合均采用手工缝合。</li>
	<li>配制溶液。配制肝素注射液，每 0.5 mL 组氨酸-色氨酸-酮戊二酸盐（HTK）溶液中含 100 U 肝素。将生理盐水、肝素化生理盐水、PBS 和 HTK 保存液置于冰上预冷。</li>
</ol>
2. 供体小鼠的获取
<ol>
	<li>将供体小鼠置于异氟烷吸入麻醉舱中以诱导麻醉。确保异氟烷浓度约为2.5%，氧气流速为2 mL/min。等待5分钟，使小鼠达到外科麻醉深度。为确认麻醉程度是否合适，可轻捏小鼠脚趾以观察其反应；若无反应，则表明已达到合适的麻醉水平。</li>
	<li>使用电子剃毛器剃除小鼠腹部毛发，并将小鼠仰卧位固定于加热板上。先用聚维酮碘清洁腹部，再用70%乙醇擦拭。在小鼠眼睛下方涂抹眼用软膏，以防角膜干燥。</li>
	<li>将小鼠置于高倍显微镜下，并通过浓度为2%、氧气流速为2 mL/min的异氟烷吸入维持麻醉状态。</li>
	<li>使用剪刀（根据外科医生偏好选择）从剑突至耻骨联合行正中腹腔切口。随后，在肋缘下方做一额外横向切口，形成“十字形”切口模式。使用蚊式止血钳将剑突向上牵拉，以充分暴露腹腔内容物。 
	注：止血钳可根据术者习惯进行固定。</li>
	<li>将肠管移出腹腔并置于左侧腹腔内的湿纱布海绵上。切断肝脏周围所有韧带附着，游离肝脏。</li>
	<li>暴露肝固有动脉（pHA）。使用弯头镊子剥离血管周围组织，使其裸化，并用10-0尼龙缝线结扎该血管。</li>
	<li>结合锐性与钝性分离技术，完整解剖胆总管（CBD）全长。在尽可能靠近胰腺上缘处行胆管切开术（切口大小应足以容纳胆管支架），以保留足够长度供后续使用（距离肝脏下缘约1 cm）。使用精细镊子将胆管支架插入胆总管，并用10-0尼龙缝线固定。使用10-0尼龙缝线结扎胆总管远端（图4）。</li>
	<li>用湿纱布海绵将右肝叶向剑突方向牵拉，暴露下腔静脉（IVC）。游离肝下下腔静脉（IHIVC）使其脱离后腹膜，并使用手持电凝设备凝固并切断右肾上腺静脉（见材料表）。</li>
	<li>解剖出右肾动脉和肾静脉，并分别使用7-0和10-0尼龙线结扎。切断右肾静脉、肾动脉及剩余的韧带附着，最终完整切除右肾。 
	注：此步骤旨在为后续切断肝下下腔静脉时提供更好的术野暴露。</li>
	<li>使用30 G针头经门静脉（PV）注入0.5 mL含100 U肝素的冷HTK溶液。等待1分钟，使肝素充分分布至全身。在脾静脉与肠系膜上静脉汇合处稍上方切断门静脉。</li>
	<li>使用30 G针头向肝下下腔静脉（IHIVC）缓慢注入含肝素的冷HTK保存液，以灌注供体肝脏。当门静脉流出液变清亮时，停止灌注。灌注完成后，在右肾静脉上方稍远处的IHIVC处夹闭微型血管夹，并在其下方稍远处切断血管。此步骤完成后，关闭呼吸机并停止异氟烷供应，此时动物已被实施安乐死。</li>
	<li>在步骤7中已放置支架的胆总管远端进行切断。此外，识别胆囊管，并使用10-0尼龙缝线结扎该管。接着，用镊子夹住胆囊顶部，结合锐性与钝性分离技术，将其从胆囊窝中游离。待胆囊充分游离后，使用弹簧剪在先前结扎线的上方剪断胆囊管，完成胆囊切除术。</li>
	<li>将肝脏向下牵拉，暴露肝上下腔静脉（SHIVC）。切断SHIVC时需特别注意保留足够长度，以便在受体动物中进行吻合。</li>
	<li>进一步游离肝脏周围其他韧带附着，将供体肝脏完整取出（ex-vivo），并将其置于盛有冷生理盐水的容器中保存。</li>
</ol>
3. 肝同种异体移植物的修肝准备
<ol>
	<li>将冰放入保温容器中，并将培养皿置于冰床上。在培养皿中加入冷生理盐水，将肝脏同种移植物放入培养皿中，使其内脏面暴露。</li>
	<li>将门静脉（PV）穿过先前选定的套管，翻转静脉使其内皮表面暴露。用10-0尼龙缝线固定套管。为获得最佳效果，确保缝线位于套管的凹槽内（图5）。</li>
	<li>调整肝脏同种移植物以暴露肝上腔静脉（SHIVC），并在3点和9点位置分别放置两根8-0尼龙固定缝线，用于后续在受体动物中进行吻合。再次调整肝脏同种移植物以暴露肝下腔静脉（IHIVC），并在3点和9点位置分别放置两根8-0尼龙固定缝线，用于后续在受体动物中进行吻合。</li>
</ol>
4. 受体操作
注意：由于这是无菌操作，需佩戴手套并使用适当的个人防护装备，同时给予抗生素。在手术时，以0.1 mg/kg剂量皮下注射布托啡诺作为术前镇痛。
<ol>
	<li>暴露供体手术中的肝动脉（pHA）；仅采用正中腹切口，而非先前所述的腹部切口。</li>
	<li>游离肝脏并切断所有韧带连接。此外，使用10-0尼龙缝线结扎左侧膈肌和食管旁血管。</li>
	<li>将肝脏向下牵拉，从后腹膜分离下腔静脉（SHIVC）；接着将肝脏向上牵拉，从后腹膜分离肝下下腔静脉（IHIVC）。必要时采用前述相同技术电凝小的桥接静脉和腰静脉。</li>
	<li>使用手持电凝设备凝闭右侧肾上腺静脉，并暴露肝门。用10-0尼龙缝线结扎肝动脉（pHA）。随后，将胆总管（CBD）从门静脉（PV）分离，并在胆总管分叉处附近用7-0缝线结扎，以保留足够长度用于胆总管吻合。</li>
	<li>通过受体自身肝脏的门静脉注入0.5 mL肝素盐水（使用30 G针头）以冲洗器官。使用微血管夹夹闭肝下下腔静脉（IHIVC），并用7-0缝线暂时结扎门静脉。开始无肝期，停止异氟烷吸入。 
	注意：在夹闭门静脉和下腔静脉后，无肝期完全阻断了肝脏静脉回流。吸入性麻醉药异氟烷由肝脏代谢；因此，为避免药物蓄积导致心肺衰竭，需暂时停止其吸入。</li>
	<li>通过受体原肝脏的门静脉，使用30 G针头注入0.5 mL肝素盐水以冲洗器官。</li>
	<li>在SHIVC和IHIVC上尽可能靠近远端和近端放置微血管夹，以保留足够长度用于吻合。切断受体自身的SHIVC、IHIVC、PV（靠近先前放置的缝线处）以及任何残留的韧带连接，将原肝脏完整取出体外（ex vivo）。 
	注意：IHIVC的血管夹应置于右肾静脉上方。</li>
	<li>将供体肝脏移植物置入腹腔内，并牵拉供体移植物的肝门以暴露门静脉。使用30 G针头向供体和受体门静脉各注入0.5 mL肝素盐水，以排除血管内空气，防止空气栓塞。然后，将预先制备的供体PV套管插入受体肝脏PV管腔内；如有需要，可使用8-0缝线固定缝线辅助吻合。最后用7-0缝线固定吻合口（图6）。</li>
	<li>将手术台旋转180°。使用10-0尼龙缝线手工缝合供体与受体的SHIVC。完成后壁吻合后，注入0.5 mL肝素盐水冲洗以排除空气，防止空气栓塞。随后完成上壁的吻合（图7）。</li>
	<li>首先移除门静脉上的结扎缝线，然后松开SHIVC上的血管夹以开始再灌注。结束无肝期，并重新开始异氟烷吸入。以与SHIVC吻合同样的方式，使用10-0尼龙缝线手工缝合重建IHIVC。完成重建后，移除受体和供体IHIVC上的微血管夹以恢复灌注（图8）。</li>
	<li>在受体胆总管（CBD）靠近先前结扎缝线处行胆管切开术，进行胆总管吻合。将供体CBD内的支架插入受体CBD管腔，并用10-0缝线固定吻合口（图9）。</li>
	<li>用1 mL生理盐水冲洗腹腔；检查止血情况，并电凝任何残留的出血血管。使用6-0缝线分两层关闭腹部切口。</li>
	<li>将动物置于温暖的培养箱（42 °C）中恢复，直至其恢复意识并具备足够活动能力前不得无人看护。术后皮下注射0.1 mg/kg布托啡诺，之后每8至12小时给药一次，持续48小时。此外，在术后7天内通过受体动物的饮水瓶给予卡洛芬（0.2 mL溶于400 mL水中）。观察受体动物4–5小时，待其完全恢复后将其送回饲养环境，此时已可与其他动物共处。 
	注意：镇痛药和抗生素的使用可根据当地动物伦理委员会的建议进行调整。</li>
</ol>
5. 小鼠显微CT血管成像
<ol>
	<li>在观察小鼠预定的研究时间间隔后，准备通过显微CT血管造影评估异体移植物的通畅性。</li>
	<li>确保已打开通气和麻醉设备以预热异氟烷蒸发器。向麻醉储液罐中加入30 mL液态异氟烷，并确保呼吸机已连接氧气。打开显微CT扫描仪，确认所有软件正常运行。</li>
	<li>启动显微CT扫描系统上的图像采集软件。</li>
	<li>在显微CT设备的显示器上，点击初始化系统，并选择CT扫描模式。</li>
	<li>弹出扫描床；安装小鼠固定床并锁定。</li>
	<li>将恢复笼的加热板温度设为42 °C。</li>
	<li>用1 mL注射器抽取100 µL CT造影剂。安装30号针头，用于后续静脉注射造影剂。确保注射器内无气泡。</li>
	<li>将小鼠放入尾静脉固定装置中。当小鼠完全进入固定装置后，关闭装置门，使尾巴自然垂直下垂，并用酒精溶液（70%乙醇）仔细擦拭。 
	注意：可通过用手套包裹的手握住小鼠尾巴数分钟以加温，从而提高尾静脉插管的成功率。</li>
	<li>握住尾巴远端部分，用两根手指（食指和中指）环绕计划注射部位近端的尾巴。将尾巴远端部分（注射部位以下）置于拇指与无名指之间。</li>
	<li>用两组手指轻轻施加压力，以较浅的深度将针头插入静脉，确保注射器和针头与尾巴平行。在释放近端尾部食指压力的同时，静脉注射CT造影剂。避免使用注射器抽吸，以免导致静脉塌陷。 
	注意：若针头正确位于静脉内，注射时应无阻力感。若感到阻力，应拔出针头并在原注射点上方重新插入。若两次尝试后仍无法成功插管，则更换针头。</li>
	<li>成功注射造影剂并拔出针头后，使用无菌纱布对注射部位施加轻柔压力以止血。</li>
	<li>将小鼠转移至异氟烷吸入室，设置浓度为2.5%，氧流量为2 mL/min，等待3–4分钟。待麻醉状态稳定后，迅速将小鼠转移至显微CT扫描仪床，并使其俯卧于扫描台上（图10）。</li>
	<li>用适量眼科软膏覆盖动物眼睛。正确放置鼻罩，并确保空气和异氟烷通过鼻罩正常流动。使用前述相同的麻醉参数（步骤5.12）。润滑后插入直肠温度探针，以在成像期间持续监测动物体温。</li>
	<li>将呼吸器与小鼠接触。</li>
	<li>使用胶带将ECG电极片分别固定于左侧、右前肢和左后肢。使用超声耦合凝胶以增强ECG电极片与皮肤之间的信号传导。</li>
	<li>在计算机软件上检查ECG和呼吸信号，确保在显示器上可见清晰的QRS波群。为此，请在源设置选项卡中勾选逻辑导联，并选择能提供最清晰ECG曲线的导联。 
	注意：逻辑导联对应连接于右侧、左侧胸部和下肢的三个ECG电极片。每个导联代表一条ECG曲线。</li>
	<li>设置增益以获得合适的信号高度，通常4或8较为合适。选择双门控。在显示设置选项卡下，调整显示参数以获得清晰的信号视图：勾选ECG和RESP旁的复选框，并将两者均设为500。在触发设置选项卡下，确认已勾选通道A、通道B和DualTrig。</li>
	<li>确保以下参数也已设置：阈值：当信号低于此值时触发；设为2,500；迟滞：确保信号穿过迟滞区以创建软件触发点，从而开始新的触发周期；设为300；延迟：触发发送前的等待时间；设为100；抑制：在此期间无法生成信号，设为200。</li>
	<li>确保ECG阈值在显示屏幕上低于迟滞值且高于sT段峰值。</li>
	<li>将动物推进扫描仪，并点击更新图像。获取动物的X射线定位像，以选择后续显微CT成像所需的适当视野和解剖扫描范围。</li>
	<li>使用以下参数进行显微CT血管造影图像采集：放大倍数：超聚焦，扫描角度：全角度（360°）扫描，能量：单能，扫描模式：门控，设置：默认（完整360°旋转，X射线管默认参数为0.33 mA和55 kV，每步0.750°，每步1个投影，1×1像素合并，曝光时间40 ms；双门控指心脏和呼吸门控）（图11）。</li>
	<li>扫描完成后，将动物转移至预热的恢复笼。待动物完全恢复后，将其转回主饲养笼。</li>
	<li>使用系统软件重建显微CT图像。上传图像后，调整蓝色标线使其覆盖目标解剖区域；预览一个切片，使重建体积尽可能缩小并紧贴小鼠轮廓（此步骤有助于减小重建图像的尺寸）。</li>
	<li>开启感兴趣区域轮廓以优化图像边界。选择40 µm体素尺寸、Hann投影滤波器和高斯体滤波器（80 µm）。进入高级 | 基于图像的门控，将触发窗口和相位分别调整为0.5和0.6，选择10个相位用于心脏门控，然后点击体积重建按钮。</li>
</ol>

Liver Transplantation in Mouse and Analyzing Allograft Patency

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</ol>

作者声明无任何利益冲突。

啮齿类动物的肝移植（OLT）在文献中已有充分描述2,8。由于该手术技术要求高，通常需要数年的显微外科（或普通外科）经验才能掌握，因其涉及对解剖结构的深入理解以及熟练的手术操作能力。在建立该模型的过程中，我们遇到了多个技术难题，主要集中在吻合步骤上。尤其是门静脉（PV）吻合时，静脉常难以稳定以进行吻合。我们发现，放置一至两根固定缝线（由术者根据偏好决定）有助于套管的安置。需要注意的是，增加固定缝线的数量会延长手术时间。
此外，SHIVC 位于腹腔深部，难以使用血管夹进行充分暴露。我们发现，如果小鼠在固定时尽可能放松，将有助于增加静脉的灵活性。最终，手术医生需要通过练习来确定合适的操作位置。另外，在进行胆总管吻合时，胆管本身非常脆弱，放置固定缝线以稳定胆管可能较为困难，此时可考虑将胆管置于一小块纱布上，以辅助其稳定。最后，由于所有小型哺乳动物对麻醉时间均较为敏感，因此应尽可能快速完成手术。理想的手术时间如下：1）供体手术，45–60 分钟；2）台下准备，15 分钟；3）受体手术，60–80 分钟。通过练习可减少不必要的操作动作。
随着动物模型的发展，评估研究干预效果的能力也不断进步。微型计算机断层扫描（microCT）最早于20世纪90年代末被用于大鼠血管系统的研究17。在啮齿类动物中开展准确且清晰的microCT血管造影研究面临诸多挑战，其中大多数挑战源于这些哺乳动物较短的心动和呼吸周期。通过采用短时间曝光以减少运动伪影，并结合更高的光子通量率，可克服这一问题18。总体而言，我们发现使用心电门控技术，并调整异氟烷浓度以降低呼吸频率，能够获得最清晰的图像。我们还发现，针对特定时期（如肝动脉期、门静脉期和延迟期）采用针对啮齿类动物优化的对比剂显影时间，也能改善成像可视化效果19。使用ExiTron nano 12000对比剂具有多项优势，可提升整体图像质量。该对比剂在肝脏20和血液21中均能提供最强的对比增强效果。另一项优势在于，初次注射后对比剂在肝脏中可存留长达120小时，若需重复扫描，则可减少对比剂使用量，从而降低相关的肝毒性风险20。
此外，由于扫描是在小鼠经异氟烷麻醉的状态下进行的，因此这种生理状态的改变不会影响对比增强效果。20通过采用这些成像技术及ExiTron造影剂，可对OLT中吻合术的成功情况进行清晰评估。MicroCT能够实现无创性评估 体内 在较长时间内对同种异体移植物进行观察。该方案减少了为评估血管吻合所需牺牲的动物数量，并提供了在数周内研究治疗手段及其对血管系统影响的机会。
局限性 
需要注意的是，尽管OLT模型已历经多次改进以完善其技术，但利用显微CT对吻合结构进行可视化仍处于持续探索阶段。此外，小鼠OLT模型为移植医学提供了独特的研究视角。然而，该模型并非全面适用，因为这些小鼠术后存活超过1周仍存在较大困难。因此，还应结合其他移植模型，以进一步验证临床前实验的结果。
结论 
在过去十年中，显微CT技术迅速发展，为动物模型和移植领域的研究人员提供了宝贵的新型工具。未来，更精细的3D成像将为科研与发现提供更深入的见解。

移植是治疗终末期肝病的唯一有效疗法。不可否认，肝移植的疗效非常显著，中位生存期为11.6年，而等待移植名单上的患者中位生存期仅为3.1年1。然而，肝移植的广泛应用仍面临诸多限制，其中最重要的是缺乏合适且高质量的供体器官。因此，要扩大供体器官来源，就必须采用创新策略，使目前被认为不适合使用的同种移植物得以利用，从而提高移植的安全性。为此，开展小动物的临床前研究至关重要。
在移植研究中，体内移植模型尤为重要。小鼠原位肝移植（OLT）已有近30年的历史2，对研究移植的多个方面至关重要，包括免疫反应的特征、缺血-再灌注损伤、急性排斥反应、新型药物的治疗效果以及长期存活率3,4,5,6,7。利用小鼠进行移植研究至关重要，因为它允许使用转基因小鼠品系，以研究特定分子通路对移植结局的影响。小鼠肝移植的既定方案此前已有详尽描述8,9。
对于肝上和肝下下腔静脉（IVC）、门静脉（PV）以及胆总管（CBD），存在多种吻合方法。这些方法通常采用手工吻合，或类似于小鼠肺移植的改良血管套管技术10,11,12。在受体小鼠的长期研究和存活观察中，以及在建立稳定的鼠类肝移植项目过程中，评估这些关键吻合口的能力是一个重要环节。临床上用于评估肝脏移植物通畅性的影像学手段通常依赖超声和计算机断层扫描（CT）13,14。相较于超声，CT具有明显优势，因其可提供包含所有吻合口在内的全腹部视图，而超声在小型动物中获取此类图像尤为困难。目前已有大量研究和资源投入于开发精确的微型CT（microCT），以增强动物实验研究能力，并提高从这些损伤与疾病模型中获取的信息质量15,16。本文描述了一种小鼠原位肝移植的实验方案（图1），并简要介绍了一种用于评估移植物通畅性及吻合口耐久性的microCT检查方案。

<table><tbody><tr><td>#11 刀片</td><td>费舍尔科学公司</td><td>3120030</td><td></td></tr><tr><td>4-0 丝线缝合线</td><td>外科专科公司</td><td>SP116</td><td></td></tr><tr><td>6-0 尼龙缝合线</td><td>AD 外科公司</td><td>S-N618R13</td><td></td></tr><tr><td>7-0 尼龙缝合线</td><td>AD 外科公司</td><td>S-N718SP13</td><td></td></tr><tr><td>8-0 尼龙缝合线</td><td>AD 外科公司</td><td>XXS-N807T6</td><td></td></tr><tr><td>10-0 尼龙缝合线</td><td>AD 外科公司</td><td>M-N510R19-B</td><td></td></tr><tr><td>20 G Angiocath</td><td>Boundtree</td><td>602032D</td><td></td></tr><tr><td>30 G 针头</td><td>Med Needles</td><td>BD-305106</td><td></td></tr><tr><td>拜耳灵（恩诺沙星）抗菌片剂</td><td>伊莱科公司</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Bovie Chang-A-Tip 高温电灼器</td><td>USA 医疗与外科用品公司</td><td>BM-DEL1</td><td></td></tr><tr><td>Bulldog 静脉夹 1 1/8</td><td>Ambler 外科美国公司</td><td>18-181</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J 小鼠&amp;nbsp;</td><td>Jackson 实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo 微型解剖弹簧剪</td><td>Roboz 外科器械商店</td><td>RS-5668</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 - 精细镊子</td><td>精细科学工具公司</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>精细科学工具公司</td><td>11252-50</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 医用 #5/45 镊子 - 45&amp;deg; 角度</td><td>精细科学工具公司</td><td>11253-25</td><td></td></tr><tr><td>ExiTron nano 12000</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130&amp;nbsp;-&amp;nbsp;095&amp;nbsp;-&amp;nbsp;698</td><td>CT 对比剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>镊子</td><td>精细科学工具公司</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Halsted-蚊式止血钳</td><td>Roboz 外科公司</td><td>RS-7112</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Fresnius 实验室，伊利诺伊州莱克祖里奇</td><td>C504701</td><td></td></tr><tr><td>组氨酸-色氨酸-酮戊二酸盐&amp;nbsp;</td><td>大学药房</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>绝缘容器</td><td>YETI</td><td>ROADIE 24 硬质冷藏箱</td><td>https://www.yeti.com/coolers/hard-coolers/roadie/10022350000.html</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Piramal 危重症护理公司</td><td>NDC 66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Hikma 制药公司 PLC</td><td>NDC 0413-9505-10</td><td></td></tr><tr><td>微型持针器</td><td>精细科学工具公司</td><td>18055-05</td><td></td></tr><tr><td>小鼠直肠温度探头</td><td>WPI 公司</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>持针器/镊子 直型</td><td>Micrins</td><td>MI1540</td><td></td></tr><tr><td>PE10 管路&amp;nbsp;</td><td>费舍尔科学公司</td><td>BD 427400</td><td></td></tr><tr><td>Perfadex</td><td>XVIVO Perfusion AB</td><td>REF99450</td><td></td></tr><tr><td>PhysioSuite</td><td>Kent 科学公司</td><td>PS-MSTAT-RT</td><td></td></tr><tr><td>Puralube&amp;nbsp;眼科软膏</td><td>Dechra</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>PP 制药有限责任公司</td><td>NDC 63323-186-10</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>精细科学工具公司</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>小型小鼠固定器 &amp;ndash; 1&amp;rdquo; 内径</td><td>Pro Lab 公司</td><td>MH-100</td><td></td></tr><tr><td>SomnoSuite 小动物麻醉系统</td><td>Kent 科学公司</td><td>SS-MVG-Module</td><td></td></tr><tr><td>手术显微镜</td><td>徕卡</td><td>M500-N w/ OHS</td><td></td></tr><tr><td>U-CT&lt;sup&gt;HR&lt;/sup&gt;</td><td>MI Labs</td><td>NA</td><td>CT 扫描仪软件</td></tr><tr><td>Vannas-Tubingen 弹簧剪</td><td>精细科学工具公司</td><td>15008-08</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Korn 制药公司</td><td>NDC 59399-110-20</td><td></td></tr><tr><td>Yasagil 夹</td><td>Aesculap</td><td>FT351T</td><td></td></tr><tr><td>Yasagil 夹</td><td>Aesculap</td><td>FT261T</td><td></td></tr><tr><td>Yasagil 夹施加器</td><td>Aesculap</td><td>FT484T</td><td></td></tr></tbody></table>

利用显微计算机断层扫描血管造影术在小鼠中成功实施原位肝移植

Successful Orthotopic Liver Transplantation in Mice Utilizing Microcomputed Tomography Angiography

微型计算机断层扫描（microCT）血管造影技术为研究人员提供了宝贵的资源。该技术的最新进展使得能够获得高质量的微血管系统图像，已成为器官移植领域中高保真度的研究工具。在小鼠原位肝移植（OLT）模型中，microCT 可实现实时评估移植物吻合情况，并且额外优势在于无需处死实验动物。通过选择合适的对比剂以及优化图像采集参数，可以获得高清晰度的图像，为研究人员提供极为重要的信息。这不仅有助于评估手术操作的技术细节，还可用于长期观察不同治疗手段的效果。在本方案中，我们逐步详细描述了小鼠 OLT 模型的建立过程，并最终介绍了一种可获得高质量图像的 microCT 检测方案，以协助研究人员对实体器官移植进行深入分析。我们提供了小鼠肝移植的分步操作指南，并简要讨论了通过 microCT 血管造影评估移植物通畅性的相关实验方案。

对于非外科专业、不熟悉解剖学或难以准确解读影像学结果的研究人员，应由经过适当培训的人员进行正确的图像分析。本方案已展示了小鼠原位肝移植（OLT）成功的操作过程。此外，为了提高研究指标的准确性，实时评估移植手术的成功情况，并避免进行尸检，可采用微型计算机断层血管造影（microCT angiography）扫描，以获得精确且清晰的图像。本文中已包含代表性图像。图11）。代表性图像 体内 吻合失败可见于 图12.
熟悉肝脏解剖结构和血管系统的人员可观察到下腔静脉（IVC）通畅的静脉吻合口。在某些情况下，也可观察到门静脉，由于本模型采用了门静脉套环技术，门静脉更易于识别。开放吻合口的观察表明手术操作技术成功。此外，对这些图像进行三维重建可为研究人员提供额外信息，并更详细地展示血管解剖结构。采用上述模型时，OLT小鼠队列的死亡率约为40-45%。
<img alt="肝脏解剖示意图与手术图像；门静脉、胆管、肝内下腔静脉吻合。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65537/65537fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：原位肝移植概述。（A）示意图显示四种不同的吻合部位：i）肝上段下腔静脉吻合，ii）肝下段下腔静脉吻合，iii）门静脉吻合，iv）胆总管吻合。每个箭头指示相应血管或胆管的切割相对位置——肝上段下腔静脉（方案步骤2.13）、肝下段下腔静脉（方案步骤2.11）、门静脉（方案步骤2.10）和胆总管（方案步骤2.7）。（B）吻合部位的体内示意图。比例尺 = 2 mm。缩写：IVC = 下腔静脉。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65537/65537fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="手术器械套装，包括镊子、剪刀、持针器、小镊子；用于外科手术。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65537/65537fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：手术中使用的外科器械。（A）45°精细镊子，（B-E）精细镊子，（F）弯头持针器/镊子，（G）直头镊子，（H）血管夹施加器，（I）止血钳，（J）持针器，（K）电凝设备，（L）#11刀片，（M）腹部拉钩，（N,O）显微剪刀，（P）精细剪刀，（Q）手术剪刀，（R,S）Yasargil夹子，（T） bulldog静脉夹，（U）显微血管夹。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65537/65537fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显微外科器械：门静脉套管和胆管支架，比例尺为3.5 mm。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65537/65537fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3门静脉套管和胆管支架 离体 使用前的支架和袖带图像。比例尺 = 3.5 mm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65537/65537fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="胆管支架手术示意图；实验研究中肝脏至十二指肠连接的手术设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65537/65537fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：供体手术期间的胆总管支架置入。（A）胆管支架正在插入胆总管。（B）胆管支架已固定于胆管内。比例尺 = 2 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65537/65537fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="实验设置中带肝下下腔静脉和门静脉套管的肝脏解剖示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65537/65537fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：肝脏同种异体移植物修整过程中放置门静脉套管。 （A）将门静脉穿过静脉套管。 （B）静脉外翻覆盖在套管上。比例尺 = 2 mm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65537/65537fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微外科手术中门静脉袖套技术；详细操作图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65537/65537fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：受体手术期间的门静脉吻合。（A）将静脉袖套插入受体门静脉。（B）用缝线固定门静脉吻合口。比例尺 = 2 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65537/65537fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="外科吻合技术；标注膈肌，SIVVC吻合；外科手术过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65537/65537fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 7"> 
图 7：受体手术期间的肝上腔静脉吻合。（A）吻合口后壁已缝合完成。（B）已完成的肝上腔静脉（SHIVC）吻合。比例尺 = 2 mm。缩写：IVC = 下腔静脉；SHIVC = 肝上腔静脉。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65537/65537fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="外科手术、肝静脉吻合、特写、医疗技术、血管连接。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65537/65537fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图8"> 
图8：受体手术期间的肝下腔静脉吻合。（A）吻合口后壁已缝合完毕。（B）已完成的肝下腔静脉吻合。比例尺 = 2 mm。缩写：IVC = 下腔静脉；IHIVC = 肝下腔静脉。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65537/65537fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="胆管支架置入；显微外科示意图；器官连接；肝脏、肾脏、门静脉、肝内静脉。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65537/65537fig09.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图9"> 
图9：受体手术期间的胆总管吻合。（A）在受体胆总管内放置胆管支架。（B）固定胆管吻合口。比例尺 = 1 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65537/65537fig09large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="动物MRI装置；对置于固定装置中的小鼠进行磁共振分析的成像实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65537/65537fig10.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图10"> 
图10：小鼠微计算机断层扫描（microCT）血管造影的动物准备。（A）通过小鼠尾静脉注射给予造影剂。（B）将小鼠送入microCT仪器中。缩写：microCT = 微计算机断层扫描。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65537/65537fig10large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示肝脏解剖结构的CT扫描图像，标注了门静脉（PV）和下腔静脉（IVC）" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65537/65537fig11.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图11"> 
图11：显示同种异体移植血管通畅性的显微CT血管造影代表性图像。（A,B）可见对比剂充盈整个下腔静脉（IVC），表明肝上和肝下吻合口通畅。（C）门静脉内的对比剂显影，再次显示吻合口通畅。（D）血管系统的三维重建。缩写：microCT = 显微计算机断层扫描；IVC = 下腔静脉；PV = 门静脉。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65537/65537fig11large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="手术吻合图像：门静脉扭曲，SHIVC 出血，包含比例尺指示。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65537/65537fig12.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图12"> 
图12：显示失败的代表性图像 体内 吻合口 (A) 由于静脉扭曲导致血流缺失，门静脉吻合失败。B) 由于大量出血导致肝上腔静脉吻合失败。比例尺 = 2 mm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65537/65537fig12large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

在本实验方案中，我们探讨了在小鼠中成功实施原位肝移植（OLT）模型的方法。此外，还讨论了在小鼠成功进行OLT后，用于进一步分析同种异体移植物通畅性的辅助技术，特别是利用微型计算机断层扫描（microCT）成像的方法。

微型计算机断层扫描（microCT）血管造影技术为研究人员提供了宝贵的资源。该技术的最新进展使得高质量……

移植通常是终末期器官疾病唯一有效的治疗方法。为了深入了解肝内移植中固有的复杂损伤机制，已开发出可靠的啮齿类动物移植模型，以重现同种移植物损伤的生理和病理生理过程。未来需要开发创新性策略，以深入探究移植过程中组织损伤所涉及的机制通路，并扩大供体来源。利用小鼠研究移植至关重要，因为它允许使用基因编辑和转基因小鼠品系来研究特定分子通路在同种异体移植物损伤病理生理过程中的作用。小鼠肝脏移植存在多项技术挑战，包括血管吻合口直径较小，以及由此引发血栓形成导致移植物功能衰竭的风险。尽管已采用多种技术（如超声血管造影），但微型计算机断层扫描具有优势，例如能够获得整个腹部血管吻合口的高分辨率图像。这些研究可纵向进行，以评估随时间推移肝脏的血管通畅性和灌注情况。在啮齿类动物中开展准确而清晰的微型CT血管造影研究存在诸多挑战。我们发现，采用心脏门控技术并调整异氟烷浓度以降低呼吸速率，可获得最清晰的图像。我们还发现，针对特定阶段采用啮齿类动物专用的对比剂显影时间，也能改善成像效果。首先，将麻醉后的供体小鼠置于高倍显微镜下。使用剪刀，从剑突开始沿中线切口，一直切至耻骨联合。然后在肋骨下方做一横向切口，形成十字形切口。牵开剑突后，取出肠管并将其放置于腹腔左侧湿润的纱布海绵上。为游离肝脏，需将其与所有韧带附着部分分离。暴露肝固有动脉（PHA）后，使用弯钳将其游离。结扎PHA后，解剖胆总管（CBD）的全长。将胆道支架插入CBD，并用10-0尼龙缝线固定。然后结扎胆总管远端。使用湿润的纱布垫将右肝叶向剑突方向牵拉，暴露下腔静脉（IVC）。将肝内下腔静脉（IHIVC）从后腹膜游离，并电凝右肾上腺静脉。分离并结扎右肾动脉和肾静脉后，切断这两条血管及剩余的韧带组织。取出右肾后，经门静脉（PV）注入0.5毫升含100单位肝素的冷组氨酸-色氨酸-酮戊二酸盐溶液。注射1分钟后，在脾静脉和肠系膜上静脉上方切断门静脉。为灌注肝脏，缓慢将冷组氨酸-色氨酸-酮戊二酸盐保存液注入肝后下腔静脉（IHIVC），直至从门静脉流出的液体变清亮。在右肾静脉上方的下腔静脉处放置微型钳或细缝线，并在钳下方稍远处剪断。当远端胆总管在支架以远被剪断后，辨认胆囊管并用10-0尼龙缝线结扎。用镊子夹住胆囊顶部，使用弹簧剪在缝线上方剪断胆囊管，完成胆囊切除术。将肝脏向下牵拉，以暴露肝上腔静脉（SHIVC）并将其切断，注意在受体小鼠中保留足够长度以供吻合。在去除额外的韧带附着后，将肝脏置于冷生理盐水中。在剃除并消毒麻醉后受体小鼠的手术部位后，采用正中腹切口暴露肝固有动脉（PHA）。肝脏游离后，使用10-0尼龙缝线结扎左侧膈下血管和食管旁血管。接着，将肝脏向下牵拉，并从后腹膜分离肝上段下腔静脉（SHIVC）。将肝脏向上牵拉，并从后腹膜分离肝下下腔静脉（IHIVC）。随后结扎右肾上腺静脉，暴露肝门。使用10-0尼龙缝线结扎PHAs。从门静脉（PV）分离出胆总管（CBD），并在接近分叉处用7-0缝线结扎，以留出足够的空间用于CBD吻合。当肝下下腔静脉（IHIVC）被夹闭后，暂时用7-0缝线结扎门静脉。使用30号针头，将0.5毫升肝素化生理盐水冲洗入原肝脏的门静脉中。固定供体下腔静脉（SHIVC）和受体下腔静脉（IHIVC）后，切断受体自身肝脏的SHIVC、IHIVC、门静脉（PV）以及任何残留的韧带连接。将供体肝脏移植物置入腹腔，并牵拉供体移植物的肝门以暴露门静脉。当供体与受体的门静脉冲洗完毕后，将预先制备好的供体门静脉套管插入受体肝脏门静脉管腔内。在固定吻合口后，使用10-0尼龙缝线手工缝合供体与受体的SHIVC。最后，完成前壁的吻合。然后移除门静脉（PV）的结扎缝线，接着从下腔静脉肝段（SHIVC）开始撤除血管夹，以恢复灌注。按照SHIVC的操作方法，手工缝合吻合肝内下腔静脉（IHIVC）。完成重建后，移除IHIVC上的微型血管夹或缝线，以恢复血流灌注。创建胆管切口后，将供体胆总管支架插入受体胆总管腔内，并用10-0缝线固定吻合口。首先，使用胶带将心电图电极片分别贴附于麻醉小鼠的左侧、右侧前肢和右侧后肢，该小鼠已移植肝脏。为确保在信号源设置选项卡中获得正确清晰的QRS波群，选择心电图（ECG）作为逻辑导联的信号源，并选取能提供最清晰心电图曲线的导联。在触发设置选项卡中，确认已勾选通道 A，然后选择所需的输出并设置通道 A 的触发参数。接着在显示设置选项卡中，调整显示设置以获得清晰的信号视图。将 ECG 旁边的方框设置为 500。设置成像参数。确保心电图（ECG）的阈值低于滞后值且高于ST段的峰值。将小鼠放入扫描仪后，按下“更新图像”。然后获取小鼠的X射线定位像，以选择适当的视野范围和解剖扫描覆盖区域。为进行显微CT血管成像采集，需设置所示参数。为重建显微CT图像，需上传图像并调整蓝色标记条，使其跨位于目标解剖区域两侧。打开重建工具界面，选择待重建的数据文件。开启感兴趣区域轮廓以优化图像边界。然后选择 40 微米的体素尺寸、手形投影滤波器和高斯体滤波器（80 微米）。选择切片预览以减小文件大小，并根据感兴趣区域的轮廓确定视野。接下来，裁剪X射线图像以去除不需要的空白或区域。进入高级设置，点击基于图像的门控。选择10个相位用于心脏门控。更新文件名，然后点击容积重建按钮。最后，重命名文件以包含参数选择，并选择容积重建。成功的微型CT血管造影扫描可提供有关血管吻合的详细信息。通过下腔静脉（IVC）和门静脉（PV）所见的对比显影，可显示肝上和肝内吻合口的通畅性。此外，成功微型CT扫描的三维重建可提供关于血管解剖结构的详细信息。

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一种采用新型磁性吻合技术进行肝上腔静脉重建的原位肝移植大鼠模型

采用手术原位移植技术，将患者来源的肿瘤组织块植入小鼠体内，同时结合培养的人眼葡萄膜黑色素瘤细胞系进行针头注射，从而建立人肝转移性葡萄膜黑色素瘤的原位异种移植小鼠模型。...

在免疫缺陷小鼠中建立肝脏原位人眼葡萄膜黑色素瘤异种移植平台

本文介绍了一种建立正位肝细胞癌异种移植模型的方案，该方案包括结扎和不结扎肝动脉的条件，并利用[18F]氟米索硝唑（[18F]FMISO）和[18F]氟脱氧葡萄糖（[18F]FDG）进行无创正电子发射断层扫描（PET）成像，以检测肿瘤缺氧情况。...

原位小鼠肝细胞癌模型中的无创PET/MR成像

小鼠心脏移植模型是研究移植免疫学的重要研究工具。本方案详细介绍了小鼠异位颈部心脏移植技术，该技术涉及在受体的颈总动脉和供体的肺动脉干上放置套管，以实现层流血流。...

利用血管套环的小鼠异位颈部心脏移植

本方案提供了利用套管技术在小鼠原位肝移植中进行血管重建的技术信息。...

小鼠原位肝移植中采用套管技术进行血管重建

小肠移植已成为不可逆性肠功能衰竭患者的可接受治疗选择。我们在大鼠中建立的原位小肠移植实验模型，是研究肠移植过程中复杂的免疫和炎症反应的可靠工具。...

大鼠原位小肠移植

学习小鼠原位肝移植手术技术，利用显微计算机断层扫描血管造影评估移植肝血管通畅性。该方法结合心脏门控技术，为移植生物学研究提供高分辨率成像方案。

利用显微计算机断层扫描血管造影术在小鼠中成功实施原位肝移植

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