从人脱落乳牙中分选免疫表型鉴定的间充质干细胞的单细胞分离技术

本方案详细介绍了一种在单一平台上准确表征和纯化人源间充质干细胞的关键方法，可实现干细胞移植等高效的下游应用。该方法对于临床实验室尤为重要，有助于通过精确的单细胞分选技术提升对基因工程化或天然干细胞的分子与细胞遗传学检测能力。目前常用的分离纯化干细胞群体的方法包括免疫磁珠分离、密度梯度离心以及微流控细胞分选等技术。

索引分选技术可与单细胞RNA测序相结合，从而获取每个分选细胞的转录组信息。关键挑战包括维持样品质量，优化细胞培养条件，以及在分选过程中和分选后确保细胞密度和细胞活性。此外，还需考虑为仪器选择合适的喷嘴尺寸，并确保能够及时使用分选设备。

本方案展示了一种精确的染色方案，用于免疫表型分析及分选目标细胞群体。该方法可确保样本质量标准化、细胞活力和密度达到细胞分选的最佳状态，并在FACSDiva软件中设定分选实验参数。此方法能够简便地实现对表达特定生物标志物的干细胞群体进行筛选和免疫表型分析。

这种简单的平台可根据目标细胞群实现高效分选，有助于获得纯化的样本用于后续下游应用。首先，将间充质干细胞接种至T75培养瓶、100 mm培养皿以及两个48孔板中，用于所有实验。向48孔板的各孔中加入200 µL 10% MSC培养基。

当细胞单层达到90%融合度时，将指定对照孔中的原有培养基更换为含2%血清的培养基。向标记为测试的最后两孔中加入脂肪生成或成骨生成谱系的分化培养基。同一天，用胰酶消化一个融合的100 mm培养皿，并将细胞悬液转移至两个已标记的15毫升离心管中。

将离心管在300 ×g下离心6分钟。然后，用移液器向对照管和试验管中各加入2 mL相应的培养基。将管盖松开的离心管置于37°C、5%二氧化碳的培养箱中培养21天，每3天更换一次培养基。

通过标准免疫荧光检测对SHEDs进行表征，结果显示波形蛋白、肌动蛋白丝表达阳性，以及DAPI染色的细胞核。短期细胞增殖实验显示，从第2天到第8天细胞增殖速率增加。集落形成单位实验和结晶紫染色证实，SHEDs在培养14天后具有集落形成能力。

为了染色2D脂肪细胞系，向培养板中加入200微升试剂盒中的通透化溶液。接着，将细胞在200微升油红O工作液中孵育10分钟。随后，去除染液后用200微升蒸馏水洗涤细胞五次。

对二维成骨细胞系进行染色时，向每个孔中加入200微升5%的新鲜硝酸银溶液。然后将培养板置于紫外光下照射一小时。用200微升2.5%的硫代硫酸钠溶液孵育细胞五分钟，随后用蒸馏水冲洗。

对于三维培养物，首先获取团块培养物的冷冻切片。为了染色软骨细胞系的细胞，向空气干燥的切片中加入一到两毫升洗涤液。接着，将切片置于固定液中孵育30分钟。

用蒸馏水洗涤后，将细胞置于1-2毫升染色液中染色30分钟。用0.1 N盐酸冲洗细胞3次，再用蒸馏水冲洗。21天后，体外培养条件下的MSCs分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞谱系。

首先，将消化后的间充质干细胞在 300 G 条件下离心 6 分钟，以获得细胞沉淀。接着，用 1 毫升间充质干细胞培养基重悬细胞沉淀，然后进行细胞计数。再次离心细胞悬液。

弃去上清液后，将沉淀重悬于适量体积的染色缓冲液中。为制备补偿对照，标记7个流式管分别为未染色、DAPI、V450、FIT、PE、PerCP Cy5.5和APC。接着，制备用于补偿的单染对照管，并在避光条件下孵育30分钟。

孵育结束后，用一毫升染色缓冲液将每根试管中的细胞洗涤两次，磁珠洗涤一次。接着，将涡旋混匀后的试管在室温下以200 G离心10分钟。弃去上清液后，将沉淀重悬于500微升染色缓冲液中。

将DAPI管置于60摄氏度水浴中孵育5分钟，随后在冰上孵育15分钟，以诱导染料的摄入。向悬浮液中加入5 µL DAPI，并孵育至检测前。根据表格所示，在5个标记好的FACS管中分别制备细胞和抗体悬浮液。

孵育前轻轻涡旋混匀各管。随后，每管用1毫升染色缓冲液洗涤两次。将涡旋后的管在室温下以200 ×g离心10分钟。

然后，将剩余的沉淀重悬于500微升染色缓冲液中。首先，标记两个新的流式管分别为混合管一和混合管二。根据下表所示配制细胞和抗体悬液，用于流式细胞术分析。

将试管孵育30分钟后，用1毫升染色缓冲液洗涤每支试管两次。将涡旋混匀的试管在室温下以200 G离心10分钟。然后，将沉淀重悬于500微升染色缓冲液中。

用 200 至 500 微升胎牛血清（FBS）包被 48 孔板的孔，孵育一小时。随后吸除残留的 FBS，每孔加入 200 至 500 微升含 10% MSC 的培养基。为准备单细胞分选样品，向两个新的 FACS 管中各加入一毫升 FBS。

轻轻滚动离心管，使FBS均匀覆盖管内壁表面。根据分选实验表格，在混合管一和混合管二中分别制备细胞和抗体悬液。然后在室温下避光孵育30分钟。

用染色缓冲液洗涤后，在室温下以 200 G 离心 10 分钟。然后将沉淀重悬于 500 µL 染色缓冲液中，并在分选前加入 5 µL DAPI 孵育 15 分钟。为设置补偿矩阵，请使用单染补偿管。

在仪器软件的工具栏中点击实验，然后点击补偿设置，接着创建补偿对照。接下来点击未染色样本管，再在流式细胞仪对话框中选择参数。

通过编辑每个参数的数值来调整电压。在采集仪表板中点击“load”，然后点击“acquire”。将P1门拖动至细胞群，并将其应用于所有补偿对照，以设置每个参数的电压和阴性门。

现在，分别加载单染补偿管。记录数据并保存。选择当前实验，右键单击，然后依次选择“计算补偿值”、“链接并保存”。

运行混合管并记录10,000个细胞。根据适当的设门策略，对目标分选细胞群设置门控。接下来，将收集板装入仪器，并设定每孔目标细胞数，范围为2,500至5,000个细胞。

然后，选择单细胞分选纯度掩模。将分选后的细胞群体收集到收集装置中，并在分选实验期间保持其处于冰上。最后，将培养板转移至含5%二氧化碳的培养箱中，以维持细胞在37摄氏度的培养环境。

多参数流式细胞术检测结果图显示，CD90 FITC抗体的FITC同型对照未见表达。CD90和CD73标志物呈阳性表达，CD45呈阴性表达，与未染色对照及FMO对照结果相当。免疫表型分析展示了早期传代细胞中ISCT推荐的标志物及CD44的标志物分布情况，据此确定亲本细胞群体为间充质干细胞（MSCs）。

使用晚期传代的SHEDs进行高表达和低表达单细胞分选。分选后收集于48孔板中的细胞表现出与其亲代细胞相似的贴壁和增殖能力。在脂肪生成诱导因子存在条件下，分选后的细胞可发生分化。