Name: 从海蛾中亲和纯化纤维蛋白溶解酶 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T12:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: 学习从海蛾Sipunculus nudus中亲和纯化纤维蛋白溶解酶的方法。该方法采用精氨酸或赖氨酸亲和层析系统，具有简单、经济、高效的特点，适用于生物化学和酶学研究。

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本研究由厦门市科学技术局（3502Z20227197）和福建省科学技术厅（编号：2019J01070，编号：2021Y0027）资助。

1. 准备
<ol>
	<li>样品处理
	<ol>
		<li>仔细解剖新鲜的 S. nudus（100 g），收集肠道及其内部液体。</li>
		<li>加入 300 mL Tris-HCl 缓冲液（0.02 M，pH 7.4）进行匀浆（1,000 rpm，60 s）。</li>
		<li>反复冻融匀浆液 3 次。</li>
		<li>离心样品（10,956 × g，0.5 h，4 °C），收集上清液。将样品置于 4 °C 保存，待后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白质沉淀
	<ol>
		<li>将上清液与饱和硫酸铵溶液（九倍体积）混合，并于 4 °C 静置 12 h。 
		注意：本步骤可在此暂停，后续继续操作。</li>
		<li>离心（10,956 × g，0.5 h，4 °C）以获得蛋白质沉淀；将其在 4 °C 保存，供后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白质重悬
	<ol>
		<li>用 30 mL Tris-HCl 缓冲液（0.02 M，pH 7.4）重悬蛋白质沉淀。将此粗蛋白溶液在 4 °C 保存，供后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 亲和层析
<ol>
	<li>溶液过滤
	<ol>
		<li>将粗蛋白溶液通过 0.22 µm 滤膜过滤。将此样品在 4 °C 下保存以供后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>柱子填装
	<ol>
		<li>通过将适量的赖氨酸-琼脂糖基质介质和精氨酸-琼脂糖基质介质装入 5 mL 空层析柱中，制备赖氨酸-琼脂糖基质亲和层析柱和精氨酸-琼脂糖基质亲和层析柱。 
		注意：层析柱可于 2–8 °C 保存，基质需浸没于保存缓冲液（20% 乙醇）中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>亲和纯化
	<ol>
		<li>先用 ddH2O 平衡亲和层析柱（1 mL/min，10 个柱体积），随后用 Tris-HCl 缓冲液（0.02 M，pH 8.0，1 mL/min，5 个柱体积）继续平衡。</li>
		<li>将蛋白溶液样品上样至预先平衡好的层析柱中（1 mL/min，1/3 柱体积）。 
		注意：上样体积取决于 sFE 的浓度。</li>
		<li>用 Tris-HCl 缓冲液（0.02 M，pH 8.0）洗涤层析柱（5 个柱体积）。</li>
		<li>依次用 0.15 M、0.25 M、0.35 M、0.45 M、0.55 M 和 0.65 M NaCl 溶液（1 mL/min，各 5 个柱体积）进行梯度洗脱。</li>
		<li>观察应在 0.15 M NaCl 洗脱组分中出现的洗脱峰，并将各组分收集至 5 mL 离心管中。</li>
		<li>使用 3 kD 超滤离心管对洗脱样品进行浓缩（3,944 × g，1.5 小时，4 °C）。将浓缩后的样品于 -80 °C 保存以供后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 纯度评估
<ol>
	<li>十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶制备
	<ol>
		<li>根据 Laemmli 方法制备 SDS-PAGE 凝胶，使用 5% 浓缩胶和 12% 分离胶13。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>电泳
	<ol>
		<li>将样品（15 µL）与 5 倍浓度的 SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液（1/4 体积）混合，在沸水中加热 5 分钟，上样至 SDS-PAGE 凝胶，以 80 V、60 mA 电压电流条件电泳运行 1.5 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析
	<ol>
		<li>电泳结束后，按照试剂盒生产商的说明书使用银染试剂盒对凝胶进行染色，并使用化学发光成像系统观察染色后的凝胶。</li>
		<li>使用以下公式分析目标蛋白的纯度：目标蛋白纯度 = 目标蛋白强度值 / 总蛋白强度值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 纤溶活性评价
<ol>
	<li>纤维蛋白平板制备
	<ol>
		<li>通过将 25 mg 纤维蛋白原与 1.25 mL 生理盐水混合，制备纤维蛋白原溶液。</li>
		<li>通过将 100 U 凝血酶与 1.05 mL 生理盐水充分混合，制备凝血酶溶液。</li>
		<li>将 0.5 g 琼脂糖加入 22.5 mL Tris-HCl 缓冲液（0.02 mol/L，pH 7.4）中，制备琼脂糖溶液。混合后在 100 °C 加热琼脂糖溶液，直至完全溶解。</li>
		<li>将琼脂糖溶液冷却至约 50 °C，加入纤维蛋白原溶液。然后立即加入凝血酶溶液，迅速混合，并倒入 60 mm 培养皿中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加样
	<ol>
		<li>使用无菌打孔器在制备好的纤维蛋白平板上打 3 mm 孔，每孔加入 10 µL 样品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析
	<ol>
		<li>在 37 °C 培养 18 小时后，通过计算样品降解区的大小来测定纤溶活性。纤溶活性 =（样品降解区大小 / 尿激酶降解区大小）× 100 U。降解区大小 = 直径 × 直径。 
		注：生理盐水缓冲液、粗提蛋白（方案步骤 1.3.1 获得的样品）和尿激酶分别用作空白对照、阴性对照和阳性对照。与尿激酶相比，我们发现纯化的 sFE 的纤溶活性约为 19,200 U/mL。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Purifying a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus via Affinity Chromatography

<ol><li>Rosell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patients+with+COVID-19+have+elevated+levels+of+circulating+extracellular+vesicle+tissue+factor+activity+that+is+associated+with+severity+and+mortality-brief+report%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).</li>
<li>Schultz, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombosis+and+thrombocytopenia+after+ChAdOx1+nCoV-19+vaccination.+The+New+England%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Thrombosis and thrombocytopenia after ChAdOx1 nCoV-19 vaccination. The New England.</a> Journal of Medicine. 384 (22), 2124-2130 (2021).</li>
<li>von Kaulla, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urokinase-induced+fibrinolysis+of+human+standard+clots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Urokinase-induced fibrinolysis of human standard clots.</a> Nature. 184 (4695), 1320-1321 (1959).</li>
<li>Van de Werf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+thrombolysis+with+tissue-type+plasminogen+activator+in+patients+with+evolving+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Coronary thrombolysis with tissue-type plasminogen activator in patients with evolving myocardial infarction.</a> The New England Journal of Medicine. 310 (10), 609-613 (1984).</li>
<li>Schaller, J., Gerber, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasmin-antiplasmin+system%3A+structural+and+functional+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">The plasmin-antiplasmin system: structural and functional aspects.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (5), 785-801 (2011).</li>
<li>Ge, Y. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+antithrombotic+protease+from+marine+worm+Sipunculus+nudus%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">A novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus nudus.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3023(2018).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+a+novel+fibrinolytic+enzyme+from+culture+supernatant+of+Pleurotus+ostreatus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from culture supernatant of Pleurotus ostreatus.</a> Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (2), 245-253 (2014).</li>
<li>Choi, J. -H., Sapkota, K., Kim, S., Kim, S. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starase%3A+A+bi-functional+fibrinolytic+protease+from+hepatic+caeca+of+Asterina+pectinifera+displays+antithrombotic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Starase: A bi-functional fibrinolytic protease from hepatic caeca of Asterina pectinifera displays antithrombotic potential.</a> Biochimie. 105, 45-57 (2014).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+fibrinolytic+protein+From+Pheretima+vulgaris%3A+purification%2C+identification%2C+antithrombotic+evaluation%2C+and+mechanisms+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">A novel fibrinolytic protein From Pheretima vulgaris: purification, identification, antithrombotic evaluation, and mechanisms investigation.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 772419(2022).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidant%2C+hypolipidemic+and+hepatic+protective+activities+of+polysaccharides+from+Phascolosoma+esculenta%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Drugs%22%5BJournal%5D)">Antioxidant, hypolipidemic and hepatic protective activities of polysaccharides from Phascolosoma esculenta.</a> Marine Drugs. 18 (3), 158(2020).</li>
<li>Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en">https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en</a> (2019).</li>
<li>Li, W., Yuan, M., Wu, Y., Xu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+expressed+differentially+in+female+and+male+gametes+of+Sipunculus+nudus%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of genes expressed differentially in female and male gametes of Sipunculus nudus.</a> Aquaculture Research. 51 (9), 3780-3789 (2020).</li>
<li>Ossipow, V., Laemmlii, U. K., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+renature+DNA-binding+proteins+separated+by+SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A simple method to renature DNA-binding proteins separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Research. 21 (25), 6040-6041 (1993).</li>
<li>Hsu, T., Ning, Y., Gwo, J., Zeng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+barcoding+reveals+cryptic+diversity+in+the+peanut+worm+Sipunculus+nudus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology+Resources%22%5BJournal%5D)">DNA barcoding reveals cryptic diversity in the peanut worm Sipunculus nudus.</a> Molecular Ecology Resources. 13 (4), 596-606 (2013).</li>
<li>Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasminogen-plasmin+system.+I.+Purification+and+properties+of+human+plasminogen%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Plasminogen-plasmin system. I. Purification and properties of human plasminogen.</a> The Journal of Biochemistry. 64 (6), 743-750 (1968).</li>
<li>Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasminogen-plasmin+system.+II.+Purification+and+properties+of+human+plasmin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Plasminogen-plasmin system. II. Purification and properties of human plasmin.</a> The Journal of Biochemistry. 64 (6), 751-757 (1968).</li>
<li>Wiman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity-chromatographic+purification+of+human+%CE%B12-antiplasmin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Affinity-chromatographic purification of human α2-antiplasmin.</a> The Biochemical Journal. 191 (1), 229-232 (1980).</li>
<li>Sandbjerg Hansen, M., Clemmensen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+purification+and+characterization+of+a+new+fast-acting+plasmin+inhibitor+from+human+platelets.+Evidence+for+non-identity+with+the+known+plasma+proteinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Partial purification and characterization of a new fast-acting plasmin inhibitor from human platelets. Evidence for non-identity with the known plasma proteinase inhibitors.</a> The Biochemical Journal. 187 (1), 173-180 (1980).</li>
<li>Pietrocola, G., Rindi, S., Nobile, G., Speziale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+human+plasma%2Fcellular+fibronectin+and+fibronectin+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Fibrosis%22%5BJournal%5D)">Purification of human plasma/cellular fibronectin and fibronectin fragments.</a> Fibrosis. 1627, 309-324 (2017).</li>
<li>Nabiabad, H. S., Yaghoobi, M. M., Javaran, M. J., Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+and+purification+of+human+recombinant+tissue+type+plasminogen+activator+%28rt-PA%29+from+transgenic+tobacco+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Preparative+Biochemistry+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Expression analysis and purification of human recombinant tissue type plasminogen activator (rt-PA) from transgenic tobacco plants.</a> Preparative Biochemistry and Biotechnology. 41 (2), 175-186 (2011).</li>
<li>Shearin, T. V., Pizzo, S. V., Gonzalez-Gronow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+abnormalities+of+human+plasminogen+isolated+from+synovial+fluid+of+rheumatoid+arthritis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Molecular abnormalities of human plasminogen isolated from synovial fluid of rheumatoid arthritis patients.</a> Journal of Molecular Medicine. 75 (5), 378-385 (1997).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

由于无法获得sFE的精确基因序列，目前使用的sFE是从新鲜的S. nudus14中提取的。此外，文献中报道的sFE纯化流程较为复杂且成本较高，这些方法基于sFE的一些通用特性，如分子量、等电点、离子强度和极性15,16。迄今为止，尚未有sFE的亲和纯化方案被报道。在本研究中，基于sFE晶体结构的知识，成功开发了一种亲和纯化方案。与已报道的纯化方法相比，该亲和纯化方法操作简便、成本低廉且易于使用。此外，采用该方法可显著提高活性sFE的回收率。
尽管已有多种纤溶酶亲和纯化方法的报道，但这些方法均基于抗体17、抑制剂18、配体和受体16。这些抗体、抑制剂、配体和受体的制备在技术上具有挑战性且费时费力。此外，还需额外步骤将这些分子偶联到基质上。相比之下，精氨酸-琼脂糖...

血栓形成是公共卫生的主要威胁，尤其是在全球新冠疫情之后1,2临床上，许多纤溶酶原激活剂（PAs），如组织型纤溶酶原激活剂（tPA）和尿激酶（UK），已被广泛用作溶栓药物。PAs 可将患者体内的纤溶酶原激活为具有活性的纤溶酶，从而降解纤维蛋白。因此，其溶栓效率在很大程度上受限于患者的纤溶酶原状态3,4纤溶药物，如金属蛋白酶纤溶酶和丝氨酸纤溶酶，是另一类临床溶栓药物，还包括纤溶酶类（FE）如纤溶酶，可直接溶解血栓，但会迅速被多种纤溶酶抑制剂失活5随后，有研究报道了一种新型溶栓剂，其不仅可通过激活纤溶酶原转化为纤溶酶来溶解血栓，还能直接降解纤维蛋白6- 来自远古花生虫的纤溶酶 Sipunculus nudus (sFE)6这种双功能特性使sFE相较于传统溶栓药物具有其他优势，尤其是在异常纤溶酶原状态下。与其他双功能纤溶剂相比7,8,9，与非食品来源的药物开发试剂相比，sFE 在药物研发中具有多项优势，尤其是在口服药物方面表现出更高的安全性。这是因为 sFE 具有良好的生物安全性和生物相容性 Sipunculus nudus 已得到充分确立10.
与其他从微生物、蚯蚓和蘑菇中分离得到的天然纤溶酶类似，来自 S. nudus 的sFE纯化过程非常复杂，包含多个步骤，如组织匀浆、硫酸铵沉淀、脱盐、阴离子交换层析、疏水相互作用层析以及分子筛层析10,11,12。该纯化体系不仅依赖熟练的技术和昂贵的材料，而且需要数天时间才能完成整个流程。因此，建立一种简便的sFE纯化方案对其进一步开发具有重要意义。幸运的是，我们已成功获得sFE的两种晶体（PDB: 8HZP；PDB: 8HZO）（见补充文件1和补充文件2）。通过结构分析和分子对接实验，我们发现sFE的催化核心能够特异性结合含有精氨酸或赖氨酸残基的底物。
本文首次提出了一种基于sFE晶体结构的亲和纯化系统。通过遵循本方案，可从粗提物中经单步亲和纯化获得高纯度且高活性的sFE。本研究所建立的方案不仅对sFE的大规模制备具有重要意义，还可能适用于其他纤溶剂的纯化。

<table><tbody><tr><td>30% 丙烯酰胺-双丙烯酰胺（29:1）</td><td>Biosharp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Solarbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖 G-10</td><td>Biowest</td><td></td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>SINOPHARM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硫酸铵</td><td>SINOPHARM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>精氨酸-Sepharose 4B</td><td>Solarbio</td><td>精氨酸-琼脂糖基质</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝（BPB）</td><td>Solarbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>快速银染试剂盒</td><td>Beyotime</td><td></td><td></td></tr><tr><td>纤维蛋白原</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Solarbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>SINOPHARM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>激酶</td><td>RHAWN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>赖氨酸-Sepharose 4B</td><td>Solarbio</td><td>赖氨酸-琼脂糖基质</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>预染彩色蛋白质 Marker（10–170 kD）</td><td>Beyotime</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>SINOPHARM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>十二烷基磺酸钠（SDS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>SINOPHARM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>凝血酶</td><td>Meilunbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>三（羟甲基）氨基甲烷</td><td>Solarbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐</td><td>Solarbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKT Aprotein 纯化系统 pure</td><td>GE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MLS-3750 自动立式压力蒸汽灭菌器</td><td>SANYO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>化学发光成像系统</td><td>GE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BT-100 恒流泵</td><td>QITE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>恒温培养箱</td><td>JINGHONG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-30KS 台式冷冻离心机</td><td>SIGMA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DGG-9140AD DHG 系列加热干燥烘箱</td><td>SENXIN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DY89-II 电动玻璃匀浆器</td><td>SCIENTZ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电子分析天平</td><td>DENVER</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DK-S12 电热恒温水浴锅</td><td>SENXIN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水平脱色摇床</td><td>Kylin-Bell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AF 103 制冰机</td><td>Scotsman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KQ-500E 超声波清洗机</td><td>ShuMei</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>Zhi wei</td><td></td><td></td></tr><tr><td>H1650-W 微型冷冻离心机</td><td>Cence</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微波炉</td><td>Galanz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Reference</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>精密台式 pH 计</td><td>Sartorious</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小型旋涡振荡器</td><td>Kylin-Bell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>垂直电泳系统</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;耗材&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L PCR 管（200 &amp;micro;L）</td><td>Axygene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心管（1.5 mL）</td><td>Biosharp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心管（5 mL）</td><td>Biosharp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心管（50 mL）</td><td>NEST</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心管（7 mL）</td><td>Biosharp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养皿（60 mm）</td><td>NEST</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滤膜（0.22 &amp;micro;m）</td><td>Millex GP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>封口膜（Parafilm）</td><td>Bemis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头（1 mL）</td><td>KIRGEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头（10 &amp;micro;L）</td><td>Axygene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头（200 &amp;micro;L）</td><td>Axygene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>专用指示试纸</td><td>TZAKZY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超滤离心管（15 mL，3 KDa）</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超滤离心管（4 mL，3 KDa）</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>通用 pH 指示剂</td><td>SSS Reagent</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

从无管螠（sipunculus nudus）中亲和纯化纤溶酶

Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus

Sipunculus nudus来源的纤溶酶（sFE）是一种新型纤溶剂，既能将纤溶酶原激活为纤溶酶，又能直接降解纤维蛋白，相较于传统溶栓药物具有显著优势。然而，由于缺乏结构信息，目前所有sFE的纯化方案均依赖多步层析纯化，过程过于复杂且成本较高。本文首次基于sFE的晶体结构开发了一种亲和纯化方案，包括粗提样品的制备、赖氨酸/精氨酸-琼脂糖凝胶亲和层析柱的制备、亲和纯化及纯化后sFE的表征。按照本方案，可在1天内完成一批sFE的纯化。此外，纯化后sFE的纯度和活性分别达到92%和&#160;19,200 U/mL&#160;。因此，该方法是一种简便、经济且高效的sFE纯化策略。本方案的建立对于sFE及其他类似药物的进一步应用具有重要意义。

按照本方案，提取了粗组织裂解液，构建了精氨酸-琼脂糖凝胶亲和层析柱和赖氨酸-琼脂糖凝胶亲和层析柱，获得了纯化的sFE，并分别通过SDS-PAGE和纤维蛋白平板法检测了纯化sFE的纯度和纤溶活性。
离心后，收集的上清液为透明的浅褐色黏稠液体。当该上清液与饱和硫酸铵溶液（九倍体积）混合时开始出现沉淀。静置12小时后，试管底部形成大量沉淀。将沉淀用Tris-HCl缓冲液重悬时，蛋白质沉淀迅速消失并溶解于缓冲液中，呈现为透明的淡黄色液体。
当蛋白溶液上样至精氨酸-琼脂糖亲和层析柱时，约40分钟时出现一个明显的峰（峰1，穿流峰），至约66分钟时停止洗脱。在梯度洗脱阶段，使用0.15 M NaCl洗脱时，约94分钟时出现一个明显的峰（峰2，洗脱峰），至约110分钟时停止洗脱。在后续的洗脱阶段（0.25 M、0.35 M、0.45 M、0.55 M和0.65 M NaCl）中未出现明显的洗脱峰（图1A）。本研究中，我们重复使用精氨酸-琼脂糖亲和层析柱多达10次，发现柱子的性能未发生...

本文介绍一种从无疣星虫（Sipunculus nudus）中分离纤溶酶的亲和纯化方法，该方法简便、经济且高效。

从无管螠（Sipunculus nudus）中亲和纯化纤溶酶

来自无疣星虫（Sipunculus nudus）的纤溶酶（sFE）是一种新型纤溶剂，既能将纤溶酶原激活为纤溶酶，又能降解纤维蛋白……

我们的研究主要涉及纤溶酶的纯化。本工作旨在建立一种简便的纤溶酶纯化方法。在本研究中，我们首次报道了一种以精氨酸或赖氨酸为最佳亲和配基的纤溶酶纯化系统。与传统的纯化方法相比，这是一种从无疣索蚕（Sipunculus nudus）中纯化纤溶酶的简单、低成本且高效的方法。本实验方案的建立对于进一步利用无疣索蚕及其他类似来源的纤溶酶具有重要意义。样品处理步骤从解剖100克新鲜的无疣索蚕开始，收集其肠道及内腔液体。加入 300 毫升 Tris-HCl 缓冲液，以 1,000 转/分钟均质化 60 秒。将匀浆液进行三次冻融循环。将冻融后的匀浆液离心后，收集上清液，并于 4 摄氏度保存，以备后续使用。开始蛋白质沉淀时，将上清液从4°C取出，加入九倍体积的饱和硫酸铵溶液并混匀。在4°C下孵育混合物12小时。然后通过离心沉淀蛋白质，并将沉淀的蛋白质储存在4°C下。将蛋白质沉淀物重悬于30毫升Tris-HCl缓冲液中，并将此粗蛋白溶液于4°C保存以备后续使用。使用0.22微米滤膜过滤从无管虫（Sipunculus nudus）肠道中提取的粗蛋白。将此样品于4°C保存以备后续使用。通过将精氨酸-琼脂糖基质填料装入一个5毫升的空层析柱中，来装填精氨酸-琼脂糖基质亲和层析柱。同样，将赖氨酸-琼脂糖基质填料装入另一根空层析柱中，以制备赖氨酸-琼脂糖基质亲和层析柱。先用双蒸水，再用Tris-HCl缓冲液对亲和层析柱进行平衡。将过滤后的蛋白质样品上样至预先平衡的层析柱中。用五倍柱体积的0.02摩尔Tris-HCl缓冲液洗涤层析柱，随后依次用0.15、0.25、0.35、0.45、0.55和0.65摩尔氯化钠溶液进行洗脱。当0.15摩尔氯化钠洗脱液中出现洗脱峰时，用5毫升离心管收集洗脱组分。使用3 kDa超滤离心滤器浓缩洗脱样品，并将该样品在-80摄氏度下保存以备后续使用。当蛋白溶液上样至精氨酸-琼脂糖亲和柱时，穿流峰大约出现在40至66分钟之间。在梯度洗脱阶段，用0.15摩尔氯化钠洗脱的峰出现在大约94至110分钟之间。当蛋白溶液上样至赖氨酸-琼脂糖亲和柱时，穿流峰大约在38至60分钟出现。在梯度洗脱阶段，使用0.15摩尔氯化钠洗脱的峰出现在80至86分钟。开始制备纤维蛋白平板时，将25毫克纤维蛋白原与1.25毫升生理盐水混合。接下来，通过将100单位凝血酶与1.05毫升生理盐水充分混合来配制凝血酶溶液。然后，将0.5克琼脂糖加入22.5毫升0.02摩尔Tris-HCl缓冲液中，配制琼脂糖溶液。将琼脂糖溶液在100摄氏度加热至完全溶解。将琼脂糖溶液冷却至约 50 摄氏度，然后立即加入纤维蛋白原溶液。随后迅速加入凝血酶溶液，快速混匀，并将混合液倒入 60 毫米的培养皿中。加样时，使用无菌打孔器在纤维蛋白平板上打直径3毫米的孔，每孔加入10微升样品。将平板在37摄氏度下孵育18小时，然后测量降解区的大小并计算纤溶活性。纤溶活性评估显示，尿激酶对照组出现1.3厘米的溶菌区。生理盐水缓冲液中无溶菌圈，粗蛋白孔中溶菌圈直径为2.1厘米，纯化的纤溶酶孔中溶菌圈直径为1.8厘米。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

从海蛾中亲和纯化纤维蛋白溶解酶

MamA 是一种独特的与磁小体相关的蛋白质，已被证明参与磁小体的活化过程。本文介绍了从M. magneticum AMB-1中纯化 MamA...

磁小体相关蛋白 MamAΔ41 的纯化：来自 M. magneticum 菌株 AMB-1

串联亲和纯化是一种用于鉴定蛋白质结合伴侣的可靠方法。作为概念验证，该方法已应用于研究较为深入的翻译起始因子...

使用串联亲和纯化鉴定蛋白质相互作用伙伴

重组原型泡沫病毒整合酶蛋白在纯化过程中常被细菌核酸酶污染。本方法可鉴定核酸酶污染并将其从酶的最终制备物中去除。...

重组原型泡沫病毒整合酶纯化过程中核酸酶污染的检测与去除

本方案描述了如何从猪肾和小鼠肝脏中提取含延胡索酰乙酰乙酸水解酶结构域蛋白1（FAHD1）。所列出的方法可针对其他感兴趣的蛋白质进行调整，并可根据其他组织类型进行修改。...

从猪肾和小鼠肝脏中提取与纯化FAHD1蛋白

本文提供了一种人源重组蛋白 flap 内切酶 1（FEN1）的亲和纯化方法，该蛋白带有...

使用快速蛋白液相色谱系统亲和纯化6X-His标签蛋白

本文介绍了一种纤维蛋白原-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）方案，用于快速分离并显示无疣星虫（Sipunculus...

通过纤维蛋白原-聚丙烯酰胺凝胶电泳快速分离与显示Sipunculus nudus中的活性纤维蛋白溶解因子

本文介绍了一种在C41(DE3)表达系统中过表达重组Nsp15（一种具有毒性的核酸酶）的方法，随后通过亲和层析和尺寸排阻层析纯化带标签的蛋白。这些方案可适用于其他难以表达的毒性蛋白。...

过表达并纯化一种来自 Escherichia coli 的毒性核酸酶

本文介绍了一种用于制备、纯化和使用酶包封外膜囊泡（OMV）的实验方案，该囊泡可提高酶的稳定性，适用于多种不同应用。...

定向蛋白质包装至外膜囊泡中 大肠杆菌设计、生产与纯化

本文描述了在低温条件下通过固态研磨破碎哺乳动物细胞，从所得细胞粉末制备细胞提取物，并利用抗体偶联的微米级顺磁性珠进行亲和捕获以分离目标蛋白复合物的实验方案。...

从冷冻研磨的哺乳动物细胞中进行蛋白质复合物亲和捕获

本文介绍一种新颖、稳健且高效的串联亲和纯化（TAP）方法，用于从真核细胞中表达、分离和表征蛋白质复合物。该方案可用于对特定复合物进行生物化学表征，以及鉴定调控其功能的新型相互作用蛋白和翻译后修饰。...

从真核细胞中对蛋白质复合物进行串联亲和纯化

学习从海蛾Sipunculus nudus中亲和纯化纤维蛋白溶解酶的方法。该方法采用精氨酸或赖氨酸亲和层析系统，具有简单、经济、高效的特点，适用于生物化学和酶学研究。

从无管螠（Sipunculus nudus）中亲和纯化纤溶酶

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