探究红景天苷抑制MCF-7细胞增殖与迁移的药理作用及分子机制

我们致力于探索源自天然产物的活性化合物及其在治疗乳腺癌方面的潜力。具体而言，我们的目标是阐明红景天苷的药理作用及其在对抗乳腺癌过程中的分子机制。目前，尚缺乏可靠的实验技术来验证红景天苷在治疗乳腺癌中的分子靶点。

该领域的一项重要发现是，MCF-7 细胞可能通过调控 PI3K-AKT-HIF-1a-FoxO1 信号通路实现增殖与迁移。本实验室未来的研究重点是深入探索乳腺癌发生、发展、预后及转归的病理机制。此外，我们正在筛选来源于天然资源的有效小分子天然药物，以期用于乳腺癌的预防与治疗。

首先，在六孔板中培养2毫升MCF-7细胞，直至细胞融合度达到90%。在生长形成的单层细胞中，使用无菌移液枪头在中央划出一条直线划痕。随后在不同时间点使用光学显微镜拍摄图像。

对于Transwell实验，将MCF-7细胞悬浮于无血清培养基中。然后将细胞接种至Transwell小室的上室，上室可预先包被或不包被Matrigel。在Transwell小室底部加入含血清的DMEM完全培养基，作为化学诱导剂。

24 小时后，移除上室中的细胞，并用甲醇固定剩余的侵袭性和迁移细胞。使用结晶紫溶液对 MCF-7 细胞进行染色。随后，使用光学显微镜观察染色后的细胞。

观察到红景天苷对细胞增殖具有剂量依赖性的抑制作用，在40 µM时细胞活力下降50%。此外，红景天苷可随时间抑制MCF-7细胞的活力，共孵育24小时后MCF-7细胞活力降低50%。伤口划痕实验显示，红景天苷处理对MCF-7细胞具有抑制作用。

此外，红景天苷处理显著抑制了MCF-7细胞的异常迁移和侵袭能力。使用二辛可宁酸试剂盒，按照制造商说明书测定裂解后MCF-7细胞的蛋白浓度。将裂解后的细胞样本加入96孔板中相应的分组孔内。

然后加入工作液，在37摄氏度下孵育5分钟。最后，使用功能型酶标仪在636纳米处测定吸光度值。红景天苷抑制了钠钾ATP酶和钙ATP酶的酶活性，表明其在促进线粒体功能障碍方面可能具有潜在作用。

首先，收集经胰蛋白酶消化的 MCF-7 细胞。接着，用 XN5 FITC 和碘化丙啶对 PBS 悬浮的细胞进行染色，孵育 20 分钟。然后使用流式细胞仪检测凋亡细胞的数量。

进行细胞周期分析时，将重悬的细胞与碘化丙啶溶液在新试管中混合，室温避光孵育30分钟，然后使用流式细胞仪检测样品。红景天苷增加了处于早期和晚期阶段性阶段的MCF-7细胞数量。

与此同时，与对照组相比，红景天苷处理显著增加了 G0/G1 期细胞数量，同时降低了 S 期细胞的比例。向 MCF-7 细胞中加入 10 µmol 的 DCFH-DA 荧光探针，在 37 °C 下孵育 20 分钟。孵育结束后，用 PBS 洗涤细胞三次，以去除多余的 DCFH-DA。

接下来，使用荧光显微镜，以488纳米的激发波长和525纳米的发射波长检测荧光强度。将MCF-7细胞与5 µM的Fluo-4 AM荧光探针溶液在37°C下孵育45分钟。用PBS洗涤细胞三次后，使用激发波长为488纳米、发射波长为516纳米的荧光显微镜测定荧光强度。

红景天苷显著增强了DCFH-DA免疫荧光染色显示的ROS荧光信号。一致地，红景天苷干预也明显提高了Fluo-4 AM免疫荧光染色所证实的钙离子生成。首先，将含有不同药物的2毫升MCF-7细胞加入6孔板的各孔中。

将细胞培养物在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育24小时。在4摄氏度下以560×g离心3分钟收集细胞。随后用预冷的PBS洗涤细胞两次，每次洗涤之间以560×g离心3分钟。

向洗涤后的细胞中加入 50 微升裂解缓冲液，将样品置于冰浴中 15 分钟。然后在 4°C 条件下以 8,550 ×g 离心 10 分钟，收集上清液蛋白样品。按 4:1 的比例将蛋白样品与上样缓冲液混合。

接下来，在金属浴中于100摄氏度变性混合物10分钟。然后将混合物在室温下冷却。使用10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质样品。

将蛋白质转移至0.22微米的PVDF膜上。用5% BSA封闭膜后，在4摄氏度下与相应的初级抗体孵育过夜。次日，在37摄氏度下与羊抗兔IgG二抗孵育两小时。

然后使用ECL化学发光溶液对膜进行显影，并利用非接触式定量Western印迹成像系统采集图像。Western印迹结果显示，红景天苷处理促进了促凋亡因子CC9、CC7、CC3、Bim和Bax的蛋白表达，同时抑制了抗凋亡蛋白BCL2的表达。红景天苷显著降低了PI3K磷酸化水平与总PI3K的比值以及AKT磷酸化水平与总AKT的比值。

同时，mTOR、HIF-1α 和 FoxO1 的蛋白表达也显著受到抑制。在 4°C 条件下，以 560 × g 离心 3 分钟收集 MCF-7C 细胞。向 5 × 10⁶ 个细胞中加入 500 微升缓冲 RL1 溶液，充分混匀直至无可见细胞团块。

接下来，将细胞匀浆转移至嵌入收集管中的DNA纯化柱。在4°C条件下，以8,550G离心2分钟。离心后，取出DNA纯化柱，保留收集管中的上清液。

加入800微升RL2缓冲液和500微升上清液，轻轻混匀。接着，将700微升混合液转移至嵌入收集管中的RNA专用柱。在4°C条件下，以8,550×g离心1分钟。

然后弃去收集管中的流穿液。先用500毫升RW1缓冲液洗涤RNA专用柱，再用700毫升RW2缓冲液洗涤，每次洗涤均在4°C条件下以8,550×g离心1分钟。再次离心以去除残留的RW2缓冲液后，将RNA专用柱转移至新的收集管中。

向RNA专用柱的膜中心加入100微升预热至65摄氏度的无RNA酶去离子水，静置两分钟。然后在4摄氏度下以8,550 ×g离心一分钟，收集RNA溶液。配制PCR反应体系，随后设定系统的PCR反应条件。

执行qRT-PCR实验。qRT-PCR结果显示，红景天苷处理促进了促凋亡因子CC9、CC7、CC3、Bim和Bax的基因表达，同时抑制了抗凋亡因子BCL2的基因表达。此外，红景天苷给药降低了PI3K、AKT、mTOR、HIF-1α和FoxO1的基因表达水平。