Name: 在刚性或柔性基材上使用垂直排列的碳纳米纤维阵列，将生物分子和染料输送到植物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 32 s
Description: 学习使用垂直排列碳纳米纤维阵列向植物输送生物分子和染料的方法。该技术适用于多种植物物种，可克服传统转化方法的局限性，实现快速高效的基因递送。

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纳米纤维阵列在能源部科学办公室下属的纳米相材料科学中心（用户设施）制备完成（项目编号：CNMS2019-103 和 CNMS2022-A-1182）。对纳米相材料科学中心（CNMS）的支持通过同行评审的提案系统授予，并为计划发表研究成果的获批申请人提供免费使用资源的机会（http://www.cnms.ornl.gov/user/becoming_a_user.shtml）。我们感谢 Kevin Lester 和 CNMS 在纳米纤维阵列制备过程中提供的协助。我们感谢 John Caughmen 博士、Timothy McKnight 博士、Amber Webb 博士、Daryl Briggs 和 Travis Bee 在实验设计方面的重要讨论。我们感谢 Adam Rondinone 博士提供 PECVD 设备的示意图。我们感谢 Leslie Carol 提供科学插图。本研究由美国能源部科学办公室生物与环境研究局生物成像科学项目资助（项目编号：DE-SC0019104），以及美国农业部资助（项目编号：2021-67013-34835）。JMM 得到美国农业部国家食品与农业研究所农业与食品研究计划博士前奖学金（项目编号：2021-67034-35167）的支持。

1. VACNFs 的制备（图 2 和 图 3）
<ol>
	<li>在硅片上旋涂聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）495 A4&#160;以 4000 rpm 旋涂光刻胶，并在 180 ℃ 烘烤 &#176;C，5 分钟 
	注意：将晶圆冷却10秒后再进行下一步操作。</li>
	<li>旋涂第二层光刻胶（PMMA 950 A2）并在180℃下烘烤 &#176;C，5 分钟。</li>
	<li>使用电子束光刻技术在指定的横向间距（节距：10）下定义直径为300 nm的催化剂点 &#181;米，或 35 &#181;3 毫米 × 3 毫米阵列中</li>
	<li>将光刻胶在 30–40 mL 的甲基异丁基酮：异丙醇（IPA）比例为 1:3 的显影液中显影 1.5 分钟，随后用 IPA 冲洗并用 N₂ 吹干2. 
	注意：使用明场显微镜（20倍物镜）检查点阵分布情况。</li>
	<li>使用硅刻蚀机中的氧气等离子体对晶圆进行6秒曝光（去胶残），以清除残留光刻胶。</li>
	<li>使用电子束蒸发法先沉积一层金属粘附层（Ti 或 Cr，10 nm），然后沉积第二层 Ni 催化剂（130 nm 或 150 nm）。在沉积 Ti 或 Ni 金属期间，保持电流在 10 kV 下低于 0.2 A，压力低于 5 × 10⁻⁶ Torr。-6 Torr，沉积速率约为 1 Å/s，用于视线沉积。</li>
	<li>使用连续的浴式超声处理去除沉积在底层光刻胶上的金属（Ni），保留直接沉积在硅片上的镍。该过程称为剥离（lift-off）。
	<ol>
		<li>为此，准备3个盛有丙酮的容器，在室温（RT，20℃）下将晶圆置于丙酮中进行超声波清洗1分钟；重复3次。 &#176;C) 以 35 kHz 的频率进行。用异丙醇（IPA）冲洗，并用氮气（N₂）吹干。2. 
		注意：切勿让丙酮在晶圆上自然晾干。最后一次丙酮超声处理后，应立即用异丙醇（IPA）冲洗，然后用氮气吹干。2 气体。如果晶圆在任何时刻过早变干（在异丙醇冲洗之前），可能导致无法完全去除多余的金属和光刻胶，且丙酮可能留下残留物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用扫描电子显微镜（SEM）检查催化剂形貌的几何结构。为获取VACNF芯片的SEM图像，将样品台倾斜至30度&#176; 角度，并使用1-3 kV的电压，束流约为100 pA，工作距离约为5 mm。 
	注意：催化剂应呈圆柱形致密块状，形似冰球图4）。致密圆柱体的高度应反映沉积在硅片上的镍的厚度。如果镍点的轮廓较高且顶部呈凹陷状，形似火山（图4），那么催化剂更容易破裂形成多个镍液滴，从而导致碳纳米纤维发生分支9(图4 以及 图5）。这些问题可能源于金属蒸发过程中因沉积时间过长导致光刻胶熔化，或与剥离工艺相关的问题。图4 和 图5).</li>
	<li>将硅晶圆切成四等份，并放入直流等离子体增强化学气相沉积室（dc-PECVD）中，通入乙炔/氨气混合气体。优化生长参数以控制纳米纤维的长度和锥度（尖端） &#60;200 nm
	<ol>
		<li>使用1-1.5 A的电流和440-560 V的电压范围。在生长纤维时，当设备和基底加热至620 °C时，采用氨气流进行预处理阶段。 &#176;C. 确保在启动等离子体前10秒打开碳源（乙炔）。 
		注意：若需优化等离子体增强化学气相沉积（PECVD）设备的运行参数，则使用四分之一晶圆。以制备长度超过 40 的纤维 &#181;m且尖端直径小于200 nm的垂直排列碳纳米纤维（VACNFs），建议采用以下参数：当Ni催化剂厚度为130 nm时，使用1.75 A电流，生长时间70分钟，乙炔∶氨气流量比为45标准立方厘米每分钟（sccm）∶100 sccm；当Ni厚度为150 nm时，使用1.5 A电流，生长时间80分钟，乙炔∶氨气流量比为48 sccm∶100 sccm。无论催化剂厚度如何，生长VACNFs时均采用以下参数：生长温度620 °C &#176;C，等离子体过程中压力为10 torr，喷头高度为20 mm（图6).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 SEM 在 30 评估所得纤维的几何形态&#176; 以1 kV的加速电位倾斜。 
	注意：理想的纤维应为笔直且无分支。使用电子束蒸发仪无法控制镍催化剂的晶体取向，因此由于催化剂去湿现象，部分纤维会出现分支。9此外，晶体取向导致VACNFs生长高度不同，因此难以实现所有VACNFs的高度均一。</li>
	<li>以1000 rpm转速将一层光刻胶（SPR955）旋涂于纤维上，持续45秒。随后切割 &#188; 使用切割锯将晶圆切成 3 mm × 3 mm 的阵列。将纤维在此阶段保存，以备后续使用。 
	&#8203;注意：如果计划将纤维转移至柔性基底，则不要执行步骤 1.11。</li>
</ol>
2. 将垂直排列的碳纳米纤维转移至柔性基底（图&#160;7 和图 8）
<ol>
	<li>纤维合成后，在晶圆或四分之一晶圆上以 4000 rpm 的速度旋涂 SU-8 2015 光刻胶，持续 45 秒。</li>
	<li>在 95 °C 下对晶圆进行前烘 3 分钟。</li>
	<li>使用接触式光刻机，采用 3 mm × 3 mm 的阵列掩模对晶圆进行曝光，曝光剂量为 95 mJ/cm2，掩模需与电子束光刻定义的图案对齐。 
	注意：使用接近式接触模式，曝光间隙应比最高纤维高度大 20 µm。此步骤中纤维可能被碰倒。</li>
	<li>在 95 °C 下进行曝光后烘烤，持续 6 分钟。</li>
	<li>将晶圆在 SU-8 显影液中显影 15 秒，用 IPA 冲洗，并用 N2 从上至下吹干。 
	&#8203;注意：显影时确保晶圆完全浸没。</li>
	<li>对已图案化的晶圆旋涂一层保护性薄光刻胶（SPR 955 CM 0.7），转速为 3000 rpm，持续 45 秒，并在 90 °C 下前烘 30 秒。</li>
	<li>通过原子层沉积在 100 °C 下进行 22 个循环，在晶圆上沉积一层薄硅氧化物层（2–3 nm）。</li>
	<li>使用划片机将晶圆切割成 3 mm × 3 mm 的正方形，划片机需与晶圆上已有的图案对齐。</li>
	<li>使用扫描电子显微镜（SEM），在 30° 倾斜角和 3 kV 加速电压下评估所得纤维的形貌。</li>
	<li>若需长期保存芯片（&#62;1 周），可在此步骤停止。将芯片避光保存。</li>
	<li>为分离柔性基底与刚性基底，将单个芯片置于丙酮中 30 分钟，或直至 SU-8 开始卷曲。</li>
	<li>将 SU-8 薄膜（无论是否仍附着于刚性基底）用异丙醇（IPA）清洗 5 分钟，再用水清洗 5 分钟。运输时将芯片放入带有粘性垫的商用盒中。</li>
	<li>可选：将 SU-8 薄膜无纤维的一面置于水溶性胶带，或置于带有薄聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET，厚度 12.5 µm）背衬的薄硅橡胶上。
	<ol>
		<li>使用镊子转移 SU-8 薄膜。按压 SU-8 方片的边缘，使其牢固粘附于胶带/硅橡胶-PET 上，以避免纤维断裂。此时，VACNF 薄膜已可立即使用。</li>
		<li>制备硅橡胶/PET 载具的方法如下：使用双组分硅橡胶试剂盒，将两组分（弹性体与交联剂）混合均匀。然后，裁剪一块 PET 方片，并用胶带固定于透明塑料皿中。在 PET 上倾倒一层极薄的硅橡胶，于 80 °C 下固化 1–2 小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 植株上操作法（将待递送溶液滴加到植物表面）使用刚性基底中的纤维（图1A）
<ol>
	<li>用丙酮（100%，5 分钟）、异丙醇（100%，5 分钟）和去离子水（5 分钟）依次洗涤，逐步去除光刻胶。2使用前 O（5 分钟）。</li>
	<li>将待穿刺的植物组织置于坚硬的表面上以提供支撑。</li>
	<li>放置1 &#181;L染料或DNA液滴&#160;(200 ng) 置于植物组织表面。</li>
	<li>将带有刚性基底的VACNF芯片置于液滴顶部，使纤维方向朝向液滴并与其接触。 
	注意：芯片的方向可以通过以下方式确定 &#34;光泽度&#34; 晶圆的表面。芯片的光面带有纤维，而暗面则无纤维。</li>
	<li>使用镊子的平面轻敲芯片。用软头标记笔标记芯片与植物接触的区域。递送完成后，移除VACNF芯片。 
	注意：敲击时施加的力度需根据所用植物组织的类型而调整。建议在进行纤维穿刺操作前先练习敲击芯片。避免对植物组织造成损伤，若在植物组织中可见VACNF芯片的轮廓，则表明已造成损伤。</li>
	<li>重复步骤 3.1–3.5 进行对照实验（+染料/DNA，-纤维；-染料/DNA，+纤维；以及-染料/DNA，-纤维）。“-纤维”指芯片无纤维的一侧。</li>
	<li>将完整植株或离体植物器官置于长日照条件（16小时光照，8小时黑暗）的湿润培养箱中保存，必要时进行。对于离体器官，使用底部铺有湿润滤纸的塑料培养皿。</li>
</ol>
4. 芯片上法（将待递送溶液的液滴置于 VACNF 芯片上），刚性基底（图 1B）
<ol>
	<li>使用丙酮（100%，5 分钟）、异丙醇（IPA，100%，5 分钟）和双蒸水（ddH2O，5 分钟）依次洗涤，去除光刻胶，然后方可使用。</li>
	<li>在带有刚性基底的 VACNF 芯片的纤维侧滴加 1 µL 染料或质粒 DNA（200 ng）。确保将液滴置于芯片中央，并覆盖多根纤维。让液滴干燥 15 分钟。 
	注意：可通过晶圆的&#34;光泽度&#34;来判断芯片的方向。芯片的光亮面含有纤维，而不透明面则无纤维。</li>
	<li>处理叶片或其他离体器官时，将其放置于硬质表面之上；处理完整植株时，则在施加 VACNF 的器官下方放置硬质支撑物。</li>
	<li>经过 15 分钟干燥后，将 VACNF 芯片定位，使纤维面与植物组织接触。用镊子尾部轻敲芯片。 
	注意：轻敲时施加的力度需根据所用植物组织类型进行调整。建议预先练习轻敲操作。</li>
	<li>重复植株上操作法中的步骤 3.6–3.7。</li>
</ol>
5. 采用芯片上方法将SU-8薄膜中的垂直排列碳纳米纤维（VACNFs）应用于植物组织（图1C）
<ol>
	<li>在SU-8薄膜的纤维侧滴加1 µL染料或DNA（200 ng），静置干燥10分钟。确保液滴位于芯片中央。 
	注意：干燥时间根据所用基底的不同而有所差异。</li>
	<li>使用一对尖头镊子将VACNF薄膜放置于植物表面。 
	注意：SU-8薄膜在空气中暴露的时间越长，其脆性越大。为降低丢失SU-8薄膜的风险，请确保所有植物/样品和设备均放置在SU-8薄膜附近。</li>
	<li>用一个小的化妆棉签轻轻滚压VACNF薄膜。用软头标记笔标记柔性基底接触的位置。使用胶带将柔性基底从植物表面移除。 
	注意：滚压化妆棉签时施加的力度因所用植物组织的不同而异。在进行生物分子或染料递送前，应先练习VACNF薄膜的应用。若在植物组织上可见VACNF薄膜的轮廓，则表明植物组织已出现明显损伤。</li>
	<li>对对照组重复步骤5.1–5.3，并按照离体植株法步骤3.7中所述条件储存植物。</li>
</ol>
6. 所有递送方法的显微镜观察与图像分析
<ol>
	<li>使用共聚焦显微镜对样品成像，选择适合所递送荧光探针/报告分子的发射和激发波长。 
	注意：瞬时转化所需时间因植物种类和递送的标记物而异。例如，荧光标记物的表达在拟南芥中于48小时后检测到，而在生菜叶片中则需96小时7。</li>
	<li>成像时，尽量聚焦于纤维脱落的区域。纤维可能具有不同的取向。递送成功与否并不依赖于断裂纤维的外观。 
	注意：由于等离子体增强化学气相沉积（PECVD）过程中形成的氮化硅层，纤维在最常见的激发/发射设置下会呈现荧光18。</li>
	<li>每个样品至少采集5张图像。所得信号可能存在差异。</li>
	<li>使用ImageJ19测量20 µm × 20 µm共聚焦图像区域内的总荧光强度（积分密度）7。</li>
</ol>

Using Carbon Nanofiber Arrays for Efficient Biomolecule and Dye Delivery to Plants

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<li>Rooks, M. J., Wind, S., McEuen, P., Prober, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+30-nm-scale+structures+for+electron+transport+studies+using+a+polymethylmethacrylate+bilayer+resist%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vacuum+Science+%26+Technology+B%3A+Microelectronics+Processing+and+Phenomena%22%5BJournal%5D)">Fabrication of 30-nm-scale structures for electron transport studies using a polymethylmethacrylate bilayer resist.</a> Journal of Vacuum Science & Technology B: Microelectronics Processing and Phenomena. 5 (1), 318-321 (1987).</li>
<li>Lee, G., Sohn, D. K., Seok, S. H., Ko, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+hole+density+variation+in+the+PECVD+reactor+showerhead+on+the+deposition+of+amorphous+carbon+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Vacuum%22%5BJournal%5D)">The effect of hole density variation in the PECVD reactor showerhead on the deposition of amorphous carbon layer.</a> Vacuum. 163, 37-44 (2019).</li>
<li>Fowlkes, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+catalyst+particle+crystallographic+orientation+in+vertically+aligned+carbon+nanofiber+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Carbon%22%5BJournal%5D)">Control of catalyst particle crystallographic orientation in vertically aligned carbon nanofiber synthesis.</a> Carbon. 44 (8), 1503-1510 (2006).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了构建垂直排列碳纳米纤维阵列的方法，将纤维转移至柔性基底，并将纤维应用于刚性或柔性基底上的植物，以实现生物分子或染料向植物体内的递送。我们描述了两种通用的材料沉积方法——芯片上法（on-chip）和植株上法（on-plant），并展示了在刚性基底上的纤维以及使用VACNF薄膜的芯片上法所取得的成功结果。相较于传统的植物转化方法（如基因枪法、聚乙二醇介导或电穿孔法的原生质体转化），这些纤维的应用在理论和实践中更为简便，且可用于对农杆菌介导转化具有抗性的植物。然而，仅有少数细胞被成功转化。
垂直排列的碳纳米纤维通过橡树岭国家实验室纳米相材料科学中心的用户计划制备。用户可申请使用该设施来生产垂直排列的碳纳米纤维（VACNFs）。此外，也可在洁净室中使用直流等离子体增强化学气相沉积设备并结合碳源来制备VACNF芯片22,23。根据所述方法，纤维的制备、纤维转移以及VACNF芯片/薄膜的应用过程中有几个关键步骤。为确保纤维能够有效应用于植物细胞递送，纤维必须保持笔直，且其尖端直径需&#60;200 nm6,7（图3）。为了制备特定尺寸和间距的碳纳米纤维，可通过调节多种参数实现，包括点直径、横向间距以及所沉积催化剂的量。为选择用于碳纳米纤维制备的最佳点直径，我们从不同点直径生长了纤维（如图5所示）。研究发现，300 nm直径的点可获得最佳纤维，因此选定该点尺寸（图5）。在确定合适参数后，我们选用那些具有理想几何形貌（笔直且尖端直径&#60;200 nm）的纤维比例超过&#62;50%的芯片。为检测纤维的几何形貌，我们采用扫描电子显微镜对VACNF芯片/薄膜样品上的随机视野区域进行成像分析。
此外，纤维必须具有一定的最小长度，才能实现向植物细胞内的递送。制备不同长度纤维的重要性在于，较长的纤维可用于穿透更深的组织层。较长的纤维（&#62;40 µm）对于柔性薄膜至关重要，因为纤维转移依赖于从基部断裂纤维，并需要在纤维顶部叠加 SU-8 层。本方案中所用 SU-8 层的工作厚度为 20–35 µm。在各种植物（弯曲或平坦）表皮内实现递送所需的最小高度为 10–15 µm6,7。因此，VACNF 薄膜必须使用长度 &#62;40 µm 的纤维。在制备碳纳米纤维时需考虑多个不同参数：催化剂材料、催化剂几何形状、催化剂材料厚度，以及 PECVD 腔室内的条件（气体比例、压力、温度、电流、喷头高度和生长时间）8,9,24,25。为了制备 Morgan 等人7 和 Davern 等人6 所使用的长度超过 25 µm 的碳纳米纤维，我们增加了 Ni 催化剂的用量，调整了乙炔与氨气的比例，并提高了电流和生长时间。此外，我们更加关注催化剂材料的几何形状。为了获得高而直立的纤维，沉积的催化剂应呈曲棍球饼状，而非类似火山口的形状（图 4）。火山口结构源于显影后残留的光刻胶。为防止火山口结构的形成，在电子束光刻过程中使用了双层 PMMA 以形成底切结构26。该底切结构有助于沉积的金属催化剂的剥离（图 2）。催化剂的较厚层对于高 VACNF 的生长至关重要。VACNF 的形貌已被 Merkulova 等人24 研究。VACNF 的垂直取向归因于 Ni 催化剂的尖端型生长机制以及直流电场势垂直于基底的取向（图 6）。喷头描述了 PECVD 反应器的几何结构（图 6），并作为电场电势的来源27。
为了利用电子束光刻技术定义催化剂点阵列，我们涂覆了一层电子束抗蚀剂（聚甲基丙烯酸甲酯），然后使用电子束在晶圆上特定位置和特定形状处于抗蚀剂中形成微小孔洞。具有目标直径的孔洞以规则网格排列，并设定好间距（节距）；在将基底放入设备之前，已将指定所需图案的文件载入电子束光刻系统中。除了纤维高度外，影响纤维成功转移的另一个关键参数是在丙酮浴中浸泡的时间。垂直阵列碳纳米管薄膜需在丙酮浴中浸泡足够长时间，使其边缘开始卷曲；若浸泡时间过短，则薄膜更难从芯片上剥离，且可能发生断裂。芯片存放时间越久，在丙酮浴中所需浸泡的时间就越长。完成丙酮浸泡后，将薄膜/芯片依次置于异丙醇和水中，以去除残留的丙酮以及纤维表面的保护性光刻胶。
进行旋涂时，将晶圆或晶圆碎片放置在旋涂机的真空吸盘上，并使用旋涂机的测试功能确认晶圆的中心位置。在晶圆中心滴加一小滴光刻胶（直径约2.5 cm），然后以3000 rpm的转速旋转45秒。纤维在旋涂前后的图像见图8，显示纤维的几何形貌（高度、取向和间距）得以保持。由于纤维的存在，光刻胶会在纤维底部积聚，导致涂层厚度超过预期。其他研究团队已对垂直阵列碳纳米管（VACNF）生长后的旋涂工艺进行了探索11,18。
该流程中另一个至关重要的步骤是确保对 VACNF 芯片/薄膜施加适当大小的力。递送机制依赖于镊子在刚性基底上轻敲所产生的冲力，使纤维在细胞壁上形成微小穿孔6,7，或在柔性基底上使用迷你化妆涂抹头进行滚动实现。纤维可能会断裂并残留在植物细胞内6,7，但这并不影响最终结果；然而，仍需通过实践结合染料摄取和组织损伤的观察，以准确掌握施加的压力。此外，在使用 VACNF 芯片/薄膜递送 DNA 后，选择合适的成像时间点也十分重要，因为可检测表达的时间因植物物种及所递送载体类型的不同而有所差异7（图 16）。
尽管该方法在植物研究中具有广泛适用性，但仍存在一些局限性。例如，由于在SU-8表面添加了光刻胶保护层，向VACNF薄膜上沉积一层薄薄的二氧化硅并不总能使其完全变为亲水性。如果出现这一问题，可尝试在VACNF上施加更厚的二氧化硅层。为检测薄膜是疏水性还是亲水性，可将其置于水中观察：若薄膜下沉，则为亲水性；若漂浮，则为疏水性。此外，不同批次制备的纤维之间可能存在差异。在直流等离子体增强化学气相沉积（dc-PECVD）设备中生长纤维时，有多个参数可以调节；本方案中所述内容是针对两种不同量的Ni催化剂所设定的一组参数。另外，Ni催化剂的晶体取向无法控制28，且纤维中不可避免地会出现一定程度的分支结构。
本文中，我们利用刚性和柔性基底将荧光素染料和DNA递送至植物细胞，展示了该方法的应用。该方法还可广泛适用于其他生物分子和遗传修饰手段，例如在苹果或其他需要数年时间才能获得稳定转基因品系的果树系统中，可用于RNAi基因沉默。此外，这些纤维还可用于向植物递送基因编辑材料或实现稳定的遗传转化。

植物转化（包括瞬时转化和稳定转化）尚未在所有植物组织和物种中广泛实现。植物的瞬时转化是指将质粒中编码的基因暂时导入植物细胞，但这些基因不会稳定地整合到基因组中。传统方法如微粒轰击、农杆菌介导、电穿孔或聚乙二醇处理原生质体等，操作过程缓慢或较为繁琐。此外，这些方法并非适用于所有植物物种1,2,3,4。&#160;利用纳米材料递送DNA是一个新兴领域，目前仍处于发展初期5。已有研究表明，特定类型的纳米材料——碳纳米纤维，能够成功将蛋白质、葡聚糖和染料递送至植物叶片，且不会引发伤口反应6。本研究旨在提供一种利用碳纳米纤维这类纳米材料向植物递送生物分子或染料的详细实验方案。本文以DNA作为目标生物分子，实现多种植物器官中细胞的瞬时转化。
此前，Morgan 等人7证明了将碳纳米纤维固定在刚性硅基底上，可用于瞬时转化生菜、N. benthamiana 和杨树的叶片，以及拟南芥的叶片和根部。尽管在多种器官上均实现了转化，但纤维在曲面结构的植物组织（如根或果实）上更难施用。我们推测，若采用柔性基底承载纳米纤维，可能因其更贴合器官形状而提高递送效率。
本文详细介绍了用于制备和设计垂直排列碳纳米纤维（VACNFs）、将VACNFs转移至柔性基底，以及在刚性和柔性基底上将VACNFs应用于植物以递送生物分子和染料的方法。碳纳米纤维采用直流催化等离子体增强化学气相沉积法（dc C-PECVD）结合镍催化剂制备。镍催化剂点的位置、直径和高度通过电子束光刻、金属蒸发和剥离工艺的组合进行控制，具体方法如Melechko等人8,9所述。使用双层电子束抗蚀剂，可在基底上沉积更厚的镍催化剂，从而获得更长的纤维10。将纤维从刚性基底转移至柔性基底的方法基于Fletcher等人11所述方法的改进，当前方法无需使用非晶碳层或牺牲性光刻胶层。通过利用SU-8在欠烘焙和欠曝光条件下产生的固有拉伸应力，实现带有纤维转移的SU-8剥离12,13,14。SU-8是一种复杂的聚合物，天然具有疏水性，这使其在促进DNA递送方面的应用变得困难。为克服SU-8的疏水性，在将纤维嵌入SU-8后，我们通过原子层沉积法施加一层薄硅氧化物15。在刚性基底上应用纤维进行生物分子/染料递送时，采用Davern等人6所述的镊子轻敲所产生的冲击力，以及Morgan等人7所述的“芯片上”（on-plant）和“芯片内”（on-chip）方法。柔性VACNF薄膜应用于曲面植物表面时，首先采用Morgan等人7所述的“芯片内”方法，将DNA或染料液滴半干燥于薄膜表面，然后使用小型化妆涂抹工具将薄膜卷覆在曲面植物表面16,17。图1展示了将纤维应用于刚性和柔性基底并作用于植物的多种方法。

<table><tbody><tr><td>13&quot; x 13&quot; 白色1/4折重型Brawny工业用抹布，70片装</td><td>Fastenal&amp;nbsp;</td><td>690535</td><td></td></tr><tr><td>2-丙醇（IPA）&amp;nbsp;</td><td>Fischer Scientific</td><td>A451-4</td><td></td></tr><tr><td>4&quot; 盖子</td><td>Entegris</td><td>H22-401-0615</td><td>晶圆载具</td></tr><tr><td>4&quot; 托盘</td><td>Entegris</td><td>H22-40-0615</td><td>晶圆载具</td></tr><tr><td>Accretech SS10 切割锯</td><td>Accreteck</td><td>SS10</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Fischer Scientific</td><td>A18-4</td><td></td></tr><tr><td>ORNL洁净室中使用的丙酮</td><td>JT Baker</td><td>9005-05</td><td></td></tr><tr><td>苹果</td><td>杂货店</td><td>无产品编号</td><td></td></tr><tr><td>Arabidopsis thaliana&amp;nbsp;</td><td>来自芝加哥大学Jean Greenberg教授实验室的Columbia生态型种子</td><td>无产品编号</td><td></td></tr><tr><td>碳直流等离子体增强化学气相沉积设备</td><td>橡树岭国家实验室&amp;nbsp;</td><td>定制设备</td><td></td></tr><tr><td>Cobham Green生菜&amp;nbsp;</td><td>来自加州大学戴维斯分校Richard Michelmore教授实验室的种子</td><td>无产品编号</td><td>奶油生菜</td></tr><tr><td>荧光素染料</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2456-2.5G</td><td></td></tr><tr><td>凝胶盒&amp;nbsp;</td><td>Gel-Pak</td><td>&amp;nbsp;AD-23C-00-X4</td><td></td></tr><tr><td>Heidelberg DWL 66 直写光刻设备&amp;nbsp;</td><td>Heidelberg</td><td>DWL 66</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>美国国立卫生研究院&amp;nbsp;</td><td>无产品编号</td><td></td></tr><tr><td>ORNL洁净室中使用的异丙醇（IPA）</td><td>Doe and Ingalls</td><td>CMOS Grade 9079-05</td><td></td></tr><tr><td>JEOL 9300FS 100kV电子束光刻系统</td><td>JEOL</td><td>8100</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes擦拭纸</td><td>Kimtech</td><td>Kimberly-Clark Professional 34120</td><td></td></tr><tr><td>Kord-Valmark一次性聚苯乙烯培养皿</td><td>VWR</td><td>11019-554</td><td></td></tr><tr><td>Layout Editor&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;juspertor GmbH</td><td>无产品编号&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>LSM 710共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td>无产品编号</td><td></td></tr><tr><td>LSM 800共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td>无产品编号</td><td></td></tr><tr><td>化妆用涂抹棒&amp;nbsp;</td><td>Amazon</td><td>G2PLUS</td><td>500支装一次性微型涂抹刷，适用于化妆和个人护理（刷头直径：1.5 mm）- 5 x 100支</td></tr><tr><td>Merlin场发射扫描电子显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Merlin</td><td></td></tr><tr><td>MIBK/IPA&amp;nbsp;（甲基异丁基酮/异丙醇）（1:3）</td><td>Microchem</td><td>M089025</td><td></td></tr><tr><td>洋葱</td><td>杂货店</td><td>无产品编号</td><td></td></tr><tr><td>Oxford FlexAl原子层沉积设备</td><td>Oxford</td><td>FlexAl</td><td></td></tr><tr><td>PMMA 495 A4</td><td>Microchem</td><td>M130004</td><td></td></tr><tr><td>PMMA 950 A4</td><td>Microchem</td><td>M230004</td><td>可稀释至A2</td></tr><tr><td>聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）</td><td>Amazon</td><td>KS-6304-21-11</td><td>D型透明PET（聚酯）片材，厚度0.0005&quot;，宽度27&quot;，长度10英尺，1片</td></tr><tr><td>精密镊子</td><td>Aven Inc.&amp;nbsp;</td><td>18032TT</td><td></td></tr><tr><td>pUBQ10:YFP-GW</td><td>拟南芥生物资源中心</td><td>CD3-1948</td><td></td></tr><tr><td>硅刻蚀机（用于去残胶）&amp;nbsp;</td><td>Oxford</td><td>Plasmalab</td><td></td></tr><tr><td>硅橡胶套件</td><td>Smooth-On Inc</td><td>Ecoflex 00-20</td><td></td></tr><tr><td>硅晶圆</td><td>Pure Wafer</td><td>4N0.001-.005SSP-INV</td><td></td></tr><tr><td>旋涂仪</td><td>Brewer Sciences</td><td>Model 100CB</td><td></td></tr><tr><td>SPR 955cm 0.7&amp;nbsp;</td><td>Megaposit</td><td>10018314</td><td></td></tr><tr><td>草莓</td><td>杂货店</td><td>无产品编号</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2015</td><td>Microchem</td><td>SU-8 2000系列</td><td>有毒。操作时需小心。处理SU-8 2000系列光刻胶时应佩戴化学护目镜、化学手套和适当的防护服。避免接触眼睛、皮肤或衣物。</td></tr><tr><td>SU-8显影液</td><td>Microchem</td><td>SU-8 2000系列</td><td>操作时需小心。处理SU-8 2000系列光刻胶时应佩戴化学护目镜、化学手套和适当的防护服。避免接触眼睛、皮肤或衣物。</td></tr><tr><td>Suss MicroTec接触式光刻对准仪</td><td>Suss MicroTec</td><td>MA6/BA6</td><td></td></tr><tr><td>台式显微镜</td><td>Phenom XL</td><td>用于金属沉积后检查镍催化剂</td><td></td></tr><tr><td>Thermionics VE-240电子束蒸发仪</td><td>Thermionics</td><td>VE-240</td><td></td></tr></tbody></table>

利用刚性或柔性基底上的垂直排列碳纳米纤维阵列向植物递送生物分子和染料

Using Vertically Aligned Carbon Nanofiber Arrays on Rigid or Flexible Substrates for Delivery of Biomolecules and Dyes to Plants

将生物分子和不可渗透性染料递送至完整植株是一项重大挑战。纳米材料是向植物递送DNA的新兴工具。尽管这些新工具前景广阔，但其应用仍不广泛。在刚性基底（支撑材料）上制备的纳米材料尤其难以成功应用于弯曲的植物结构。本研究描述了微加工垂直排列碳纳米纤维阵列并将其从刚性基底转移至柔性基底的过程。我们详细阐述并演示了这些纤维（无论位于刚性或柔性基底上）如何用于植物的瞬时转化或染料（例如荧光素）递送。我们展示了如何将垂直排列的碳纳米纤维（VACNFs）从刚性硅基底转移至柔性SU-8环氧树脂基底，从而形成柔性VACNF阵列。为克服SU-8的疏水性，我们在柔性薄膜中的纤维表面包覆了一层薄的二氧化硅层（2–3 nm）。为了将这些纤维用于向弯曲植物器官递送物质，我们在VACNF薄膜的纤维侧滴加1 µL的染料或DNA溶液，静置10分钟，然后将薄膜贴附于植物器官表面，并使用棉签以滚动方式推动纤维进入植物细胞。通过该方法，我们已成功实现了对具有弯曲表面的植物器官进行染料和DNA递送。

本文介绍了垂直排列碳纳米纤维（VACNFs）的微加工方法、将VACNFs转移至柔性基底的技术，以及在刚性和柔性基底上将VACNFs应用于植物以实现生物分子和染料递送的方法。

向完整植株递送生物分子和不可渗透染料是一项重大挑战。纳米材料是用于DNA递送的新兴工具，可……

我们正在尝试展示一种利用碳纳米纤维阵列将染料或DNA递送至植物的通用方法。许多植物对传统转化方法具有抗性。我们的方法可通过在柔性刚性基底上使用碳纳米纤维阵列来解决这一问题。我们的技术快速且易于操作，几乎可应用于任何植物物种或植物器官。此外，该技术还可用于递送其他试剂，如染料和蛋白质。首先制备垂直排列的碳纳米纤维（VACNFs）。为了将VACNFs转移至柔性基底，先将单个芯片放入丙酮中，以分离柔性基底与刚性基底。随后用异丙醇（IPA）清洗SU-8薄膜5分钟，再用水清洗5分钟。运输芯片时，将其放置在带有粘性垫的商用盒中。通过混合双组分试剂盒中的弹性体和交联剂，制备硅橡胶 PET 持架。剪裁一块方形 PET 膜，并用胶带固定在透明塑料培养皿中。然后，在 PET 表面浇注一层非常薄的硅橡胶，并在 80 摄氏度下固化 1 至 2 小时。使用镊子将 SU-8 薄膜转移至 PET 持载片上，将 SU-8 薄膜无纤维的一面置于硅橡胶上。按压 SU-8 方片的边缘，以帮助其粘附在硅橡胶 PET 上，并避免纤维断裂脱落。然后，在SU-8薄膜的纤维一侧滴加1微升染料液滴，并静置干燥10分钟。干燥后，使用一对尖头镊子将VACNF薄膜放置在植物表面。接着，用一个小的化妆品涂抹头轻轻滚压VACNF薄膜，并用软头标记笔标记出柔性基底所放置的区域。然后，使用胶带将柔性基底从植物表面取下。对照组需重复进行VACNF处理，例如将染料施加到薄膜无纤维的一侧、使用不含染料的薄膜，或使用薄膜的无纤维侧。片上方法被用于将荧光素染料递送至曲面，例如草莓表面，其中立即观察到强烈的荧光素信号。而在苹果中，经过两小时递送后观察到强烈的荧光素信号。类似地，含有黄色荧光蛋白的质粒也在苹果中实现了递送。此外，通过使用VACNF薄膜递送含有黄色荧光蛋白的质粒，成功实现了洋葱的瞬时转化。首先，用100%丙酮清洗VACNFs五分钟，以去除光刻胶，随后用100%异丙醇清洗五分钟，再用双蒸水清洗五分钟。然后，将待穿刺的植物组织放置在坚硬的表面上以提供支撑。在植物组织表面放置一滴1微升的染料。将带有刚性基底的VACNF芯片置于液滴顶部，调整纤维方向，使其与液滴接触。使用镊子的平坦面轻敲芯片，用软头标记笔标记芯片接触植物的区域。递送完成后移除VACNF芯片。对对照组重复这些步骤，例如将染料置于薄膜无纤维的一侧、使用不含染料的薄膜，以及使用薄膜的无纤维侧。将完整的植物或离体植物器官置于长日照条件下的湿润培养箱中保存。对于离体器官，使用底部铺有湿润滤纸的塑料培养皿。利用该方法，将荧光素染料递送至拟南芥叶片中。在不同时间点拍摄的图像显示，荧光素染料在递送后立即被观察到。类似地，含有黄色荧光蛋白的质粒也成功递送至拟南芥叶片中。

using-vertically-aligned-carbon-nanofiber-arrays-on-rigid-or-flexible

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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