在大鼠脑电图记录期间通过尾侧静脉采集脑脊液和血液

在我们的研究中，旨在寻找癫痫潜在的诊断和预后生物标志物。为了在生物液体中验证这些标志物，我们比较了大鼠脑脊液和血浆中特定物质的水平与自发性癫痫发作的发生情况。迄今为止，一些小的非编码核糖核酸（如miRNA或tRNA片段）已被鉴定为癫痫的循环生物标志物，但其作为癫痫有效且可靠的诊断或预后工具的实用性仍有待证实。

我们研究癫痫的不同循环标志物。在进行脑电图记录以识别自发性癫痫发作时，我们常规采集癫痫大鼠的血浆和脑脊液。由于我们在多天内重复采样，因此可以将标志物水平与单次癫痫发作或其累积效应进行关联分析。

目前的挑战是在不引起动物因操作而产生应激性发作的前提下，获得足量且高质量的样本，以用于后续分析。对于癫痫患者，尤其是具有预后意义或高风险的生物标志物，迫切需要发现相关的生物标志物。通过与脑电图（EEG）发作监测同步采集血浆和脑脊液样本，可显著提高发现合适标志物的机会。

我们采用的尾静脉阻断采血技术可获得高质量、无溶血的血浆样本，该方法无需使用真空装置或挤压尾部采血。我们用于采集脑脊液的枕大池穿刺技术，与植入导管系统相比，具有更好的无菌性，且头部植入物脱落的风险更低。开始时，将动物放入清洁的笼子中，置于记录室内，使其适应新环境。

将笼子放入法拉第笼中，以避免环境电磁场对脑电图信号的干扰。将记录电缆的一端连接到记录设备。使用电压表测量电势，并区分接地电极和参考电极。

然后将水泥罩固定在动物头部，并将记录电缆的另一端插入固定在大鼠头部的电极连接器中。使用换向器来平衡记录电缆的重量，使动物能够自由活动而不会缠绕电缆。在开始记录之前，检查用于采集和处理脑电图数据的所有设置。

确保应用适当的滤波和采样率，以避免脑电图（EEG）信号中出现伪迹和噪声。在监视器上启动视频记录和脑电图记录。检查特定频段随时间变化的功率，以确保记录的信号符合预期的脑电图信号特征。

定期检查脑电图（EEG）轨迹，同时观察动物状态。如果记录电缆从电极连接器上脱落，请重新连接，并检查是否存在清晰的 EEG 信号。

通过筛查脑电图记录来分析脑电图信号，并识别类似癫痫发作的活动。通过查看与脑电图同步采集的视频记录，确认可能的惊厥性癫痫发作。首先，使用1%的乙二胺四乙酸钾（potassium EDTA）溶液涂覆蝴蝶针及其导管。

在针头后方切断导管，以便逐滴收集血液。将麻醉后的大鼠置于立体定位仪上，并通过面罩持续维持麻醉状态。在动物身下放置加热垫，使其尾部的一部分与加热垫直接接触。

将动物的背部转向侧面，使侧尾静脉位于上方并清晰可见。将尾巴浸入温水中以扩张侧静脉，然后用70%乙醇擦拭尾巴。

使用普通的白炽灯泡将暖光照射到尾巴上。以20度的角度将21G蝶形针插入尾侧静脉，深度为5毫米。接着，用含有5毫克乙二胺四乙酸钾作为抗凝剂的500微升真空采血管采集血液。

取下针头，并通过按压穿刺部位来停止血液流动。将大鼠放回其饲养笼中。接着，轻轻将试管倒置10次，使抗凝剂与血液充分混匀。

在冰中制作深1.5厘米的孔，将试管垂直放入其中。采集后一小时内，将血液样本在预冷的离心机中离心，以分离血浆。然后吸取约200 µL血浆，避免触及红细胞和白细胞层。

将采集的血浆放入一个0.2毫升的无菌微量离心管中。留出五微升样本用于质量控制，其余样本于负80摄氏度保存，直至分析。采用不同方法在五个时间点从大鼠采集血液，例如第52天使用真空采血法，第55天使用尾静脉挤血法，第58至64天使用滴血法。

采用紫外分光光度法评估血浆样本质量的结果显示，使用真空采集技术获得的血浆呈粉红色，平均吸光度值为0.647。同样，尾部挤奶技术获得的血浆也呈粉红色，平均吸光度为0.620。相比之下，采用重力驱动的液滴采集系统所获得的血浆样本透明，平均吸光度显著降低，表明该方法是获取高质量分析样本的最佳方案。

首先，准备一支203G蝶形针，剪去其塑料保护套，使裸露的针尖露出7毫米。然后将蝶形针通过聚合物导管连接至1毫升注射器。将麻醉后的大鼠置于立体定位仪上，并通过面罩维持麻醉状态。

接下来，去除大鼠头部后部和颈部的毛发。使用耳杆固定大鼠头部。调节立体定位仪的鼻杆，使动物头部垂直向下降低约45度。

在枕骨隆起与寰椎棘突之间，寻找头后部一个呈菱形的轻微凹陷区域。用70%乙醇擦拭该区域表面。采集脑脊液时，将蝶形针垂直插入菱形凹陷区域的中心，进入小脑延髓池，直至针头的塑料护套阻止其进一步移动。

轻轻拉动注射器活塞，使脑脊液缓慢通过针头。将约 100 µL 脑脊液收集到聚合物导管中。在靠近蝶形针的位置夹紧聚合物导管，并从此处剪断导管。

用注射器吸取澄清的样本，将样本排入无菌的0.2毫升微量离心管中，置于冰上保存最多一小时。对动物头部脑脊液抽取部位进行消毒。

将大鼠从立体定位仪中取出并放回笼中。留出两微升样本用于质量控制，其余样本储存于零下80摄氏度以备后续分析。在三组实验大鼠中连续五天进行重复脑脊液采集，并以获得清晰脑脊液的成功采集次数百分比表示结果。

在双头植入并埋植导管用于脑脊液采集的大鼠中，成功率为71.1%，表明动物头部的导管可能干扰脑脊液的重复采样。相比之下，在仅植入系留式或遥测电极的动物中，通过小脑延髓池穿刺进行脑脊液采集的成功率分别为86.7%和88.9%。这些结果表明，穿刺技术更适合于植入电极动物的多次脑脊液采集。