Name: 肿瘤微环境空间免疫细胞景观的多重免疫组织化学分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: 了解多重免疫组织化学技术用于肿瘤微环境中免疫细胞的空间定位与表型分析。该方法结合数字成像和光谱分离技术，帮助研究人员可视化多种免疫标志物，为癌症免疫治疗策略提供重要依据。

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PhenoImager HT 的采购资金由拉德堡德大学医学中心和拉德堡德显微技术中心提供。CF 获得了荷兰癌症协会基金（10673）和欧洲研究委员会高级资助项目 ARTimmune（834618）的经费支持。JT 获得了荷兰科学研究组织（NWO）Vidi 基金（VI.Vidi.192.084）的经费支持。作者谨此感谢 Eric van Dinther 和 Ankur Ankan 在建立多重免疫组化数据存储工作流程方面的协助，同时感谢 Bengt Phung 提供在 QuPath 中实施多重免疫组化数据以进行感兴趣区域（ROI）绘制的操作指导。

Mapping the Tumor Immune Landscape: An In-Depth Multiplex IHC Analysis Protocol

<ol><li>Dunn, G. P., Bruce, A. T., Ikeda, H., Old, L. J., Schreiber, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunoediting%3A+from+immunosurveillance+to+tumor+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cancer immunoediting: from immunosurveillance to tumor escape.</a> Nature Immunology. 3 (11), 991-998 (2002).</li>
<li>van der Woude, L. L., Gorris, M. A. J., Halilovic, A., Figdor, C. G., de Vries, I. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migrating+into+the+tumor%3A+a+roadmap+for+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Migrating into the tumor: a roadmap for T cells.</a> Trends in Cancer. 3 (11), 797-808 (2017).</li>
<li>Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+contexture+in+human+tumours%3A+impact+on+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome.</a> Nature Reviews. Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).</li>
<li>Fridman, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+microenvironment+of+human+tumors%3A+general+significance+and+clinical+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Microenvironment%22%5BJournal%5D)">The immune microenvironment of human tumors: general significance and clinical impact.</a> Cancer Microenvironment. 6 (2), 117-122 (2013).</li>
<li>Pages, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+validation+of+the+consensus+Immunoscore+for+the+classification+of+colon+cancer%3A+a+prognostic+and+accuracy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">International validation of the consensus Immunoscore for the classification of colon cancer: a prognostic and accuracy study.</a> Lancet. 391 (10135), 2128-2139 (2018).</li>
<li>Angell, H. K., Bruni, D., Barrett, J. C., Herbst, R., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Immunoscore%3A+colon+cancer+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The Immunoscore: colon cancer and beyond.</a> Clinical Cancer Research. 26 (2), 332-339 (2020).</li>
<li>Angell, H., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+immune+contexture+to+the+Immunoscore%3A+the+role+of+prognostic+and+predictive+immune+markers+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">From the immune contexture to the Immunoscore: the role of prognostic and predictive immune markers in cancer.</a> Current Opinion in Immunology. 25 (2), 261-267 (2013).</li>
<li>Galon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+classification+using+the+Immunoscore%3A+a+worldwide+task+force%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cancer classification using the Immunoscore: a worldwide task force.</a> Journal of Translational Medicine. 10, 205(2012).</li>
<li>Galon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((World-wide+Immunoscore+Task+Force%3A+meeting+report+from+the+34%3BMelanoma+Bridge%26%2334%2C+Napoli%2C+November+30th-December+3rd%2C+2016%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">World-wide Immunoscore Task Force: meeting report from the 34;Melanoma Bridge&#34, Napoli, November 30th-December 3rd, 2016.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 212(2017).</li>
<li>Tumeh, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+blockade+induces+responses+by+inhibiting+adaptive+immune+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance.</a> Nature. 515 (7528), 568-571 (2014).</li>
<li>Creemers, J. H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tipping+point+in+cancer-immune+dynamics+leads+to+divergent+immunotherapy+responses+and+hampers+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">A tipping point in cancer-immune dynamics leads to divergent immunotherapy responses and hampers biomarker discovery.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002032(2021).</li>
<li>Blank, C. U., Haanen, J. B., Ribas, A., Schumacher, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CANCER+IMMUNOLOGY.+The+%26%2334%3Bcancer+immunogram%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CANCER IMMUNOLOGY. The &#34;cancer immunogram&#34;.</a> Science. 352 (6286), 658-660 (2016).</li>
<li>Teruya-Feldstein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunohistochemistry+laboratory+looking+at+molecules+and+preparing+for+tomorrow%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">The immunohistochemistry laboratory looking at molecules and preparing for tomorrow.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 134 (11), 1659-1665 (2010).</li>
<li>Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+tissue+antigens+and+antibodies+get+along%3A+revisiting+the+technical+aspects+of+immunohistochemistry--the+red%2C+brown%2C+and+blue+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry--the red, brown, and blue technique.</a> Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).</li>
<li>Hegde, P. S., Karanikas, V., Evers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+where%2C+the+when%2C+and+the+how+of+immune+monitoring+for+cancer+immunotherapies+in+the+era+of+checkpoint+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The where, the when, and the how of immune monitoring for cancer immunotherapies in the era of checkpoint inhibition.</a> Clinical Cancer Research. 22 (8), 1865-1874 (2016).</li>
<li>Parra, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+platforms+of+multiplexed+immunofluorescence+for+study+of+paraffin+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Treatment+and+Diagnosis%22%5BJournal%5D)">Novel platforms of multiplexed immunofluorescence for study of paraffin tumor tissues.</a> Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).</li>
<li>Gorris, M. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eight-color+multiplex+immunohistochemistry+for+simultaneous+detection+of+multiple+immune+checkpoint+molecules+within+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Eight-color multiplex immunohistochemistry for simultaneous detection of multiple immune checkpoint molecules within the tumor microenvironment.</a> Journal of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).</li>
<li>Roelofsen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+regression+of+ovarian+carcinoma+after+septic+peritonitis%3B+a+unique+case+report%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous regression of ovarian carcinoma after septic peritonitis; a unique case report.</a> Frontiers in Oncology. 8, 562(2018).</li>
<li>van den Brand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-mediated+delivery+of+therapeutic+mRNA+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Peptide-mediated delivery of therapeutic mRNA in ovarian cancer.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 141, 180-190 (2019).</li>
<li>van den Brand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpCAM-binding+DARPins+for+targeted+photodynamic+therapy+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">EpCAM-binding DARPins for targeted photodynamic therapy of ovarian cancer.</a> Cancers. 12 (7), 1762(2020).</li>
<li>Di Blasio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumour+microenvironment+shapes+dendritic+cell+plasticity+in+a+human+organotypic+melanoma+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The tumour microenvironment shapes dendritic cell plasticity in a human organotypic melanoma culture.</a> Nature Communications. 11 (1), 2749(2020).</li>
<li>van Beek, J. J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pDCs+are+superior+to+cDC2s+in+attracting+cytolytic+lymphocytes+in+melanoma+patients+receiving+DC+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human pDCs are superior to cDC2s in attracting cytolytic lymphocytes in melanoma patients receiving DC vaccination.</a> Cell Reports. 30 (4), 1027-1038 (2020).</li>
<li>Rodriguez-Rosales, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+aged+neutrophils+are+augmented+in+blood+and+skin+of+psoriasis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory aged neutrophils are augmented in blood and skin of psoriasis patients.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 148 (4), 1030-1040 (2021).</li>
<li>Hoeijmakers, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+composition+in+the+endometrium+of+patients+with+a+complete+molar+pregnancy%3A+Effects+on+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecologic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Immune cell composition in the endometrium of patients with a complete molar pregnancy: Effects on outcome.</a> Gynecologic Oncology. 160 (2), 450-456 (2021).</li>
<li>van Ravensteijn, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+and+genomic+analysis+reveals+clinically+relevant+distinctions+between+angiosarcoma+subgroups%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Immunological and genomic analysis reveals clinically relevant distinctions between angiosarcoma subgroups.</a> Cancers. 14 (23), 5938(2022).</li>
<li>van der Woude, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+shows+an+immunological+abscopal+effect+in+patients+with+NSCLC+treated+with+pembrolizumab-radiotherapy+combination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment shows an immunological abscopal effect in patients with NSCLC treated with pembrolizumab-radiotherapy combination.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (10), e005248(2022).</li>
<li>Graham Martinez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+microenvironment+landscape+shows+treatment-specific+differences+in+rectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The immune microenvironment landscape shows treatment-specific differences in rectal cancer patients.</a> Frontiers in Immunology. 13, 1011498(2022).</li>
<li>Cortenbach, K. R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topography+of+immune+cell+infiltration+in+different+stages+of+coronary+atherosclerosis+revealed+by+multiplex+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology.+Heart+%26+Vasculature%22%5BJournal%5D)">Topography of immune cell infiltration in different stages of coronary atherosclerosis revealed by multiplex immunohistochemistry.</a> International Journal of Cardiology. Heart & Vasculature. 44, 101111(2023).</li>
<li>van Wilpe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+repair+deficient+prostate+cancer+represents+an+immunologically+distinct+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination repair deficient prostate cancer represents an immunologically distinct subtype.</a> Oncoimmunology. 11 (1), 2094133(2022).</li>
<li>Gorris, M. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired+primary+and+metastatic+lesions+of+patients+with+ipilimumab-treated+melanoma%3A+high+variation+in+lymphocyte+infiltration+and+HLA-ABC+expression+whereas+tumor+mutational+load+is+similar+and+correlates+with+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Paired primary and metastatic lesions of patients with ipilimumab-treated melanoma: high variation in lymphocyte infiltration and HLA-ABC expression whereas tumor mutational load is similar and correlates with clinical outcome.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (5), e004329(2022).</li>
<li>van Wilpe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumoral+T+cell+depletion+following+neoadjuvant+chemotherapy+in+patients+with+muscle-invasive+bladder+cancer+is+associated+with+poor+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Intratumoral T cell depletion following neoadjuvant chemotherapy in patients with muscle-invasive bladder cancer is associated with poor clinical outcome.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 72 (1), 137-149 (2023).</li>
<li>Sultan, S., Gorris, M. A. J., Buytenhuijs, F., Lvan de Woude, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Segmentation-free+machine+learning+architecture+for+immune+land-scape+phenotyping+in+solid+tumors+by+multichannel+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A Segmentation-free machine learning architecture for immune land-scape phenotyping in solid tumors by multichannel imaging.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-profiling+and+cellular+spatial+analysis+using+five+immune+oncology+multiplex+immunofluorescence+panels+for+paraffin+tumor+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Immuno-profiling and cellular spatial analysis using five immune oncology multiplex immunofluorescence panels for paraffin tumor tissue.</a> Scientific Reports. 11 (1), 8511(2021).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+multiplex+immunofluorescence+panels+using+multispectral+microscopy+for+immune-profiling+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+human+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).</li>
<li>Sun, Z., Nyberg, R., Wu, Y., Bernard, B., Redmond, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+an+enhanced+7-color+multiplex+IHC+protocol+to+dissect+immune+infiltration+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Developing an enhanced 7-color multiplex IHC protocol to dissect immune infiltration in human cancers.</a> PLoS One. 16 (2), e0247238(2021).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

对肿瘤微环境（TME）进行空间分析是一种备受关注的技术，有助于深入了解免疫细胞组成，并发现新的预后和预测性生物标志物，尤其在肿瘤免疫学领域具有重要意义16。目前已有多种技术被开发用于实现这一目标，包括检测蛋白质、mRNA转录本或两者联合检测，可同时检测的目标数量估计可达100至1,000个。然而，更高重数的检测通常伴随着通量降低、实验成本升高以及技术挑战增加，且往往只能分析TME中很小的一部分。本文所描述的基于TSA方法的多重免疫组化（IHC）技术可同时检测六种不同的标志物加DAPI，相对成本较低，整个组织切片可在20分钟内完成成像，随即进入全面分析阶段。随着染色流程的自动化，该技术的操作复杂性已显著降低。多光谱显微镜的改进，包括新增两个滤光片，极大地提升了光谱分离效果和扫描速度。目前可实现最多同时检测八种不同标志物加DAPI。然而，当标志物数量进一步增加时，前述优势将逐渐消失，因为光谱分离变得更加困难，全片扫描时间也显著延长。目前正积极开展工作，以在不同机构之间实现多重IHC技术的标准化，从而更便于其在诊断环境中的推广应用。对于多重IHC的标准化，我们建议使用者采用更为可行的六种标志物加DAPI的实验方案。尽管如此，该技术仍需要相当程度的技术经验，且后续分析可能具有挑战性，为此我们已在本方案中详细描述了相应的分析方法。
标准化始于多重免疫组化（IHC）面板的开发。先前已有研究强调了选择针对特定蛋白靶点的一抗在其中的重要性17。我们的多重IHC面板主要采用那些已在本机构诊断部门用于IHC并经过验证的一抗克隆。然而，在树突状细胞多重IHC面板中，大多数抗体此前并未在诊断环境中使用（van der Hoorn 等，论文待发表）。为确保特异性并尽量减少批次间的差异，我们优先选用单克隆抗体而非多克隆抗体，并且大多数抗体均通过转染细胞系和原代细胞进行了验证。多年来，不同版本的多重IHC面板已在多项研究中使用Vectra 3系统进行应用18,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32。为了在PhenoImager HT系统上最优地实施这些多重IHC面板，需对一抗与荧光染料的组合进行一些调整。为了更好地实现光谱分离并加快整张组织切片的扫描速度，在七色多重IHC面板中应采用最新的Opal480和Opal780荧光染料，并避免使用Opal540和Opal650荧光染料。扫描速度根据组织切片大小的不同，可提高约3至10倍。多重IHC面板的调整相对容易实现，但仍需注意若干事项。Opal480的荧光光谱与自发荧光光谱重叠较多，因此会干扰红细胞及其他自发荧光结构的光谱分离。在大多数情况下，通过提高与Opal480配对的一抗浓度可解决此问题。PhenoImager HT系统上专有的Sample AF滤光片有助于Opal480与自发荧光的分离。然而，最佳策略是选用与Opal480联用时能产生清晰信号的一抗，使其信号强度高于自发荧光。
尽管这些多重免疫组化检测面板已经建立，但仍需考虑批间差异的问题。在开展完整的多重免疫组化实验之前，通过进行单plex免疫组化对照实验，我们有时会发现一抗在不同实验之间的染色强度存在增强或减弱的情况。造成这一现象的原因可能包括移液误差、试剂储存条件不理想以及试剂保质期等因素。我们通过根据经验调整一抗溶液的浓度来解决这一问题。即使无需进行上述任何调整，在每次多重免疫组化批次实验中，仍需依据单plex免疫组化染色的对照切片来设定曝光时间。
由于我们的研究最初聚焦于不同类型的癌和黑色素瘤，因此需要多重免疫组化（IHC）检测面板在不同肿瘤类型之间可互换，且仅需极少调整。因此，在优化过程中我们始终纳入多种（肿瘤）组织类型，并观察到不同肿瘤类型之间免疫细胞标志物的一抗稀释比例可保持相近。然而，癌与黑色素瘤之间的肿瘤组织检测需要使用不同的肿瘤标志物。为此，肿瘤标志物总是在每个多重IHC检测面板的最后一步进行优化，目前始终与Opal780联用，而Opal780恰好也必须位于多重IHC染色流程的最后一个荧光染料位置。通过始终将肿瘤标志物置于多重IHC的最后一步，这些多重IHC检测面板可轻松适用于其他肿瘤类型，例如胶质母细胞瘤（即GFAP）和霍奇金淋巴瘤（即CD30）。对于血管肉瘤，我们使用该淋巴细胞多重IHC检测面板，并以红系白血病病毒相关基因（ERG）作为肿瘤标志物，仅进行了两次优化实验25。优化内容包括对ERG一抗进行滴定，以及测试将ERG置于末步的多重IHC检测面板效果。
通过将某种免疫细胞标志物替换为其他免疫或功能标志物，也可对这些多重免疫组化（IHC）检测面板进行其他调整。每次更改均需进行优化，优化方案可参照先前所述的方法17。对所提出的多重IHC面板进行某些修改可能会影响我们开发的ImmuNet算法。为将这些更改整合至算法中，必须生成足够的数据并投入相应时间（每种新标志物和/或细胞表型至少需要750个注释，验证先前训练过的标志物则需150个注释）。本文所展示的面板未包含功能标志物，尽管我实验室已常规将PD-1和PD-L1等免疫检查点标志物纳入多重IHC面板中。然而，对于在阴性和阳性信号之间区分度较低、非典型二元表达的标志物，其分析已被证实更具挑战性，目前仍是我课题组积极研究的方向。
与其它新兴技术相比，多重免疫组化（multiplex IHC）可同时检测的标志物数量有限。尽管可通过在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织块的连续切片上分析不同的抗体组合来弥补这一限制，但在空间上对这些切片进行比较仍存在困难。由于切片制备后组织的方向性和折叠伪影可能不一致，因此难以实现精确的空间对应。然而，多重免疫组化技术具有较高的可及性，使其成为更多机构和研究人员易于采用的工具，因而更适用于未来在诊断环境中的推广应用。随着针对多种肿瘤类型的多重免疫组化免疫细胞抗体组合及其下游分析流程的逐步标准化，研究人员有望更深入地了解不同患者之间以及不同肿瘤类型之间肿瘤微环境（TME）的差异。例如，这可能有助于阐明TME在特定治疗方案抗肿瘤反应中的作用。甚至可能由此发现可用于预测治疗反应和预期生存等指标的新生物标志物。总体而言，这有望推动多重免疫组化发展成为个性化医疗中辅助临床决策的临床工具。诚然，为了使其适用于日常诊断工作，分析流程中的更多步骤可能需要实现自动化和标准化，因此目前该技术的应用前景仍主要处于未来展望阶段。
尽管存在技术挑战，但在单个样本切片上分析多个标志物仍是一种非常强大的工具。通过标准化的实验方案和稳健的分析方法（如本文使用ImmuNet所描述的），多标志物的定量分析比传统免疫组化（IHC）更具信息量，同时与新型更高重数的实验方法相比，多重免疫组化仍具有相对较高的通量。

免疫细胞在抵御病毒和细菌等病原体以及癌细胞方面发挥着关键作用1。因此，肿瘤微环境（TME）中的免疫系统在发现预后和预测性生物标志物方面具有巨大潜力2。免疫细胞浸润已被证实与多种癌症类型的预后相关，但目前尚未应用于临床实践3,4。在大多数肿瘤类型中，高水平的细胞毒性T细胞和T辅助1细胞和/或低水平的调节性T细胞与较好的预后相关。目前正在进行努力，将所谓的&#34;免疫评分&#34;纳入结直肠癌的TNM分期系统，从而形成TNM-I分期5,6。免疫评分基于两个不同肿瘤区域中T细胞总数（通过CD3检测）和细胞毒性T细胞数量（通过CD8检测）：即肿瘤核心区域与肿瘤侵袭边缘（IM）。免疫评分也被提议在其他癌症类型中具有预后价值，例如黑色素瘤、肺癌和乳腺癌6,7,8,9。此外，免疫细胞浸润也可能与检查点阻断免疫治疗的疗效相关10。然而，这些预测性生物标志物必须在前瞻性研究中得到验证后，才能常规应用于临床实践。而且，已有研究提出单一生物标志物可能不足以实现有意义的预测11。因此，有人建议通过整合多种生物标志物，对患者样本进行全面描绘，构建所谓的&#34;癌症免疫图谱&#34;，作为更全面的预测性生物标志物12。
在研究肿瘤微环境（TME）中免疫细胞的方法中，历史最悠久且最为人熟知的技术是免疫组织化学（IHC），该技术常规用于多种疾病的诊断检测，尤其是癌症13。长期以来，该技术仅限于使用一种或少数几种标志物14，因此在科研领域逐渐被流式细胞术和基因表达谱分析（GEP）等其他技术所取代。然而，常规诊断和研究中常用的甲醛固定石蜡包埋（FFPE）肿瘤组织并不（理想）适用于流式细胞术和GEP。此外，尽管GEP和流式细胞术能够深入揭示细胞表型与功能，但缺乏空间定位信息是一个主要缺点。因此，样本内部的异质性，例如肿瘤组织中免疫细胞浸润区与非浸润区之间的差异，可能无法被检测到15。近年来已开发出多种可用于FFPE组织多重分析的新平台，例如多重IHC、成像质谱流式细胞术以及通过索引进行共检测（CO-Detection by indEXing, CODEX），这些技术能够在组织切片中同时检测多种标志物16。目前，科研人员正广泛研究TME中的免疫细胞，以寻找最适合免疫治疗的生物标志物。然而，多重检测技术与自动化图像分析本身也面临诸多挑战。
本实验室在使用Opal/酪胺信号放大（TSA）方法进行多重免疫组化（IHC）染色方面具有丰富经验，并已在&#160;IHC平台（参见材料表）上实现自动化17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31。我们已优化了用于检测淋巴细胞、髓系细胞和树突状细胞（DCs）不同亚群的免疫细胞抗体组合。含有密集免疫细胞区域的组织——尤其是淋巴细胞或具有复杂细胞形态（如髓系细胞和DCs）的组织——在分析上尤为困难，容易导致对免疫细胞数量的高估或低估。为解决这一问题，我们团队开发了ImmuNet分析软件32，该机器学习分析流程极大地提升了对这些不同类型免疫细胞的识别质量。本文详细描述了从获取FFPE组织样本到分析不同组织区室中免疫细胞密度以及免疫细胞类型间距离的完整实验方案。
本方案概述了自2022年数字病理成像仪投入使用以来，拉德堡德大学医学中心开展多重免疫组化（IHC）检测面板的具体操作流程。所述的多重IHC检测面板可用于多种癌瘤（如肺、前列腺、结直肠、膀胱、乳腺癌）的研究，使用广谱细胞角蛋白抗体作为肿瘤标志物；也可用于黑色素瘤研究，使用黑色素细胞相关抗体作为肿瘤标志物。这些多重IHC方案在初级抗体浓度、荧光染料组合以及染色步骤顺序方面均经过精心优化。我们及其他研究者此前已报道过多重IHC检测面板的优化方法17,33,34,35。多重IHC检测面板可进行调整，但所描述的分析流程需相应地进行评估，必要时进行调整或重新训练。所述的七色多重IHC方案使用Opal荧光染料Opal480、Opal520、Opal570、Opal620、Opal690、Opal780以及4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），从而可在成像仪上利用&#34;Multispectral One Touch ImmunoFluorescence&#34;（MOTiF）实现简便的光谱分离和快速扫描。本方案未描述九色染色与扫描，因其需要对实验设置进行更精细的优化，并在成像仪上采用基于液晶可调滤光片的另一种扫描模式。

<table><tbody><tr><td>抗 CD14</td><td>Cell Marque&amp;nbsp;</td><td>114R-16</td><td>第3区，克隆EPR3653</td></tr><tr><td>抗CD163</td><td>Cell Marque&amp;nbsp;</td><td>163M-15</td><td>第3节，克隆MRQ-26</td></tr><tr><td>抗CD19</td><td>Abcam</td><td>ab134114</td><td>第3部分，克隆 EPR5906</td></tr><tr><td>抗 CD1c（BDCA1）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>TA505411</td><td>第3部分，克隆OTI2F4</td></tr><tr><td>抗CD20</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>MS-340-S</td><td>第3部分，克隆L26</td></tr><tr><td>抗CD3</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>RM-9107</td><td>第3节，克隆sp7</td></tr><tr><td>抗-CD303/BDCA2</td><td>树突状细胞（Dendritics），通过 Enzo Lifesciences/Axxora 提供</td><td>DDX0043</td><td>第3区，克隆124B3.13</td></tr><tr><td>抗CD56</td><td>Cell Marque&amp;nbsp;</td><td>156R-94</td><td>第3部分，克隆MRQ-42</td></tr><tr><td>抗CD66b</td><td>BD 生物科学</td><td>555723</td><td>第3部分，克隆G10F5</td></tr><tr><td>抗 CD68</td><td>Dako Agilent</td><td>M087601</td><td>第3部分，克隆PG-M1</td></tr><tr><td>抗CD8</td><td>Dako Agilent</td><td>M7103</td><td>第3区，克隆C8/144B</td></tr><tr><td>抗 Foxp3</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14-4777</td><td>第3区，克隆236A/E7</td></tr><tr><td>抗Gp100</td><td>Dako Agilent</td><td>M063401</td><td>第3部分，克隆HMB45</td></tr><tr><td>抗 HLA-DR、DP、DQ</td><td>圣克鲁斯</td><td>sc-53302</td><td>第3部分，克隆CR3/43</td></tr><tr><td>抗MART-1</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>MS-799</td><td>第3部分，克隆A103</td></tr><tr><td>抗广谱细胞角蛋白</td><td>Abcam</td><td>ab86734</td><td>第3部分，克隆AE1/AE3 + 5D3</td></tr><tr><td>抗SOX10</td><td>Sigma Aldrich</td><td>383R</td><td>第3节，克隆EP268</td></tr><tr><td>抗酪氨酸酶</td><td>Sanbio</td><td>MONX10591</td><td>第3节，克隆T311</td></tr><tr><td>抗XCR1</td><td>通过Biok实现的细胞信号传导技术&amp;eacute;</td><td>44665S</td><td>第3节，克隆D2F8T</td></tr><tr><td>抗体稀释液</td><td>Akoya BioSciences</td><td>SKU&amp;nbsp;ARD1001EA</td><td>第3部分，来自Opal 7色自动化IHC试剂盒50片装（可选择性地替换为含10% BSA的TBST）</td></tr><tr><td>键合抽吸探针</td><td>Leica Biosciences</td><td>S21.0605</td><td>第3节</td></tr><tr><td>键合吸液探针清洁</td><td>Leica Biosciences</td><td>CS9100</td><td>第3节</td></tr><tr><td>Bond 脱蜡液</td><td>徕卡生物科学</td><td>AR9222</td><td>第3节</td></tr><tr><td>Bond 载玻片标签 + 打印防尘</td><td>Leica Biosciences</td><td>S21.4564.A</td><td>第3节</td></tr><tr><td>Bond 研究检测系统 2</td><td>Leica Biosciences</td><td>DS9777</td><td>第3节</td></tr><tr><td>Bond RX全自动染色机&amp;nbsp;</td><td>Leica Biosciences</td><td>-</td><td>第3节，自动化平台</td></tr><tr><td>Bond TM 抗原修复液 1 - 1 L</td><td>Leica Biosciences</td><td>AR9961</td><td>第3节</td></tr><tr><td>Bond TM Epitope Retrieval 2 - 1 L</td><td>Leica Biosciences</td><td>AR9640</td><td>第3节</td></tr><tr><td>Bond TM 洗涤液 10x - 1 L</td><td>Leica Biosciences</td><td>AR9590</td><td>第3节</td></tr><tr><td>BOND Universal Covertile</td><td>Leica Biosciences</td><td>S21.4611</td><td>第3节</td></tr><tr><td>Bond(TM) 滴定试剂盒</td><td>Leica Biosciences</td><td>OPT9049</td><td>第3节</td></tr><tr><td>盖玻片 24 x 32 mm #1（0.13–0.16 mm）</td><td>Fisher Scientific</td><td>15717592</td><td>第2节</td></tr><tr><td>盖玻片 24 x 50 mm</td><td>VWR</td><td>631-0146</td><td>第2节</td></tr><tr><td>DAPI Fluoromount-G</td><td>VWR</td><td>0100-20</td><td>第3部分，当需要快速检查单重染色切片（非正式分析）时，应单独进行DAPI染色以获得更佳结果</td></tr><tr><td>伊红</td><td></td><td></td><td>第2节，自制</td></tr><tr><td>乙醇 99.5%</td><td>VWR</td><td>4099.9005</td><td>第2节</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>VWR</td><td>0100-01</td><td>第3节&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>苏木精</td><td></td><td>-</td><td>第2节，自制</td></tr><tr><td>ImmuNet</td><td></td><td>-</td><td>免疫细胞检测与表型分析流程</td></tr><tr><td>inForm 软件 2.4.10</td><td>Akoya BioSciences</td><td>-</td><td>第4节 &amp;和 6</td></tr><tr><td>OPAL 480 试剂盒</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1500001KT</td><td>第3节</td></tr><tr><td>OPAL 520 试剂盒</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1487001KT</td><td>第3节</td></tr><tr><td>OPAL 570 试剂盒</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1488001KT</td><td>第3节</td></tr><tr><td>OPAL 620 试剂盒</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1495001KT</td><td>第3节</td></tr><tr><td>OPAL 690 试剂盒</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1497001KT</td><td>第3节</td></tr><tr><td>OPAL 780 试剂盒</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1501001KT</td><td>第3节</td></tr><tr><td>Opal 7色自动化免疫组化试剂盒，50张载玻片</td><td>Akoya BioSciences</td><td>NEL821001KT</td><td>第3节</td></tr><tr><td>PhenoChart 1.1.0</td><td>Akoya BioSciences</td><td>-</td><td>第5节</td></tr><tr><td>PhenoImagerHT</td><td>Akoya BioSciences</td><td>CLS143455</td><td>第4节，数字病理成像仪，配备载玻片观察器和成像软件（曾用名：Vectra Polaris）</td></tr><tr><td>Quick-D封片剂</td><td>Klinipath</td><td>7280</td><td>第2节</td></tr><tr><td>QuPath 0.3.2</td><td></td><td></td><td>全切片图像分析软件平台</td></tr><tr><td>R 4.1.1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>载玻片盒</td><td>VWR</td><td>631-0737</td><td>第1节</td></tr><tr><td>SuperFrost Plus</td><td>赛默飞世尔科技通过 VWR</td><td>631-9483</td><td>第1节</td></tr><tr><td>Vectra Polaris 软件 1.0.13</td><td>Akoya BioSciences</td><td>-</td><td>第4节</td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>VWR</td><td>4055-9005</td><td>第2节</td></tr></tbody></table>

肿瘤微环境中空间免疫细胞格局的多重免疫组织化学分析

Multiplex Immunohistochemical Analysis of the Spatial Immune Cell Landscape of the Tumor Microenvironment

肿瘤微环境中免疫细胞的分布特征可能包含发现预后和预测性生物标志物的重要信息。多重免疫组织化学是一种有价值的工具，可在保留空间信息的同时，对肿瘤组织中不同类型的免疫细胞进行可视化和鉴定。本文提供了详细的实验方案，用于分析组织切片中的淋巴细胞、髓系细胞和树突状细胞群体。方案涵盖从切割福尔马林固定石蜡包埋组织切片、在自动化平台上进行自动多重染色、使用多光谱成像显微镜扫描切片，到利用本课题组自主开发的机器学习算法ImmuNet进行图像分析的完整流程。通过更换肿瘤标志物，这些方案可适用于多种肿瘤样本，用于分析样本不同区域（肿瘤实质与侵袭边缘）的免疫细胞，并可进一步开展最近邻细胞分析。该分析方法不仅限于肿瘤样本，也可应用于其他（非）病理性组织。近年来设备和工作流程的改进显著缩短了整体处理时间，为该技术在未来临床诊断中的应用提供了便利。

本方案详细描述了如何利用多重免疫组织化学对肿瘤微环境中的免疫细胞进行表征。

肿瘤微环境中的免疫细胞图谱可能包含用于发现预后和预测性生物标志物的信息。

我们的目标是确定肿瘤微环境中免疫细胞的数量、类型和位置。在免疫组织化学领域，近年来技术取得了重大进展。多重免疫组织化学技术的进步使得能够可靠地研究更多的标志物。目前的实验挑战是可视化肿瘤样本中特定类型的免疫细胞，而这一挑战已通过使用多重免疫组织化学方法得以克服。然而，对这些图像进行准确的自动分析仍然是我们正在努力解决的挑战。原发性肿瘤与转移性肿瘤之间免疫细胞图谱的差异引发了一系列问题：哪些肿瘤内在特性驱动了这些差异？这些差异对于靶向免疫系统的治疗意味着什么？除了探索性研究外，我们还将关注具有临床意义的问题，例如：不同类型的抗癌治疗如何影响肿瘤的免疫细胞图谱，以及免疫细胞图谱是否能够预测治疗的结局。对FFPE组织进行免疫组化染色后，使用数字病理成像仪对切片进行成像。启动软件以对标注的图像进行光谱解混。选择文件。然后单击“打开图像”，选择 QuP TIFF 文件以将图像上传到软件中。允许标记为已知情项目的印章上传至项目中。加载为自发荧光补偿准备的 QuP TIFF 文件。选择图像工具中的自发荧光选项，在未染色切片的图像上绘制一条线，穿过红细胞和胶原等自发荧光结构，以校正自发荧光。然后，进入“编辑标记物和颜色”部分。分配与 Opal 荧光染料相匹配的标记物名称，并将颜色设置调整为您偏好的选项。选择界面左下角的“Prepare all”以启动荧光染料的解混。检查所有图像，确认所有信号的可见性以及解混过程是否成功完成。逐个点击眼睛图标以逐一关闭和打开所有标记，检查图像质量。现在导航到导出选项卡，通过点击导出目录下方的“浏览”按钮，创建一个新的空导出目录。在要导出的图像选项卡下，选择“复合图像和组件图像”的多图像TIFF格式。然后垂直位于左侧的“批量分析”选项卡，对幻灯片进行批量处理，并在导出选项中选择“为每个项目创建单独的目录”。要添加用于分析的切片，请在“添加切片”按钮下选择 QuP TIFF 文件，并将其加载到批量分析中。选择“运行”以开始切片的批量处理。创建一个新文件夹，仅包含光谱解混的组件文件，并确保层级文件夹结构保持完整。启动完整的 SlideViewer 软件。单击左侧的“创建项目”，创建或选择一个具有适当名称的新空文件夹。然后单击“自动化”并选择“显示脚本编辑器”。复制并粘贴现有脚本，修改其路径以指向包含所有切片组件文件的文件夹。选择运行以开始批量拼接切片的过程，然后等待其完成。现在，将新生成的 OME-TIFF 文件移入 QuPath 项目中，并将其保存为一个新项目。当新窗口出现时，选择将图像类型设置为荧光，然后点击导入按钮。在左侧菜单中导航，从列表中选择一个样本，双击以打开所选样本。通过点击对比度图标调整各通道的强度，以增强可见性。选择所有通道并选择重置。确保关闭自发荧光。要为肿瘤绘制感兴趣区域（ROI），请再次点击对比度图标，然后选择显示灰度图像。然后，选择肿瘤标志物通道并调节强度以获得最佳可见度。点击画笔工具，在肿瘤周围绘制一个感兴趣区域（ROI）。点击魔棒工具，在按住 alt 键的同时调整 ROI，从外部平滑感兴趣区域。完成后，将肿瘤的各个分离部分合并到同一个 ROI 中。右键单击左侧列表中的 ROI 注释，选择“设置属性”，并提供一个合适的名称，例如 Tumor。通过依次选择“对象”、“注释”，然后选择“扩展注释”，从肿瘤区域向外扩展 ROI 以获得侵袭边缘。选择所需的扩展半径大小。勾选“移除内部”选项，并约束至父级。单击对比度图标。选择自发荧光通道并调整强度以获得最佳可见度。点击魔棒工具，同时按住 alt 键从外部平滑调整感兴趣区域（ROI），并去除不应包含在该 ROI 中的背景。右键单击左侧列表中的标注，然后选择“设置属性”，为该 ROI 分配一个合适的名称，例如：浸润边缘，或简写为 IM。如有需要，可更改其颜色。要导出注释，请进入文件选项。点击对象数据，选择“以 GO JSON 格式导出”，然后选择导出所有对象。继续使用导出为要素集合的默认选择，并将其保存到首选位置。

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