Name: 基于气相色谱-质谱的硬珊瑚样品靶向代谢组学研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 了解基于气相色谱-质谱的硬珊瑚靶向代谢组学方法，用于分离分析珊瑚宿主组织与虫黄藻细胞组分。该技术有助于揭示珊瑚共生体代谢互作机制，为珊瑚礁保护与修复研究提供重要生物标志物检测手段。

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J.L.M. 获得了悉尼科技大学校长研究奖学金的支持。

注意：实验设计、样品采集与保存已在其他文献中详细描述2,30,31。在采集和实验前，必须获得采集野生珊瑚的许可批准。本研究所用样品采自 Batavia Coral Farms（西澳大利亚杰拉尔顿）进口的Montipora mollis（绿色色型）珊瑚群体，原始采集地点为阿布罗略斯群岛附近海域（西澳大利亚；28°52'43.3&#34;S 114°00'17.0&#34;E），水深1米，采集依据水产养殖许可证AQ1643。取样前，珊瑚群体在800 L水族箱中驯养3个月，条件为盐度35 PSU、蓝白光光照强度150 µmol photons·m−2·s−1、温度25 °C ± 0.5 °C。珊瑚片段（约5 cm2，N = 6）经液氮速冻后，于−80 °C保存直至处理。
1. 提取溶液和设备的准备
<ol>
	<li>至少在珊瑚组织取样前1天，准备好提取溶液和设备。</li>
	<li>将超纯水在洁净、无洗涤剂的玻璃器皿中预冷至4℃ &#176;C.</li>
	<li>将100%色谱级甲醇与10 &#181;g&#183;mL−1 适当内标物的终浓度（例如， 13C6 山梨醇</li>
	<li>使用等体积的100%色谱纯甲醇和超纯水配制50%甲醇提取液。将甲醇溶液于−20℃保存。 &#730;C. 
	注意：为帮助防止代谢物降解，建议将样品处理步骤以每批五个珊瑚碎片为一组进行操作&#160;一次处理一个样本，并额外设置一个生物学空白对照（仅水）（总样本数&#160;N = 6）。一旦每个珊瑚样本被分离为两个组分（珊瑚宿主组织，此后简称 &#34;宿主&#34;，以及微藻细胞，此后简称 &#34;共生体&#34;，每个处理批次的样本总数为12。</li>
</ol>
2. 珊瑚代谢淬灭
注意：实验设计、样品采集与保存已在其他文献中详细描述2,30,31。但需注意，终止代谢所需的时间（即珊瑚样品采集至保存之间的时间）对于捕获原始生理响应至关重要30。采集样品后应尽快保存，以防止因样品降解或非靶向的生理反应导致代谢物组成发生变化32。
<ol>
	<li>将珊瑚片段放入无菌样品采集袋中，尽可能排干多余的海水。将样品浸入液氮中至少30秒。尽快将样品转移至−80 ˚C超低温冰箱中保存。 
	注意：样品可在避光容器中于−80°C冷冻保存直至处理，避免反复冻融。</li>
</ol>
3. 从骨骼上移除珊瑚组织
注意：样品应始终置于冰上（4 °C），以确保其保持液态并防止持续的代谢活动。
<ol>
	<li>将一个洁净且无菌的样品采集袋放在冰上，确保袋子稳定并开口朝上置于浅槽中的冰面上，但不要浸入冰中。向袋中加入 10 mL 冷的（4 ˚C）超纯水。 
	注意：这有助于避免因冷压缩空气和周围冰块导致珊瑚碎片反复冻融。</li>
	<li>使用无菌镊子选取一段珊瑚碎片，用无菌巴斯德移液管吸取冷的（4 ˚C）超纯水冲洗，直至无海水残留。将冲洗后的珊瑚碎片浸入装有 10 mL 超纯水的袋子中。 
	注意：此冲洗步骤至关重要，可去除可能干扰后续分析的残余盐分。避免通过袋子用手接触水或珊瑚碎片，以保持样品处于 4 ˚C。</li>
	<li>用绝缘胶带将无菌的 1 mL 移液器吸头固定在气动喷枪末端，并将吸头末端剪去约 5 mm（图 1A）。</li>
	<li>将气动喷枪对准珊瑚碎片，袋子半封闭，气流调至低至中等，使水流在珊瑚碎片表面形成环形运动，从而轻柔地去除组织。</li>
	<li>约 3 分钟后，或当所有组织似乎已从骨骼上脱离时，关闭气源，移开喷枪。将袋子完全密封。</li>
	<li>将所有脱离的珊瑚组织挤压至袋子的一个底部角落。剪掉对角的另一角落，轻轻将袋内内容物倒入置于冰上的 15 mL 离心管中。</li>
</ol>
4. 可选的匀浆步骤
注意：某些珊瑚物种比其他物种更具黏性，这意味着气动刷洗会以团块而非匀浆的形式去除组织。如果在气动刷洗的匀浆中可见组织团块，可对所有样品在 4 °C 下增加一个匀浆步骤。
<ol>
	<li>用 4 ˚C 的 70% 甲醇清洗机械锯齿式匀浆器两次，最后用 4 °C 超纯水清洗。</li>
	<li>在 15 mL 离心管中匀浆珊瑚样品约 1 分钟，直至样品完全匀浆且无可见团块。</li>
	<li>每个样品之间均按照步骤 4.1 的方法清洗匀浆器。保持各样品间的匀浆时间一致。</li>
</ol>
5. 用于归一化的样品采集
<ol>
	<li>从匀浆组织中取出1,000 µL等分试样，用于Symbiodiniaceae细胞计数、珊瑚宿主组织蛋白质含量分析以及叶绿素a含量测定。在−20 ˚C下保存，待分析时使用（第10节）。</li>
</ol>
6. 可选的珊瑚宿主组织-虫黄藻细胞分离
<ol>
	<li>将珊瑚匀浆在2,500 × g下离心 &#215; g 4℃下离心5分钟 &#176;使用预冷的离心机。 
	注意：此转速最适合将较重的虫黄藻细胞与悬浮在上清液中的宿主组织分离，同时保持虫黄藻细胞壁的完整性。</li>
	<li>移除含有宿主物质的上清液，并转移至新的15 mL离心管中。 
	注意：宿主组织中的脂质通常在虫黄藻细胞顶部形成一层较窄的粉红色/白色层。该层可与可溶性宿主上清液一并收集。 通过 移液图1B).</li>
	<li>剧烈涡旋震荡宿主样品，精确持续1分钟。将藻类沉淀样品和宿主上清液样品置于冰上保存。</li>
	<li>加入 2 mL 4 ℃的超纯水 &#176;将 C 加入藻类沉淀中。剧烈涡旋振荡恰好 2 分钟以重悬沉淀。 
	注意：如果未从珊瑚群体中采集1 cm的个体片段用于Symbiodiniaceae基因分型，则可取200 &#181;可在此处收集一份 Symbiodiniaceae 细胞悬液的等分试样，用首选的 DNA 缓冲液保存，并按照 Thurber 等人的描述进行储存。30 用于 Symbiodiniaceae 基因分型（例如，参照 González-Pech 等人）12).</li>
	<li>重复步骤 6.1–6.4&#160;再次地。 
	注意：宿主与共生体的可靠分离取决于珊瑚生物量和物种，因为某些物种可能比其他物种更具黏性。建议至少进行三次洗涤步骤，但可根据分离效果适当增加洗涤次数。重复步骤 4.7–4.9，直至在宿主组分底部观察不到 Symbiodiniaceae 细胞，且 Symbiodiniaceae 组分明显无宿主物质（例如，顶部无白色层）为止。图1).</li>
	<li>移除含有宿主物质的上清液，并转移至新的15 mL离心管中。</li>
	<li>将共生体沉淀保留在15 mL离心管中。</li>
</ol>
7. 样品干燥
<ol>
	<li>将珊瑚全共生体匀浆或分离后的宿主与虫黄藻组分分别在−80 ℃下冷冻 &#176;在−85 °C、0.01 mbar真空条件下冷冻干燥样品约120分钟，过夜。 &#730;C. 
	注意：为避免冻干过程中样品损失，建议使用从另一支无菌管上剪下的管盖或无菌封口膜，并用无菌的25 G针头小心穿刺出一个直径约2 mm的小孔。</li>
	<li>干燥后，使用实验室天平，分别称取以下样品之一：1）25 mg 全共生体；2）15 mg 共生藻组分；或 3）每个样品的 30 mg 宿主组织，置于不含增塑剂的 2 mL 塑料微量离心管中。 
	注意：关键步骤：优化提取所需的生物量至关重要，以确保在保证足够信号强度的同时，避免GC-MS超载。干燥的珊瑚材料静电较强。为防止样品损失，应使用防静电装置消除样品及称量容器上的静电。一种简单且经济的替代方法是在样品管下方放置一张衣物柔顺纸。可使用无菌刀片将干燥的共生藻沉淀切割至所需重量。</li>
</ol>
8. 胞内代谢物提取
<ol>
	<li>从冻干的全共生体中提取胞内代谢物：
	<ol>
		<li>向每支试管中加入 400 µL 冰冷（−20 ˚C）的 100% 甲醇，并加入内标物（IS；13C6 山梨醇和/或 13C5-15N 缬氨酸，浓度为 10 µM）。</li>
		<li>向每个样品中加入少量经酸洗处理的玻璃珠（710–1,180 µm，约 10 mg）。将样品置于预冷（−20 ˚C）的珠磨仪插槽中，在 50 Hz 条件下震荡 3 分钟。</li>
		<li>向每支试管中再加入 600 µL 冰冷（−20 ˚C）的 100% 甲醇，并含内标物（13C6 山梨醇和/或 13C5-15N 缬氨酸，浓度为 10 µM）。</li>
		<li>涡旋混匀 1 分钟，随后在 4 ˚C 下置于旋转摇床中孵育 30 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从分离的冻干虫黄藻细胞中提取胞内代谢物：
	<ol>
		<li>向干燥的虫黄藻材料中加入 200 µL 冰冷（−20 ˚C）的 100% 甲醇，并含内标物（13C6 山梨醇和/或 13C5-15N 缬氨酸，浓度为 10 µM）。</li>
		<li>加入少量经酸洗处理的玻璃珠（710–1,180 µm，约 10 mg），将样品置于预冷（−20 ˚C）的珠磨仪插槽中，在 50 Hz 条件下震荡 3 分钟。</li>
		<li>再加入 800 µL 冰冷（−20 ˚C）的 100% 甲醇（含内标物），涡旋 30 秒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从分离的冻干宿主组织中提取胞内代谢物：
	<ol>
		<li>向干燥的宿主材料中加入 1 mL 含内标物（13C6 山梨醇和/或 13C5-15N 缬氨酸，浓度为 10 µM）的冰冷（−20 ˚C）液相色谱级甲醇。</li>
		<li>涡旋混匀 20 秒，随后将样品置于浮式试管架中，在 4 ˚C 条件下的超声水浴中处理 30 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. 代谢物提取物的纯化
<ol>
	<li>在 4 °C 条件下，以 3,000 × g 离心样品（全共生体/宿主/共生体）30 分钟。</li>
	<li>将所有上清液转移至新的 2 mL 微量离心管中，注意不要扰动细胞碎片沉淀。 
	注意：此为中等极性提取物。可暂时置于冰上，但长期储存需在避光条件下保存于 −80 ˚C。</li>
	<li>向剩余的细胞碎片中加入 1,000 µL 预冷（−20 ˚C）的 50% 甲醇，剧烈涡旋 1 分钟以充分重悬。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 3,000 × g 离心样品 30 分钟。</li>
	<li>收集上清液（极性提取物），并与同一样品的中等极性提取物合并。 
	注意：细胞碎片可保存于 −80 ˚C，用于后续蛋白质含量归一化（第 11 节）。</li>
	<li>将合并后的提取物在 16,100 g 离心 15 分钟，以去除所有沉淀物，然后将上清液转移至新的无增塑剂微量离心管（2 mL）中。 
	注意：样品提取物可在避光条件下保存于 −80 ˚C。</li>
	<li>准备分析时，取 50 µL 每种提取物加入玻璃进样小瓶中，使用真空浓缩仪在 30 ˚C 浓缩 30 分钟。重复此步骤四次（共获得 250 µL 干燥提取物）。 
	注意：干燥后的样品可在干燥剂条件下室温保存，直至分析。</li>
</ol>
10. 代谢物衍生化
注意：采用两步在线衍生化过程对极性代谢物进行甲氧基化和三甲基硅烷化。
<ol>
	<li>向每个样品中加入 25 µL 甲氧胺盐酸盐（吡啶溶液，30 mg/mL）。</li>
	<li>在设定为 750 rpm 的恒温振荡器中，于 37 °C 振荡反应 2 小时。</li>
	<li>向每个样品中加入 25 µL N,O-双(三甲基硅基)三氟乙酰胺 + 三甲基氯硅烷。</li>
	<li>再次于 37 °C、750 rpm 条件下振荡 1 小时。</li>
	<li>将样品在室温下平衡 1 小时，然后以 1:10 分流比进样 1 µL 至气相色谱仪中。</li>
</ol>
11. 气相色谱-质谱分析
注意：应使用三（全氟丁基）胺（CF43）根据制造商的推荐对质谱仪进行调谐。
<ol>
	<li>使用超纯氦气作为载气，保持色谱柱恒定流速为 1 mL/min。</li>
	<li>使用长度为 30 m 的 DB-5 色谱柱，固定相膜厚度为 1 µm，内径为 0.25 mm。</li>
	<li>气相色谱炉程序
	<ol>
		<li>将进样口温度设为 280 °C。</li>
		<li>从进样开始，初始炉温为 100 °C，保持 4 分钟。</li>
		<li>以 10 °C/min 的速率升温至 320 °C，然后保持 11 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>质谱仪参数
	<ol>
		<li>将质谱传输线温度设为 280 °C，离子源温度设为 200 °C。</li>
		<li>使用氩气作为碰撞池气体，以生成多反应监测（MRM）产物离子。</li>
		<li>根据包含 MRM 目标的分段时间段 MRM 谱库，实现代谢物的检测。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
12. Symbiodiniaceae 细胞计数、珊瑚宿主组织蛋白含量分析及叶绿素 a 含量测定
<ol>
	<li>Symbiodiniaceae 细胞计数：
	<ol>
		<li>取一份珊瑚组织匀浆。</li>
		<li>将样品在 2,000 × g 离心 &#215; g 以沉淀藻类。</li>
		<li>移除约 200 &#181;将藻类沉淀物中的上清液转移至新的微量离心管中。 
		注意：此蛋白样品将用于数据归一化；于 −20 ℃ 保存 &#730;必要时，在分析前进行 C。</li>
		<li>将藻类沉淀物通过轻轻吹打重悬于1 mL过滤海水中。如有必要，稀释藻类悬液以方便细胞计数。</li>
		<li>使用血细胞计数板在光学显微镜下进行细胞计数，加入10 &#181;将L加入其中一个室。每个样本完成8-10次计数。 
		注：若有条件，也可采用其他方法对藻细胞进行计数（如流式细胞术、高通量共聚焦显微镜）。</li>
		<li>计算共生细胞的浓度（mL−1），并考虑所用的任何稀释因子。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白质含量测定
	<ol>
		<li>定量样品蛋白质含量（例如， 通过 Bradford 比色法，最初由 Bradford 等人描述33，或Lowry法34,35，该方案已在其他地方针对刺胞动物进行过描述36).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>叶绿素 a 提取
	<ol>
		<li>使用约 200,000 个细胞的细胞沉淀，冷冻或新鲜均可。</li>
		<li>将每个藻类沉淀转移至含有2 mL二甲基甲酰胺（DMF）的玻璃闪烁瓶中，避光并在4℃下孵育 &#730;48 小时，4 °C 
		注意：DMF 具有剧毒且为致癌物，因此样品制备必须在尽可能避光的通风橱内并在冰上完成。如果有 &#60;200,000 个细胞，使用更少的 DMF。</li>
		<li>离心3分钟，16,000 × g &#215; g.</li>
		<li>将200 mL转移至UV-96孔板中用于光度测量。每个样品设三个重复，以DMF作为空白对照。</li>
		<li>在波长（E）663.8 nm、646 nm 和 750 nm 处测定吸光度。将其他两个波长处的吸光度分别减去 750 nm 处的吸光度。 
		注意：在750 nm处测量可校正样品中任何散射或浊度的影响。</li>
		<li>计算叶绿素 a 浓度（&#181;g/mL）使用公式（1): 
		叶绿素 a 浓度&#181;g/mL) = (12.00 &#215; E663.8) - (3.11 &#215; E646.8)&#160; &#160; (1)</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
13. 代谢物提取后用于归一化的细胞生物量定量
注意：以下介绍了两种细胞生物量定量方法：一种是采用改良的布拉福德比色法测定与生物量相关的蛋白质含量，另一种是测定细胞残渣的干重。这两种方法均可用于准确测定细胞生物量。
<ol>
	<li>细胞碎片中的蛋白质含量
	<ol>
		<li>用1 mL 0.2 M NaOH重悬冷冻的细胞碎片，将样品在98℃下孵育 &#730;C，20 分钟。</li>
		<li>将样品置于冰上冷却约10分钟，然后在3,000 × g下离心 &#215; g 在常温下离心5分钟。</li>
		<li>定量样品蛋白质含量（例如， 通过 Bradford 比色法，最初由 Bradford 等人描述33 并由 Smart 等人进行了修改37).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞碎片干重的测定
	<ol>
		<li>将胞内代谢物提取所得的细胞碎片重悬于双蒸水（约10 mL）中。</li>
		<li>使用预称重的膜滤器（0.22 μm）在真空条件下过滤溶液 &#181;m 孔径，47 mm</li>
		<li>用超纯水将含有生物量的离心管清洗两次，以确保生物量完全转移至膜滤器上。</li>
		<li>移除含有生物量的膜滤器，并使用微波炉干燥（低功率；约250 W，20分钟）。</li>
		<li>将滤纸置于干燥器中过夜。记录滤纸的干重，并通过从总重量中减去干燥膜滤器的重量（使用与样品滤纸一同干燥的洁净干燥膜滤器）来计算生物量的干重。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
14. 数据分析
<ol>
	<li>使用代谢物数据库分析代谢物目标，其中每个目标由一个定量离子和定性离子的多反应监测（MRM）组成。</li>
	<li>目视检查检测到的代谢物目标，并根据需要进行手动积分。</li>
	<li>使用代谢物峰面积计算每组各样本中各代谢物的相对丰度。数值经空白校正后，先归一化至样品内标峰面积，再归一化至样品细胞碎片蛋白含量。 每 Smart 等37.</li>
	<li>弃去所有处理组中相对标准偏差大于35%的代谢物N = 23 种代谢物</li>
	<li>对数据进行转换（如立方根变换），并进行均值中心化；验证数据是否符合正态分布及方差齐性。</li>
	<li>进行数据分析（方差分析和热图构建；例如，使用 https://www.metaboanalyst.ca）38使用“cluster”、“factoextra”和“klustR”软件包对样本进行聚类分析，以考察处理组内的变异情况。计算间隙统计量（gap statistic），该方法用于确定最优聚类数目39）使用 &#34;clusGap&#34; R 中的函数及使用 R 软件包绘图 &#34;tidyverse&#34;使用 PERMANOVA 分析处理组间代谢物谱分离的显著性（例如，在 Primer 中进行）。</li>
</ol>

Metabolite Profiling of Hard Coral Samples Using GC-MS

作者声明无利益冲突。

宿主与共生体的分离可轻松且快速地实现 通过 简单的离心分离，此处结果表明，分离不同组分可提供有价值的信息，用以指示珊瑚全共生体中特定成员的贡献，从而有助于珊瑚健康的功能分析。在成体珊瑚中，脂质合成主要由定居的共生藻类完成40，提供脂质（例如，三酰甘油和磷脂）41 以及能够促进应激恢复的脂肪酸11,42在共生体中丰度较高的13种代谢物 与 本研究中的宿主特征谱包含9种脂肪酸，包括在珊瑚-虫黄藻共生关系中参与跨生物界应激信号传导的具有重要生物学意义的二十碳五烯酸（DHA，C22:6[ω-6]）、二十碳五烯酸（EPA，C20:5[ω-6]）和花生四烯酸（ARA，C20:4[ω-6]）9,10肌醇磷酸在多种细胞功能中发挥关键作用，包括细胞生长、凋亡、内吞作用和细胞分化。在共生功能障碍...

代谢物是细胞过程的终产物，而代谢组学——研究特定生物体或生态系统所产生的全套代谢物——能够直接反映生物体的功能状态1。这一点对于探索生态系统、共生相互作用以及恢复工具尤为重要，因为大多数管理策略的目标都是保护（或恢复）特定的生态系统服务功能2。珊瑚礁是一种水生生态系统，展示了代谢组学在阐明共生关系以及将珊瑚生理响应与群落水平和生态系统水平的影响相联系方面的潜在价值3。高通量气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）的应用尤其受到重视，因其能够同时快速分析多种类代谢物，具有高选择性和高灵敏度；在有谱图数据库可用时可实现快速化合物鉴定；并且具有高度的可重复性和准确性，且每样本检测成本相对较低。
珊瑚是全共生体，由珊瑚动物、光合作用的甲藻内共生体（科：Symbiodiniaceae4）以及复杂的微生物组5,6组成。总体而言，全共生体的适应性主要通过小分子和元素的交换来维持，以支持各成员的代谢功能7,8,9,10。代谢组学方法已被证明在阐明珊瑚共生特异性9,11、热应激引起的白化反应7,8,12,13、疾病响应14、污染物暴露响应15、光适应16以及化学信号传导17等方面特别有效，同时也助力于生物标志物的发现18,19。此外，代谢组学还可为基于DNA和RNA技术所得出的结论提供有价值的验证9,20。因此，代谢组学在评估珊瑚礁健康状况和开发珊瑚礁保护工具方面具有巨大潜力3，例如通过检测应激的代谢生物标志物18,19，以及评估主动管理策略（如营养补充）的可行性21。
将宿主细胞与共生细胞分离，并分别分析它们的代谢物谱，而不是将全共生体（holobiont）作为一个整体进行分析，能够更深入地揭示共生双方的相互作用、各自独立的生理与代谢状态，以及潜在的分子适应机制11,12,22,23,24。如果不将珊瑚与其共生的Symbiodiniaceae藻类分离，则几乎无法独立解析珊瑚和/或Symbiodiniaceae各自的代谢贡献与代谢过程，除非借助复杂的基因组重建和代谢建模方法25，但该方法尚未应用于珊瑚-甲藻共生体系。此外，试图从全共生体的代谢物谱中推断宿主或藻类共生体各自的代谢信息，可能导致错误解读。
例如，直到最近，人们认为珊瑚和全共生体组织提取物中存在C18:3n-6、C18:4n-3和C16多不饱和脂肪酸，这些成分源自藻类共生体，因为珊瑚被认为缺乏合成omega-3（ω3）脂肪酸所必需的ωx去饱和酶；然而，近期的基因组证据表明，多种刺胞动物具备合成ω3多不饱和脂肪酸（PUFA）的能力 从头合成 并进一步生物合成ω3长链多不饱和脂肪酸26结合气相色谱-质谱法与稳定同位素标记（例如， 13C-碳酸氢钠，NaH13CO3可用于在对照条件及对外部胁迫的响应中，追踪光合作用固定的碳在珊瑚全生物体代谢网络中的去向27,28然而，追踪过程中的一个关键步骤是 13珊瑚组织与藻类细胞分离后，才能确定C的命运 13珊瑚宿主组分中检测到的C标记化合物可明确归因于由共生虫黄藻（Symbiodiniaceae）产生并转运至珊瑚的代谢物，或为已转运的标记化合物的下游代谢产物。该技术已展现出其重要价值，通过实验证据挑战了长期以来认为甘油是光合产物从共生体向宿主转运主要形式的假设。29，以及阐明在白化过程中伙伴间的营养流动如何变化27,28 以及对不相容的Symbiodiniaceae物种的响应11.
尽管组织分离的决定主要取决于研究问题，但该方法的可行性、可靠性及其潜在的代谢影响也需加以考虑。本文提供了从全共生体以及分别从宿主和共生体组分中提取代谢物的详细且经示范的方法。我们分别比较了宿主与共生体的代谢物谱，并分析了这些代谢物谱与全共生体代谢物谱之间的异同。

<table><tbody><tr><td>100% 色谱级甲醇</td><td>Merck</td><td>439193</td><td>色谱级必需品</td></tr><tr><td>2 mL 聚丙烯微量离心管</td><td>Eppendorf</td><td>30121880</td><td>聚丙烯材料具有高耐化学性、机械应力和极端温度的能力</td></tr><tr><td>2030 岛津气相色谱仪</td><td>Shimadzu</td><td>GC-2030</td><td></td></tr><tr><td>710–1180 &amp;micro;m 酸洗玻璃珠</td><td>Merck</td><td>&lt;br/&gt; G1152</td><td>该尺寸最适合破碎虫黄藻细胞</td></tr><tr><td>AOC-6000 Plus 多功能自动进样器</td><td>Shimadzu</td><td>AOC6000</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 试剂</td><td>Merck</td><td>B6916</td><td>任何蛋白质比色试剂均可接受</td></tr><tr><td>压缩空气枪</td><td>Ozito</td><td>6270636</td><td>类似设计可接受，关键是要有适配器可安装1 mL吸头</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;内径0.25 mm、膜厚1 &amp;micro;m 的DB-5色谱柱</td><td>Agilent</td><td>122-5013</td><td></td></tr><tr><td>DMF</td><td>Merck</td><td>RTC000098</td><td></td></tr><tr><td>D-山梨醇-6-&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C 和/或 &lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;&amp;ndash;&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N 缬氨酸</td><td>Merck</td><td>605514/ 600148</td><td>可将其中一种或两种内标加入甲醇中</td></tr><tr><td>平底96孔板</td><td>Merck</td><td>CLS3614</td><td></td></tr><tr><td>玻璃闪烁瓶</td><td>Merck</td><td>V7130</td><td>20 mL，带非塑料密封盖</td></tr><tr><td>免疫球蛋白G</td><td>Merck</td><td>56834</td><td>若无法获得，可使用牛血清白蛋白替代</td></tr><tr><td>引物</td><td></td><td>v4</td><td></td></tr><tr><td>R</td><td></td><td>v4.1.2</td><td></td></tr><tr><td>岛津LabSolutions Insight软件</td><td></td><td>v3.6</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Merck</td><td>S5881</td><td>制成1 M溶液用的颗粒</td></tr><tr><td>tidyverse</td><td></td><td>v1.3.1</td><td>R语言程序包</td></tr><tr><td>TissueLyser LT组织研磨仪</td><td>Qiagen</td><td>85600</td><td>或类似设备</td></tr><tr><td>TQ8050NX三重四极杆质谱仪</td><td>Shimadzu</td><td>GCMS-TQ8050 NX</td><td></td></tr><tr><td>紫外透光96孔板</td><td>Greiner</td><td>M3812</td><td></td></tr><tr><td>Whirl-Pak样品袋</td><td>Merck</td><td>WPB01018WA</td><td>样品采集袋；尺寸：足以容纳约5 cm的珊瑚碎片，但不宜过大以免水体过于分散</td></tr></tbody></table>

基于气相色谱-质谱法的硬珊瑚样品靶向代谢组学

Gas Chromatography-Mass Spectrometry-Based Targeted Metabolomics of Hard Coral Samples

基于气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）的方法已被证明在阐明刺胞动物-甲藻共生关系的代谢基础以及珊瑚对胁迫（例如温度升高引起的白化）的响应方面具有强大能力。对珊瑚全共生体（包含刺胞动物宿主及其相关微生物，如共生甲藻和其他原生生物、细菌、古菌、真菌和病毒）进行的稳态代谢物谱分析，已在常温和胁迫条件下成功应用，以表征珊瑚整体的代谢状态。
然而，要解答有关共生相互作用的问题，必须独立分析珊瑚宿主及其藻类共生体的代谢物谱，而这只能通过物理分离和组织分离来实现，随后进行独立的提取与分析。尽管代谢组学在珊瑚研究领域中的应用相对较新，但研究团队的持续努力已推动了珊瑚代谢物分析的稳健方法的发展，包括珊瑚宿主组织与藻类共生体的分离技术。
本文提供了一种全共生体分离及用于气相色谱-质谱（GC-MS）分析的代谢物提取的逐步操作指南，包括需要考虑的关键优化步骤。我们展示了在分别分析后，两个组分（珊瑚和虫黄藻）的联合代谢物谱与整体（全共生体）的代谢物谱相似；但通过分离组织，我们还能获得关于两个共生伙伴之间代谢过程及其相互作用的关键信息，而这些信息仅通过整体样本无法获取。

本研究产生的所有数据均可在补充信息中获取。
宿主-共生体分离
<img alt="注射器、离心管及共生体研究的荧光分析；实验装置如图所示。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65628/65628fig01.jpg" data-altupdatedat="1788840098000" data-alt="图1"> 
图1珊瑚宿主组织与共生甲藻细胞分离的建立与验证 (A用于从珊瑚骨骼上清除珊瑚组织的气枪装置。用电气胶带将移液器吸头固定在气枪上，并从吸头末端切下约5 mm的小段，以允许更多空气逸出，同时避免吸头脱落。B) 全共生体以及分离的宿主组织（上清液）和虫黄藻细胞（沉淀）示例。数值表示离心步骤的次...

本文介绍了从珊瑚全共生体以及分离的珊瑚宿主组织和虫黄藻细胞组分中提取和制备极性及中等极性代谢物，用于气相色谱-质谱分析的方法。

基于气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）的方法已被证明在阐明代谢基础方面具有强大能力……

与所有生物一样，珊瑚需要极佳的营养来生长并构建珊瑚礁，以维持免疫和繁殖能力，并抵御不断变化的环境条件。然而，对于在正常或变化环境条件下珊瑚的最佳营养需求，我们知之甚少，也不清楚珊瑚全生物体（holobiont）中各个成员如何共同维持这种营养状态。珊瑚属于全生物体，由宿主及其多种共生微生物组成。这些成员包括虫黄藻科（Symbiodiniaceae）、原生生物、细菌、病毒和真菌。全生物体的适应性取决于这些成员之间的代谢相互作用。例如，虫黄藻科为宿主提供光合产物以支持其代谢，并帮助宿主适应变化的环境条件。为了理解这一关键的共生关系，我们需要分别研究每个共生伙伴的化学和代谢组成。这些发现表明，通过将宿主与共生体组分分离进行代谢分析，可以获得更丰富的信息。然而，选择分析分离组分还是全共生体（holobiont），最终取决于具体的研究问题。因此，在更适合进行全生物体分析的情况下，我们提供了一种全生物体代谢物提取的方法，以及在分析过程中尽可能获取更多信息的建议。本研究中采用的方法为相关研究开辟了新的途径，包括揭示潜在的生物标志物、鉴定特定生命阶段或胁迫条件下的关键代谢物、理解与特定物种共生所带来的优势，以及探究全生物体内部的相互作用。未来的研究将致力于将本研究建立的方案应用于多个研究领域，包括珊瑚礁保护与修复中生物标志物的检测。当其他生理学测量方法无法实现组分分离时，也可应用该方法。例如，在分析珊瑚群体释放的挥发性代谢物时。首先，将装有珊瑚碎片的样品采集袋中的过量海水排干。将样品浸入液氮中至少30秒。为去除珊瑚组织与骨骼，将一个无菌的样品采集袋置于冰上，确保其稳定且开口朝上，但不要浸入冰中。向袋中加入10毫升冷的超纯水。使用无菌镊子选取置于冰上的珊瑚片段，用冷的超纯水冲洗，直至无海水残留。将冲洗后的珊瑚片段放入含有超纯水的袋中。接下来，剪去1毫升移液器吸头约5毫米的末端，并使用电工胶带将其固定在气枪的出口端。将气枪对准珊瑚碎片，在塑料袋半封闭的状态下，以低至中等气流通过在碎片表面形成环形水流，轻柔地去除组织。三分钟后，或当所有组织从骨骼上完全去除后，关闭气流并移除喷枪。完全密封袋子，并将所有去除的珊瑚组织挤入袋子的底部角落。剪下袋子的对角，轻轻将内容物倒入置于冰上的15毫升离心管中。使用机械锯齿式匀浆器对珊瑚样品进行匀浆处理，持续一分钟，直至样品完全匀浆且无可见团块。为进行归一化处理，从均质化组织中取1毫升等分试样，用于虫黄藻细胞计数、珊瑚组织蛋白质含量分析以及叶绿素A含量估算。若需分离宿主材料与藻类细胞，将剩余的珊瑚匀浆在4摄氏度条件下以2,500 ×g离心5分钟。将含有宿主材料的上清液转移至新的15毫升离心管中。向藻类沉淀物中加入2毫升冷的超纯水，对宿主材料和藻类沉淀物均涡旋振荡2分钟，以重新悬浮。再次离心所有样品，将含有宿主材料的上清液转移至新的15毫升离心管中。弃去藻类沉淀物中的上清液后，将沉淀物保留在原始的15毫升离心管中。将全共生体匀浆或分离的宿主在 Symbiodiniaceae 组分中于 -80 摄氏度冷冻至少两小时。然后在 -85 摄氏度、0.01 毫巴真空条件下冻干过夜。冻干后，将每个样品分别转移至不含增塑剂的 2 毫升塑料微量离心管中，在分析天平上称重。显微观察显示，经过三次洗涤步骤后，宿主组织样本中未发现虫黄藻科（Symbiodiniaceae）细胞。同样，共生体组分中仅发现极少的宿主组织。然而，空心的匀浆物表明，仅通过喷枪处理无法将胞内虫黄藻科细胞从其共生体囊泡（symbiosomes）中释放出来。为了从冻干的全生物体中提取胞内代谢物，向冻干的全生物体中加入400微升含内标物的100%冷甲醇。然后加入10毫克酸洗玻璃珠，将离心管置于预冷的珠磨机适配器中，在50赫兹条件下研磨3分钟。裂解后，加入600微升冷甲醇，并涡旋震荡1分钟。将离心管置于4摄氏度的旋转摇床上孵育30分钟。为从分离并冻干的虫黄藻细胞中提取代谢物，向干燥的虫黄藻细胞中加入含有内标物的200微升冷甲醇。随后加入酸洗玻璃珠，将离心管放入预冷的珠磨机适配器中，在50赫兹条件下进行研磨。三分钟后，加入 800 微升甲醇，涡旋振荡 30 秒。从分离的冻干宿主组织中提取代谢物时，向干燥的宿主材料中加入含有内标物的 1 毫升预冷甲醇，涡旋振荡 20 秒。然后，将离心管置于漂浮管架中，在 4 °C 条件下超声处理 30 分钟。接下来，进行代谢物提取物的纯化：将所有样品在4°C条件下以3000 G离心30分钟。小心地将上清液转移至新的2毫升微量离心管中，注意不要扰动沉淀。用1毫升50%冷甲醇重悬沉淀，并剧烈涡旋振荡1分钟。再次离心，然后收集极性提取物的上清液，并与同一样品的中等极性提取物合并。将合并后的提取物在16,100 G下离心15分钟，以去除沉淀。用于分析时，取每份提取物50微升分装至玻璃插件中，在30摄氏度下使用真空浓缩仪浓缩30分钟。GCMS 分析在所有处理中鉴定出 107 种注释的代谢物，包括一系列氨基酸、有机酸、碳水化合物、脂肪酸和甾醇。K 均值聚类分析将样品分为三个不同的聚类。全共生体样品的代谢物特征介于分离的宿主和共生体组分之间。尽管K均值聚类分布、平行坐标图以及代谢物相对丰度的热图可视化结果显示，全共生体的代谢谱与宿主组分的代谢谱更为相似，但其与宿主和共生体的代谢谱均存在显著差异。宿主与共生体的代谢谱彼此之间也显著不同，宿主组分与共生体组分之间有100种代谢物的含量差异显著。

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基于气相色谱-质谱的硬珊瑚样品靶向代谢组学研究

采用超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-MS）进行非靶向代谢物谱型分析是研究代谢的重要手段。本文概述了用于血清非靶向代谢物谱型分析的典型工作流程，包括样本组织与制备、数据采集、数据分析、质量控制以及代谢物鉴定。...

大规模非靶向血清代谢组学分析：超高效液相色谱-质谱法（UPLC-MS）

非靶向代谢组学可提供代谢谱的假设生成式快照。本方案将演示从细胞、血清或组织中提取和分析代谢物的方法。通过液-液相萃取、微流速超高效液相色谱/高分辨质谱法（UPLC-HRMS）结合差异分析软件，对多种代谢物进行检测。...

使用超高效液相色谱-高分辨质谱法（UPLC-HRMS）对生物来源样本进行非靶向代谢组学分析

代谢物谱分析在健康与疾病状态下的代谢研究中具有重要价值。本文介绍了一种利用正相液相色谱联用高分辨率质谱、极性切换及快速循环周期的技术方案，可对生物材料中的极性代谢物组成进行高灵敏度、高准确性和高分辨率的分析。...

一种用于高灵敏度、大规模定量代谢组学的策略

本方案用于从海水中收集的微生物生物量中提取和浓缩蛋白质及DNA，随后生成适用于基于串联质谱的蛋白质组学分析的胰蛋白酶肽段。...

一种水生微生物宏蛋白质组学工作流程：从细胞到适用于串联质谱分析的胰蛋白酶肽段

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利用飞行时间质谱联用二维气相色谱对藻类水热液化水相组分进行定性表征

本文描述了一种通过液相色谱/质谱法改进的聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性方法，用于河豚物种的基因分型。该方法采用反相硅胶整体柱分离经酶切后的扩增产物。此技术可解析寡核苷酸的单一同位素质量，有助于碱基组成的鉴定。...

通过液相色谱/质谱法改进河豚毒素鱼类的聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性基因分型

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用于基于气相色谱-质谱法（GC-MS）代谢组学分析的 Drosophila 幼虫样品制备

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用于表征复杂天然有机质混合物的单通量互补高分辨率分析技术

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基于液相色谱-质谱的非靶向小麦籽粒代谢组学分析

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脑肿瘤代谢组学与脂质组学分析的现场取样与提取

本文介绍了一种用于大麦代谢组学分析的方法。该方法包括对代谢物进行分离和衍生化处理，并采用气相色谱-质谱联用技术（GC/MS）进行分析。代谢组学分析可用于研究间作种植和干旱胁迫对谷粒的影响。...

大麦的气相色谱/质谱代谢组学分析

了解基于气相色谱-质谱的硬珊瑚靶向代谢组学方法，用于分离分析珊瑚宿主组织与虫黄藻细胞组分。该技术有助于揭示珊瑚共生体代谢互作机制，为珊瑚礁保护与修复研究提供重要生物标志物检测手段。

基于气相色谱-质谱法的硬珊瑚样品靶向代谢组学

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