Name: 使用宏基因组扩增子测序分析葡萄酒生产过程中发酵Traminette葡萄的细菌群落 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: 了解宏基因组扩增子测序技术如何分析Traminette葡萄酒发酵过程中的细菌群落动态变化。本研究利用下一代测序技术揭示微生物组成与葡萄酒风味品质之间的关键关系。

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感谢阿巴拉契亚州立大学研究委员会（URC）资助项目以及巴西高等教育人员提升协调机构（CAPES）Print Travel 奖学金对 FAO 访问巴西圣保罗州里贝朗普雷图圣保罗大学的支持。 本研究部分由巴西高等教育人员提升协调机构（Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil，CAPES）资助，资助代码 001。ECPDM 感谢 CAPES Print Travel 奖学金对其访问阿巴拉契亚州立大学的支持。ECPDM 是巴西国家科学技术发展委员会（Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brasil，CNPq）2 级研究学者。

1. 实验性葡萄酒生产
<ol>
	<li>从位于北卡罗来纳州琼斯维尔的 Dynamis Estate 葡萄园获取 Traminnette 葡萄，去梗并压榨以释放葡萄汁，分别注入两个 600 L 的敞口发酵罐中，盖上盖子，使葡萄汁与果皮接触约 4 天。</li>
	<li>每天进行一次压帽操作，将果皮压入汁液中以保持湿润，并减少挥发性酸（VA）的生成。 
	注：由于大部分芳香前体物质（单萜类化合物）位于果皮中，使葡萄汁与果皮保持接触可增强葡萄酒的芳香潜力。</li>
	<li>4 天后，接种 Saccharomyces cerevisiae var cerevisiae QA23（Lallemand）。选择该酵母菌株是因为其具有强发酵能力，并有助于增强葡萄酒中源自葡萄的品种特性。</li>
	<li>在其中一个发酵罐 Traminette R 中，当糖度达到 17.7 时添加 20 g/hL Fermaid O，并在糖度降至 13.1 g/hL 时再次添加 20 g/hL Fermaid O 和 12.5 g/hL Fermaid K，以确保发酵稳定性；而在另一个发酵罐 Traminette L 中，当糖度为 17.1 时添加 40 g/hL Stimula Sauvignon blanc，并在糖度降至 13.4 时添加 20 g/hL Fermaid O，以增强葡萄酒的品种特性。</li>
	<li>分别在第 1 天（葡萄汁）、第 4 天（接种酵母后）、第 15 天（发酵中葡萄汁）和第 30 天（成酒）采集两份平行样品，在 DNA 提取和宏基因组分析前于 -20 °C 保存。</li>
</ol>
2. 宏基因组学的DNA提取
<ol>
	<li>将上述获得的所有重复样品置于冰上，直至进行第一次离心。</li>
	<li>将20 mL发酵样品转移至一个无菌的50 mL螺口管中。</li>
	<li>加入10 mL冷水并混匀（涡旋）。在4 °C条件下以800 × g离心1分钟，将上清液转移至新的50 mL管中。 
	注意：此步骤将去除样品中的固体成分。</li>
	<li>重复步骤2.3两次，并将上清液合并至同一管中。</li>
	<li>将上清液在4 °C条件下以3,000 × g离心20分钟，沉淀细胞。弃去上清液。</li>
	<li>用1 mL PBS重悬沉淀，转移至2 mL螺口管中，并以14,000 × g离心2分钟。使用PBS再清洗两次。</li>
	<li>在此步骤中，可将沉淀在-20°C下冷冻保存，或继续进行步骤2.8。重要的是所有样品需以相同方式处理。</li>
	<li>加入978 µL磷酸钠缓冲液。配制磷酸钠缓冲液：将3.1 g NaH2PO4·H2O和10.9 g Na2HPO4 （无水）溶于蒸馏H2O中，定容至1 L，并调节pH至7.4。</li>
	<li>加入122 µL DNA缓冲液（DNA spin试剂盒），涡旋混匀。</li>
	<li>将样品置于冰箱（4 °C）中静置45分钟至1小时。每15分钟涡旋混匀一次。此步骤也可过夜（o/n）或持续至准备继续使用DNA spin试剂盒时。</li>
	<li>将1 mL样品转移至Lysis solution 1管（DNA spin试剂盒）中并拧紧管盖（将样品编号写在管壁而非管盖上；试剂会清除管盖上的书写内容）。</li>
	<li>在珠磨破碎仪中以6.5 m/s速度（CY：24 × 2）均质样品，每次60秒，共三次。若破碎仪具备冰浴装置，可在管下放置50 g干冰。若无此装置，则每次均质后将样品置于湿冰上冷却5分钟。</li>
	<li>将Lysing Matrix E管（DNA spin试剂盒）以16,800 × g（或最大转速）离心1分钟。</li>
	<li>将上清液转移至洁净的微量离心管中。然后加入250 µL蛋白沉淀溶液（PPS试剂，DNA spin试剂盒），用手轻轻颠倒混匀10次。</li>
	<li>以16,800 × g离心5分钟，使沉淀形成沉淀物。</li>
	<li>将上清液转移至无菌的15 mL管中。向上清液中加入1 mL结合基质悬浮液（DNA spin试剂盒）。 
	注意：使用前需充分重悬结合基质悬浮液，直至均匀。</li>
	<li>用手轻轻颠倒混匀管子2分钟，然后将管子置于管架中静置3分钟（使硅胶基质沉降）。</li>
	<li>小心移除1 mL上清液。将基质在剩余的上清液中重悬。</li>
	<li>将600 µL混合液转移至离心过滤管（DNA spin试剂盒）中，并以14,500 × g离心1分钟。</li>
	<li>加入剩余的混合液并再次离心。</li>
	<li>倒出穿滤液，向离心过滤管中加入500 µL洗涤液（DNA spin试剂盒），并以14,500 × g离心1分钟（确保在洗涤液中加入乙醇；参见产品说明书）。倒出穿滤液，重复洗涤两次（共洗涤三次）。</li>
	<li>倒出穿滤液，再以14,500 × g额外离心2分钟，以去除残留的洗涤液，使基质干燥。</li>
	<li>取出离心过滤管，将其放入新的收集管（DNA spin试剂盒）中。在室温（RT）下将离心过滤管晾干5分钟。</li>
	<li>将无DNA酶的水（DNA spin试剂盒）在55 °C下预热5分钟。加入50 µL无DNA酶的水，并用移液枪头轻轻搅动滤膜上的基质，以高效洗脱DNA。让样品在室温下静置1分钟，然后以14,500 × g离心1分钟，完成DNA洗脱。</li>
	<li>将样品置于冰上。将样品混合液（2 µL样品 + 2 µL水 + 1 µL上样缓冲液）上样至凝胶。测定DNA浓度。</li>
	<li>将样品在-20 °C下保存。</li>
	<li>使用分光光度计对提取的DNA进行定量。 
	注意：取1 µL DNA样品进行检测，通过A260/A280比值评估DNA质量。</li>
</ol>
3. DNA 电泳
<ol>
	<li>用0.5倍浓度的Tris/硼酸/EDTA（TBE）缓冲液配制1%琼脂糖凝胶（小型凝胶使用20 mL，中型凝胶使用70–100 mL）。称取琼脂糖和缓冲液，微波加热至琼脂糖完全溶解，重新称重后用dH2O补足至初始重量。将琼脂糖溶液冷却至55–60 °C，倒入带有梳子组件的凝胶模具中。静置使凝胶完全凝固。</li>
	<li>向样品（10 µL）中加入1 µL 10×上样缓冲液，与分子量标记物一同上样至凝胶。以100–115 V（大凝胶）或90 V（小型凝胶）的电压从负极（黑色）向正极（红色）电泳，直至蓝色染料迁移至凝胶底部附近。</li>
	<li>将凝胶置于含1 µL/mL溴化乙锭或SYBR Green的溶液中染色30分钟（需佩戴腈类手套和护目镜），用水冲洗后在紫外（UV）光源下观察。从重复样品中选择产量最高的样品用于后续处理。</li>
</ol>
4. 高通量测序
<ol>
	<li>使用特异性引物515F（5' -GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和806R（5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3'）扩增16S rRNA基因的V4高变区22。PCR反应条件设置为：94 °C预变性2 min，随后进行30个循环（94 °C变性20 s，58 °C退火20 s，65 °C延伸1 min），最后在65 °C延伸10 min（终末延伸）。</li>
	<li>使用高保真PCR预混液进行PCR反应（材料表）。</li>
	<li>使用DNA文库构建试剂盒制备文库，随后在测序平台上进行双端测序。 
	注：本实验中使用NEBNext Ultra II DNA文库构建试剂盒制备文库，并在novaseq6000平台上采用Illumina双端测序（2 × 250 bp）进行测序。</li>
	<li>按照以下测序步骤操作：
	<ol>
		<li>步骤1：使用酶对DNA进行片段化，通常采用选择特定片段大小的方法。
		<ol>
			<li>向25 µL DNA（约1 µg）中加入3.5 µL测序缓冲液和1.5 µL酶混合液，用移液器吹打混匀10次，短暂离心。</li>
			<li>将反应管放入热循环仪中，设置如下程序：预热盖子至75°C，（1）20 °C孵育30 min，（2）65 °C孵育30 min，（3）4°C保存。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>步骤2：通过连接反应添加接头
		<ol>
			<li>用移液器向反应体系中加入15 µL连接主混合液、1.25 µL接头、0.5 µL连接增强剂和30 µL末端修复后的DNA混合液。</li>
			<li>在热循环仪中20 °C孵育15 min，然后向连接反应体系中加入1.5 µL尿嘧啶特异性切除试剂（USER）酶，总体积达48.26 µL，37 °C孵育15 min。</li>
			<li>向接头连接后的DNA中加入43.5 µL磁珠，用移液器吹打混匀20次，室温孵育5 min。使用磁力架分离磁珠，再孵育5–10 min，弃去上清液。</li>
			<li>用100 µL 80%乙醇洗涤沉淀一次，干燥30 s，再次洗涤。在8.5 µL 10 mM Tris HCl/0.1x Tris-EDTA（TE）/HPLC H2O中重悬磁珠和沉淀，用移液器混匀，室温孵育2 min。</li>
			<li>将反应管置于磁力架上，吸取7.5 µL洗脱的DNA作为上清液。将洗脱液转移至新管中，进行PCR扩增步骤。</li>
			<li>首先，向7.5 µL接头连接的DNA中加入12.5 µL主混合液、2.5 µL i7索引引物和2.5 µL通用PCR引物/i5引物，总体积为25 µL PCR反应体系。PCR程序如下：预热盖子至103 °C，98 °C预变性30 s，进行10个循环（98 °C变性10 s，65 °C延伸75 s），最后65 °C延伸5 min，4 °C保存。</li>
			<li>对25 µL扩增后的DNA进行纯化。加入22.5 µL磁珠，吹打混匀20次，室温孵育5 min，移除50 µL上清液。用100 µL 80%乙醇洗涤磁珠，轻轻干燥30 s以彻底去除乙醇。</li>
			<li>用16 µL水重悬深棕色磁珠，用移液器吹打混匀20次，置于磁力架上静置30–60 s。将15 µL上清液转移至新管中。</li>
			<li>使用荧光计测定DNA浓度。将90 µL缓冲液 + 1 µL染料 + 2 µL DNA文库样品混匀后读取浓度。将DNA稀释至2 nM，取27–30 µL上样至流动池，并放入测序仪中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>步骤3：对已连接接头的片段进行测序，将上述生成的文库杂交至规则排列的流动池基质上，并根据制造商说明书捕获DNA。以此作为第二条链合成的模板。
		<ol>
			<li>随后，将第二条链扩增形成克隆簇。线性化克隆簇并封闭活性位点。根据制造商的操作方案加入测序引物，为边合成边测序提供起始位点。 
			注：从化学原理上讲，修饰的核苷酸通过天然互补配对结合到DNA模板链上。每个核苷酸均带有荧光标记和可逆终止子，后者可阻止下一个碱基的加入。因此，荧光信号的存在指示了当前插入的核苷酸类型，随后终止子被切除，以便下一个碱基结合。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>步骤4：扩增单链结合的DNA，形成可进行同步边合成边测序的序列簇。 
		注：由于采用双向扫描和双通道测序化学技术，序列簇产生的信号比单链更强。测序软件会自动将碱基识别结果（*.cbcl文件）传输至指定的输出文件夹，用于后续数据分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 生物信息学
<ol>
	<li>将序列数据生成为 FASTQ 文件，并按以下部分进行分析。
	<ol>
		<li>第一部分：
		<ol>
			<li>保存从测序仪获得的 FASTQ 文件，点击打开电子表格文件，并创建对应的映射/元数据文件。</li>
			<li>打开 Nephele 网站（https://nephele.niaid.nih.gov/），&#160;上传 FASTQ 文件，在 QIIME2 中进行读段质量控制、过滤和修剪22。将原始序列存入 NCBI BioProject 的序列读段归档（SRA）和 GenBank（https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/bioproject/）</li>
		</ol>
		</li>
		<li>第二部分：访问 Nephele 网站（https://nephele.niaid.nih.gov/），&#160;对去多重标签的双端读段进行处理，过滤替换错误和嵌合体错误，并使用 DADA2 进行序列合并23。采用基于 Silva 132 版本 99% OTU 数据库训练的朴素贝叶斯分类器，在 97% 相似度水平下进行细菌分类学注释24。</li>
		<li>第三部分：打开 MicrobiomeDB 网站，点击上传文件，生成 OTU 的 α-多样性、β-多样性、相对丰度及稀疏曲线（https://microbiomedb.org/mbio/app）。</li>
		<li>第四部分：打开电子表格，导入数据以绘制热图、维恩图以及线性判别分析效应大小图（https://microbiomedb.org/mbio/app）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 统计分析
<ol>
	<li>打开 QIIME222，使用 alpha-group-significance 脚本确定组间 α 多样性的显著差异。该分析还将执行 Kruskal-Wallis 检验。</li>
	<li>通过 PERMANOVA 分析确定组间 β 多样性的差异，并包含成对检验25。</li>
	<li>使用 MicrobiomeDB 获取各组间细菌群落结构的显著差异。统计学显著性阈值设定为 p 值 ≤0.05。</li>
</ol>

Profiling the Bacterial Community in Grapes Using Amplicon Metagenomics

<ol><li>Skinkis, P. A., Bordelon, B. P., Wood, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+monoterpene+constituents+in+traminette%2C+gew%C3%BCrztraminer%2C+and+riesling+winegrapes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Enology+and+Viticulture%22%5BJournal%5D)">Comparison of monoterpene constituents in traminette, gewürztraminer, and riesling winegrapes.</a> American Journal of Enology and Viticulture. 59, 440-445 (2008).</li>
<li>Bordelon, B. P., Skinkis, P. A., Howard, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+training+system+on+vine+performance+and+fruit+composition+of+Traminette%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Enology+and+Viticulture%22%5BJournal%5D)">Impact of training system on vine performance and fruit composition of Traminette.</a> American Journal of Enology and Viticulture. 59, 39-46 (2008).</li>
<li>Reisch, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aReisch%2C+BI+%22Traminette%27+Grape.+New+York+Food+and+Life+Science+Bulletin%22">Traminette' Grape. New York Food and Life Science Bulletin</a>. , Communications Services Cornell University, NYSAES, Geneva, New York. (1996).</li>
<li>Clemente-Jimenez, J. M., Mingorance-Cazorla, L., Martı́nez-Rodrı́guez, S., Las Heras-Vázquez, F. J., Rodrı́guez-Vico, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+and+oenological+properties+of+wine+yeasts+isolated+during+spontaneous+fermentation+of+six+varieties+of+grape+must%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization and oenological properties of wine yeasts isolated during spontaneous fermentation of six varieties of grape must.</a> Food Microbiology. 21, 149-155 (2004).</li>
<li>Attila, K. Ã, Kluz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+microflora+of+wine+grape+berries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology%2C+Biotechnology+and+Food+Sciences%22%5BJournal%5D)">Natural microflora of wine grape berries.</a> Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences. 4 (special issue 1), 32-36 (2015).</li>
<li>Swiegers, J. H., Bartowsky, E. J., Henschke, P. A., Pretorius, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+and+bacterial+modulation+of+wine+aroma+and+flavor+in+Microbial+modulation+of+wine+aroma+and+flavour%5BTitle%5D)+AND+%22Australian+Journal+of+Grape+and+Wine+Research%22%5BJournal%5D)">Yeast and bacterial modulation of wine aroma and flavor in Microbial modulation of wine aroma and flavour.</a> Australian Journal of Grape and Wine Research. 11 (2), 139-173 (2008).</li>
<li>Alonso-del-Real, J., Pérez-Torrado, R., Querol, A., Barrio, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominance+of+wine+Saccharomyces+cerevisiae+strains+over+S.+kudriavzevii+in+industrial+fermentation+competitions+is+related+to+an+acceleration+of+nutrient+uptake+and+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dominance of wine Saccharomyces cerevisiae strains over S. kudriavzevii in industrial fermentation competitions is related to an acceleration of nutrient uptake and utilization.</a> Environmental Microbiology. 21 (5), 1627-1644 (2019).</li>
<li>Virdis, C., Sumby, K., Bartowsky, E., Jiranek, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactic+acid+bacteria+in+wine%3A+Technological+advances+and+evaluation+of+their+functional+role%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Lactic acid bacteria in wine: Technological advances and evaluation of their functional role.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 3192(2021).</li>
<li>Burns, T. R., Osborne, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+malolactic+fermentation+on+the+color+and+color+stability+of+Pinot+noir+and+Merlot+Wine%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Enology+and+Viticulture%22%5BJournal%5D)">Impact of malolactic fermentation on the color and color stability of Pinot noir and Merlot Wine.</a> American Journal of Enology and Viticulture. 64, 370-377 (2013).</li>
<li>Piao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+bacterial+community+and+its+temporal+succession+during+the+fermentation+of+wine+grapes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontier+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Insights into the bacterial community and its temporal succession during the fermentation of wine grapes.</a> Frontier of Microbiology. 6, 809(2015).</li>
<li>Figdor, D., Gukabivale, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+against+the+odds%3A+Microbiology+of+root+canals+associated+with+post-treatment+disease+Endodontic+Topics%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Survival against the odds: Microbiology of root canals associated with post-treatment disease Endodontic Topics.</a> 18, 62-77 (2011).</li>
<li>Bokulich, N. A., Joseph, C. M. L., Greg Allen, G., Benson, A. K., Mills, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+reveals+significant+bacterial+diversity+of+botrytized+wine%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+ONE%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing reveals significant bacterial diversity of botrytized wine.</a> Plos ONE. 7 (5), e36357(2012).</li>
<li>Berbegal, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+metagenomic-based+approach+for+the+characterization+of+bacterial+diversity+associated+with+spontaneous+malolactic+fermentations+in+wine%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">A metagenomic-based approach for the characterization of bacterial diversity associated with spontaneous malolactic fermentations in wine.</a> International Journal of Molecular Science. 20, 3980(2019).</li>
<li>Leveau, J. H., Tech, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grapevine+microbiomics%3A+bacterial+diversity+on+grape+leaves+and+berries+revealed+by+high-throughput+sequence+analysis+of+16S+rRNA+amplicons%5BTitle%5D)+AND+%22International+Symposium+on+Biological+Control+of+Postharvest+Diseases%3A+Challenges+and+Opportunities%22%5BJournal%5D)">Grapevine microbiomics: bacterial diversity on grape leaves and berries revealed by high-throughput sequence analysis of 16S rRNA amplicons.</a> International Symposium on Biological Control of Postharvest Diseases: Challenges and Opportunities. 905, 31-42 (2010).</li>
<li>Rubiola, S., Macori, G., Civera, T., Fanning, S., Mitchell, M., Chiesa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+full-length+16s+RNA+metabarcoding+and+whole+metagenome+sequencing+suggests+the+use+of+either+is+suitable+for+large-scale+microbiome+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Foodborne+Pathogens+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Comparison between full-length 16s RNA metabarcoding and whole metagenome sequencing suggests the use of either is suitable for large-scale microbiome studies.</a> Foodborne Pathogens and Disease. 19, 495-504 (2022).</li>
<li>Bokulich, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+among+wine+grape+microbiome%2C+metabolome%2C+and+fermentation+behavior+suggest+microbial+contribution+to+regional+wine+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Mbio%22%5BJournal%5D)">Associations among wine grape microbiome, metabolome, and fermentation behavior suggest microbial contribution to regional wine characteristics.</a> Mbio. 7 (3), e00631-e00716 (2016).</li>
<li>Siren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-omics+and+potential+applications+in+wine+production%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multi-omics and potential applications in wine production.</a> Current Opinion in Biotechnology. 56, 172-178 (2019).</li>
<li>Kidd, S. P., Bastian, S. E. P., Eisenhofer, R., Welsh, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+viable+grapevine+microbiome+to+enhance+the+quality+of+wild+wines%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+Australia%22%5BJournal%5D)">Monitoring the viable grapevine microbiome to enhance the quality of wild wines.</a> Microbiology Australia. 44 (1), 13-17 (2023).</li>
<li>Lorenz, P., Eck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomics+and+industrial+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Metagenomics and industrial applications.</a> Nature Reviews Microbiology. 3, 510-516 (2005).</li>
<li>Tosi, E., Azzolini, M., Guzzo, F., Zapparoli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+different+fermentation+behaviours+of+two+indigenous+strains+of+Saccharomyces+cerevisiae+and+Saccharomyces+uvarum+isolated+from+Amarone+wine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evidence of different fermentation behaviours of two indigenous strains of Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces uvarum isolated from Amarone wine.</a> Journal of Applied Microbiology. 107 (1), 210-218 (2009).</li>
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<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nature Methods. 5, 335-336 (2010).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

宏基因组学实验方案从葡萄汁的采样开始，随后在酵母加入葡萄汁后，采集发酵中的葡萄酒以及最终成品酒样品。接着对这些样品进行了两轮重复的DNA提取，并成功获得了DNA。提取所得DNA的浓度在15 ng/µL至87 ng/µL之间不等。这表明该DNA提取方案适用于葡萄酒宏基因组学研究。尽管DNA在A260/A280处的纯度存在差异，但这种变化可能归因于多种影响提取效果的因素，例如酒精浓度以及发酵过程中和发酵后产生的其他代谢产物，以及其他可能抑制基因组提取的有机植物成分。先前的研究已报道过类似关于宏基因组植物材料的观察结果27。然而，本方案中提取的DNA数量足以满足后续分析步骤的要求。宏基因组学研究所需的PCR条形码构建，尤其是使用Illumina测序平台时，要求最低DNA量为1 ng/µL。本研究对V4区进行了测序，而细菌多样性分析需依赖16S rRNA基因测序；该基因包含从V1到V9的多个可变区23。从不同样品提取的DNA共获得6,393,443条双端序列读长，平均每组样本产生399590.1875 ± 138442.6148条序列。V4区被广泛使...

Traminette 葡萄以生产高品质葡萄酒为特征，同时具有可观的产量以及对多种真菌感染的部分抗性1,2,3。葡萄的自然发酵依赖于相关的微生物、酿酒环境以及发酵容器4,5。许多酒厂通常依赖野生酵母和细菌进行发酵，以产生酒精、酯类，并促进香气和风味的形成6。
本研究旨在分析葡萄中的细菌组成，并监测其在发酵过程中的动态变化。尽管现代酿酒中普遍采用如Saccharomyces cerevisiae等起始菌种进行主发酵（即酒精生成阶段），且该方法广泛应用于不同类型的葡萄酒酿造7。此外，苹果酸在次级发酵过程中被Oenococcus oeni脱羧转化为乳酸，这一过程可改善葡萄酒的感官特性与风味特征，并降低其酸度8,9。随着非培养依赖性分析技术的最新进展，目前已能够鉴定与酿酒葡萄相关联的多种微生物，以及在不同发酵阶段从葡萄汁传递至最终产品中的微生物种类10。
不同葡萄中野生细菌在葡萄酒发酵过程中转移至葡萄汁后的角色与动态变化尚不明确。许多这类细菌的分类学地位甚至尚未确定，或其表型特性未被表征，这导致它们在共培养发酵中的应用仍远未得到充分开发。然而，基于微生物培养的分析方法已被用于确定与葡萄和葡萄酒相关的细菌种群10。众所周知，选择性培养平板法操作繁琐、易受污染、重复性差，结果可能不可靠，且无法检测那些生长需求未知的细菌种类。先前研究表明，不依赖培养的、基于16S rRNA基因的分析方法在表征复杂微生物群落方面更具可靠性且成本效益更高11。例如，对16S rRNA基因高变区进行测序已成功应用于研究葡萄叶片、浆果及葡萄酒中的细菌12,13,14。研究显示，采用16S rRNA元条形码技术或全宏基因组测序均适用于微生物组研究15。目前正逐步积累有关细菌多样性与其在葡萄酒酿造过程中代谢特性之间潜在关联的信息，这有助于解析酿酒特性与风土特征16。
利用下一代测序（NGS）技术充分发挥宏基因组学工具的优势，以研究葡萄和葡萄酒微生物生态的需求已被多次强调16,17。此外，基于高通量测序的无需培养的方法，用于分析食品及发酵生态系统中微生物多样性的技术已变得极为重要且具有广泛应用价值，被众多实验室采纳，并推荐用于工业实践18,19。该方法能够检测现存的微生物群落并进行分类学分析，揭示环境微生物的组成、相对丰度以及α和β多样性，具有显著优势20。对16S基因可变区的测序已成为微生物生态学研究中首选的重要基因标记，并已在多项不同研究中广泛应用。
尽管许多研究关注葡萄酒发酵过程中的真菌，尤其是酵母21，但本研究报道了利用16S扩增子测序和生物信息学工具研究特拉米内特葡萄酿酒过程中细菌群落的方法。

<table><tbody><tr><td>琼脂糖凝胶&amp;nbsp;</td><td>Promega，美国威斯康星州麦迪逊市</td><td>V3121</td><td>电泳&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>FastPrep 土壤DNA离心柱试剂盒&amp;nbsp;</td><td>MP Biomedicals，Solon，OH，美国</td><td>116560-200</td><td>DNA 提取&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>FastQC 软件</td><td>英国巴布拉汉研究所</td><td></td><td>生物信息学&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fermaid O</td><td>Scott 实验室，美国加利福尼亚州佩塔卢马&amp;nbsp;</td><td></td><td>发酵&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>高保真 PCR 预混液&amp;nbsp;</td><td>美国新英格兰生物实验室</td><td>F630S</td><td>用于测序的聚合酶链式反应&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra</td><td>美国新英格兰生物实验室</td><td>NEB #E7103</td><td>DNA文库构建</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II DNA文库构建试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Illumina，加利福尼亚州圣地亚哥&amp;nbsp; 美国</td><td></td><td>DNA测序&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NovaSeq 控制软件（NVCS）</td><td>Illumina，加利福尼亚州圣地亚哥&amp;nbsp; 美国</td><td></td><td>DNA测序&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Novaseq6000 平台&amp;nbsp;</td><td>Illumina，加利福尼亚州圣地亚哥&amp;nbsp; 美国</td><td></td><td>DNA测序&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>QuiBit</td><td>美国马萨诸塞州沃尔瑟姆，赛默飞世尔科技公司</td><td></td><td>DNA 定量&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Quickdrop分光光度计&amp;nbsp;</td><td>Molecular device，美国加利福尼亚州圣何塞</td><td></td><td>DNA 定量&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>磷酸钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>342483</td><td>DNA提取缓冲液</td></tr><tr><td>Stimula 长相思白葡萄酒</td><td>Scott 实验室，美国加利福尼亚州佩塔卢马&amp;nbsp;</td><td></td><td>发酵&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

利用宏基因组扩增子测序分析葡萄酒酿造过程中发酵中的特拉米内特葡萄的细菌群落

Profiling the Bacterial Community of Fermenting Traminette Grapes during Wine Production using Metagenomic Amplicon Sequencing

测序技术的进步以及生物信息学工具在微生物群落结构分析中的相对便捷获取，促进了人们对葡萄和葡萄酒中可培养与不可培养微生物的更深入理解。在工业发酵过程中，已知和未知的微生物常常影响产品的形成以及产生异味。因此，对从葡萄到葡萄酒中细菌的群落结构进行分析，有助于清晰了解 原位 微生物动态。本研究对发酵过程中的特拉米内特葡萄汁及其最终葡萄酒中的细菌进行了DNA提取，提取浓度为15 ng/µL至87 ng/µL。对V4高变区的16S扩增子进行测序，结果显示相对丰度较高的细菌门类包括变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteriota）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）、梭杆菌门（Fusobacteriota），其次为疣微菌门（Verrucomicrobiota）、盐杆菌门（Halobacterota）、脱硫杆菌门（Desulfobacterota）、黏球菌门（Myxococcota）和酸杆菌门（Acidobacteriota）。通过对操作分类单元（OTU）的共有性进行Venn图分析，发现共有15个细菌门类存在于葡萄汁、发酵阶段及最终葡萄酒中。通过16S扩增子测序检测到此前未见报道的细菌门类，以及肠杆菌科（Enterobacteriaceae）和乳杆菌科（Lactobacillaceae）等属。测试了葡萄酒中有机营养物质利用的差异及其对细菌的影响；特拉米内特 R 含有 Fermaid O 和 Traminette 的容器 L 用长相思（Sauvignon blanc）和 Fermaid O 刺激后，通过Kruskal-Wallis检验分析α多样性以确定均匀度。β多样性显示，在发酵阶段，两种处理间的细菌群落结构发生改变，而最终葡萄酒中的细菌群落结构则趋于相似。该研究证实，16S扩增子测序可用于监测葡萄酒生产过程中细菌群落的变化，从而支持产品质量控制，并更有效地利用葡萄来源的细菌。

首先测定了从葡萄汁、发酵酒液及成品酒中提取的DNA的数量和质量，其数量范围为15-87 ng/µL（表1）。
测序与生物信息学分析 
Illumina 高通量测序仪生成的 FASTQ 文件被导入 Nephele 平台，并在 QIIME 2 平台上进行查看26。首先，使用 FastQC 软件评估序列质量。随后，对序列的 5'-和 3'-端进行修剪，以去除低质量的核苷酸，接着进行去噪、序列合并，并去除嵌合序列，最后利用 DADA2 去噪器将序列聚类为 OTU（物种的操作性定义）23。使用 SILVA v138.1 数据库将序列比对至细菌分类单元。根据 99% 的核苷酸序列相似性将序列聚类为 OTU。图 1展示了 OTU 的 DADA2 稀疏曲线，曲线已趋于平缓，表明测序深度已足够覆盖大多数微生物多样性。对序列进行的重复分析未产生显著差异。
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本文介绍了一种扩增子宏基因组学实验方案，用于分析特拉米内葡萄、发酵葡萄及成品葡萄酒中的细菌群落组成。

测序技术的进步以及生物信息学工具在微生物群落结构分析中的相对便捷获取已……

研究范围聚焦于发酵微生物组的理解，旨在回答诸如自然发酵中微生物的多样性如何，以及哪些编码代谢物的基因对风味和安全性至关重要等问题。本领域最新的进展之一是阐明微生物组的动态变化如何与发酵食品和饮料中观察到的代谢特征相关联。下一代测序技术是目前推动我们研究领域进步的关键技术。首先，将20毫升发酵葡萄样品转移至无菌的50毫升螺旋盖管中。然后，向管中加入10毫升冷水，并涡旋振荡以实现均质化。在4°C条件下，以800g离心样品1分钟。将上清液转移至新的50毫升离心管中，在4°C条件下以3,000g离心20分钟。弃去上清液后，用1毫升PBS重悬沉淀。将细胞悬液转移至一个2毫升螺口离心管中，在14,000g离心2分钟。然后，将沉淀重悬于978微升pH 7.4的磷酸钠缓冲液和122微升DNA缓冲液中。涡旋混匀管内液体，并置于4摄氏度条件下孵育45分钟至1小时。取一毫升样品加入Lysis solution one管中，拧紧管盖。使用珠磨机对样品进行三次均质处理，每次60秒。然后，将Lysing Matrix E管在16,800g条件下离心1分钟。将样本转移至一个洁净的微量离心管中，并向管中加入250 µL蛋白质沉淀溶液。振荡管子10次以混匀内容物。在16,800 ×g条件下离心5分钟，然后将上清液转移至一个无菌的15 mL离心管中。然后，向上清液中加入1 mL结合基质悬液，通过倒置离心管混匀2分钟，随后将离心管置于试管架中静置3分钟。去除1 mL上清液后，将基质在剩余的上清液中重新悬浮。取600 µL混合液转移至离心过滤管中，进行离心。然后，倾倒出流穿液，并向离心过滤管中加入 500 µL 洗涤液。取下离心过滤器，将其放入一个新的收集管中静置五分钟。干燥后，在滤膜上加入 50 µL 温热的无 DNA 酶水，并用移液器吸头轻轻搅拌基质。在14,500g离心1分钟以洗脱DNA。将样品上样至琼脂糖凝胶。最后，测定DNA浓度。首先，使用特异性引物515F和806R扩增16S rRNA基因的V4高变区。按照给定条件进行PCR反应。随后，在试管中加入3.5 µL测序缓冲液和1.5 µL酶混合液。混合并离心样品后，设置一个PCR仪反应。现在，将接头连接混合物加入离心管中，在PCR仪中于20摄氏度孵育15分钟。向连接混合物中加入1.5微升尿嘧啶特异性延伸试剂酶，并在37摄氏度孵育15分钟。现在，向接头连接的 DNA 中加入 43.5 µL 磁珠，混合 20 次。5 分钟后，将离心管置于磁力架上 5 至 10 分钟以实现磁珠分离，弃去上清液。用 100 µL 80% 乙醇洗涤沉淀物，并将磁珠干燥 30 秒。为洗脱磁珠和沉淀物，向管中加入8.5 µL的10 mM Tris-HCl，孵育2分钟。将管子置于磁力架上，将7.5 µL上清液中的洗脱DNA转移至新管中。向含有接头连接DNA的管中加入PCR试剂，配制25 µL的反应体系。为了纯化扩增的DNA，向离心管中加入22.5微升磁珠并混匀20次。5分钟后，移除50微升上清液，并用100微升80%乙醇洗涤磁珠。将深棕色磁珠重悬于16微升水中，并混匀20次。将离心管置于磁力架上静置30至60秒，然后转移15微升至新的离心管中。加入90微升缓冲液、1微升染料和2微升DNA文库样品，混匀后在荧光计上读取DNA浓度。将DNA稀释至2纳摩尔后，上样27至30微升至流动池，并将其放入测序仪中。保存从测序仪获得的FASTQ文件。点击打开一个电子表格文件，创建一个比对或元数据文件。打开Nephele网站，上传FASTQ文件并进行读段质量控制。在QIIME 2中执行过滤和修剪操作。接下来，使用 DADA2 对去多重的双端测序读段进行执行，包括过滤替换、嵌合体错误校正及序列合并。利用基于 SILVA 版本 132、99% 操作分类单元（OTU）数据库训练的朴素贝叶斯分类器，在 97% 相似度水平下进行细菌分类学注释。打开 MicrobiomeDB 网站，点击上传文件，生成 OTU 的 α 多样性、β 多样性、相对丰度和稀疏曲线。最后，打开电子表格软件并导入数据，以生成热图、维恩图和线性判别分析效应量图。基于葡萄酒酿造不同阶段细菌相对丰度绘制的热图显示，变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteriota）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）和梭杆菌门（Fusobacteriota）等门类占据主导地位。在属水平上，鉴定出肠杆菌科（Enterobacteriaceae）和乳杆菌科（Lactobacillaceae）等重要类群。维恩图分析显示，从葡萄醪到最终葡萄酒共有15个共有的独特OTU。基于V4可变区的扩增子测序结果也表明了两种酒样中的α多样性。β多样性分析显示发酵过程中细菌群落发生了变化，但最终葡萄酒中的细菌组成与葡萄醪和添加酵母阶段相似。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

使用宏基因组扩增子测序分析葡萄酒生产过程中发酵Traminette葡萄的细菌群落

表征微生物群落一直是环境微生物学中的长期目标。新一代测序技术如今能够以极低的成本和工作量，以前所未有的深度对微生物群落进行表征。本文详细介绍了我们使用台式测序仪对细菌16S核糖体RNA基因进行测序的方法。...

16S核糖体RNA基因扩增子的高通量测序

我们介绍一种高效、稳定且经济的从拭子中提取核酸的方法，用于通过16S...

高效的核酸提取与16S rRNA基因测序用于细菌群落特征分析

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风土概念通过葡萄果实代谢组学与转录组学的解析

采用宏基因组学方法研究青贮饲料中牛饲料的微生物组。通过鸟枪法测序进行分析，以表征牛饲料中微生物群落的组成。...

青贮饲料的宏基因组分析

本方案描述了一种用于定量且全面研究多种营养物质代谢的实验方法。该工作流程结合了同位素示踪实验与分析程序，可确定被消耗营养物质的去向以及微生物合成分子的代谢来源。...

基于同位素示踪实验组合的工作流程以研究微生物对多种营养源的代谢

本文描述了在葡萄中鉴定和表征基因家族的方法，该方法应用于拟南芥酵母毒性（Arabidopsis Tóxicos in...

葡萄树ATL E3泛素连接酶基因家族的全基因组鉴定与表达荟萃分析的综合工作流程

16S rRNA扩增子测序法表征粪便微生物的标准化操作流程

本文介绍了一种获取土壤、根际和根内微生物组扩增子序列数据的实验方案。该信息可用于研究与植物相关的微生物群落的组成和多样性，适用于多种植物物种。...

探索根系微生物组：从土壤、根际和根内圈提取细菌群落数据

利用两步PCR和下一代16S rRNA基因测序进行微生物群分析

微生物工程“设计-构建-测试”循环中的一个瓶颈在于对菌株进行功能筛选的速度。本文介绍了一种高通量菌株筛选方法，每次实验可应用于数百至数千个酵母细胞，该方法采用基于液滴的RNA测序技术。...

基于液滴的高通量酵母菌株表型分析与RNA测序

本方案提供了详细的步骤，用于构建、灭菌、组装、使用以及重复利用真菌通道柱，以从多种环境基质中富集通过真菌通道相互作用的细菌-真菌配对。...

利用多样化环境与基质中的真菌高速公路柱研究细菌-真菌相互作用

了解宏基因组扩增子测序技术如何分析Traminette葡萄酒发酵过程中的细菌群落动态变化。本研究利用下一代测序技术揭示微生物组成与葡萄酒风味品质之间的关键关系。

利用宏基因组扩增子测序分析葡萄酒酿造过程中发酵中的特拉米内特葡萄的细菌群落

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