使用液相色谱、捕获离子淌度谱和飞行时间质谱进行组蛋白修饰筛选

提出了一种采用组蛋白提取方法的方案，提取效率可达95%。结合LC-TIMS-ToF MS/MS技术，可在较短时间内对组蛋白中存在的翻译后修饰（PTMs）进行筛查，并且尤其能够实现异构体的分离。尽管仅使用串联质谱技术理论上也可分离异构肽段，但实际操作中往往较为困难。

通过引入离子淌度分离技术（TIMS），我们增加了一个分离维度，简化了多种位置异构体的鉴定。此外，该被动技术提高了这些实验的灵敏度，进一步增强了我们分析表观遗传变异的能力。随着对翻译后修饰位点鉴定能力的提升，我们得以进一步确定各种环境或生物学因素与其对表观基因组影响之间的相关性。

可改善并促进组蛋白分析的方法可应用于多个研究领域，包括医学和环境化学。通过液相色谱-离子淌度串联质谱（LC-TIMS-ToF MS/MS）和纳米液相色谱-离子淌度串联质谱（Nano LC-TIMS-ToF MS/MS）结合氢氘交换（HDX）技术，将阐明天然或受损状态下蛋白质构象的动态变化，并绘制出不同生物样本中翻译后修饰（PTM）的差异图谱。打开TIMS控制软件。

单击仪器选项卡并切换至操作模式。验证TIMS参数，然后检查质谱设置，包括扫描起始、扫描结束、离子极性及扫描模式。再次核对TIMS设置，包括模式、迁移率起始、迁移率结束、斜坡时间、累积时间、占空比、斜坡速率、质谱速率、质谱平均及自动校准。

接下来，为校准目的将扫描模式更改为 MS。确保仪器处于运行模式后，从源选项卡中启动装有调谐混合液的 Hamilton 500 微升注射器。然后转到校准选项卡。

点击质量与电荷比，在校准模式下选择二次模式。将缩放控制在±0.01%范围内，然后点击校准，当达到100%评分时，点击接受。接下来，转到迁移率选项卡，在校准模式下选择线性模式。

将检测范围设置为正负 5%，宽度设置为 0.1 道尔顿。然后点击校准，当得分超过 98.5% 时，点击接受。为了建立用于分析蛋白水解组蛋白肽的 LIC-TIMS-ToF MS/MS 方法，需将配备 C18 柱的高效液相色谱仪与采用专有被动技术的商用 TIMS-ToF MS 仪器联用。

接下来，将纳米电喷雾电离源的工作参数设置为：毛细管电压 4,500 伏特，终端板偏移电压 800 伏特，雾化气压力 3 巴，干燥气体流速 10 升/分钟，干燥加热器温度 200 摄氏度。将质谱参数配置为：碰撞能量 6 电子伏特，碰撞射频电压 1,200 Vpp，传输时间 75 微秒，前脉冲存储时间 5 微秒。调节进样体积至 20 微升，相当于样品量 8 微克，并将流速设定为 0.4 毫升/分钟。

输入指定的梯度程序和含0.1%甲酸的乙腈-水溶液比例后，在两个弹出窗口中均选择“确定”以保存方法。使用含0.1%甲酸的水相和乙腈-水溶液进行60分钟的非线性液相色谱梯度洗脱。通过纳电喷雾离子化在正离子模式下，验证样品从高效液相色谱洗脱进入TIMS-ToF质谱仪的情况。

在 MS-Digest 工具中，为了鉴定肽段序列和修饰位点，需使用 Protein Prospector 生成理论肽段列表。随后进行理论酶切分析，需考虑酶切条件、翻译后修饰类型、肽段大小范围、质荷比检测范围以及可能的漏切位点数量。为分析所获得的数据，应对每种理论肽段在多个电荷态下（每个肽段从 1 到 4 电荷态）进行质荷比匹配搜索。

在确定每个质荷比后，选择相应峰，并根据肽段序列（包括翻译后修饰）的理论碎片离子列表，确认其二级质谱（MS/MS）。肽段的碎片谱图显示出三种具有不同转录后修饰的肽段变体，其中包括位于不同位点的丙酰基和乙酰基修饰。与未修饰版本相比，丙酰化组蛋白H3标准品表现出更长的肽段。

从HeLa S3细胞中提取的组蛋白在相同的氨基酸位点上显示出多种翻译后修饰模式。