Name: 早期无引导人脑类器官神经血管生态位建模到允许的雏鸡胚绒毛膜尿囊膜中 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 8 s
Description: 学习将人脑类器官移植到鸡胚绒毛膜尿囊膜的技术，用于研究神经血管生态位发育与小胶质细胞成熟。该方法为构建具有临床相关性的血管化脑类器官模型提供优化条件。

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感谢巴塞罗那大学的 Alcántara 博士和 Ortega 博士，以及 Acosta 博士实验室的其他成员所参与的富有见地的讨论。S.A. 是由加泰罗尼亚自治区资助、在巴塞罗那大学任职的塞拉-亨特学者计划助理教授。

白来航鸡（Gallus gallus）胚胎的处理遵循美国国家研究委员会生命科学委员会实验动物资源研究所发布的《实验动物护理和使用指南》，实验已获得巴塞罗那大学实验动物护理和使用委员会的批准。
1. 非引导性脑类器官制备
<ol>
	<li>将 H9 人胚胎干细胞（hESCs）在室温预热的 mTESR1 培养基中培养，细胞融合度控制在 70%，培养容器为 Matrigel（用 DMEM 按 1:40 稀释）包被的 6 孔板，置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中。 
	注意：Matrigel 必须始终保持在冰上直至用于包被，以防止其发生聚合。</li>
	<li>按照非定向脑类器官方案2生成脑类器官。
	<ol>
		<li>使用 500 µL 细胞解离液对 H9 hESCs 进行解离，并在 37 °C 下孵育 3–5 分钟。用含有 ROCK 抑制剂 Y27632（终浓度 50 µM）的 mTESR1 培养基重悬细胞，按每孔 9,000 个细胞接种至经低黏附预处理的 96 孔板中。</li>
		<li>当类器官在含 ROCK 抑制剂 Y27632（终浓度 50 µM）的 mTESR1 培养基中聚集成球后，将其转移至诱导培养基中培养 5–6 天。</li>
		<li>根据非定向脑类器官方案26，在约第 4–5 天将类器官转移至神经诱导培养基中。</li>
		<li>当类器官达到一定大小并形成神经上皮环结构后，将其转移至冰上预冷的 Matrigel 液滴中。待 Matrigel 完全聚合后，将类器官转移至含 5 mL 预热成熟培养基的 5 cm 低黏附培养皿中。</li>
		<li>4 天后，将脑类器官置于轨道振荡条件下培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在移植前立即用新鲜 DPBS 收集待移植的类器官。</li>
</ol>
2. 卵的维持、发育激活及卵壳穿刺
<ol>
	<li>将受精卵（第0天）保存在18 °C的培养箱中，直至使用。 
	注意：在此温度下，胚胎不会发育，将保持在相同的成熟阶段。</li>
	<li>使用时，将鸡蛋置于38 °C、相对湿度60%的环境中孵育，并以45 °C的角度进行轻柔的往复摇动。</li>
	<li>第1天，用70%乙醇清洁蛋壳表面，并用纸巾擦干以达到消毒目的。</li>
	<li>在蛋壳顶部贴上外科用纸质粘性绷带，后文简称&#34;绷带&#34;，覆盖蛋的气室区域。 
	注意：此举可防止蛋壳碎屑落入CAM（绒毛尿囊膜），避免其卡在膜中。</li>
	<li>使用无菌针头（21 G × 11/2''）进行气室穿刺操作，后文简称气室孔（ACH），轻柔刺穿蛋壳。在蛋的顶端打开ACH，以避免干扰此时已与蛋壳分离的CAM。</li>
	<li>为确定穿刺ACH的最佳位置，可使用光源照射，识别蛋顶端蛋壳最薄的区域。透光最明显的位置即为最佳钻孔点。</li>
	<li>用新的绷带覆盖ACH，以保护胚胎免受外界环境影响，并将蛋放回培养箱中。</li>
	<li>自此之后，停止培养箱内的旋转，将蛋保持垂直放置，开窗端朝上。 
	注意：这有助于胚胎发育，同时使CAM位于上方，并在胚胎与蛋壳之间形成气室，便于后续移植操作。</li>
	<li>从第1天至第4天打开ACH。第4天（移植前3天）胚胎活性显著提高。</li>
</ol>
3. 脑类器官移植
<ol>
	<li>在第7天进行移植，此时绒毛尿囊膜（CAM）已充分发育并血管化，覆盖整个胚胎的卵表面。</li>
	<li>移除胶带，用70%乙醇擦拭蛋壳表面以对蛋壳进行消毒，然后小心地扩大人工开窗（ACH），形成移植窗口。</li>
	<li>放置一个新的、更大的胶带覆盖在最终移植窗口之外的区域，以防止在扩大移植窗口时蛋壳碎片落入绒毛尿囊膜上。 
	注意：此更大的窗口有助于选择最佳移植位置，并便于后续移植操作。</li>
	<li>通过轻柔穿刺蛋壳来扩大移植窗口，直至窗口直径达到约2 cm。使用镊子轻轻移除蛋壳边缘，使窗口扩大。随后轻柔揭下胶带，去除仍附着在胶带上的残留灰尘和蛋壳碎片。</li>
	<li>使用P200自动移液器将类器官放置到位。用无菌锋利剪刀剪切移液器吸头尖端，使其开口根据类器官大小适当扩大，以避免损伤类器官；或使用大孔径的无菌移液吸头。将类器官收集于最大体积为50 µL的PBS中，并直接将其转移至绒毛尿囊膜上，位置应选择在胚胎所在位置的对侧。</li>
	<li>确保移植位置远离卵黄，以避免在收获时破裂；最好将其置于血管附近。</li>
	<li>将类器官放置于绒毛尿囊膜上后，在其周围滴加7 µL Matrigel。 
	注意：这将防止类器官在膜上移动。</li>
	<li>使用一块大小与窗口完全匹配的Parafilm薄膜覆盖窗口，并用胶带将其固定在蛋壳上。 
	注意：必须用Parafilm完全覆盖窗口，以防止胚胎干燥，同时允许气体交换。应准确界定窗口覆盖范围，避免超出窗口边缘，否则可能阻碍胚胎正常发育所需的气体交换27。</li>
</ol>
4. 移植类器官的收获
<ol>
	<li>在鸡胚胎发育第12天（即移植后5天）收获移植的类器官及其周围的绒毛尿囊膜（CAM），此时对应Hamburger和Hamilton发育阶段的第38期（HH38）28。在此阶段，CAM已完全分化并具有成熟的脉管系统，同时羽毛胚已覆盖胚胎的翅膀及上眼睑。</li>
	<li>移除粘性绷带后，进一步扩大窗口，以便使用剪刀和精细镊子进行样本采集。</li>
	<li>如有需要，可在双目解剖显微镜下观察类器官，并进行2分钟的预固定（使用4%多聚甲醛，PFA），以利于类器官和CAM的采集。</li>
	<li>收集包含类器官的约1.5 cm2大小的CAM组织区域。</li>
	<li>样本固定
	<ol>
		<li>用1×PBS洗涤样本，随后在4 °C条件下用4% PFA（溶于PBS，pH 7.2）固定30分钟。然后用PBS洗涤3次，每次5分钟。</li>
		<li>将样本在含叠氮化钠的PBS中4 °C保存，或直接在30%蔗糖-PBS溶液中4 °C过夜进行冷冻保护。</li>
		<li>完成冷冻保护后，将样本包埋于最佳切割温度化合物（OCT）中，-20 °C保存直至切片。使用冷冻切片机切割20 µm厚的组织切片，并将其收集到经多聚赖氨酸处理的载玻片上。切片载玻片于-20 °C保存，待染色时使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 免疫荧光
<ol>
	<li>用含0.1% Triton X-100的PBS溶液（PBS-T）在室温（RT）下处理切片10分钟，以去除OCT。</li>
	<li>用封闭液（BS）（含2% BSA、3%驴血清的PBS-T 0.01%溶液）在室温下处理切片1小时。</li>
	<li>将所选的一抗抗体（见材料表）用封闭液稀释后，于4 °C孵育过夜。</li>
	<li>次日，在室温下用1× PBS溶液清洗样本3次，每次10分钟。</li>
	<li>将二抗抗体用封闭液稀释后，在室温下孵育2小时（见材料表）。</li>
	<li>在室温下用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）孵育样本10分钟，以标记细胞核；DAPI用PBS-T按1:1,000稀释。</li>
	<li>用封片剂封片，并加盖盖玻片。</li>
	<li>使用宽场荧光显微镜在2.5、10、20和40倍镜下采集所有图像。</li>
	<li>将切片储存于4 °C。</li>
</ol>
6. 苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色
注意：为了证实嫁接成功，需进行苏木精-伊红（H&E）染色。
<ol>
	<li>在室温下用 PBS-T 0.1% 去除 OCT，持续 10 分钟。</li>
	<li>在通风橱中进行逐级脱水，步骤如下：蒸馏水（DW）中 10 分钟，苏木精中 45 秒，DW 中 1 分钟，PBS 中 20 秒，70% EtOH 中 2 次，每次 30 秒，80% EtOH 中 2 次，每次 30 秒，96% EtOH 中 2 次，每次 30 秒，伊红中 30 秒，96% EtOH 中 2 次，每次 15 秒，100% EtOH 中 2 次，每次 15 秒，二甲苯-100% EtOH 中 1 分钟，二甲苯中 1 分钟，新鲜二甲苯中 1 分钟。</li>
	<li>使用基于二甲苯的封片介质封固玻璃盖玻片。</li>
</ol>

Grafting Human Brain Organoids into the Chorioallantoic Membrane of the Chick Embryo

<ol><li>Camp, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cerebral+organoids+recapitulate+gene+expression+programs+of+fetal+neocortex+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).</li>
<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis+in+a+dish%3A+Modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125(2014).</li>
<li>Yang, Q., Hong, Y., Zhao, T., Song, H., Ming, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+makes+organoids+good+models+of+human+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">What makes organoids good models of human neurogenesis.</a> Front Neurosci. 16, 872794(2022).</li>
<li>Sun, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+vascularized+brain+organoids+to+study+neurovascular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions.</a> Elife. 11, e76707(2022).</li>
<li>Paredes, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte+precursor+cell+specification+is+regulated+by+bidirectional+neural+progenitor-endothelial+cell+crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte precursor cell specification is regulated by bidirectional neural progenitor-endothelial cell crosstalk.</a> Nat Neurosci. 24 (4), 478-488 (2021).</li>
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<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+human+cortical+organoids+%28vorganoids%29+model+cortical+development+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Vascularized human cortical organoids (vorganoids) model cortical development in vivo.</a> PLoS Biol. 18 (5), e3000705(2020).</li>
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<li>Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chicken+chorioallantoic+membrane+angiogenesis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chicken chorioallantoic membrane angiogenesis model.</a> Methods Mol Biol. 843, 47-57 (2012).</li>
<li>Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chicken+chorioallantoic+membrane+model+in+biology%2C+medicine+and+bioengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering.</a> Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).</li>
<li>Kennedy, D. C., Coen, B., Wheatley, A. M., Mccullagh, K. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+experimentation+in+the+chick+chorioallantoic+membrane+as+a+model+for+screening+angiogenic+agents+including+from+gene-modified+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Microvascular experimentation in the chick chorioallantoic membrane as a model for screening angiogenic agents including from gene-modified cells.</a> Int J Mol Sci. 23 (1), 452(2021).</li>
<li>Garreta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+tuning+the+extracellular+environment+accelerates+the+derivation+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nat Mater. 18 (4), 397-405 (2019).</li>
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<li>Himmels, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neurons+control+blood+vessel+patterning+in+the+developing+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Motor neurons control blood vessel patterning in the developing spinal cord.</a> Nat Commun. 8, 14583(2017).</li>
<li>Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+brain+organoids+to+investigate+neural+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The use of brain organoids to investigate neural development and disease.</a> Nat Rev Neurosci. 18 (10), 573-584 (2017).</li>
</ol>

作者未报告任何利益冲突。

本研究中，我们描述了一种详细的实验方案，包含多个关键步骤，可在不干扰鸡胚存活的前提下，促进人脑类器官移植后的良好生长与发育。我们建议在孵化24小时后（第1天）使用无菌针头刺穿鸡蛋的气室。此外，我们也曾尝试在第4天进行穿刺（通过透光观察蛋壳，检测血管系统的发育情况，以确保仅对健康的胚胎进行操作）。然而，由于尿囊膜血管已接近蛋壳，该操作导致胚胎存活率下降。需要注意的是，施加过大的力量可能导致蛋壳破裂，进而损伤尿囊膜血管系统。使用光源检测蛋壳变薄的区域有助于制作钝性孔洞，同时防止过度穿刺穿透蛋壳，避免侵入尿囊膜。
尽管在孵化过程中鸡蛋的定期翻转对鸡胚的正常发育似乎是必需的，但在穿刺气室后必须避免翻转。本模型无需移除蛋清，也无需添加PBS以防止鸡蛋脱水。此外，使用70%乙醇溶液时应谨慎操作，需特别注意将蛋壳表面残留的乙醇彻底干燥，以维持胚胎活性。另一个关键点是用于移植的蛋壳开孔尺寸，需在保证移植物操作便利的前提下，尽可能缩小开孔大小。选择E7胚龄进行移植，是基于绒毛尿囊膜（CAM）的成熟程度及其相对大小，有利于移植物的整合。然而，若移植的类器官需要更长时间 在卵内 成熟后，可在E5.5/6天进行移植。通过控制脑类器官的变异性以确保实验的可行性。同龄类器官具有相似的大小，需注意的是，无论类器官的年龄如何，移植后均孵育5天。此外，为保持一致性，对照组类器官被严格筛选，以精确匹配移植组类器官的大小。另一项与维持移植类器官及胚胎存活相关的关键技术细节是：使用方形帕拉膜（parafilm）封闭移植孔，以维持稳定的环境 在卵内 环境
与我们的初始假设相反，年轻的类器官在移植过程及绒毛尿囊膜（CAM）整合后的存活率高于年老的类器官。我们推测，年轻的类器官由于富含早期祖细胞而具有更强的可塑性33，而成熟神经元则需要容许性的神经环境以维持其存活。此外，在早期（D18）脑类器官移植中，星形胶质细胞的分布出现了细胞结构上的变化。值得注意的是，我们发现星形胶质细胞仅在移植后才在此早期阶段发生分化，并分布于类器官表面下方形成一种假性包膜结构。该结构可能反映了类器官形成神经血管界面的潜能，从而模拟血脑屏障（BBB）。或者，呈屏障样结构排列的星形胶质细胞反应性增强，可能提示类器官对CAM分泌的信号分子产生了免疫原性反应。然而，这一假设尚需进一步研究加以验证。综上所述，本文描述了将不同发育阶段的类器官移植至鸡胚CAM的操作步骤，表明早期发育阶段的类器官在此环境中更具适应性，并探讨了此类移植对神经元和GFAP阳性细胞的细胞学影响。

人脑类器官是一种新兴技术，能够在体外重现人脑的早期发育过程in vitro1,2,3。然而，该模型的主要局限性之一是缺乏血管化，而血管系统不仅在脑内环境稳态中发挥不可或缺的作用，也在脑发育过程中具有关键功能4。除了输送氧气和营养物质外，越来越多的证据表明，脑血管系统在发育过程中调控神经分化、细胞迁移和突触形成5,6。因此，迫切需要建立可靠的模型，为脑类器官提供缺失的血管信号和结构支持，从而提升人脑类器官生成的复杂性7。
在已提出的血管化方法中，主要有两种研究方向：将类器官移植到活体生物体内，以及在体外通过共培养内皮细胞和神经细胞的纯in vitro技术8,9,10,11,12。在小鼠脑内进行移植成本高且耗时，因此其他技术在简化模型中具有重要意义。鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）模型已被广泛用于血管生成的研究13,14,15。在过去十年中，多个研究团队已成功将多种类器官移植到CAM上，包括肾类器官16,17、心肌类器官18以及肿瘤类器官19,20。然而，关于将人脑类器官移植到CAM上的效率、毒性/排斥反应、生理效应以及具体移植方法，目前仍知之甚少。另一个尚未被探索但具有重要意义的方面是CAM与类器官星形胶质细胞界面之间是否能够形成嵌合的血脑屏障（BBB）。先前的开创性研究表明，通过移植星形胶质细胞或星形胶质细胞条件培养基，可能在CAM上构建出BBB21,22,23。然而，成熟星形胶质细胞似乎无法实现这一功能24,25。因此，星形胶质细胞诱导形成BBB的能力仍存在争议，而移植人脑类器官将有助于澄清这一问题。
本视频文章介绍了一种将人脑类器官移植到鸡胚尿囊膜（CAM）上的 in ovo 实验方案，该方法可促进类器官的生长、功能改善及血管化，最终形成的类器官包含组织学上符合血脑屏障（BBB）特征的结构成分。本文提供了一套确保鸡胚存活的实验流程，并报道了CAM支持脑类器官生长的容受性。

<table><tbody><tr><td>抗 TUBB3 [Tuj1] 抗体，小鼠&amp;nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>801201</td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>抗 GFAP 抗体，兔</td><td>GeneTex</td><td>GTX108711</td><td>1:500</td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 标记山羊抗兔 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>AlexaFluor 594 标记山羊抗小鼠 IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-585-150</td><td>1:500</td></tr><tr><td>受精白来航鸡（Gallus gallus）鸡蛋</td><td>Granja Gibert（西班牙卡姆布里尔斯）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>1:10,000</td></tr><tr><td>DPX</td><td>Sigma</td><td>100579</td><td>基于二甲苯的封片介质&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>温和解离溶液</td><td>CreativeBiolabs</td><td>ITS-0622-YT187</td><td>细胞解离溶液</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88 封片剂</td><td>Merk</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>实验室级纸巾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z188956</td><td></td></tr><tr><td>ROCK 抑制剂 Y27632</td><td>Millipore</td><td>SCM075</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>尖头手术剪刀</td><td>VWR</td><td>470106-340</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 黏附载玻片</td><td>Epredia</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr></tbody></table>

早期无引导人脑类器官神经血管微环境在容许性鸡胚尿囊膜中的建模

Early Unguided Human Brain Organoid Neurovascular Niche Modeling into the Permissive Chick Embryo Chorioallantoic Membrane

将类器官移植到模式动物（如免疫缺陷小鼠或鸡胚绒毛尿囊膜（CAM））的血管化组织中，已被证明是模拟新生血管形成的高效方法。CAM 是一种富含血管的胚外膜，其免疫反应性较低，因此成为人源细胞移植的理想宿主模型。
本文描述了将处于多个成熟阶段的人脑类器官移植到鸡胚尿囊膜（CAM）中的策略。人脑类器官的细胞组成随时间发生变化，反映了人类大脑发育过程中的关键阶段。我们将处于不同成熟阶段的人脑类器官——神经上皮扩增阶段（18天体外培养，DIV）、早期神经发生阶段（60天体外培养，DIV）以及早期胶质发生阶段（180天体外培养，DIV）——移植至孵化第7天（E7）的鸡胚尿囊膜上。移植5天后获取类器官，并对其组织学特征进行分析。
在移植的类器官中或移植物邻近区域均未检测到新生血管形成的组织学迹象或异常血管。此外，观察到移植类器官的细胞组成发生显著变化，即胶质纤维酸性蛋白阳性反应性星形胶质细胞数量增加。然而，这些细胞结构的变化依赖于类器官的成熟阶段。综上所述，这些结果表明脑类器官可在鸡胚尿囊膜（CAM）上生长，并且其细胞结构特征会因移植时所处的成熟阶段不同而有所差异。

选择用于移植的胚胎成熟时间表 
实验从第0天（D0）开始，将受精卵置于38 °C、相对湿度60%的条件下孵育。绒毛尿囊膜（CAM）是一种高度血管化的胚外膜，于卵孵化后发育形成，由尿囊和绒毛膜融合而成。在第1天（D1），即孵育24小时后，穿刺气室以防止绒毛尿囊膜与壳内膜粘连。相较于后期（D4）穿刺，D1穿刺可获得更高质量的气室。绒毛尿囊膜持续生长，至第12天（D12）时包裹整个卵内容物，并牢固附着于壳内膜（图1）。在第7天（D7）将原先的孔扩大，以便于后续样本收获。D7是移植物接种的最佳时间点，此时绒毛尿囊膜已发育成熟，覆盖卵黄囊及胚胎表面。在此阶段，扩大气室孔，借助自动移液器将类器官接种至绒毛尿囊膜上。
脑类器官移植 
在脑类器官固有的成熟过程中 体外其细胞组成从神经前体细胞转变为成熟的神经元和胶质细胞。在脊椎动物中，神经血管系统与神经发生是相互交织且相互依赖的发育过程，介导这种交互作用的信号通路在很大程度上依赖于神经组分的成熟阶段29神经前体细胞是发育中大脑促血管生成因子的主要来源29,30相反，神经元和星形胶质细胞在成熟阶段及成年期通过分泌血管内皮生长因子促进新生血管形成。31,32这些大脑细胞结构的变化在脑类器官中同样有所体现，可能导致不同成熟阶段的脑类器官对CAM移植的整合与反应出现差异。因此，我们在脑类器官分化的第13天进行移植 体外 （DIV），当神经上皮细胞和放射状胶质细胞扩增时；在 DIV 37，神经发生开始时；在 DIV 60，神经发生旺盛，不同身份的神经元已终末分化；在 DIV 120，类器官中已充满大量成熟神经元，形成发育良好的神经网络，同时星形胶质细胞生成也广泛发生。
在所有情况下，样本均在5天后采集 在卵内 （DIO）孵育。为避免脑类器官因批次效应产生偏差，所有移植与非移植类器官之间的比较均在同一实验批次中成对进行。每个时间点的类器官均来自至少两次独立实验，总计进行了六次独立分化。每次移植实验中，多个成熟阶段的类器官均平行进行移植。移植后，类器官在CAM血管旁继续成熟，未见血管侵入类器官内部。图2).
类器官移植后的存活率在最年轻的类器官中可达80%，而在移植后5天，成熟类器官的存活率下降至约66%，表明类器官的容受性及移植可塑性可能随时间发生变化（表1）。类器官的活力通过H&amp;E染色中是否存在固缩核来确定。移植组与未移植对照组类器官之间的固缩核数量相似（图3），提示鸡绒毛尿囊膜（CAM）具有容受性，能够支持移植后类器官的存活。此外，在CAM上未检测到组织学异常或造血样释放现象，且胚胎保持存活状态，表明移植操作本身以及类器官均未破坏CAM的完整性，也未对胚胎发育造成显著影响。
移植脑类器官中的细胞组成 
未引导的脑类器官在不同类器官之间以及同一类器官内部均表现出显著的细胞异质性。然而，它们主要由神经细胞构成，并按顺序相继产生前体细胞、神经元和星形胶质细胞2,26。接下来，我们评估了移植是否改变了脑类器官中的神经细胞组成。较年轻的类器官（13 DIV + 5 DIO：18天）在神经元（TUBB3+）存在方面与其未移植的对照类器官相比无明显差异。而在较晚的成熟阶段（60 DIV + 5 DIO：65天和120 DIV + 5 DIO：125天），与未移植类器官相比，神经元（TUBB3+）的比例显著降低（图4）。在培养60 DIV的未移植类器官中，神经元广泛分布于整个类器官中。
值得注意的是，胶质纤维酸性蛋白阳性（GFAP+) 星形胶质细胞，与未移植对照组相比表现出增加。此外，这些GFAP+ 星形胶质细胞在类器官外侧呈现出意料之外的定位。在培养18天时，游离类器官（未移植）中仅可见少量星形胶质细胞，且无法检测到明确的结构分布；相反，它们在整个类器官中呈均匀分布图3).
<img alt="卵壳移植过程；类器官发育示意图；神经诱导时间线" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65710/65710fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1类器官移植的CAM实验设置时间线 (A在卵的上方贴上外科用纸胶带。B用针在胶布上方的蛋壳上打孔。C打开蛋壳窗口，从顶部观察，准备进行移植（D人脑类器官（第60天）。比例尺 = 100 µm. (E) 在CAM上移植5天后观察类器官的植入情况 在卵内 孵育。F) 从第0天到第120天脑类器官发育的特征。箭头指示类器官的位置。缩写：CAM = 绒毛尿囊膜。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65710/65710fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="组织学显微镜，组织变化 2.5x/10x，DIV+DIO 阶段，细胞发育比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65710/65710fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：类器官在绒毛尿囊膜上移植后的苏木精-伊红染色。 （A）13 DIV + 5 DIO 类器官；（B）37 DIV + 5 DIO 类器官；（C）60 DIV + 5 DIO 类器官；以及（D）120 DIV + 5 DIO 类器官；红色方框标记类器官位置。比例尺 = 500 µm。缩写：DIV = 体外培养天数（day in vitro）；DIO = 胚内发育天数（day in ovo）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65710/65710fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示组织发育的荧光显微镜图像序列，带箭头标记细胞生长阶段。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65710/65710fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：类器官在不同发育阶段的免疫细胞化学染色。 使用GFAP进行染色，DAPI标记细胞核。比例尺 = 100 µm。（A,B）同一移植类器官在13 DIV + 5 DIO阶段的图像，可见星形胶质细胞位于类器官边缘。（C）18 DIV未移植类器官的图像，其中星形胶质细胞几乎不可见。未移植与移植类器官之间的差异非常明显。（D,E）37 DIV + 5 DIO移植类器官的图像，仅可见少量星形胶质细胞。（F）42 DIV未移植类器官的图像。黄色箭头指示星形胶质细胞的位置。缩写：DIV = 体外培养天数（day in vitro）；DIO = 胚内发育天数（day in ovo）；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚；GFAP = 胶质纤维酸性蛋白。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65710/65710fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="120 天体外培养类器官的静态平衡示意图；CAM 移植组与对照组；荧光显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65710/65710fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：120 天体外培养（DIV）类器官的免疫细胞化学染色。 使用 TUBB3 标记神经元，DAPI 标记细胞核。比例尺 = 100 µm；图像放大倍数为 20 倍。（A） 一个 120 天体外培养加 5 天卵内培养（120 DIV +5 DIO）的移植类器官，其中可见少量神经元。（B） 一个 125 天体外培养（125 DIV）的游离类器官，含有大量神经元。星号表示类器官的位置，虚线表示类器官与绒毛尿囊膜（CAM）之间的边界（由组织学分析确定）。缩写：DIV = 体外培养天数（day in vitro）；DIO = 卵内培养天数（day in ovo）；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚；CAM = 绒毛尿囊膜。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65710/65710fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>类器官</td>
			<td>13 天体外培养</td>
			<td>37 天体外培养</td>
			<td>60 天体外培养</td>
			<td>120 天体外培养</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>存活</td>
			<td>6 (75%)</td>
			<td>10 (83%)</td>
			<td>6 (66%)</td>
			<td>6 (66%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>死亡</td>
			<td>2 (25%)</td>
			<td>2 (16%)</td>
			<td>3 (34%)</td>
			<td>3 (34%)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：CAM类器官移植后胚胎存活率 缩写：DIV = 天 体外；DIO = 天 在卵内；CAM = 绒毛尿囊膜。

本文介绍了一种将处于不同成熟阶段的人脑类器官移植到鸡胚尿囊膜（CAM）上的实验方案。人脑类器官采用非定向标准化方案进行培养。

将类器官移植到模式动物的血管化组织中，例如免疫缺陷小鼠或鸡胚尿囊膜（CAM），已……

我旨在解决的关键问题涉及在正常发育以及各种病理状态下人类大脑形成的相关机制与过程。这包括研究影响大脑发育的因素，例如遗传、环境和表观遗传因素。获得在结构上接近成年人大脑的脑类器官仍具有挑战性，特别是实现血管化、血脑屏障功能、小胶质细胞的存在以及细胞类型的多样性。克服这一难题对于开发出更接近生理状态的脑类器官模型至关重要，此类模型能够高效模拟成人人类大脑，从而增强临床应用价值。通过我们的研究，我们提供了将人类脑类器官移植到绒毛尿囊膜中的最佳条件，以确保小胶质细胞的良好发育。这一临床改进对于未来在该领域构建类脑类器官的合成血管化环境的努力具有核心意义。与其它技术相比，本方案的优势在于其高效性和成本效益。我们利用农场鸡的受精卵进行具有活性的类器官移植，已获得了较高的成功率。未来，本实验室将致力于开展与类器官相关的新生血管功能评估研究。探索该血管化模型在静脉注射纳米药物中的潜在应用。此外，我们旨在评估这些纳米药物在人类中枢神经系统中的分布情况。首先，利用H9胚胎干细胞衍生脑类器官，并获取新受精的鸡卵。第一天，用70%乙醇清洁蛋壳表面并使其干燥。在蛋的上方贴上外科纸胶带。使用灯照射，确定蛋尖上方最薄的蛋壳区域。然后用无菌针头轻轻刺破蛋壳，以创建气室孔，注意不要损伤鸡胚的绒毛尿囊膜（CAM）。为保护胚胎免受外界环境影响，用新的敷料覆盖气室孔，并将鸡蛋置于38摄氏度条件下孵育。在第7天，移除敷料并用70%乙醇擦拭蛋壳表面。然后放置一个新的、更大的敷料覆盖在延伸区域。轻轻刺破蛋壳，将孔扩大成一个直径为两厘米的嫁接窗。使用镊子移除蛋壳窗的边缘，并撕去敷料以清除残留的灰尘和蛋壳碎片。使用无菌宽口枪头，用 50 µL PBS 收集类器官，并小心将其转移至远离胚胎位置的绒毛尿囊膜上。在类器官周围加入 7 µL Matrigel 液滴。用 Parafilm 封闭窗口，并使用胶带将其固定在蛋壳上。将移植样本孵育以进行CAM分化。五天后，移除粘性绷带。使用剪刀和精细镊子扩大窗口，以便于样品收获。用 4% 多聚甲醛固定 2 分钟，收集含有类器官的 1.5 平方厘米 CAM 组织区域。为确认移植成功，对含有类器官的 CAM 组织进行 20 µm 厚切片的苏木精-伊红染色。移植物组织的苏木精-伊红染色结果显示，类器官在 CAM 血管旁持续成熟，且未见血管浸润迹象。

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科研

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Developmental Biology

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