从无管螠（Sipunculus nudus）中亲和纯化纤溶酶

我们的研究主要涉及纤溶酶的纯化。本工作旨在建立一种简便的纤溶酶纯化方法。在本研究中，我们首次报道了一种以精氨酸或赖氨酸为最佳亲和配基的纤溶酶纯化系统。

与传统的纯化方法相比，这是一种从无疣索蚕（Sipunculus nudus）中纯化纤溶酶的简单、低成本且高效的方法。本实验方案的建立对于进一步利用无疣索蚕及其他类似来源的纤溶酶具有重要意义。样品处理步骤从解剖100克新鲜的无疣索蚕开始，收集其肠道及内腔液体。

加入 300 毫升 Tris-HCl 缓冲液，以 1,000 转/分钟均质化 60 秒。将匀浆液进行三次冻融循环。将冻融后的匀浆液离心后，收集上清液，并于 4 摄氏度保存，以备后续使用。

开始蛋白质沉淀时，将上清液从4°C取出，加入九倍体积的饱和硫酸铵溶液并混匀。在4°C下孵育混合物12小时。然后通过离心沉淀蛋白质，并将沉淀的蛋白质储存在4°C下。

将蛋白质沉淀物重悬于30毫升Tris-HCl缓冲液中，并将此粗蛋白溶液于4°C保存以备后续使用。使用0.22微米滤膜过滤从无管虫（Sipunculus nudus）肠道中提取的粗蛋白。将此样品于4°C保存以备后续使用。

通过将精氨酸-琼脂糖基质填料装入一个5毫升的空层析柱中，来装填精氨酸-琼脂糖基质亲和层析柱。同样，将赖氨酸-琼脂糖基质填料装入另一根空层析柱中，以制备赖氨酸-琼脂糖基质亲和层析柱。先用双蒸水，再用Tris-HCl缓冲液对亲和层析柱进行平衡。

将过滤后的蛋白质样品上样至预先平衡的层析柱中。用五倍柱体积的0.02摩尔Tris-HCl缓冲液洗涤层析柱，随后依次用0.15、0.25、0.35、0.45、0.55和0.65摩尔氯化钠溶液进行洗脱。当0.15摩尔氯化钠洗脱液中出现洗脱峰时，用5毫升离心管收集洗脱组分。

使用3 kDa超滤离心滤器浓缩洗脱样品，并将该样品在-80摄氏度下保存以备后续使用。当蛋白溶液上样至精氨酸-琼脂糖亲和柱时，穿流峰大约出现在40至66分钟之间。在梯度洗脱阶段，用0.15摩尔氯化钠洗脱的峰出现在大约94至110分钟之间。

当蛋白溶液上样至赖氨酸-琼脂糖亲和柱时，穿流峰大约在38至60分钟出现。在梯度洗脱阶段，使用0.15摩尔氯化钠洗脱的峰出现在80至86分钟。开始制备纤维蛋白平板时，将25毫克纤维蛋白原与1.25毫升生理盐水混合。

接下来，通过将100单位凝血酶与1.05毫升生理盐水充分混合来配制凝血酶溶液。然后，将0.5克琼脂糖加入22.5毫升0.02摩尔Tris-HCl缓冲液中，配制琼脂糖溶液。将琼脂糖溶液在100摄氏度加热至完全溶解。

将琼脂糖溶液冷却至约 50 摄氏度，然后立即加入纤维蛋白原溶液。随后迅速加入凝血酶溶液，快速混匀，并将混合液倒入 60 毫米的培养皿中。

加样时，使用无菌打孔器在纤维蛋白平板上打直径3毫米的孔，每孔加入10微升样品。将平板在37摄氏度下孵育18小时，然后测量降解区的大小并计算纤溶活性。纤溶活性评估显示，尿激酶对照组出现1.3厘米的溶菌区。

生理盐水缓冲液中无溶菌圈，粗蛋白孔中溶菌圈直径为2.1厘米，纯化的纤溶酶孔中溶菌圈直径为1.8厘米。