利用宏基因组扩增子测序分析葡萄酒酿造过程中发酵中的特拉米内特葡萄的细菌群落

研究范围聚焦于发酵微生物组的理解，旨在回答诸如自然发酵中微生物的多样性如何，以及哪些编码代谢物的基因对风味和安全性至关重要等问题。本领域最新的进展之一是阐明微生物组的动态变化如何与发酵食品和饮料中观察到的代谢特征相关联。

下一代测序技术是目前推动我们研究领域进步的关键技术。首先，将20毫升发酵葡萄样品转移至无菌的50毫升螺旋盖管中。然后，向管中加入10毫升冷水，并涡旋振荡以实现均质化。

在4°C条件下，以800g离心样品1分钟。将上清液转移至新的50毫升离心管中，在4°C条件下以3,000g离心20分钟。弃去上清液后，用1毫升PBS重悬沉淀。

将细胞悬液转移至一个2毫升螺口离心管中，在14,000g离心2分钟。然后，将沉淀重悬于978微升pH 7.4的磷酸钠缓冲液和122微升DNA缓冲液中。涡旋混匀管内液体，并置于4摄氏度条件下孵育45分钟至1小时。

取一毫升样品加入Lysis solution one管中，拧紧管盖。使用珠磨机对样品进行三次均质处理，每次60秒。然后，将Lysing Matrix E管在16,800g条件下离心1分钟。

将样本转移至一个洁净的微量离心管中，并向管中加入250 µL蛋白质沉淀溶液。振荡管子10次以混匀内容物。在16,800 ×g条件下离心5分钟，然后将上清液转移至一个无菌的15 mL离心管中。

然后，向上清液中加入1 mL结合基质悬液，通过倒置离心管混匀2分钟，随后将离心管置于试管架中静置3分钟。去除1 mL上清液后，将基质在剩余的上清液中重新悬浮。取600 µL混合液转移至离心过滤管中，进行离心。

然后，倾倒出流穿液，并向离心过滤管中加入 500 µL 洗涤液。取下离心过滤器，将其放入一个新的收集管中静置五分钟。干燥后，在滤膜上加入 50 µL 温热的无 DNA 酶水，并用移液器吸头轻轻搅拌基质。

在14,500g离心1分钟以洗脱DNA。将样品上样至琼脂糖凝胶。最后，测定DNA浓度。

首先，使用特异性引物515F和806R扩增16S rRNA基因的V4高变区。按照给定条件进行PCR反应。随后，在试管中加入3.5 µL测序缓冲液和1.5 µL酶混合液。

混合并离心样品后，设置一个PCR仪反应。现在，将接头连接混合物加入离心管中，在PCR仪中于20摄氏度孵育15分钟。向连接混合物中加入1.5微升尿嘧啶特异性延伸试剂酶，并在37摄氏度孵育15分钟。

现在，向接头连接的 DNA 中加入 43.5 µL 磁珠，混合 20 次。5 分钟后，将离心管置于磁力架上 5 至 10 分钟以实现磁珠分离，弃去上清液。用 100 µL 80% 乙醇洗涤沉淀物，并将磁珠干燥 30 秒。

为洗脱磁珠和沉淀物，向管中加入8.5 µL的10 mM Tris-HCl，孵育2分钟。将管子置于磁力架上，将7.5 µL上清液中的洗脱DNA转移至新管中。向含有接头连接DNA的管中加入PCR试剂，配制25 µL的反应体系。

为了纯化扩增的DNA，向离心管中加入22.5微升磁珠并混匀20次。5分钟后，移除50微升上清液，并用100微升80%乙醇洗涤磁珠。将深棕色磁珠重悬于16微升水中，并混匀20次。

将离心管置于磁力架上静置30至60秒，然后转移15微升至新的离心管中。加入90微升缓冲液、1微升染料和2微升DNA文库样品，混匀后在荧光计上读取DNA浓度。将DNA稀释至2纳摩尔后，上样27至30微升至流动池，并将其放入测序仪中。

保存从测序仪获得的FASTQ文件。点击打开一个电子表格文件，创建一个比对或元数据文件。打开Nephele网站，上传FASTQ文件并进行读段质量控制。在QIIME 2中执行过滤和修剪操作。

接下来，使用 DADA2 对去多重的双端测序读段进行执行，包括过滤替换、嵌合体错误校正及序列合并。利用基于 SILVA 版本 132、99% 操作分类单元（OTU）数据库训练的朴素贝叶斯分类器，在 97% 相似度水平下进行细菌分类学注释。打开 MicrobiomeDB 网站，点击上传文件，生成 OTU 的 α 多样性、β 多样性、相对丰度和稀疏曲线。

最后，打开电子表格软件并导入数据，以生成热图、维恩图和线性判别分析效应量图。基于葡萄酒酿造不同阶段细菌相对丰度绘制的热图显示，变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteriota）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）和梭杆菌门（Fusobacteriota）等门类占据主导地位。在属水平上，鉴定出肠杆菌科（Enterobacteriaceae）和乳杆菌科（Lactobacillaceae）等重要类群。

维恩图分析显示，从葡萄醪到最终葡萄酒共有15个共有的独特OTU。基于V4可变区的扩增子测序结果也表明了两种酒样中的α多样性。β多样性分析显示发酵过程中细菌群落发生了变化，但最终葡萄酒中的细菌组成与葡萄醪和添加酵母阶段相似。