用于冷冻电子显微镜的单层石墨烯涂层网格的制备
2023年9月8日
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在这里，我们描述了一种将单层石墨烯应用于电子显微镜网格的方案，以及如何准备它们以用于冷冻电镜结构测定。
目前，以最佳方式保存生物样品是获得高分辨率 CryoEM 结构的主要挑战。在样品制备过程中，样品暴露在疏水性空气-水界面中，这对样品有变性作用，并可能导致稳定的样品在冰中采用优先取向，从而妨碍高分辨率结构测定。在冷冻电镜网格上涂上一层薄薄的碳，如软氧化石墨烯，通常用于解决与空气-水界面相互作用相关的问题。
然而，这些层通常会增加图像中的背景噪声，从而影响我们结构的分辨率。用单层石墨烯涂覆网格可以实现类似的保护，而不会引入明显的背景噪声。使用石墨烯涂层的冷冻电镜网格可以帮助克服与空气-水界面相互作用相关的问题，然而，商业石墨烯网格价格昂贵，许多实验室认为石墨烯网格过于复杂，无法在内部制备。
CryoEM领域的研究人员现在可以使用这种分步协议在一天内复制完全生产的数十种高质量石墨烯。
概述
本研究解决了为高分辨率冷冻电子显微镜（cryo-EM）最优保存生物样本的难题。作者提出了一种在透射电镜载网表面涂覆单层石墨烯的方案，以在成像过程中最大限度降低背景噪声并提高样本完整性。
关键研究组成部分
研究领域
- 冷冻电子显微镜
- 生物成像中的样品保存
- 石墨烯在显微镜中的应用
背景
- 生物样本的保存对于获得高分辨率的冷冻电镜结构至关重要。
- 传统的碳涂层会增加成像中的背景噪声。
- 石墨烯可提供保护层，同时不损害图像质量。
使用的方法
- 将单层石墨烯应用于电子显微镜载网
- 冷冻电镜成像技术
- 使用自制旋涂仪及多种清洗试剂
主要结果
- 石墨烯涂层载网在成像中表现出更低的背景噪声。
- 该方法可在一天内实现高质量石墨烯的大规模生产。
- 电镜载网在生物样本的保存和富集方面表现出良好效果。
结论
- 该方案为实验室提供了一种简便的方法，用于制备石墨烯包被的透射电镜载网。
- 这一改进有助于提升生物研究中冷冻电镜成像的质量与应用潜力。
常见问题
使用石墨烯涂层载网的主要优势是什么？
石墨烯涂层载网可在保持样品完整性的同时，最大限度地减少冷冻电镜成像中的背景噪声。
该实验方案是否可在任何实验室中使用？
是的，该实验方案旨在不同研究环境中均可重复。
制备石墨烯网格需要多长时间？
该过程一天可制备出数十个高质量的石墨烯载网。
冷冻电镜成像中常见的挑战有哪些？
挑战包括样品变性以及传统涂层带来的背景噪声增加。
石墨烯涂层工艺复杂吗？
所提供的方案简化了制备流程，使实验室操作更加便捷。
哪些生物样本可从该方法中获益？
各种生物样品，特别是对气-水界面敏感的样品，可受益于石墨烯涂层。
该方案如何确保有效的样本保存？
通过在制备过程中尽量减少暴露于疏水性气-液界面来实现。
行业高管相关性
高分辨率冷冻电镜技术对结构生物学和药物发现至关重要，但样品在气液界面处发生的变性及取向偏好会限制数据质量和通量。单层石墨烯包被载网可通过保持大分子完整性并降低背景噪声，有效解决这些瓶颈问题，直接推动早期发现与靶点验证。石墨烯载网的可扩展化自主制备能够促进其更广泛应用，支持覆盖整个研发管线的结构研究，并加速作用机制层面的风险排除。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 实现对大分子复合物的高保真结构解析，用于靶点验证。
- 减少变性和聚集，支持早期发现阶段的机制性风险降低。
- 提高取向多样性，增强结构模型的预测可信度。
筛选与检测方法开发
- 有助于制备可重复、低背景的冷冻电镜载网，用于后续筛选。
- 通过最小化噪声和浓度伪影，支持定量成像。
- 能够在较低样品浓度下可靠评估蛋白质复合物。
转化与临床前研究
- 通过支持生成可靠的结构数据，提升从发现到临床前验证的连续性。
- 通过提高结构分辨率，与转化生物标志物开发保持一致。
- 减少因结构数据不明确或受损而导致的后期研发失败风险。
流程与工作流整合
单层石墨烯包被载网可整合到冷冻电镜工作流程中，贯穿早期发现、先导物鉴定及临床前研究阶段，支持基于假设的结构研究，并实现可重复的高质量成像。
- 发现生物学：通过保持大分子的天然构象，支持假设验证和通路阐明。
- 筛选：提供标准化、可重复的网格，用于定量冷冻电镜检测。
- 分析：提供低噪声、高分辨率图像，支持可靠的比较分析。
- 转化研究：通过实现对候选治疗分子的可靠结构表征，增强临床前研究的连续性。
- 企业级复用：建立可扩展且具有成本效益的平台，支持跨项目重复开展结构研究。
运营与企业影响
- 科学价值：提高结构生物学中的预测置信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：标准化载网制备流程，提升实验可重复性，并实现批量扩增。
- 战略价值：通过更高品质的数据，加速“推进/终止”决策，降低后期生物学风险。
- 项目组合影响：支持基于风险调整的、针对结构验证靶点的优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备冷冻电镜载网操作和石墨烯处理的专业技术。
- 需要配备旋涂仪、通风橱以及标准的电镜载网制备基础设施。
- 要求跨团队标准化操作，以确保载网质量和成像结果的可重复性。
- 针对不同蛋白质类别或样品类型，可能需要进行方法调整。
- 潜在局限性包括对操作敏感性的要求，以及石墨烯转移步骤所需的初期培训。
生物制药常见问题
为什么零假设检验对石墨烯网格靶标验证很重要？
零假设检验可确保使用石墨烯涂层载网在样品保存和成像质量方面的观察改善具有统计学显著性，从而支持结构生物学工作流程中可靠的靶点验证决策。
自变量隔离如何融入石墨烯网格发现流程？
分离石墨烯涂层对冷冻电镜载网性能的影响，可使研究团队将样品完整性和成像质量的提升直接归因于支撑材料，从而在发现流程中明确其机制性贡献。
定量因变量测量在石墨烯网格冷冻电镜中能够实现什么？
定量测量（如背景噪声降低和取向多样性）能够对不同类型的载网进行客观比较，并支持在研发决策中通过数据驱动的方式优化冷冻电镜样品制备。
为何石墨烯网格跨职能协作对重复性要求至关重要？
石墨烯载网制备与成像方案的可重复性确保了不同团队间实验结果的可重现性，有助于结构与转化研究中的可靠数据共享及跨学科协作。
在实施石墨烯网格协议之前需要具备哪些统计分析能力？
在生物制药研发流程中广泛采用石墨烯载网之前，对成像输出结果（如信噪比和取向分布）进行统计学分析，对于验证其操作优势至关重要。
