Name: 在脑电图记录期间从大鼠的侧尾静脉采集脑脊液和血液 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-01T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: 学习在癫痫大鼠视频脑电图监测期间同步采集脑脊液和血浆样本的方法。该技术通过改进的侧尾静脉采血法获得无溶血高质量血浆，结合枕骨大池穿刺术采集脑脊液，用于识别癫痫诊断和预后生物标志物。

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本研究由欧盟“地平线2020”计划（项目征集编号：H2020-FETOPEN-2018-2020）资助，资助协议号为964712（PRIME项目；资助对象：M. Simonato）。

Cerebrospinal Fluid and Blood Withdrawal from Rats with Concurrent EEG Recording

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作者无任何利益冲突需要披露。

本研究介绍了一种易于掌握的大鼠脑脊液和血液采集技术，该技术不仅可用于癫痫模型的研究，也可用于阿尔茨海默病、帕金森病或多发性硬化等其他神经系统疾病或病症的研究。在癫痫研究中，将这两种采样方法与视频脑电图（video-EEG）相结合，特别适用于探索不同可溶性分子水平与癫痫发作活动之间的相关性。正是出于这一特定目的，采用了持续的视频脑电图记录：i）以准确诊断癫痫，或 ii）监测疾病进展的不同阶段，和/或 iii）将采样时间与自发性癫痫发作的发生相关联。这些采样技术可在麻醉大鼠中进行，因而造成的应激最小。
关键步骤、故障排除与方法局限性 
该实验方案包含若干关键技术步骤。首先，初次尝试时可能难以准确定位脑脊液采集位置。若操作者首次未能成功穿刺小脑延髓池，则后续任何尝试均会导致血液污染，因为动物会在针孔处出血。从这一角度来看，采集成功与否在很大程度上依赖于操作者的技能。其次，采血过程中的某些步骤需要特别注意。特别是，若操作者用乙醇过度摩擦尾部、用于尾静脉扩张的水温超过42 °C，或采集管中的血液与抗凝剂混合过于剧烈，均存在较高的溶血风险。在慢性癫痫...

脑脊液（CSF）和血液采样对于在临床前和临床研究中识别和验证癫痫生物标志物具有重要意义1,2。目前，癫痫的诊断以及大多数关于癫痫生物标志物的研究主要依赖脑电图（EEG）和神经影像学技术3,4,5。然而，这些方法存在若干局限性。除常规头皮记录外，在许多情况下，脑电图需要采用深度电极等侵入性技术6。脑成像方法的时间和空间分辨率较低，且相对昂贵、耗时较长7,8。因此，识别非侵入性、低成本且基于体液的生物标志物将提供一种极具吸引力的替代方案。此外，这些体液生物标志物还可与现有的诊断方法相结合，以提高其预测能力。
癫痫患者通常需要接受脑电图（EEG）9,10 和血液采样11,12,13,14，许多患者还需进行脑脊液（CSF）采集，以排除危及生命的病因（如急性感染、自身免疫性脑炎）15。这些血液和脑脊液样本可用于旨在识别癫痫生物标志物的临床研究。例如，Hogg 及其同事发现，人类癫痫患者血浆中三种tRNA片段的升高早于癫痫发作的发生14。类似地，人脑脊液和血清中白细胞介素-1β（IL-1β）的水平，以脑脊液与血清中IL-1β水平的比值表示，可预测创伤性脑损伤后创伤后癫痫的发生16。这些研究凸显了体液样本在癫痫生物标志物研究中的重要性，但也面临临床试验固有的多种局限性，例如抗癫痫药物（AEDs）在血液中的混杂因素、病因信息常缺失、对照组不足、患者数量有限等17,18。
临床前研究为探索生物液体中的分子作为癫痫潜在生物标志物提供了其他机会。事实上，在进行脑电图（EEG）记录的同时，可以从动物体内采集血浆和/或脑脊液（CSF）。此外，可在实验的多个不同日期重复采样，并可使用大量在年龄、性别和癫痫损伤程度上相匹配的对照动物，以提高研究的可靠性。本文详细描述了一种在脑电图监测的大鼠中，通过枕大池采集脑脊液并同时经尾静脉采集血浆的灵活技术。该技术相较于其他方法具有多项优势。通过使用蝶形针方法，可在不损害脑电图电极或其他头部植入装置功能的前提下，多次采集脑脊液。这相对于鞘内导管采集方法是一种改进，后者具有相对较高的感染风险。此外，本文所述用于血液采集的自由滴落法优于其他尾静脉采血方法，因其显著降低了溶血风险——血液不经过导管，且未施加负压真空。若在严格的无菌条件下操作，动物感染风险极低。另外，通过从动物尾部末端开始采血，可实现多次重复取样。此类技术易于掌握，可广泛应用于多种中枢神经系统疾病的临床前研究中。

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer Safety-Lok 血液采集套装</td><td>BD Italy SpA, Milan, Italy</td><td>367246</td><td>材料</td></tr><tr><td>血液采集管（Microtainer K2E）</td><td>BD Italy SpA, Milan, Italy</td><td>365975</td><td>材料</td></tr><tr><td>蝶形带翼输液套件 23G x 3/4'' 0.6 x 19 mm</td><td>Nipro, Osaka, Japan&amp;nbsp;</td><td>PSY-23-ET-ICU</td><td>材料</td></tr><tr><td>ALC PK 130R 冷冻离心机</td><td>DJB Labcare Ltd, Buckinghamshire, England</td><td>112000033</td><td>材料</td></tr><tr><td>3-0 棉质缝合线</td><td>Ethicon, Johnson &amp;amp; Johnson surgical technologies, Raritan, New Jersey, USA</td><td>7343H</td><td>材料</td></tr><tr><td>地西泮 5 mg/2ml，Solupam</td><td>Dechra Veterinary Products, Torino, Italy</td><td>105183014 (AIC)</td><td>溶液</td></tr><tr><td>遥测脑电图设置用数字视频 8 通道媒体记录系统</td><td>Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA</td><td>PNM-VIDEO-008</td><td>设备</td></tr><tr><td>有线脑电图设置用数字视频监控系统</td><td>EZVIZ Network, Hangzhou, 中国台湾</td><td>EZVIZ (V5.3.2)</td><td>设备</td></tr><tr><td>基于稳定过氧化物和季铵盐活性的消毒剂</td><td>Laboratoire Garcin-Bactinyl, France</td><td>LB 920111</td><td>溶液</td></tr><tr><td>假引导套管 8 mm</td><td>Agn Tho's, Lindig&amp;ouml;, Sweden</td><td>CXD-8</td><td>材料</td></tr><tr><td>三通道双绞电极</td><td>Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA</td><td>MS333/3-B/SPC</td><td>材料</td></tr><tr><td>立体定位手术用电极固定器</td><td>Agn Tho's, Lindig&amp;ouml;, Sweden</td><td>1776-P1</td><td>设备</td></tr><tr><td>Eppendorf BioSpectrometer basic</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td><td>6137</td><td>设备</td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; Eppendorf PCR 管 0.2 mL</td><td>Eppendorf Srl, Milan, Italy</td><td>30124332</td><td>材料</td></tr><tr><td>Eppendorf &amp;mu;比色皿 G1.0</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td><td>6138</td><td>设备</td></tr><tr><td>大鼠用柔性饲喂针头 17G</td><td>Agn Tho's, Lindig&amp;ouml; Sweden</td><td>7206</td><td>材料</td></tr><tr><td>Grass Technology 装置</td><td>Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA</td><td>M665G08</td><td>设备（AS40 放大器、头盒、连接电缆、Telefactor 型号 RPSA S40）</td></tr><tr><td>异氟烷 100%，IsoFlo</td><td>Zoetis, Rome, Italy</td><td>103287025 (AIC)</td><td>溶液</td></tr><tr><td>氯胺酮（Imalgene）</td><td>Merial, Toulouse, France</td><td>221300288 (AIC)</td><td>溶液</td></tr><tr><td>氯化锂&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Milan, Italy</td><td>L9650</td><td>材料</td></tr><tr><td>微注射套管 31G 9 mm</td><td>Agn Tho's, Lindig&amp;ouml; Sweden</td><td>CXMI-9</td><td>材料</td></tr><tr><td>MP150 模块化数据采集与&amp;nbsp;分析系统&amp;nbsp;</td><td>Biopac, Goleta, California, USA</td><td>MP150WSW</td><td>设备</td></tr><tr><td>眼科兽用软膏，Hylo night</td><td>Ursapharm, Milan, Italy</td><td>941791927 (AIC)</td><td>材料</td></tr><tr><td>盐酸匹鲁卡品</td><td>Sigma-Aldrich, Milan, Italy</td><td>P6503</td><td>材料</td></tr><tr><td>带接头的聚四氟乙烯管</td><td>Agn Tho's, Lindig&amp;ouml;, Sweden</td><td>JT-10</td><td>材料</td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>0.9% NaCl，pH 调至 7.0</td><td></td><td>溶液</td></tr><tr><td>氢溴酸东莨菪碱三水合物</td><td>Sigma-Aldrich, Milan, Italy</td><td>S2250</td><td>材料</td></tr><tr><td>硝酸甲基东莨菪碱</td><td>Sigma-Aldrich, Milan, Italy</td><td>S1876</td><td>材料</td></tr><tr><td>1% 磺胺嘧啶银乳膏&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sofar, Trezzano Rosa, Milan, Italy</td><td>025561010 (AIC)</td><td>材料</td></tr><tr><td>Simplex 快速牙科甲基丙烯酸酯水泥&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom</td><td>ACR811</td><td>材料</td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>David Kopf Instruments, Los Angeles, CA, USA</td><td>Model 963</td><td>设备</td></tr><tr><td>蔗糖溶液</td><td>10% 蔗糖溶于蒸馏水中</td><td>自制</td><td>溶液</td></tr><tr><td>1 mL 注射器&amp;nbsp;</td><td>Biosigma, Cona, Venezia, Italy</td><td>20,71,26,03,00,350</td><td>材料</td></tr><tr><td>遥测仪</td><td>Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA</td><td>CTA-F40</td><td>材料</td></tr><tr><td>遥测脑电图波形分析仪</td><td>Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA</td><td>NeuroScore v3-0</td><td>设备</td></tr><tr><td>遥测系统</td><td>Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA</td><td>硬件加软件 Ponemah core 6.51</td><td>设备</td></tr><tr><td>盐酸赛拉嗪</td><td>Sigma-Aldrich, Milan, Italy</td><td>X1251</td><td>材料</td></tr></tbody></table>

在大鼠脑电图记录期间通过尾侧静脉采集脑脊液和血液

Sampling Cerebrospinal Fluid and Blood from Lateral Tail Vein in Rats During EEG Recordings

由于体液成分反映了多种生理和病理动态，因此在许多实验背景下常采集生物液体样本，以检测感兴趣的分子，如激素、生长因子、蛋白质或小非编码RNA。一个具体实例是在癫痫生物标志物研究中采集生物液体。在这些研究中，理想的做法是通过平行采集脑脊液（CSF）和血浆，并考虑采样与癫痫发作之间的时间间隔，来比较分子在脑脊液和血浆中的水平。结合脑脊液和血浆采样，并在癫痫动物中进行视频脑电图（EEG）监测，是一种有前景的潜在诊断和预后生物标志物验证方法。本文描述了一种在持续视频脑电图监测的癫痫大鼠中，从枕大池采集脑脊液并同时从尾侧尾静脉采血的技术。该方法相较于其他常用技术具有显著优势：采样快速，疼痛和侵入性最小，且麻醉时间更短。此外，该方法可用于固定式或遥测脑电图记录的大鼠，并可在多个实验日中重复使用。通过缩短异氟烷麻醉时间以减少采样带来的应激，所测得的生物分子水平能更真实地反映其在体液中的实际浓度。根据所用分析检测方法的可行性，该技术可在进行脑电图记录的同时，用于测定多种不同分子的水平。

报告了在9只对照组和18只慢性癫痫大鼠中进行的不同脑脊液（CSF）和血液采集操作的结果，所有大鼠均在癫痫持续状态（SE）后1个月植入电极，结果以成功率表示。植入电极后，所有大鼠均接受为期1个月的视频脑电图（video-EEG）监测，在实验最后两周内每3天进行一次脑脊液联合血液采集，共采集5次（即SE后第52、55、58、61和64天，dpSE）。通过不同动物多次采集的数据，比较了双头植入装置大鼠（带有用于脑脊液采集的导管）与仅植入系绳式或遥测电极动物（通过小脑延髓池穿刺采集脑脊液）在脑脊液采集成功率方面的差异（表1）。在不同动物中，评估了真空采血或尾部挤血对血浆样本质量的影响（表2）。为此，采用414 nm波长的紫外分光光度法检测游离血红蛋白。统计分析使用商业软件进行，采用Kruskal-Wallis检验或单因素方差分析（one-way ANOVA），并进行事后Tukey多重比较检验（p&lt;0.05被认为具有统计学显著性）。数据以均值±标准误（SEM）表示。
在植入导管和穿刺的大鼠中多次采集脑脊...

该方案展示了对癫痫大鼠进行重复的脑脊液和血液采集，同时并行持续视频脑电图（EEG）监测。这些操作对于探索多种体液分子变化与癫痫发作活动之间的可能关联至关重要。

由于体液成分反映了多种生理和病理动态变化，生物液体样本在许多研究和临床检测中被广泛采集。

在我们的研究中，旨在寻找癫痫潜在的诊断和预后生物标志物。为了在生物液体中验证这些标志物，我们比较了大鼠脑脊液和血浆中特定物质的水平与自发性癫痫发作的发生情况。迄今为止，一些小的非编码核糖核酸（如miRNA或tRNA片段）已被鉴定为癫痫的循环生物标志物，但其作为癫痫有效且可靠的诊断或预后工具的实用性仍有待证实。我们研究癫痫的不同循环标志物。在进行脑电图记录以识别自发性癫痫发作时，我们常规采集癫痫大鼠的血浆和脑脊液。由于我们在多天内重复采样，因此可以将标志物水平与单次癫痫发作或其累积效应进行关联分析。目前的挑战是在不引起动物因操作而产生应激性发作的前提下，获得足量且高质量的样本，以用于后续分析。对于癫痫患者，尤其是具有预后意义或高风险的生物标志物，迫切需要发现相关的生物标志物。通过与脑电图（EEG）发作监测同步采集血浆和脑脊液样本，可显著提高发现合适标志物的机会。我们采用的尾静脉阻断采血技术可获得高质量、无溶血的血浆样本，该方法无需使用真空装置或挤压尾部采血。我们用于采集脑脊液的枕大池穿刺技术，与植入导管系统相比，具有更好的无菌性，且头部植入物脱落的风险更低。开始时，将动物放入清洁的笼子中，置于记录室内，使其适应新环境。将笼子放入法拉第笼中，以避免环境电磁场对脑电图信号的干扰。将记录电缆的一端连接到记录设备。使用电压表测量电势，并区分接地电极和参考电极。然后将水泥罩固定在动物头部，并将记录电缆的另一端插入固定在大鼠头部的电极连接器中。使用换向器来平衡记录电缆的重量，使动物能够自由活动而不会缠绕电缆。在开始记录之前，检查用于采集和处理脑电图数据的所有设置。确保应用适当的滤波和采样率，以避免脑电图（EEG）信号中出现伪迹和噪声。在监视器上启动视频记录和脑电图记录。检查特定频段随时间变化的功率，以确保记录的信号符合预期的脑电图信号特征。定期检查脑电图（EEG）轨迹，同时观察动物状态。如果记录电缆从电极连接器上脱落，请重新连接，并检查是否存在清晰的 EEG 信号。通过筛查脑电图记录来分析脑电图信号，并识别类似癫痫发作的活动。通过查看与脑电图同步采集的视频记录，确认可能的惊厥性癫痫发作。首先，使用1%的乙二胺四乙酸钾（potassium EDTA）溶液涂覆蝴蝶针及其导管。在针头后方切断导管，以便逐滴收集血液。将麻醉后的大鼠置于立体定位仪上，并通过面罩持续维持麻醉状态。在动物身下放置加热垫，使其尾部的一部分与加热垫直接接触。将动物的背部转向侧面，使侧尾静脉位于上方并清晰可见。将尾巴浸入温水中以扩张侧静脉，然后用70%乙醇擦拭尾巴。使用普通的白炽灯泡将暖光照射到尾巴上。以20度的角度将21G蝶形针插入尾侧静脉，深度为5毫米。接着，用含有5毫克乙二胺四乙酸钾作为抗凝剂的500微升真空采血管采集血液。取下针头，并通过按压穿刺部位来停止血液流动。将大鼠放回其饲养笼中。接着，轻轻将试管倒置10次，使抗凝剂与血液充分混匀。在冰中制作深1.5厘米的孔，将试管垂直放入其中。采集后一小时内，将血液样本在预冷的离心机中离心，以分离血浆。然后吸取约200 µL血浆，避免触及红细胞和白细胞层。将采集的血浆放入一个0.2毫升的无菌微量离心管中。留出五微升样本用于质量控制，其余样本于负80摄氏度保存，直至分析。采用不同方法在五个时间点从大鼠采集血液，例如第52天使用真空采血法，第55天使用尾静脉挤血法，第58至64天使用滴血法。采用紫外分光光度法评估血浆样本质量的结果显示，使用真空采集技术获得的血浆呈粉红色，平均吸光度值为0.647。同样，尾部挤奶技术获得的血浆也呈粉红色，平均吸光度为0.620。相比之下，采用重力驱动的液滴采集系统所获得的血浆样本透明，平均吸光度显著降低，表明该方法是获取高质量分析样本的最佳方案。首先，准备一支203G蝶形针，剪去其塑料保护套，使裸露的针尖露出7毫米。然后将蝶形针通过聚合物导管连接至1毫升注射器。将麻醉后的大鼠置于立体定位仪上，并通过面罩维持麻醉状态。接下来，去除大鼠头部后部和颈部的毛发。使用耳杆固定大鼠头部。调节立体定位仪的鼻杆，使动物头部垂直向下降低约45度。在枕骨隆起与寰椎棘突之间，寻找头后部一个呈菱形的轻微凹陷区域。用70%乙醇擦拭该区域表面。采集脑脊液时，将蝶形针垂直插入菱形凹陷区域的中心，进入小脑延髓池，直至针头的塑料护套阻止其进一步移动。轻轻拉动注射器活塞，使脑脊液缓慢通过针头。将约 100 µL 脑脊液收集到聚合物导管中。在靠近蝶形针的位置夹紧聚合物导管，并从此处剪断导管。用注射器吸取澄清的样本，将样本排入无菌的0.2毫升微量离心管中，置于冰上保存最多一小时。对动物头部脑脊液抽取部位进行消毒。将大鼠从立体定位仪中取出并放回笼中。留出两微升样本用于质量控制，其余样本储存于零下80摄氏度以备后续分析。在三组实验大鼠中连续五天进行重复脑脊液采集，并以获得清晰脑脊液的成功采集次数百分比表示结果。在双头植入并埋植导管用于脑脊液采集的大鼠中，成功率为71.1%，表明动物头部的导管可能干扰脑脊液的重复采样。相比之下，在仅植入系留式或遥测电极的动物中，通过小脑延髓池穿刺进行脑脊液采集的成功率分别为86.7%和88.9%。这些结果表明，穿刺技术更适合于植入电极动物的多次脑脊液采集。

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科研

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Neuroscience

神经科学

在脑电图记录期间从大鼠的侧尾静脉采集脑脊液和血液

阿尔茨海默病（AD）的转基因（Tg）小鼠模型为研究疾病进展过程中人脑脊液（CSF）内Aβ或tau蛋白水平变化的机制和原因提供了极佳的机会。本文中，我们展示了一种改良的大脑池穿刺技术，用于对小鼠进行系列脑脊液取样。...

一种在小鼠中通过大池进行脑脊液连续采集的技术

本视频演示了在麻醉大鼠中同步记录共定位脑电图（EEG）和局部场电位（LFPs）的操作流程。该过程包括准备大鼠，并在其胡须垫上安装刺激电极。将一个EEG蜘蛛电极放置于大鼠颅骨表面，用于获取表面脑电图信号。同时，通过颅骨上的钻孔，将一根多通道微电极插入特定脑区，以记录局部脑区的神经电活动。...

在麻醉大鼠中同步记录脑电图与局部场电位

本视频介绍了在非侵入性条件下，对采用特定局灶性癫痫临床前模型的镇静大鼠进行高分辨率脑电图的制备、记录及源分析操作流程。...

使用高分辨率脑电图记录在局灶性癫痫的临床前大鼠模型中进行脑源成像

血液样本可用于评估生理状态或疾病的生物标志物 in...

从大鼠尾侧静脉采血

本方案描述了一种在麻醉大鼠中同时记录共定位脑电图（EEG）和多层局部场电位的简单方法。在颅骨上钻出用于插入微电极的骨孔，结果表明该操作对脑电图信号的干扰可忽略不计。...

同步记录啮齿类动物共定位的脑电图与局部场电位

本研究介绍了一种同步记录自由活动大鼠脑部局部场电位、心电图、肌电图和呼吸信号的方法。该技术可降低实验成本并简化数据分析，有助于深入理解大脑与外周器官之间的相互作用。...

自由活动大鼠皮层局部场电位、心电图、肌电图与呼吸节律的同步记录

此处，我们介绍一种方法 在体...

在自由活动大鼠脑电图记录期间进行兴奋性氨基酸的微透析

本方案通过微透析系统，对清醒大鼠海马区细胞外液进行详细的实时动态取样。...

使用微透析系统在清醒大鼠中实时动态采集海马区细胞外液

本文详细介绍了从活体大鼠脑组织中分离神经干细胞和少突胶质前体细胞的方法。该方法可在不损害动物健康状况的前提下，从同一动物多次采集这些细胞。...

从活体大鼠中分离神经干细胞和少突胶质细胞前体细胞的“脑乳法”

本文介绍了在小鼠颅骨上植入超薄聚酰亚胺基微电极阵列（PBM-array）以获取小鼠模型高密度脑电图（EEG）的手术步骤及操作要点。...

基于聚酰亚胺的微电极对自由活动小鼠进行高密度脑电图记录

学习在癫痫大鼠视频脑电图监测期间同步采集脑脊液和血浆样本的方法。该技术通过改进的侧尾静脉采血法获得无溶血高质量血浆，结合枕骨大池穿刺术采集脑脊液，用于识别癫痫诊断和预后生物标志物。

在大鼠脑电图记录期间通过尾侧静脉采集脑脊液和血液

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