Name: 用于冷冻电子显微镜的单层石墨烯涂层网格的制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: 学习制备单层石墨烯涂层冷冻电镜网格的完整实验方案，该方法可有效降低背景噪声并保护生物样品完整性。本方案支持实验室在一天内批量制备高质量石墨烯网格，适用于高分辨率结构生物学研究。

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我们感谢小范博士在斯克里普斯研究所建立这些方法期间提供的有益讨论。B.B. 获得了赫威特医学研究基金会博士后研究奖学金的支持。W.C. 获得了美国国家科学基金会研究生奖学金的支持。D.E.P. 的研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 NS095892（资助对象：G.C.L.）支持。本项目还获得了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 GM142196、GM143805 和 S10OD032467（资助对象：G.C.L.）的支持。

1. 制备石墨烯载网所需的材料和配件
注意：石墨烯容易受到污染，这会降低石墨烯涂层的效率和石墨烯载网的质量；因此，彻底清洁所有与石墨烯接触的材料至关重要。材料的准备及所有操作步骤均应在通风橱中进行。
<ol>
	<li>准备用于在载网上涂覆石墨烯的必要材料（图2A）。</li>
	<li>用去离子水（DI水）多次冲洗玻璃器皿，以去除灰尘、纤维和油性残留物。</li>
	<li>使用一次性擦拭纸巾，以75%乙醇清洁玻璃盖玻片，并使用气吹清除任何污染物。 
	&#8203;注意：本方案中使用的TEM载网夹紧固定块最多可容纳45个载网。对于大批量制备石墨烯载网，可一次性制备45个或更少的载网。然而，建议在实验方法尚未建立时，先从小批量（四到六个载网）开始制备。</li>
</ol>
2. 配制0.2 M过硫酸铵（APS）水溶液
注意：该 APS 溶液用作蚀刻剂，以在后续步骤中去除石墨烯/铜片上的铜（Cu）支撑层。务必使用新鲜配制的 APS 溶液。重复使用或存放过久的溶液将无法有效蚀刻铜，可能导致后续步骤中石墨烯上残留铜。
<ol>
	<li>用去离子水（DI）冲洗一个500 mL的烧瓶，然后加入200 mL去离子水，并在微波炉中以最大功率加热约1分钟，以去除水中的溶解气体。</li>
	<li>将9 g过硫酸铵加入200 mL去离子水中，配制成0.2 M的APS溶液。 
	警告：APS有毒，操作时建议佩戴个人防护装备（PPE）。APS废液应送至经批准的废弃物处理场所进行处置。</li>
	<li>将溶液置于磁力搅拌器上，用搅拌子持续搅拌，同时在通风橱内将烧瓶连接至真空源。 
	&#8203;注意：对APS溶液进行脱气有助于防止气泡生成，从而避免在第6步中影响铜刻蚀的效率。</li>
</ol>
3. 使用一张吸水纸将石墨烯/铜转移至洁净的盖玻片上
注意：我们使用的是从石墨烯供应商处购买的尺寸为 15 × 15 cm 的铜基化学气相沉积（CVD）石墨烯薄膜。 commercially purchased 单层石墨烯/铜片应保存在真空环境中。由于通过 CVD 方法生长的石墨烯会在铜片两侧同时形成，石墨烯供应商通常会进行质量检测并推荐较优的一侧用于实验。在本实验方案中，我们将该推荐侧称为“&#34;上&#34;侧”，另一侧则称为“&#34;背&#34;侧”。
<ol>
	<li>将一张滤纸裁剪成约 20 mm × 40 mm 的矩形。该滤纸用作石墨烯/铜片的衬垫，以吸收用于包覆石墨烯/铜片的过量甲基丙烯酸甲酯（MMA (8.5) MMA EL6）；因此，请确保将其裁剪成比待使用的石墨烯/铜片更大的尺寸。</li>
	<li>使用聚酰亚胺胶带将滤纸的四个角固定在一块洁净的盖玻片顶部，该盖玻片需可放入自制的旋涂仪中。 
	注意：选用聚酰亚胺胶带是因为其厚度薄且易于移除，便于操作。</li>
	<li>从真空储存中取出一片石墨烯/铜片。</li>
	<li>使用洁净无尘的剪刀小心裁剪一小块铜-石墨烯片，其大小应足以完全覆盖待制备的网格数量。例如，对于排列为 5 × 5 阵列的 25 个网格，可裁剪一块 18 mm × 18 mm 的样品。使用洁净干燥的镊子将石墨烯/铜片放置在滤纸上。确保石墨烯/铜片的背面朝下，并小心避免意外翻转，因为其正面与背面难以区分。</li>
	<li>用胶带固定石墨烯/铜片的四个角于滤纸/盖玻片上，尽量减少胶带与石墨烯/铜片的接触面积，因为在下一步中，被胶带覆盖的区域将无法被 MMA 覆盖。 
	注意：静电放电可能损坏石墨烯薄膜，因此在操作石墨烯或石墨烯网格时，建议保持接地状态，并尽量减少静电荷的积聚。可通过佩戴腕部接地带，或在操作前立即触碰接地金属物体来实现。</li>
</ol>
4. 在单层石墨烯/铜片上涂覆一层薄薄的MMA(8.5)MMA EL6（MMA）
注意：铜被蚀刻掉后，该层甲基丙烯酸甲酯（MMA）将支撑单层石墨烯，以便在后续步骤中对石墨烯片进行操作。此外，由于单层石墨烯本身是透明的，MMA 涂层还能使石墨烯薄膜可见，便于观察。
<ol>
	<li>将带有胶带固定的石墨烯/Cu 片的盖玻片置于通风橱内的自制旋涂仪上（可使用计算机风扇组装而成），如 Han 等人25先前所述（图 2B）。</li>
	<li>佩戴安全护目镜后，用玻璃移液管在石墨烯表面滴加两滴 MMA，并立即以最高速度开始旋转。</li>
	<li>旋转过程中，在中心位置再滴加两滴，持续旋涂 1 分钟。 
	注意：确保已加入足够的 MMA 以完全覆盖石墨烯。若不确定，可额外添加几滴。若石墨烯未被充分覆盖，在 Cu 被蚀刻去除后，薄膜中会出现&#34;孔洞&#34;。</li>
	<li>在通风橱内静置晾干 10 分钟。</li>
</ol>
5. 去除石墨烯/铜片背面的石墨烯
注意：在进行后续步骤之前，必须去除生长在铜膜背面（未涂覆MMA的一侧）的石墨烯，因为多余的石墨烯会降低铜的蚀刻效率。我们通过将石墨烯暴露于等离子体中来去除该层石墨烯，此操作可使用任何常用于生物样品制备中透射电镜载网处理的辉光放电装置完成。
<ol>
	<li>用干净、干燥的镊子小心地移除胶带，并将涂有 MMA 的石墨烯/Cu 片从盖玻片上提起。</li>
	<li>将 MMA/石墨烯/Cu 片以 MMA 面朝下的方式用胶带固定在洁净无尘的玻璃盖玻片上。</li>
	<li>将带有 MMA/石墨烯/Cu 片的盖玻片放入电晕放电装置中，设置通常用于负染或冷冻电镜样品制备时的网格处理参数。 
	&#8203;注意：应避免长时间电晕放电，以防背面的 Cu 被氧化，导致氧化铜（CuO）（纳米）颗粒污染石墨烯薄膜。</li>
</ol>
6. 在APS溶液中刻蚀去除MMA/石墨烯/Cu片中的Cu
<ol>
	<li>在通风橱中，将&#160;200 mL 新配制的 APS 溶液倒入一个洁净无尘的结晶皿（150 × 75 mm）中。</li>
	<li>将 MMA/石墨烯/Cu 片从载玻片上取下，并记录含有 MMA 的一侧。</li>
	<li>开始刻蚀时，将经等离子体处理的 Cu 面朝下放置于 APS 溶液表面。用铝箔或盖子盖住广口玻璃烧杯，防止灰尘进入。</li>
	<li>孵育 3 小时。若 1 小时后大部分 Cu 仍未被刻蚀，则重复第 2–6 步的操作，然后继续下一步。 
	&#8203;注意：若 1 小时后大部分 Cu 仍未被刻蚀，可能是将薄膜的 MMA/石墨烯面朝下接触了 APS 溶液，而非 Cu 面。Cu 应在 3 小时内完全被刻蚀，若 Cu 完全刻蚀，MMA/石墨烯薄膜将呈无色。石墨烯极易受到污染，因此务必盖好所有容器，避免表面聚集绒毛或油性残留物，否则会严重影响石墨烯的质量。</li>
</ol>
7. 用去离子水冲洗MMA/石墨烯薄膜
<ol>
	<li>在通风橱中，将去离子水注入洁净无尘的结晶皿内。</li>
	<li>用一片洁净无尘的玻璃盖玻片，以相对于过硫酸铵（APS）溶液表面约45°的角度，轻轻捞起石墨烯-MMA薄膜。</li>
	<li>将玻璃载片垂直（接近90°）置于水面，然后缓慢将玻璃盖玻片浸入水中，使MMA/石墨烯薄膜逐渐从盖玻片上滑落&#160;并漂浮于水面。</li>
	<li>让MMA/石墨烯薄膜在水面漂浮1小时，以充分洗去残留的APS。</li>
</ol>
8. 清洁待镀单层石墨烯的载网
注意：用于转移石墨烯的载网必须尽可能洁净，以最大化石墨烯与载网箔表面的附着。 commercially purchased grids 常含有残留污染物，在转移石墨烯前必须去除。
<ol>
	<li>清洗并干燥三个结晶皿，确保其无灰尘。</li>
	<li>在通风橱中，分别向三个结晶皿中各倒入&#160;200 mL 氯仿、丙酮和异丙醇（IPA）。用铝箔覆盖结晶皿，以减少有机溶剂的挥发。 
	注意：氯仿和丙酮可引起皮肤刺激，吸入后可能具有毒性。应尽量减少接触这些有机溶剂，并穿戴个人防护装备（PPE）。</li>
	<li>将夹持式透射电镜载网支架底座放入盛有 200 mL 氯仿的第一只结晶皿底部。</li>
	<li>将每个载网从载网盒中单独转移至支架块的孔位中，确保有微孔膜的一面朝上。用铝箔覆盖结晶皿，置于轨道摇床上，轻轻振荡 30 分钟。</li>
	<li>将金属盖盖在载网支架块上，以在转移至下一个结晶皿时固定载网。使用弯头叉和长镊子小心地将载网支架块从结晶皿中取出，放入盛有 200 mL 丙酮的第二个结晶皿底部。取下支架块上的盖子，置于轨道摇床上轻轻振荡 30 分钟。</li>
	<li>盖上支架块的盖子，将其转移至盛有 200 mL 异丙醇（IPA）溶液的结晶皿中，以清除残留的丙酮。取下盖子后，轻轻振荡 20 分钟。</li>
	<li>将载网从支架块中逐一转移至铺有吸水纸的玻璃培养皿中，转移时确保微孔膜面朝上。</li>
	<li>在通风橱中干燥载网至少 30 分钟，并确保载网被覆盖，以防灰尘落入。</li>
</ol>
9. 将洁净的载网转移至置于去离子水下的不锈钢丝网或带孔托盘中的吸水纸上
注意：必须将载网平放在去离子水中并完全浸没，以便将石墨烯漂浮到水面上，并缓慢降至载网上。此操作可使用商用载网涂覆槽，或采用 Palovcak 等人18所述的培养皿与蠕动泵完成，后者常用于制备氧化石墨烯载网。
<ol>
	<li>将不锈钢网或托盘放入网格镀膜槽中，并用去离子水冲洗。</li>
	<li>裁剪一张略小于不锈钢网/托盘的滤纸，将其放置在平台上，并浸没于去离子水中。 
	注意：滤纸略小于平台，以便于移动和操作。</li>
	<li>将清洗后的载网小心转移至滤纸上，确保带有筛孔薄膜的一面朝上。载网通常具有疏水性，因此应垂直将其浸入水中，否则可能因水面张力而弯曲。将载网排列成方形阵列，尽可能紧密放置，但不得相互重叠（图 2C）。</li>
	<li>此时载网已准备好进行单层石墨烯镀膜。向网格镀膜槽中加入更多去离子水，使水面至少高于载网表面 5 mm。</li>
</ol>
10. 将石墨烯转移至载网
<ol>
	<li>用干净的盖玻片小心地从结晶皿中捞取 MMA/石墨烯薄膜：将盖玻片以一定角度缓慢插入水槽中，位置应远离石墨烯薄膜。将盖玻片移至石墨烯-MMA 薄膜下方，使薄膜边缘与盖玻片边缘保持平行，然后垂直向上提起盖玻片，将 MMA/石墨烯薄膜一同带出水面。</li>
	<li>将带有 MMA/石墨烯薄膜的盖玻片以约 45° 角缓慢浸入水中，使 MMA/石墨烯薄膜从盖玻片上脱离并漂浮于水面上，完成薄膜转移。</li>
	<li>在降低水位前，将 MMA/石墨烯薄膜准确置于载网正上方。使用尖端已熔融封闭的玻璃巴斯德吸管，小心调节 MMA/石墨烯薄膜的位置。</li>
	<li>用注射器以约 1.25 mL/min 的速度缓慢降低水位，使 MMA/石墨烯薄膜在落于滤纸时能完全覆盖载网表面。 
	注意：随着水位下降，可能需要进一步调整石墨烯-MMA 薄膜的位置，以确保其始终位于载网正上方。</li>
	<li>使用一对洁净干燥的镊子，将承载载网的吸水纸转移至洁净、干燥且无尘的培养皿中，或直接转移整个不锈钢平台。</li>
	<li>将 MMA/石墨烯载网置于通风橱内至少空气干燥 30 分钟。期间需用铝箔或培养皿盖覆盖载网，防止灰尘污染。</li>
	<li>将载网转移至培养箱中，在 65 °C 条件下烘烤 30 分钟。</li>
	<li>从培养箱中取出载网后，保持覆盖状态，在室温下静置 5 分钟，使载网冷却至室温。</li>
</ol>
11. 去除 MMA 并清洗载网
注意：必须用丙酮彻底清洗 MMA，以防止石墨烯包被的载网上残留任何 MMA。
<ol>
	<li>在通风橱中，准备两个分别装有&#160;200 mL 丙酮和一个装有&#160;200 mL 异丙醇（IPA）的结晶皿，均置于室温下。用铝箔覆盖结晶皿，以减少有机溶剂的挥发。 
	注意：操作丙酮时需穿戴个人防护装备（PPE），因其可能引起皮肤刺激，吸入后可能有害。</li>
	<li>将夹持式透射电镜（TEM）载网支架底座放入第一个盛有 200 mL 新鲜丙酮的结晶皿底部。</li>
	<li>将每张载网从吸水纸上单独转移至载网支架块的孔中，确保 MMA 面朝上。用铝箔覆盖结晶皿，置于旋转摇床中，轻轻振荡 30 分钟。</li>
	<li>将金属盖盖在载网支架块上，以在转移至下一个结晶皿时固定载网。使用弯头叉和长镊子小心地将载网支架块从结晶皿中取出，放入第二个盛有 200 mL 新鲜丙酮的结晶皿底部。取下载网支架块的盖子，并在旋转摇床上轻轻振荡 30 分钟。</li>
	<li>将盖子重新盖在载网支架块上，将其转移至盛有 200 mL IPA 溶液的结晶皿中，以清洗残留的丙酮。取下盖子后轻轻振荡 20 分钟。</li>
	<li>将载网转移至一个内铺吸水纸的小型玻璃培养皿中，在空气中干燥至少 10 分钟。用盖子覆盖载网，防止灰尘颗粒污染。</li>
	<li>载网即可使用，或转移至用铝箔包裹的载网盒中，并存放于真空干燥器内。 
	&#8203;注：将石墨烯载网存放在真空干燥器中可防止环境中的疏水性颗粒污染。这些载网可在使用前存放数月之久27。</li>
</ol>
12. 使用紫外/臭氧处理使石墨烯网格具亲水性
注意：石墨烯具有极强的疏水性，这与冷冻电镜（cryoEM）样品制备不兼容，因为 blot-plunge 方法需要一个亲水表面，以便样品液滴能够均匀铺展。虽然传统的辉光放电装置可以通过调节以脉冲等离子体温和处理，使石墨烯表面变为亲水，但这类装置往往容易破坏超薄的单层石墨烯。先前已有研究证明，可以使用紫外/臭氧清洗仪对石墨烯表面进行部分氧化25，使其在不损伤单层结构的前提下具备亲水性，从而适用于冷冻电镜样品制备。
<ol>
	<li>若使用的 UV/Ozone 系统需要预热，请开启系统并对灯管预热 10 分钟（此步骤中需确保无 grids 暴露）。在 UV/Ozone 清洁仪预热的同时，从真空干燥器中取出 grids，并将其转移至洁净的盖玻片上。</li>
	<li>当 UV/Ozone 系统准备就绪后，将带有 grids 的盖玻片以石墨烯面朝上的方向放入 UV/Ozone 清洁仪中，并使 grids 暴露于臭氧气体中 4 分钟。</li>
	<li>暴露于臭氧后，应立即使用 grids 进行冷冻电镜样品制备。 
	注意：若使用的 UV/Ozone 系统需要预热，则必须在灯管预热 10 分钟后立即将 grids 放入清洁仪中，否则温度过低将无法产生足够的臭氧气体以对石墨烯进行氧化处理，影响样品制备。暴露于臭氧气体的时间不得超过 6 分钟，否则会破坏石墨烯层。</li>
</ol>

Coating TEM Grids with a Graphene Monolayer

<ol><li>Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+electron+dose+rate+on+electron+counting+images+recorded+with+the+K2+camera%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Influence of electron dose rate on electron counting images recorded with the K2 camera.</a> Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).</li>
<li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMAN2%3A+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li>
<li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> eLife. 7, 1-22 (2018).</li>
<li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CryoSPARC%3A+Algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li>
<li>Grigorieff, N., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-atomic+resolution+reconstructions+of+icosahedral+viruses+from+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 21 (2), 265-273 (2011).</li>
<li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).</li>
<li>Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+individual+atoms+of+protein+complex+by+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Resolving individual atoms of protein complex by cryo-electron microscopy.</a> Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).</li>
<li>Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic-resolution+protein+structure+determination+by+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.</a> Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).</li>
<li>Schultz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 21 (2), 129-228 (1988).</li>
<li>Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+blot-and-plunge+freezing+of+biological+specimens+for+single-particle+cryogenic+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. 2022 (180), 1-16 (2022).</li>
<li>Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteins%2C+interfaces%2C+and+cryo-em+grids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Colloid+%26+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Proteins, interfaces, and cryo-em grids.</a> Current Opinion in Colloid & Interface Science. 25 (3), 289-313 (2016).</li>
<li>Glaeser, R. M., Han, B. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opinion%3A+hazards+faced+by+macromolecules+when+confined+to+thin+aqueous+films%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Reports%22%5BJournal%5D)">Opinion: hazards faced by macromolecules when confined to thin aqueous films.</a> Biophysics Reports. 3 (1-3), 1-7 (2017).</li>
<li>Han, B. G., Watson, Z., Cate, J. H. D., Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer-crystal+streptavidin+support+films+provide+an+internal+standard+of+cryo-EM+image+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Monolayer-crystal streptavidin support films provide an internal standard of cryo-EM image quality.</a> Journal of Structural Biology. 200 (3), 307-313 (2017).</li>
<li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+single+particle+CryoEM+sample+and+grid+characterization+by+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography.</a> eLife. 7, 1-42 (2018).</li>
<li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (6), 560-571 (2018).</li>
<li>Liu, N., Wang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Better+cryo-EM+specimen+preparation%3A+how+to+deal+with+the+air-water+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Better cryo-EM specimen preparation: how to deal with the air-water interface.</a> Journal of Molecular Biology. 435 (9), 167926(2022).</li>
<li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+effects+of+particle+adsorption+to+the+air-water+interface+in+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM.</a> Nature Methods. 15 (10), 793-795 (2018).</li>
<li>Palovcak, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+robust+procedure+for+preparing+graphene-oxide+cryo-EM+grids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids.</a> Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).</li>
<li>Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+graphene+oxide+coating+improves+cryo-EM+sample+preparation+and+data+collection+from+tilted+grids%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+carbon+films+with+%7E500nm+holes+for+cryo-EM+with+a+direct+detector+device%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Fabrication of carbon films with ~500nm holes for cryo-EM with a direct detector device.</a> Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).</li>
<li>Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene+oxide%3A+A+substrate+for+optimizing+preparations+of+frozen-hydrated+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples.</a> Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).</li>
<li>Pantelic, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene%3A+substrate+preparation+and+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Graphene: substrate preparation and introduction.</a> Journal of Structural Biology. 174 (1), 234-238 (2011).</li>
<li>Russo, C. J., Passmore, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+towards+an+optimal+specimen+support+for+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Progress towards an optimal specimen support for electron cryomicroscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 37, 81-89 (2016).</li>
<li>Passmore, L. A., Russo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specimen+preparation+for+high-resolution+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Specimen preparation for high-resolution cryo-EM.</a> Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+monolayer+graphene+grids+for+near-atomic+resolution+cryoelectron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).</li>
<li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+ultraclean+atomically+thin+membranes+for+atomic-resolution+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Robust ultraclean atomically thin membranes for atomic-resolution electron microscopy.</a> Nature Communications. 11 (1), 541(2020).</li>
<li>Ahn, E., Kim, B., Cho, U. -S. Batch production of high-quality graphene grids for cryo-EM: cryo-EM structure of Methylococcus capsulatus soluble methane monooxygenase hydroxylase. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAhn%2C+E+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. (Cvd), (2021).</li>
<li>Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+graphene+supports+for+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).</li>
<li>Fan, H., Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+graphene+grids+for+cryoelectron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Developing graphene grids for cryoelectron microscopy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 937253(2022).</li>
<li>D'Imprima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+denaturation+at+the+air-water+interface+and+how+to+prevent+it%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it.</a> eLife. 8, e42747(2019).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+copper+step+beams+during+graphene+growth+by+CVD+method%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Surface+Science%22%5BJournal%5D)">Evolution of copper step beams during graphene growth by CVD method.</a> Applied Surface Science. 610, 155518(2023).</li>
<li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uniform+thin+ice+on+ultraflat+graphene+for+high-resolution+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Uniform thin ice on ultraflat graphene for high-resolution cryo-EM.</a> Nature Methods. 20 (1), 123-130 (2023).</li>
<li>Fujita, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epoxidized+graphene+grid+for+highly+efficient+high-resolution+cryoEM+structural+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis.</a> Scientific Reports. 13, 2279(2023).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalized+graphene+grids+with+various+charges+for+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM.</a> Nature Communications. 13, 6718(2022).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

将生物样品保存在一层薄薄的玻璃态冰中，是实现高分辨率冷冻电镜（cryoEM）结构解析的关键步骤。然而，研究人员常常会遇到由气液界面（AWI）相互作用引起的问题，导致样品出现优势取向、复合物解离、变性以及聚集等现象。此外，样品并不总能被充分浓缩，以填满穿孔薄膜孔洞间所悬垂的薄冰区域。多个研究团队已开发出在电镜载网上涂覆单层石墨烯的方法，以帮助克服上述部分限制24,25,26,27,28,29,30，石墨烯载网已被成功广泛应用。本文中，我们提供了在实验室内部高效制备石墨烯载网批次的分步操作指南，并通过透射电子显微镜（TEM）评估石墨烯载网质量的方法。我们特别强调，在某些关键步骤中需格外谨慎，具体如下所述。
石墨烯极易吸附空气中的污染物。因此，在制备石墨烯载网的过程中，必须确保所有与石墨烯/铜膜或载网接触的工具均保持清洁且无尘。用于转移石墨烯的玻璃盖玻片可通过乙醇和去离子水冲洗，或使用压缩空气除尘器进行清洁。建议在通风橱内操作，并始终用铝箔或洁净的玻璃片覆盖石墨烯样品和载网。载网上存在的灰尘或污染物可能阻碍石墨烯在电镜载网上充分贴附。在操作石墨烯或石墨烯涂层载网时，必须确保操作者接地，以防止静电放电对石墨烯薄膜造成损伤。可通过佩戴腕部接地带、每次操作石墨烯或石墨烯载网前触碰接地金属物体，和/或在持镊子的手上不佩戴手套等方式避免静电放电24。
由于单层石墨烯非常薄（相当于一个碳原子的宽度），在将石墨烯转移至载网时，需要用有机层（如MMA或聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA））作为支撑。PMMA是石墨烯转移中最常用的材料。然而，PMMA与石墨烯具有较强的亲和性，常导致石墨烯薄膜上残留聚合物污染。本实验方案采用MMA，因其残留污染较少25。但PMMA和MMA均存在形成褶皱和裂纹的缺点，在石墨烯薄膜的某些区域可观察到此类现象（图3B）。这些褶皱难以完全避免，因为它们通常在化学气相沉积（CVD）法生长石墨烯的过程中即已产生31。最近开发出一种生长超平整无褶皱石墨烯的方法，该方法使用Cu(111)/蓝宝石晶圆替代铜箔作为生长基底32。
根据我们的经验，相比于从制造商处购买聚合物覆盖的铜-石墨烯片（在铜蚀刻后会变脆且后续操作困难），自行采购石墨烯/铜片并在实验室内使用MMA对石墨烯进行支撑更为理想。我们用于MMA涂覆的旋涂仪可利用本地计算机/硬件商店的部件低成本搭建，具体方法如前所述25。
在甲基丙烯酸甲酯（MMA）涂覆步骤中，必须确保铜-石墨烯片上的石墨烯表面完全被MMA覆盖。当铜被蚀刻去除后，MMA-石墨烯将变为半透明，而未被MMA覆盖的区域会呈现为空洞状。为防止MMA涂覆到铜的背面，在涂覆过程中应在样品下方放置一小片吸水纸，以吸收从CVD薄膜甩出的过量MMA。
蚀刻并冲洗后，可使用商用或自制的槽系统，通过注射器或蠕动泵控制水位，将MMA/石墨烯片转移至电镜载网。在转移步骤之前，需依次用氯仿、丙酮和异丙醇对载网进行充分的预冲洗。将涂有石墨烯的载网在65 °C下烘烤，有助于保持石墨烯的完整性，并促进石墨烯与载网的吸附。最后，为防止MMA污染载网，必须在丙酮浴中彻底去除MMA，并用异丙醇清洗载网。任何未洗净的MMA残留物都会出现在电镜载网上，降低图像的信噪比（图3C）。丙酮-异丙醇清洗步骤可重复进行，以进一步清洁石墨烯表面。
为了使石墨烯载网具有亲水性，我们将载网暴露于紫外/臭氧环境中。不同型号的紫外/臭氧清洗仪可能需要优化条件，以在不损伤石墨烯的前提下，充分氧化石墨烯层，满足冷冻电镜样品制备的要求。无论使用何种设备，关键是在紫外/臭氧处理后立即用于冷冻电镜样品的制备。其他研究中也描述了使石墨烯载网亲水化的替代方法33,34。

单颗粒冷冻电子显微镜（cryoEM）是一种日益广泛应用的技术，用于研究生物大分子的三维结构。过去十年中，电子显微镜光学系统、直接电子探测技术1以及计算机算法2,3,4的不断进步，使 cryoEM 使用者能够以接近原子级分辨率解析生化性质稳定的大型分子复合物的结构5,6,7,8。尽管取得了这些进展，但在 cryoEM 成像过程中仍存在显著的样品保存障碍，导致大多数生物样本难以达到如此高的分辨率。
用于高分辨率冷冻电镜分析的样品制备，涉及将均匀分布且具有多种取向的生物大分子包裹在一层薄的玻璃态冰中。用于在载网上制备生物样品薄层以进行冷冻电镜研究的最常用冷冻方法是&#34; blot and plunge&#34;方法9,10。这些方法包括将数微升样品溶液滴加到含有亲水化处理的多孔薄膜的电镜载网上，随后用滤纸吸除大部分液体，再迅速将载网浸入液态乙烷或乙烷-丙烷混合物的冷冻剂中9。
尽管该方法已成功用于测定多种生物样品的结构，但目前所有常用的冷冻电镜样品制备方法都会使样品暴露于疏水性的气液界面（AWI），这通常会引入&#160;限制高分辨率结构测定的问题。已知生物样品在暴露于AWI时极易发生变性，可能导致复杂的聚集和解离现象11,12,13,14此外，生物样本表面的疏水性区域会导致颗粒在冰层中采取特定的优势取向。12在许多情况下，样品的单一疏水区域会迫使所有颗粒在冰层中采取单一取向，从而无法获得可靠的三维重构。除了气-水界面（AWI）相关问题外，样品还可能对有孔支持膜的表面产生亲和性，导致悬浮在孔洞冰层中的颗粒数量受限。15.
针对由气液界面（AWI）或薄膜引起的上述问题，已开发出多种方法学和技术解决方案16,17。其中一种常用方法是用一层薄的（数十纳米）非晶碳覆盖电镜载网的带孔薄膜。该涂层可在孔洞上形成连续的支撑表面，使颗粒得以吸附，同时在一定程度上屏蔽样品与AWI之间的相互作用15,18,19,20。然而，额外的碳层会增加成像区域的背景信号，引入可能影响可达到分辨率的噪声，尤其对于较小的样品（&#60;150 kDa）更为显著。近年来，研究表明使用氧化石墨烯（GO）薄片制备冷冻电镜载网支撑膜相比传统的非晶碳具有优势。GO薄片通过石墨层的氧化制得，形成单层石墨的准晶态片层，其表面和边缘含有大量羧基、羟基和环氧基团，因而具有亲水性。市售的水相悬浮液中的GO薄片价格低廉，且已有多种文献报道的方法可用于将GO薄片涂覆到电镜载网上18,21。然而，这些方法常常导致载网上仅部分区域被GO薄片覆盖，同时存在多层GO薄片堆积的区域。此外，GO薄片在冷冻电镜图像中产生的背景信号较为明显，接近薄层非晶碳所引起的背景水平22,23。
原始单层石墨烯由单层二维晶格排列的碳原子构成，与氧化石墨烯（GO）不同，其在电子显微镜下不产生相位衬度。因此，单层石墨烯可用作生物样品成像的隐形支撑层。单层石墨烯的强度也高于氧化石墨烯，并可作为单层直接应用于电镜载网上。近年来，石墨烯涂层电镜载网制备技术的进步使得在实验室内部自行制备高覆盖率的单层石墨烯载网成为可能24,25,26,27,28,29,30。然而，尽管石墨烯涂层载网在冷冻电镜结构解析中具有诸多优势，但由于商业产品价格昂贵且实验室自制流程复杂，目前尚未被广泛使用。本文中，我们提供了一套逐步操作指南，用于高效制备覆盖单层石墨烯的电镜载网，以用于生物样品的冷冻电镜结构解析 (图1)。通过遵循本详细方案，冷冻电镜研究人员可在一天内可重复地制备出数十个高质量的石墨烯支撑载网。石墨烯涂层载网的质量可使用配备LaB6灯丝的低端透射电子显微镜（TEM）进行快速检测。

<table><tbody><tr><td>70% 乙醇</td><td>Pharmco (190 pf 乙醇)</td><td>241000190CSGL</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650501-4L</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵 (APS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>215589-500g</td><td>危险品；需极度小心操作</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2432-1L</td><td></td></tr><tr><td>45 格 TEM 网格夹持块</td><td>PELCO</td><td>16830-45</td><td></td></tr><tr><td>电脑风扇</td><td>Amazon (Noctua)</td><td>B07CG2PGY6</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Bellco Glass</td><td>1203J71</td><td>标准盖玻片</td></tr><tr><td>结晶皿</td><td>Pyrex</td><td>3140-100</td><td></td></tr><tr><td>电子清洁剂</td><td>Falcon Safety Products</td><td>75-37-6</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Dust-off 压缩空气清洁剂</td><td>Staples</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>滤纸</td><td>Whatman</td><td>1001-055</td><td></td></tr><tr><td>细尖镊子</td><td>Dumont</td><td>0508-L4-PO</td><td></td></tr><tr><td>烧瓶</td><td>Pyrex</td><td>4980-500</td><td></td></tr><tr><td>叉子</td><td>超市</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>玻璃巴斯德移液管</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td></td></tr><tr><td>石墨烯/铜基底 (Graphene/Cu)</td><td>Graphenea</td><td>N/A</td><td>CVD 单层石墨烯铜基底</td></tr><tr><td>网格涂覆槽</td><td>Ladd Research Industries</td><td>10840</td><td>易碎</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>聚酰亚胺胶带 (Kapton 胶带)</td><td>Amazon (MYJOR)</td><td>MY-RZY001</td><td>聚酰亚胺胶带</td></tr><tr><td>Kimwipes 擦拭纸</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>长柄镊子</td><td>Cole Parmer Essentials</td><td>UX-07387-15</td><td></td></tr><tr><td>金属网格架</td><td>Ted Pella</td><td>16820-81</td><td></td></tr><tr><td>MMA(8.5)MMA EL 6</td><td>KAYAKU Advanced Materials</td><td>M31006 0500L 1GL</td><td>易燃</td></tr><tr><td>Model 10 实验室烘箱</td><td>Quincy Lab, Inc.</td><td>FO19013</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Pyrex</td><td>3610-102</td><td></td></tr><tr><td>等离子清洗仪 (Solarus 950)</td><td>Gatan, Inc.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Fiskars</td><td>194813-1010</td><td></td></tr><tr><td>标准模拟轨道摇床</td><td>VWR</td><td>89032-088</td><td></td></tr><tr><td>UltrAuFoil R1.2/1.3 - Au300</td><td>Quantifoil</td><td>N/A</td><td>带孔金网格</td></tr><tr><td>紫外臭氧清洗系统</td><td>UVOCS</td><td>model T10X10/OES</td><td></td></tr></tbody></table>

用于冷冻电子显微镜的单层石墨烯包被载网的制备

Fabrication of Monolayer Graphene-Coated Grids for Cryoelectron Microscopy

冷冻电子显微镜（cryoEM）已成为研究大分子复合物原子结构的一种强大技术。进行cryoEM样品制备时，需要将样品保存在一层薄的非晶态冰中，通常悬浮于带有孔洞的支撑膜的孔隙内。然而，目前cryoEM研究中常用的所有样品制备方法都会使样品暴露于气液界面，从而对样品产生强烈的疏水效应，常导致变性、聚集以及复合物解离。此外，样品某些区域与气液界面之间发生的优先疏水相互作用会影响大分子所采取的取向，导致三维重构结果出现方向性分辨率各向异性。
冷冻电镜样品吸附到单层石墨烯上已被证明有助于减轻样品与气液界面的相互作用，同时最大限度地减少背景噪声的引入。石墨烯载网还具有显著降低冷冻电镜成像所需蛋白浓度的优势。尽管此类载网具有诸多优点，但由于商业产品价格昂贵，且自行大规模制备存在技术挑战，石墨烯涂层载网在冷冻电镜领域尚未得到广泛应用。本文介绍了一种高效制备具有近乎完全单层石墨烯覆盖的冷冻电镜载网的方法。

成功执行此处所述的石墨烯网格制备方案将获得完全被单层石墨烯包覆的电镜载网。可使用任何透射电子显微镜（TEM）检测载网上的石墨烯覆盖情况。由于洁净的单层石墨烯在透射电镜下几乎不可见，必须利用显微镜的衍射模式进行观察，并检测到对应于构成石墨烯的碳原子六方排列的布拉格衍射斑点。 (图3A)偶尔观察到单层石墨烯出现一些褶皱是正常的，这些褶皱是在MMA包埋过程中引入的。图3B）。也可以通过获取其中一个覆盖石墨烯的孔中心的高倍率图像，来检查石墨烯上的污染程度（图3C）。如果使用高分辨率探测器获取该图像，对其进行傅里叶变换后应出现对应于碳-碳间距为2.14 Å的布拉格衍射斑点图4C）。单层碳原子无法产生足够的电子散射以形成相位衬度，因此洁净石墨烯的图像在进行傅里叶变换时不会呈现出与传递函数相关的萨恩环。然而，石墨烯网格在制备后很难完全避免污染，电子显微镜网格清洗不充分，或在石墨烯包被后未能彻底去除MMA，都会导致网格上存在明显的污染物，这些污染物在实空间图像中可见（图3C）。如图所示 图 4，石墨烯载网对样品具有富集效应，这一点在将0.5 mg/mL的脱铁铁蛋白施加于含（或不含）石墨烯的穿孔金载网上进行比较时可观察到图 4A）以及无石墨烯支撑的情况（图4B）。类似的石墨烯制备方案此前已有报道，可用于解析蛋白质（如脱铁铁蛋白）的高分辨率冷冻电镜结构25,27.
<img alt="石墨烯转移过程示意图；详细展示了铜蚀刻、MMA 涂覆、溶剂清洗等步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：制备石墨烯包覆冷冻电镜载网的示意图。图中展示了石墨烯载网制备过程中的关键步骤。缩写：cryoEM = 冷冻电子显微镜；MMA = 甲基丙烯酸甲酯；APS = 过硫酸铵。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="冷冻电镜样品制备装置：旋涂仪、APS溶液工具、铜-石墨烯片、载网涂覆过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：制备石墨烯载网所需的材料。（A）用于包覆冷冻电镜载网的必要材料已相应标注。（B）旋涂仪的特写，其中石墨烯/铜片被胶带固定在载玻片上的滤纸上。旋涂仪可通过从本地计算机/五金商店购买零件自行组装。（C）与注射器连接的载网涂覆槽特写，注射器可用于控制水位。载网放置在不锈钢网架上的滤纸表面。滤纸有助于调整载网的位置，以便将石墨烯片与之对齐。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="电子衍射与显微技术；晶体结构，纳米尺度分析，2.14Å 间距示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图3：显示褶皱或MMA污染的石墨烯网格的代表性衍射图样及明场图像。（A）在透射电子显微镜（TEM）的衍射模式下成像时，覆盖有单层石墨烯的EM网格会显示出对应于石墨烯六方晶格的布拉格衍射峰。图中用圆圈标出并以箭头指示的布拉格峰对应于2.14 Å的碳-碳间距。（B）存在部分褶皱（以箭头指示）的单层石墨烯网格的明场图像。（C）含有MMA污染（以箭头指示）的单层石墨烯的明场图像。比例尺 = 100 nm（B,C）。缩写：EM = 电子显微技术；MMA = 甲基丙烯酸甲酯。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="冷冻电镜图像与衍射图样；纳米颗粒可视化；结构分析；比例尺 100 nm。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：载于石墨烯覆盖金网格上的脱铁铁蛋白：（A）0.5 mg/mL 脱铁铁蛋白在石墨烯覆盖金网格上的冷冻电镜照片。（B）相同浓度下成像的脱铁铁蛋白，当使用无石墨烯的穿孔金网格制样时，在显著更低的浓度下即可观察到。（C）0.5 mg/mL 脱铁铁蛋白在石墨烯覆盖金网格上的冷冻电镜照片的快速傅里叶变换（FFT），其中标注了对应六方晶系石墨烯晶格的布拉格衍射斑点。比例尺 = 100 nm（A,B）。缩略语：cryoEM = 冷冻电子显微镜技术；FFT = 快速傅里叶变换。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

本文介绍了一种将单层石墨烯应用于透射电镜载网的方案，以及如何制备这些载网以用于冷冻电镜结构解析。

冷冻电子显微镜技术（cryoEM）已成为研究大分子复合物原子结构的一种强大技术。样品……

目前，如何最优地保存生物样品是在获得高分辨率冷冻电镜（cryo-EM）结构过程中面临的主要挑战之一。在样品制备过程中，样品会暴露于具有疏水性的气-水界面，该界面会对样品产生变性作用，并可能导致原本稳定的样品在冰层中产生优势取向，从而阻碍高分辨率结构的解析。为解决与气-水界面相互作用相关的问题，通常采用在cryo-EM载网上覆盖一层薄碳膜或类似氧化石墨烯的柔软材料的方法。然而，这些涂层通常会增加图像中的背景噪声，从而降低结构的分辨率。使用单层石墨烯包被载网可实现类似的保护作用，同时不会引入显著的背景噪声。采用石墨烯包被的冷冻电镜载网有助于克服与气液界面相互作用相关的问题。然而，商用石墨烯载网价格昂贵，且许多实验室认为在本实验室制备石墨烯载网过于复杂。冷冻电镜领域的研究人员现在可使用本逐步操作方案，在一天内成功制备出数十片高质量的石墨烯。首先，在通风橱内，将带有胶带固定石墨烯片的盖玻片放置于自制的旋涂仪上。佩戴安全护目镜，使用玻璃移液管将两滴甲基丙烯酸甲酯（MMA）滴加到石墨烯表面，并立即以最高速度开始旋转。旋转过程中，在中心再添加两滴，继续旋转一分钟。将三个结晶皿清洗并干燥后，分别向其中各倒入200毫升氯仿、丙酮和异丙醇。将夹紧型透射电镜载网支架底座置于盛有200毫升氯仿的第一个培养皿底部。确保有孔薄膜一侧朝上，将载网从载网盒中逐个转移至支架底座的孔中。用铝箔覆盖培养皿，并将其放置于旋转摇床上，轻轻振荡30分钟。接下来，将金属盖放在网格支架块上，以固定网格，便于转移至下一个结晶皿。使用弯头叉和长镊子，小心地将网格支架块从皿中取出，放入第二个含有200毫升丙酮的皿底部。取下网格支架块上的盖子，并在轨道摇床上轻轻振荡。30分钟后，将盖子盖在载网支架块上，并将其转移至含有200毫升异丙醇的培养皿中，以去除丙酮残留。取下载网支架块的盖子，轻轻振荡20分钟。将载网逐个从载网支架块转移至铺有吸水纸的玻璃培养皿中，转移时确保带孔薄膜面朝上。将清洁后的载网有孔薄膜面朝上转移至湿润的滤纸上。将疏水性载网垂直浸入水中，以防止因水的表面张力导致载网弯曲。将浸没的载网排列成方形阵列，保持彼此靠近但不重叠。用更多去离子水填充网格涂层槽，确保水面高于网格至少五毫米。要从培养皿中捞取MMA石墨烯薄膜，需将盖玻片缓慢地以一定角度插入培养皿中，位置应远离石墨烯薄膜。将盖玻片置于石墨烯MMA薄膜下方，并使其边缘与薄膜边缘平行对齐。然后将盖玻片从水中垂直提起，使MMA石墨烯薄膜随之带出。通过以45度角将盖玻片缓慢浸入水中，将MMA石墨烯薄膜转移至水槽中，使薄膜脱离盖玻片并漂浮在水面上。在水位下降之前，将MMA石墨烯薄膜定位在载网的上方。使用尖端已熔融封闭的巴斯德移液管，小心调整MMA石墨烯薄膜的位置。用注射器缓慢降低液面，使MMA石墨烯薄膜准确地落在载网上，并完全覆盖其表面。使用一对洁净干燥的镊子，将夹持载网的吸水纸转移至洁净无尘的培养皿中。将夹紧型透射电镜载网支架底座置于第一个含有200毫升新鲜丙酮的结晶皿底部。将每张载网从吸水纸上单独转移至支架底座的孔中，确保甲基丙烯酸甲酯（MMA）面朝上。用铝箔覆盖结晶皿，并在旋转摇床上轻轻振荡30分钟。将金属盖盖在网格支架块上以固定网格。然后使用弯头叉或长镊子小心地将支架块从培养皿中取出，并放入盛有200毫升新鲜丙酮的第二个培养皿底部。从支架块上取下盖子后，在旋转摇床上轻轻振荡30分钟。将盖子重新盖在网格支架块上，并将其转移至含有200毫升异丙醇的培养皿中。在轻轻振荡前取下盖子，振荡20分钟。将网格转移至一个铺有吸水纸的小型玻璃培养皿中，室温下晾干10分钟。在透射电子显微镜（TEM）衍射模式下，覆盖有单层石墨烯的EM载网显示出对应于石墨烯六方晶格的布拉格衍射峰。石墨烯载网对样品具有富集效应，这一点在比较施加于完全金载网（有或无石墨烯支撑）的脱铁铁蛋白时可观察到。对石墨烯覆盖的金载网上脱铁铁蛋白的冷冻电镜图像进行快速傅里叶变换，同样显示出对应于六方石墨烯晶格的布拉格衍射峰。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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