Name: 探究红景天苷抑制MCF-7细胞增殖和迁移的药理作用及分子机制 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-09T12:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: 探索红景天苷对MCF-7乳腺癌细胞的药理作用及其分子机制，通过细胞增殖和迁移实验分析PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1信号通路的调控作用。该研究为天然化合物在肿瘤治疗中的应用提供了重要的实验依据。

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本工作得到四川省卫生健康委员会（120025）的资助。

本研究使用的 MCF-7 细胞购自商业来源（见材料表）。
1. 细胞培养
<ol>
	<li>在37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中，使用添加10% FBS和1%青霉素（10,000 U/mL）/链霉素（10,000 µg/mL）的DMEM培养MCF-7细胞（参见材料表）。 
	&#8203;注意：实验选用贴壁细胞融合度达到培养皿底部90%的细胞，并将其分为以下组别：对照组、盐酸多柔比星组（DXR，5 µM）、Sal组（20 µM、40 µM和80 µM）；或对照组、LY294002组（10 µM，PI3K抑制剂）、Sal组（80 µM）以及LY294002（10 µM）+ Sal（80 µM）组（参见材料表）。</li>
</ol>
2. 细胞活力检测
注意：有关此实验步骤的详细信息，请参见先前的报告27。
<ol>
	<li>以每孔 8 × 104 个细胞的密度将 MCF-7 细胞接种于 96 孔板中，并加入 Sal（10 µM、20 µM、40 µM、80 µM、160 µM 和 320 µM）处理 24 小时，或加入 Sal（20、40、80 µM）处理 12 小时/24 小时/36 小时/48 小时，过夜培养至细胞贴壁。</li>
	<li>处理结束后，每孔加入 10 µL CCK-8 溶液（见材料表），共同孵育 2 小时。随后使用全自动酶标仪在 450 nm 处测定吸光度（OD450）。</li>
</ol>
3. 细胞迁移与侵袭
注意：有关本实验步骤的详细信息，请参阅先前的报告35。
<ol>
	<li>将浓度为 5 × 106 个细胞/mL 的细胞以 2 mL 接种于 6 孔板中，孵育至细胞覆盖孔底约 90%。</li>
	<li>使用无菌移液枪头沿细胞单层中央划出直线划痕，并在 0 h、24 h 和 48 h 使用光学显微镜采集图像。</li>
	<li>使用 Image J 软件测量划痕伤口的宽度。</li>
	<li>进行 transwell 实验时，将 MCF-7 细胞重悬于无血清培养基中，接种于预先包被或未包被 Matrigel 的 transwell 上室（见材料表）。</li>
	<li>在 transwell 下室中加入 DMEM 完全培养基作为化学趋化诱导剂。孵育 24 h 后，移除上室中的细胞，用甲醇固定下室中迁移和侵袭的细胞35。</li>
	<li>用结晶紫溶液对 MCF-7 细胞染色（见材料表），并使用光学显微镜拍摄图像。</li>
</ol>
4. Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的评估
<ol>
	<li>按照制造商说明（参见材料表），使用二辛可宁酸（BCA）试剂盒测定裂解后的 MCF-7 细胞中蛋白质浓度。
	<ol>
		<li>将各组裂解细胞样品加入相应的 96 孔板中。然后加入工作液，在 37 °C 下进一步孵育 5 分钟。最后，使用多功能酶标仪测定 OD636 的数值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 细胞凋亡与细胞周期的流式细胞术分析
注意：有关本实验步骤的详细信息，请参阅先前的报告31。
<ol>
	<li>消化细胞，收集后重悬于磷酸盐缓冲液（PBS）中，加入膜联蛋白V-FITC和碘化丙啶（PI）染色30分钟（参见材料表），然后使用流式细胞仪检测凋亡细胞数量。</li>
	<li>将重悬的样品溶液与PI溶液混合，孵育30分钟，随后用流式细胞仪进行检测。</li>
</ol>
6. DCFH-DA 和 Fluo-4 AM 荧光染色
注意：有关本实验步骤的详细信息，请参见先前的报告29。
<ol>
	<li>将MCF-7细胞与10 µM的DCFH-DA荧光探针（参见材料表）在37 °C下孵育20分钟。用PBS洗涤三次以彻底去除多余的DCFH-DA后，使用荧光显微镜在激发波长488 nm和发射波长525 nm下检测荧光强度。</li>
	<li>将MCF-7细胞与5 µM的Fluo-4 AM荧光探针溶液（参见材料表）在37 °C下孵育45分钟。用PBS洗涤三次后，使用荧光显微镜在激发波长488 nm和发射波长516 nm下测定荧光强度值。</li>
</ol>
7. 蛋白质印迹（Western blot）
<ol>
	<li>将含有不同药物的 2 mL 细胞悬液（浓度为 5 × 106 个细胞/mL）加入 6 孔板中，在 37 °C、5% CO2 培养箱中培养 24 小时。 
	注意：用于蛋白印迹分析的实验分组设置如下：对照组、LY294002（10 µM）组、Sal（80 µM）组，以及 LY294002（10 µM）+ Sal（80 µM）组（参见材料表）。</li>
	<li>收集细胞和上清液，在 4 °C 条件下以 560 × g 离心 3 分钟。弃去上清液，用预冷的 PBS 洗涤两次。每次洗涤后均在 4 °C 条件下以 560 × g 离心 3 分钟。</li>
	<li>向第 7.2 步的细胞样品中加入 50 µL 裂解缓冲液，冰浴 15 分钟。在 4 °C 条件下以 8550 × g 离心 10 分钟，收集上清中的蛋白样品。</li>
	<li>采用 BCA 法检测蛋白浓度后，按 4:1 的比例将第 7.3 步获得的蛋白样品与上样缓冲液混合，在金属浴中 100 °C 变性 10 分钟，随后冷却至室温。</li>
	<li>取第 7.4 步的 20 µg 蛋白样品，使用 10% SDS-PAGE（参见材料表）分离不同分子量的蛋白质35，然后转移至 0.22 µm PVDF 膜。用 5% BSA 封闭后，在 4 °C 条件下与相应的一抗抗体孵育过夜。 
	注意：以下一抗抗体的稀释浓度均为 1:1,000：cleaved caspase-9/7/3（CC-9/7/3）、Bim、Bax、Bcl-2、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、mTOR、HIF-1α、FoxO1 和 β-actin（参见材料表）。</li>
	<li>次日，在 37 °C 条件下用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG 二抗孵育膜 2 小时。使用 ECL 化学发光液显影，并采用非接触式定量蛋白印迹成像系统采集图像（参见材料表）。</li>
</ol>
8. qRT-PCR
<ol>
	<li>以 560 × g 离心收集 MCF-7 细胞 g 4 ℃下 &#176;C，持续3分钟，然后加入500 &#181;将缓冲液RL1加入5 &#215; 106 细胞。用移液器反复吹打并混匀，直至肉眼不可见细胞团块。 
	注意：缓冲液RL1是总RNA提取试剂盒中的组分之一（参见 材料表).</li>
	<li>将第8.1步中的细胞匀浆转移至置于收集管中的DNA纯化柱中，于8,550 ×g离心 &#215; g 在4 &#176;C下2分钟。取出DNA纯化柱，保留收集管中的上清液。 
	注意：DNA 清除柱和收集管是总 RNA 提取试剂盒中的两个组分（参见 材料表).</li>
	<li>加入800 &#181;L buffer RL2 至 500 &#181;取步骤8.2中的上清液L，并轻轻混匀。 
	注意：缓冲液RL2是总RNA提取试剂盒中的组分之一（参见 材料表使用前，将120 mL无水乙醇加入60 mL RL2缓冲液中。</li>
	<li>转移 700 &#181;将步骤8.3中所得混合液的L加入嵌入收集管中的RNA专用柱，于8,550 × g离心 &#215; g 在4℃下 &#176;C下1分钟。弃去收集管中的废液。 
	注意：RNA专用柱是总RNA提取试剂盒中的一个组分（参见 材料表).</li>
	<li>重复步骤 8.4，处理步骤 8.3 中剩余的混合物。</li>
	<li>加入500 &#181;缓冲液RW1的L加入RNA专用柱中，8,550 ×g离心 &#215; g 在4 &#176;C 下 1 分钟。弃去收集管中的废液。 
	注意：缓冲液RW1是总RNA提取试剂盒中的组分之一（参见 材料表).</li>
	<li>加入700 &#181;L 缓冲液 RW2 加入 RNA 专用柱中，8,550 × g 离心 &#215; g 在 4 &#9702;1分钟。弃去收集管中的废液。重复步骤8.7一次。 
	注意：缓冲液 RW2 是总 RNA 提取试剂盒中的组分之一（参见 材料表).</li>
	<li>将仅含RNA的柱子放回收集管中，在8550 × g条件下离心 &#215; g 在 4 &#176;C离心2分钟，以去除残留的RW2缓冲液。</li>
	<li>将仅含RNA的洗脱液转移至新的收集管中，并滴加100 &#181;无RNase的ddH₂O265℃预热 &#176;将 C 加入膜中央的仅 RNA 柱中，置于 25 &#176;C下2分钟，通过8,550 × g离心收集RNA溶液 &#215; g 在 4 &#176;1 分钟，温度为 C。 
	注意：使用无RNase的ddH₂O2O 是总 RNA 提取试剂盒中的组分之一（参见 材料清单).</li>
	<li>加入4 &#181;5×反应缓冲液 L，1 &#181;oligo (dT) L18 引物，1 &#181;随机六聚体引物 L，1 &#181;L 基因特异性引物（见表1），1 &#181;L 酶混合液和 5 &#181;步骤8.9中RNA溶液的g加入100 &#181;L 8孔排管。用无RNase水将反应体系补至20 &#181;L.</li>
	<li>将系统的反应条件设置如下：（1）：95 &#176;℃，30 秒，1 个循环；（2）：95 &#176;C，5 秒，50 个循环，60 &#176;摄氏34度，34秒；（3）：95 &#176;C，5 秒，1 个循环，65 &#176;摄氏度，60 秒，97 &#176;摄氏度，1 秒；以及（4）：42 &#176;C，30 秒，1 个循环。执行 qRT-PCR 程序。 
	注意：通过2&#8722;&#916;&#916;CT 方法36,37用于qRT-PCR分析的各基因引物信息见表1。</li>
</ol>
9. 统计学分析
<ol>
	<li>以三次独立实验的均值 ± 标准差表示数据。</li>
	<li>使用图形与分析软件（见材料表）进行单因素方差分析（ANOVA），随后采用Tukey检验对多组间差异进行分析。本研究中，P &lt; 0.05 被定义为具有统计学显著性。</li>
</ol>

Salidroside's Mechanism in Suppressing MCF-7 Cell Migration and Proliferation

作者无任何利益冲突需要披露。

乳腺癌影响着各个年龄段的人群，造成无法估量的身心负担和巨大的经济压力1。乳腺癌每年发病率和死亡率不断上升，促使全球广泛关注在传统治疗之外寻找有效的基于草药的化合物疗法4,5。令人鼓舞的是，大量证据已揭示了Sal的抗癌作用24,25,38。然而，Sal在乳腺癌中的作用及其潜在的分子机制仍 largely 未知。本研究强调了Sal对人乳腺癌MCF-7细胞系增殖、迁移和侵袭的显著抑制作用。随后，我们揭示了Sal诱导MCF-7细胞凋亡和细胞周期阻滞的潜力。同时，这些数据还显示，Sal处理增加了细胞内ROS和Ca2+的水平。进一步对分子机制的探索表明，Sal在乳腺癌治疗中具有促进凋亡的作用，并影响PI3K-AKT-HIF-1α-Foxo1信号通路。
<p class="...

作为最常见的癌症诊断类型和最常见的恶性肿瘤之一，最新统计数据显示，到2020年全球乳腺癌病例达230万例，占所有癌症病例的11.7%1。乳腺癌的常见症状包括乳房压痛和刺痛感、乳房肿块和疼痛、乳头溢液、皮肤糜烂或凹陷，以及腋窝淋巴结肿大1,2。更令人担忧的是，每年乳腺癌新发病例数量和总体发病率仍以惊人的速度持续上升，占癌症相关死亡的6.9%1。目前，乳腺癌的干预手段仍主要依赖化疗、手术、放疗及综合治疗。尽管这些治疗方式可有效降低患者的复发率和死亡率，但长期治疗常导致多药耐药性、大面积脱发、恶心呕吐，以及严重的心理和精神负担2,3。值得注意的是，乳腺癌存在多器官转移的潜在风险，这也促使人们寻求新型的草药药物治疗来源4,5。
磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）介导的信号通路通过影响多个基因的剪接，在乳腺癌的生长、增殖和存活中发挥重要作用6。作为PI3K的下游信号感应蛋白，大量证据表明蛋白激酶B（AKT）可与雷帕霉素靶蛋白（mTOR）偶联，进一步促进乳腺癌的发展7,8,9。此外，抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路也被认为是抑制乳腺癌恶性增殖并诱导细胞凋亡的药物作用中的关键环节10,11,12。众所周知，肿瘤微环境中严重的缺氧状态会引发缺氧诱导因子1α（HIF-1α）的大量上调，从而进一步加剧乳腺癌的进展13,14,15。同时，AKT的激活也会导致HIF-1α过度积累，限制乳腺癌样本中的细胞凋亡16,17。有趣的是，PI3K-AKT-HIF-1α信号通路的激活已被证实参与多种癌症的病理进展和转移过程，包括肺癌18、结直肠癌19、卵巢癌20和前列腺癌21。除了受HIF-1α调控外，叉头框转录因子1（FoxO1）的过表达也由AKT信号激活所触发，从而促进乳腺癌细胞周期阻滞并抑制细胞凋亡22,23。综上所述，这些坚实的证据提示，抑制PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1信号级联通路可能成为乳腺癌药物治疗的一个潜在新靶点。
红景天苷（Sal）已被广泛证实具有抗癌作用24,25，抗缺氧26,27,28,29以及免疫增强的药理活性30它是一种浅棕色或棕色粉末，易溶于水，属于苯乙醇苷类化合物，化学分子式为C14H20O7 分子量为300.331,32现代药理学研究表明，Sal可通过抑制PI3K-AKT-mTOR信号通路促进胃癌细胞的凋亡。24进一步的证据还表明，Sal处理通过抑制PI3K-AKT-HIF-1α信号通路，可能增强癌细胞对化疗药物的敏感性，从而促进癌细胞凋亡。25证据还表明，Sal 能通过促进人乳腺癌 MCF-7 细胞的凋亡来抑制细胞迁移和侵袭，并导致细胞周期阻滞。33,34然而，Sal是否能够调控PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1信号通路并抑制MCF-7细胞的恶性增殖，仍有待阐明。因此，本实验方案旨在探讨Sal对MCF-7细胞迁移、侵袭、细胞周期及凋亡的影响。 通过 PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 通路。整合的研究策略包括常规、低成本且独立的实验，如细胞迁移和侵袭评估、流式细胞术检测凋亡和细胞周期、活性氧（ROS）和 Ca2+ 荧光测定等方法可为中药抗癌研究的实验整体设计提供参考。本研究的实验流程如图所示。 图1.

<table><tbody><tr><td>1% 青霉素/链霉素</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>AKT 抗体</td><td>ImmunoWay Biotechnology Company</td><td>YT0185</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V-FITC/PI 检测试剂盒</td><td>MultiSciences Biotech Co., Ltd.</td><td>AP101</td><td></td></tr><tr><td>全自动酶标仪</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax iD5</td><td></td></tr><tr><td>Bax 抗体</td><td>Cell Signaling Technology, Inc.</td><td>#5023</td><td></td></tr><tr><td>BCA 蛋白定量试剂盒</td><td>Biosharp Life Sciences</td><td>BL521A</td><td></td></tr><tr><td>Bcl-2 抗体</td><td>Cell Signaling Technology, Inc.</td><td>#15071</td><td></td></tr><tr><td>Bim 抗体</td><td>Cell Signaling Technology, Inc.</td><td>#2933</td><td></td></tr><tr><td>Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;&amp;ndash;ATP酶活性检测试剂盒</td><td>南京建成生物工程研究所</td><td>A070-4-2</td><td></td></tr><tr><td>细胞计数试剂盒-8</td><td>Biosharp Life Sciences</td><td>BS350B</td><td></td></tr><tr><td>细胞周期染色试剂盒</td><td>MultiSciences Biotech Co., Ltd.</td><td>CCS012</td><td></td></tr><tr><td>cleaved caspase-3</td><td>Cell Signaling Technology, Inc.</td><td>#9661</td><td></td></tr><tr><td>cleaved caspase-7</td><td>Cell Signaling Technology, Inc.</td><td>#8438</td><td></td></tr><tr><td>cleaved caspase-9</td><td>Cell Signaling Technology, Inc.</td><td>#20750</td><td></td></tr><tr><td>结晶紫溶液</td><td>碧云天生物技术</td><td>C0121</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 高糖培养基</td><td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td><td>G4510</td><td></td></tr><tr><td>盐酸多柔比星</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-15142</td><td></td></tr><tr><td>ECL 化学发光液</td><td>Biosharp Life Sciences</td><td>BL520B</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Procell Life Science &amp; Technology Co., Ltd.</td><td>164210</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>BD</td><td>FACSCanto &lt;img alt=&quot;公式 1&quot; src=&quot;/files/ftp_upload/65634/65634eq01.jpg&quot; style=&quot;margin: auto;&quot;/&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>碧云天生物技术</td><td>S1060</td><td></td></tr><tr><td>FoxO1 抗体</td><td>ImmunoWay Biotechnology Company</td><td>YT1758</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔 IgG 二抗</td><td>MultiSciences Biotech Co., Ltd.</td><td>70-GAR0072</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 软件</td><td>La Jolla</td><td>版本 6.0</td><td></td></tr><tr><td>HIF-1&amp;alpha; 抗体</td><td>Affinity Biosciences</td><td>BF8002</td><td></td></tr><tr><td>人乳腺癌细胞系 MCF-7</td><td>Procell Life Science &amp; Technology Co., Ltd.</td><td>CL-0149</td><td></td></tr><tr><td>上样缓冲液</td><td>Biosharp Life Sciences</td><td>BL502B</td><td></td></tr><tr><td>LY294002</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-10108</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Thermo&amp;nbsp;</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>mTOR 抗体</td><td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td><td>GB11405</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;&amp;ndash;K&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;&amp;ndash;ATP酶活性检测试剂盒</td><td>南京建成生物工程研究所</td><td>A070-2-2</td><td></td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Olympus</td><td>IX71PH</td><td></td></tr><tr><td>p-AKT 抗体</td><td>ImmunoWay Biotechnology Company</td><td>YP0006</td><td></td></tr><tr><td>PI3K 抗体</td><td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td><td>GB11525</td><td></td></tr><tr><td>p-PI3K 抗体</td><td>Affinity Biosciences</td><td>AF3241</td><td></td></tr><tr><td>定量 Western 印迹成像系统</td><td>Touch Image Pro</td><td>eBlot</td><td></td></tr><tr><td>逆转录第一链 cDNA 合成试剂盒</td><td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td><td>G3330-100</td><td></td></tr><tr><td>活性氧检测试剂盒</td><td>碧云天生物技术</td><td>S0033S</td><td>包含 DCFH-DA 荧光探针</td></tr><tr><td>红景天苷</td><td>成都赫柏睿生物有限公司</td><td>H-040</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE 试剂盒</td><td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td><td>G2003-50T</td><td></td></tr><tr><td>总 RNA 提取试剂盒</td><td>Foregene</td><td>RE-03014</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>HyClone</td><td>SH30042.01</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-actin</td><td>Affinity Biosciences</td><td>AF7018</td><td></td></tr></tbody></table>

探究红景天苷抑制mcf-7细胞增殖与迁移的药理作用及分子机制

Exploring the Pharmacological Action and Molecular Mechanism of Salidroside in Inhibiting MCF-7 Cell Proliferation and Migration

红景天苷（Sal）具有抗癌、抗缺氧和抗炎的药理活性。然而，其抗乳腺癌的作用机制尚未完全阐明。因此，本实验旨在解析Sal在调控人乳腺癌MCF-7细胞恶性增殖过程中PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1通路的潜在作用。首先，通过CCK-8和细胞划痕实验评估Sal对MCF-7细胞的药理活性。此外，采用迁移和Matrigel侵袭实验检测MCF-7细胞的抵抗能力。对于细胞凋亡和细胞周期实验，分别使用annexin V-FITC/PI和细胞周期染色检测试剂盒对MCF-7细胞进行处理，并进行流式细胞术分析。通过DCFH-DA和Fluo-4 AM免疫荧光染色检测活性氧（ROS）和Ca2+水平。使用相应的商用试剂盒测定Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的活性。进一步通过Western blot和qRT-PCR分析分别检测凋亡相关以及PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1通路中蛋白和基因的表达水平。研究发现，Sal处理以剂量依赖的方式显著抑制MCF-7细胞的增殖、迁移和侵袭能力。同时，Sal处理也显著诱导MCF-7细胞发生凋亡和细胞周期阻滞。免疫荧光实验显示，Sal明显促进MCF-7细胞中ROS和Ca2+的生成。进一步数据证实，Sal可上调促凋亡蛋白Bax、Bim、cleaved caspase-9/7/3及其相应基因的表达水平。与此一致的是，Sal干预显著降低Bcl-2、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、mTOR、HIF-1α和FoxO1蛋白及其相应基因的表达。综上所述，Sal可作为一种潜在的植物来源化合物用于乳腺癌治疗，其可能通过抑制PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1通路，减少MCF-7细胞的恶性增殖、迁移和侵袭。

Sal对MCF-7细胞过度增殖的抑制作用及其对伤口愈合延迟的影响 
为探究Sal对乳腺癌的潜在作用，我们首先采用细胞增殖毒性实验和划痕实验，检测其对人乳腺癌MCF-7细胞系的抗癌特性。将这些细胞与一系列浓度梯度的Sal（5-320 µM）中培养24小时，采用CCK-8法检测细胞增殖情况。结果显示，Sal对细胞增殖具有剂量依赖性抑制作用，在细胞活力下降50%时 40 µM (图2A）。Sal 浓度 20 µM, 40 µM，以及 80 µM 随后选择用于后续时间点和伤口愈合评估。结果表明 图2B 结果显示，Sal可随着时间的推移抑制MCF-7细胞的活力，在与药物共孵育24小时后，MCF-7细胞活力下降50%。 图2C-R 通过划痕实验测定，Sal处理对MCF-7细胞的伤口愈合具有抑制作用。进一步的细胞划痕实验也证实，经Sal处理培养24 h后20 µM, ...

本实验方案描述了一种全面的策略，用于评估红景天苷在抑制MCF-7细胞增殖和迁移方面的药理作用及其作用机制。

探究红景天苷抑制MCF-7细胞增殖与迁移的药理作用及分子机制

红景天苷（Sal）具有抗癌、抗缺氧和抗炎等药理活性。然而，其抗乳腺癌作用的内在机制尚不明确。

我们致力于探索源自天然产物的活性化合物及其在治疗乳腺癌方面的潜力。具体而言，我们的目标是阐明红景天苷的药理作用及其在对抗乳腺癌过程中的分子机制。目前，尚缺乏可靠的实验技术来验证红景天苷在治疗乳腺癌中的分子靶点。该领域的一项重要发现是，MCF-7 细胞可能通过调控 PI3K-AKT-HIF-1a-FoxO1 信号通路实现增殖与迁移。本实验室未来的研究重点是深入探索乳腺癌发生、发展、预后及转归的病理机制。此外，我们正在筛选来源于天然资源的有效小分子天然药物，以期用于乳腺癌的预防与治疗。首先，在六孔板中培养2毫升MCF-7细胞，直至细胞融合度达到90%。在生长形成的单层细胞中，使用无菌移液枪头在中央划出一条直线划痕。随后在不同时间点使用光学显微镜拍摄图像。对于Transwell实验，将MCF-7细胞悬浮于无血清培养基中。然后将细胞接种至Transwell小室的上室，上室可预先包被或不包被Matrigel。在Transwell小室底部加入含血清的DMEM完全培养基，作为化学诱导剂。24 小时后，移除上室中的细胞，并用甲醇固定剩余的侵袭性和迁移细胞。使用结晶紫溶液对 MCF-7 细胞进行染色。随后，使用光学显微镜观察染色后的细胞。观察到红景天苷对细胞增殖具有剂量依赖性的抑制作用，在40 µM时细胞活力下降50%。此外，红景天苷可随时间抑制MCF-7细胞的活力，共孵育24小时后MCF-7细胞活力降低50%。伤口划痕实验显示，红景天苷处理对MCF-7细胞具有抑制作用。此外，红景天苷处理显著抑制了MCF-7细胞的异常迁移和侵袭能力。使用二辛可宁酸试剂盒，按照制造商说明书测定裂解后MCF-7细胞的蛋白浓度。将裂解后的细胞样本加入96孔板中相应的分组孔内。然后加入工作液，在37摄氏度下孵育5分钟。最后，使用功能型酶标仪在636纳米处测定吸光度值。红景天苷抑制了钠钾ATP酶和钙ATP酶的酶活性，表明其在促进线粒体功能障碍方面可能具有潜在作用。首先，收集经胰蛋白酶消化的 MCF-7 细胞。接着，用 XN5 FITC 和碘化丙啶对 PBS 悬浮的细胞进行染色，孵育 20 分钟。然后使用流式细胞仪检测凋亡细胞的数量。进行细胞周期分析时，将重悬的细胞与碘化丙啶溶液在新试管中混合，室温避光孵育30分钟，然后使用流式细胞仪检测样品。红景天苷增加了处于早期和晚期阶段性阶段的MCF-7细胞数量。与此同时，与对照组相比，红景天苷处理显著增加了 G0/G1 期细胞数量，同时降低了 S 期细胞的比例。向 MCF-7 细胞中加入 10 µmol 的 DCFH-DA 荧光探针，在 37 °C 下孵育 20 分钟。孵育结束后，用 PBS 洗涤细胞三次，以去除多余的 DCFH-DA。接下来，使用荧光显微镜，以488纳米的激发波长和525纳米的发射波长检测荧光强度。将MCF-7细胞与5 µM的Fluo-4 AM荧光探针溶液在37°C下孵育45分钟。用PBS洗涤细胞三次后，使用激发波长为488纳米、发射波长为516纳米的荧光显微镜测定荧光强度。红景天苷显著增强了DCFH-DA免疫荧光染色显示的ROS荧光信号。一致地，红景天苷干预也明显提高了Fluo-4 AM免疫荧光染色所证实的钙离子生成。首先，将含有不同药物的2毫升MCF-7细胞加入6孔板的各孔中。将细胞培养物在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育24小时。在4摄氏度下以560×g离心3分钟收集细胞。随后用预冷的PBS洗涤细胞两次，每次洗涤之间以560×g离心3分钟。向洗涤后的细胞中加入 50 微升裂解缓冲液，将样品置于冰浴中 15 分钟。然后在 4°C 条件下以 8,550 ×g 离心 10 分钟，收集上清液蛋白样品。按 4:1 的比例将蛋白样品与上样缓冲液混合。接下来，在金属浴中于100摄氏度变性混合物10分钟。然后将混合物在室温下冷却。使用10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质样品。将蛋白质转移至0.22微米的PVDF膜上。用5% BSA封闭膜后，在4摄氏度下与相应的初级抗体孵育过夜。次日，在37摄氏度下与羊抗兔IgG二抗孵育两小时。然后使用ECL化学发光溶液对膜进行显影，并利用非接触式定量Western印迹成像系统采集图像。Western印迹结果显示，红景天苷处理促进了促凋亡因子CC9、CC7、CC3、Bim和Bax的蛋白表达，同时抑制了抗凋亡蛋白BCL2的表达。红景天苷显著降低了PI3K磷酸化水平与总PI3K的比值以及AKT磷酸化水平与总AKT的比值。同时，mTOR、HIF-1α 和 FoxO1 的蛋白表达也显著受到抑制。在 4°C 条件下，以 560 × g 离心 3 分钟收集 MCF-7C 细胞。向 5 × 10⁶ 个细胞中加入 500 微升缓冲 RL1 溶液，充分混匀直至无可见细胞团块。接下来，将细胞匀浆转移至嵌入收集管中的DNA纯化柱。在4°C条件下，以8,550G离心2分钟。离心后，取出DNA纯化柱，保留收集管中的上清液。加入800微升RL2缓冲液和500微升上清液，轻轻混匀。接着，将700微升混合液转移至嵌入收集管中的RNA专用柱。在4°C条件下，以8,550×g离心1分钟。然后弃去收集管中的流穿液。先用500毫升RW1缓冲液洗涤RNA专用柱，再用700毫升RW2缓冲液洗涤，每次洗涤均在4°C条件下以8,550×g离心1分钟。再次离心以去除残留的RW2缓冲液后，将RNA专用柱转移至新的收集管中。向RNA专用柱的膜中心加入100微升预热至65摄氏度的无RNA酶去离子水，静置两分钟。然后在4摄氏度下以8,550 ×g离心一分钟，收集RNA溶液。配制PCR反应体系，随后设定系统的PCR反应条件。执行qRT-PCR实验。qRT-PCR结果显示，红景天苷处理促进了促凋亡因子CC9、CC7、CC3、Bim和Bax的基因表达，同时抑制了抗凋亡因子BCL2的基因表达。此外，红景天苷给药降低了PI3K、AKT、mTOR、HIF-1α和FoxO1的基因表达水平。

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