Name: 人脱落乳牙免疫表型间充质干细胞的单细胞分选 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 44 s
Description: 学习使用荧光激活细胞分选技术对人脱落乳牙间充质干细胞进行单细胞分选与免疫表型分析，实现99%高纯度分离，为干细胞移植和再生医学研究提供精准可靠的实验方法。

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我们感谢印度班加罗尔贾瓦哈拉尔·尼赫鲁高级科学研究中心流式细胞仪中心设施提供的流式细胞术核心设施支持。分化细胞团块培养物的冷冻切片工作在印度班加罗尔Neuberg Anand参考实验室完成。本研究得到了印度马尼帕尔高等教育学院（MAHE）为UC提供的院内经费支持。AG感谢MAHE提供的T. M. A. Pai博士奖学金的支持。

Fluorescence-Activated Single-Cell Sorting of Human Mesenchymal Stem Cells

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</ol>

作者声明，本文发表不存在利益冲突。

在组织工程与再生医学领域，与其他出生后来源相比，口腔组织来源的间充质干细胞（MSCs）因其伦理负担较小且具有显著的多向分化潜能而受到广泛关注21。在牙源性间充质干细胞中，来自阻生第三磨牙的牙髓干细胞（DPSCs）以及脱落乳牙牙髓干细胞（SHEDs）因其在神经退行性疾病和创伤性疾病治疗中的潜力而受到最多关注22。本文所述的实验方案有助于通过多参数方法对SHEDs进行表征，并进一步利用单细胞分选技术分离特定细胞亚群。然而，该方案的应用不仅限于口腔来源的间充质干细胞，也可用于对人体其他组织来源的间充质干细胞进行免疫表型分析与细胞分选23。
在针对所研究的生物学问题成功实施本实验方案时，有几个关键步骤需要在此讨论。每个分选方案的关键在于检查两个重要组成部分：生物学对照和实验对照。首先，保持无菌的培养环境可确保在分选过程中所用样本不受污染。在分选前，单细胞悬液中的细胞活力应保证起始时有超过70%的活细胞群体，随后对健康的亚群进行分析和分选。单细胞悬液...

间充质干细胞（MSCs）可被视为适用于细胞治疗的可扩展细胞来源，或可被认为是再生医学中的金标准体系。这些细胞可从体内多种不同组织来源中分离获得。1根据来源组织的不同，每种MSC均表现出一定的模糊性 体外 行为2这一点在它们的形态学和功能特性中表现得十分明显3多项研究表明，间充质干细胞（MSCs）在尺寸方面存在克隆内变异，包括成体组织分化能力、基因组状态以及代谢和细胞结构。2,4.
细胞的免疫表型分析一直是流式细胞术的常见应用，用于鉴定干细胞，而这是&#160;国际社会所采用&#160;细胞与基因治疗国际学会（ISCT）于2006年制定了一套最低标准，用于鉴定细胞是否为间充质干细胞（MSCs）。该标准指出，细胞需具备贴壁生长特性，并具有向三个谱系（成骨、成软骨和成脂肪）分化的潜能。 体外通过流式细胞术检测，≥95%的细胞群体必须表达CD105、CD73和CD90，且这些细胞必须不表达（≤2%阳性）CD34、CD45、CD11b、CD14和HLA-DR。5尽管间充质基质细胞（MSCs）可通过国际细胞治疗学会（ISCT）最低标准中定义的一组生物标志物进行鉴定，但这些生物标志物无法用于评估其免疫特性，因此需要在上述标准之外建立更多指标，以更便于开展跨研究比较并量化克隆间的差异2.
尽管ISCT制定了相关指南，但大量关于间充质干细胞（MSCs）的研究表明，这类细胞群体中存在异质性，这种异质性可能由多种因素引起，主要源于MSC供体之间6、组织来源之间7、克隆群体内单个细胞之间8以及培养条件之间的普遍差异2,9,10。从多种组织来源中对这些原代细胞进行鉴定和纯化，以确保其质量和细胞命运，是其生产过程中的关键步骤。为了理解该群体中表现出的变异，需要一种有效的方法将细胞群体分解为可分别分离和收集的亚群11。单细胞水平的分析有助于克服细胞间变异带来的挑战，降低来自异质性群体的生物学噪声，并能够研究和鉴定稀有细胞12。
根据实验目的和选定的参数，可采用多种方法对目标细胞群体进行分选和富集。细胞分选技术包括群体分选和单细胞分选方法。群体分选可通过磁珠激活细胞分选（MACS）富集目标细胞群体13，组分分离14和洗脱15单细胞分选可通过荧光激活细胞分选技术（FACS）富集更均一的细胞群体11. 比较分析&#160;这些方法各自的优缺点在下文中被重点阐述 表1.
表1：不同技术的比较分析：&#160;MACS、组分分离、离心淘析和FACS，重点说明各技术原理的差异以及选择某一技术相较于其他技术的优缺点。缩写：MACS = 磁珠激活细胞分选；FACS = 荧光激活细胞分选。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65723/65723_Table_1_.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
自该技术问世以来，单细胞流式细胞术在异质性样本中特定细胞群体的计数16、检测和表征方面发挥了重要作用17。Hewitt 等人于2006年建立了自动细胞分选方法的基础，以增强分化后人胚胎干细胞（hESCs）同质群体的分离效率18。单细胞分选富集了GFP转导的hESCs群体，促进了基因修饰克隆的分离，为临床研究开辟了新的方向。为了提高分选效率，通常采用两种策略：一是调整分选后细胞收集所用的培养基，以维持分选后细胞的存活率和增殖能力19；二是对细胞分选算法或软件进行适当优化12。
随着技术的进步，商用流式细胞仪和细胞分选仪已能够帮助解决在无菌分选脆弱且稀有的细胞群体（尤其是不同来源的干细胞）过程中所遇到的挑战。&#160;干细胞生物学家面临的主要挑战之一是在基因编辑研究所需的转染操作后，实现人多能干细胞的单克隆分离19。该问题通过将单个细胞分选至涂有小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）并添加补充物及商用小分子ROCK抑制剂的96孔板中得以解决。然而，借助索引分选（index sorting）技术可大幅优化细胞分离策略，该技术是分选算法的一种功能，可识别被分选单个细胞的免疫表型12。这种改进的单细胞分选模式不仅提高了干细胞分选效率（特别是针对稀有的造血干细胞群体），还能高效地将单细胞克隆与其后续功能分析实验相关联20。
本文重点介绍免疫表型分选的单细胞分选技术&#160;人类干细胞&#160;脱落乳牙（SHEDs）用于富集亚群，以研究其功能分化能力。通过联合使用两种间充质干细胞阳性标志物CD90和CD73，以及阴性造血标志物CD45，对间充质干细胞进行免疫表型分析，并鉴定出弱表达和无表达的细胞。根据其免疫表型特征，将亚群分为纯间充质干细胞、单阳性及双阴性群体。采用单细胞分选模式对这些亚群进行分选，以获得纯化且富集的细胞亚群，用于后续功能研究，以确定标志物表达差异是否为技术假象 体外 培养条件是否会影响其功能特性。那些并非均一表达的细胞 &#34;阳性MSC标志物&#34; 用于研究其功能特性。

<table><tbody><tr><td>阿尔新蓝染色液</td><td>HiMedia</td><td>CCK029-1KT</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌剂（100倍浓缩液）&amp;nbsp;</td><td>Gibco by ThermoFisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig，&amp;kappa;/阴性对照（BSA）补偿微球（7.5 &amp;micro;m）套装</td><td>BD Biosciences</td><td>560497</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Accudrop 微球&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>345249</td><td>用于在分选模块开启时设置激光延迟</td></tr><tr><td>BD FACS Aria Fusion 流式细胞仪</td><td>BD Biosciences</td><td>---</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Diva 9.4</td><td>BD Biosciences</td><td>---</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS 包被液</td><td>BD Biosciences</td><td>342003</td><td>在 BD FACSAria Fusion 上进行分析和分选实验时均用作包被液</td></tr><tr><td>BD FACSDiva CS&amp;T 研究用微球</td><td>BD Biosciences</td><td>655050</td><td>根据喷嘴尺寸用于仪器配置</td></tr><tr><td>BD Horizon V450 小鼠抗人 CD44 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>561292</td><td></td></tr><tr><td>BD Horizon V450 小鼠 IgG2b，&amp;kappa; 同型对照</td><td>BD Biosciences</td><td>560374</td><td>CD44-V450 同型对照</td></tr><tr><td>BD Pharmingen APC 小鼠抗人 CD105 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>562408</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen APC 小鼠 IgG1，&amp;kappa; 同型对照</td><td>BD Biosciences</td><td>555751</td><td>CD105-APC 同型对照</td></tr><tr><td>BD Pharmingen DAPI 溶液</td><td>BD Biosciences</td><td>564907</td><td>DAPI 储存液，浓度为 1 mg/mL</td></tr><tr><td>BD Pharmingen FITC 小鼠抗人 CD90 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>555595</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen FITC 小鼠 IgG1，&amp;kappa; 同型对照</td><td>BD Biosciences</td><td>555748</td><td>CD90-FITC 同型对照</td></tr><tr><td>BD Pharmingen PE 小鼠抗人 CD45 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>555483</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen PE 小鼠 IgG1，&amp;kappa; 同型对照</td><td>BD Biosciences</td><td>555749</td><td>CD45-PE 同型对照</td></tr><tr><td>BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 小鼠抗人 CD73 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>561260</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 小鼠 IgG1，&amp;kappa; 同型对照</td><td>BD Biosciences</td><td>550795</td><td>CD73-PerCP-Cy 5.5 同型对照</td></tr><tr><td>BD Pharmingen 纯化小鼠抗波形蛋白抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>550513</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Hi-Media&amp;nbsp;</td><td>TC548-5G</td><td></td></tr><tr><td>结晶紫</td><td>Nice chemical pvt ltd&amp;nbsp;</td><td>C33809</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma-aldrich&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>D5652-50L</td><td>用于细胞培养和日常维护的 dPBS&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>乙醇&amp;nbsp;</td><td>---</td><td>---</td><td>用于常规消毒</td></tr><tr><td>胎牛血清&amp;nbsp;</td><td>Gibco by ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 555 标记</td><td>ThermoFisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>A-21422</td><td></td></tr><tr><td>KO-DMEM</td><td>Gibco by ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>10829018</td><td>未分化人胚胎干细胞的基础培养基，用于配制培养液</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 200 mM（100倍浓缩液）</td><td>Gibco by ThermoFisher</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学用甲醇&amp;nbsp;</td><td>Hi-Media&amp;nbsp;</td><td>MB113</td><td></td></tr><tr><td>油红 O</td><td>HiMedia&amp;nbsp;</td><td>CCK013-1KT</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛&amp;nbsp;</td><td>loba chemie</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（100倍浓缩液）</td><td>Gibco by ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>15140- 122</td><td></td></tr><tr><td>鬼笔环肽（ActinGreen 488 ReadyProbes 试剂）</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>R37110</td><td></td></tr><tr><td>硝酸银</td><td>HiMedia&amp;nbsp;</td><td>MB156-25G</td><td></td></tr><tr><td>五水硫代硫酸钠</td><td>Chemport</td><td>10102-17-7</td><td></td></tr><tr><td>Sphero 彩虹荧光微球，3.0 - 3.4 &amp;micro;m</td><td>BD Biosciences</td><td>556291</td><td></td></tr><tr><td>染色缓冲液&amp;nbsp;</td><td>在 MIRM 配制&amp;nbsp;</td><td>----</td><td>使用含 2% FBS 的 PBS 配制&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>StemPro 脂肪生成分化基础培养基&amp;nbsp;</td><td>Gibco by ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>A10410-01</td><td>脂肪生成培养基的基础培养基</td></tr><tr><td>StemPro 脂肪生成补充剂</td><td>Gibco by ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>A10065-01</td><td>脂肪生成培养基的诱导液</td></tr><tr><td>StemPro 软骨生成补充剂</td><td>Gibco by ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>A10064-01</td><td>软骨生成培养基的诱导液</td></tr><tr><td>StemPro 成骨生成补充剂</td><td>Gibco by ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>A10066-01</td><td>成骨生成培养基的诱导液</td></tr><tr><td>StemPro 成骨/软骨生成分化基础培养基&amp;nbsp;</td><td>Gibco by ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>A10069-01</td><td>成骨和软骨生成培养基的共同基础培养基</td></tr><tr><td>曲拉通 X-100</td><td>Hi-Media&amp;nbsp;</td><td>MB031</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝&amp;nbsp;</td><td>Gibco by life technologies&amp;nbsp;</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 溶液 1x</td><td>Hi-media&amp;nbsp;</td><td>TCL049</td><td></td></tr><tr><td>吐温-20&amp;nbsp;</td><td>MERCK&amp;nbsp;</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr></tbody></table>

从人脱落乳牙中分选免疫表型鉴定的间充质干细胞的单细胞分离技术

Single-Cell Sorting of Immunophenotyped Mesenchymal Stem Cells from Human Exfoliated Deciduous Teeth

生物体的间充质干细胞（MSCs）具有分化为体内多种成体细胞谱系的非凡能力，并以其免疫调节和抗炎特性而著称。这些干细胞的应用为再生生物学领域带来了福音，但与此同时，由于其伴随的多种细胞层面的不确定性，也给再生医学和治疗应用带来了挑战。这些不确定性可能源于干细胞来源的多样性以及其体外（in vitro）培养条件的差异，二者均导致了其功能上的异质性。
这需要采用相应的方法以获得纯化且均一的间充质干细胞群体&#160;用于治疗应用。流式细胞术领域的进展使得利用多参数方法检测单细胞群体成为可能。本方案概述了一种识别和纯化单细胞群体的方法&#160;干细胞来自&#160;通过荧光辅助单细胞分选技术分离人脱落乳牙牙髓干细胞（SHEDs）。通过同时检测表面标志物CD90-异硫氰酸荧光素（FITC）、CD73-多甲藻叶绿素蛋白复合物（PerCP-Cy5.5）、CD105-别藻蓝蛋白（APC）和CD44-V450的表达，鉴定出 &#34;明亮的，&#34; 间充质干细胞的阳性表达细胞&#160;使用多参数&#160;流式细胞术。然而，从第7代开始至后续各代，这些阳性标志物的四重表达细胞比例显著下降。
采用单细胞分选模式对免疫表型亚群进行分选，分选条件仅包括两种阳性标记物和一种阴性标记物。该方法可确保分选后细胞群体的存活率，并维持分选后的细胞增殖能力。此类分选的下游应用可用于评估门控亚群的谱系特异性分化。该策略可推广至其他单细胞体系，以优化分离条件并获取多种细胞表面标记物信息。

SHEDs 通过标准免疫荧光实验进行表征，结果显示波形蛋白（红色，III型中间丝）、肌动蛋白丝（Alexa Fluor 488 Phalloidin 探针标记）以及 DAPI 染色的细胞核图1A）。为了评估其增殖能力和集落形成能力，进行了标准的短期细胞生长实验。结果显示，从第2天到第8天增殖速率增加了14.3倍 图1B通过CFU-F实验测定SHEDs的克隆形成能力，结果如图所示。 图1C-E根据国际细胞治疗学会（ISCT）标准，多能间充质干细胞能够分化为三种中胚层来源的谱系。采用油红O进行细胞化学染色，以检测分化后的脂肪细胞中的脂滴。图1F）；采用von Kossa染色法对分化成骨细胞基质中钙盐沉积进行染色（图1G）；在分化后的软骨母细胞中，三维培养中的聚集蛋白聚糖经阿利新蓝...

本方案描述了采用单细胞分选方法对人源间充质干细胞进行荧光激活细胞分选的应用。具体而言，当单细胞分选与基于多参数流式细胞术的方法相结合时，可从异质性细胞群体中获得纯度达99%的免疫表型细胞。

生物体的间充质干细胞（MSCs）具有分化为体内多种成体细胞谱系的非凡能力，并且……

本方案详细介绍了一种在单一平台上准确表征和纯化人源间充质干细胞的关键方法，可实现干细胞移植等高效的下游应用。该方法对于临床实验室尤为重要，有助于通过精确的单细胞分选技术提升对基因工程化或天然干细胞的分子与细胞遗传学检测能力。目前常用的分离纯化干细胞群体的方法包括免疫磁珠分离、密度梯度离心以及微流控细胞分选等技术。索引分选技术可与单细胞RNA测序相结合，从而获取每个分选细胞的转录组信息。关键挑战包括维持样品质量，优化细胞培养条件，以及在分选过程中和分选后确保细胞密度和细胞活性。此外，还需考虑为仪器选择合适的喷嘴尺寸，并确保能够及时使用分选设备。本方案展示了一种精确的染色方案，用于免疫表型分析及分选目标细胞群体。该方法可确保样本质量标准化、细胞活力和密度达到细胞分选的最佳状态，并在FACSDiva软件中设定分选实验参数。此方法能够简便地实现对表达特定生物标志物的干细胞群体进行筛选和免疫表型分析。这种简单的平台可根据目标细胞群实现高效分选，有助于获得纯化的样本用于后续下游应用。首先，将间充质干细胞接种至T75培养瓶、100 mm培养皿以及两个48孔板中，用于所有实验。向48孔板的各孔中加入200 µL 10% MSC培养基。当细胞单层达到90%融合度时，将指定对照孔中的原有培养基更换为含2%血清的培养基。向标记为测试的最后两孔中加入脂肪生成或成骨生成谱系的分化培养基。同一天，用胰酶消化一个融合的100 mm培养皿，并将细胞悬液转移至两个已标记的15毫升离心管中。将离心管在300 ×g下离心6分钟。然后，用移液器向对照管和试验管中各加入2 mL相应的培养基。将管盖松开的离心管置于37°C、5%二氧化碳的培养箱中培养21天，每3天更换一次培养基。通过标准免疫荧光检测对SHEDs进行表征，结果显示波形蛋白、肌动蛋白丝表达阳性，以及DAPI染色的细胞核。短期细胞增殖实验显示，从第2天到第8天细胞增殖速率增加。集落形成单位实验和结晶紫染色证实，SHEDs在培养14天后具有集落形成能力。为了染色2D脂肪细胞系，向培养板中加入200微升试剂盒中的通透化溶液。接着，将细胞在200微升油红O工作液中孵育10分钟。随后，去除染液后用200微升蒸馏水洗涤细胞五次。对二维成骨细胞系进行染色时，向每个孔中加入200微升5%的新鲜硝酸银溶液。然后将培养板置于紫外光下照射一小时。用200微升2.5%的硫代硫酸钠溶液孵育细胞五分钟，随后用蒸馏水冲洗。对于三维培养物，首先获取团块培养物的冷冻切片。为了染色软骨细胞系的细胞，向空气干燥的切片中加入一到两毫升洗涤液。接着，将切片置于固定液中孵育30分钟。用蒸馏水洗涤后，将细胞置于1-2毫升染色液中染色30分钟。用0.1 N盐酸冲洗细胞3次，再用蒸馏水冲洗。21天后，体外培养条件下的MSCs分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞谱系。首先，将消化后的间充质干细胞在 300 G 条件下离心 6 分钟，以获得细胞沉淀。接着，用 1 毫升间充质干细胞培养基重悬细胞沉淀，然后进行细胞计数。再次离心细胞悬液。弃去上清液后，将沉淀重悬于适量体积的染色缓冲液中。为制备补偿对照，标记7个流式管分别为未染色、DAPI、V450、FIT、PE、PerCP Cy5.5和APC。接着，制备用于补偿的单染对照管，并在避光条件下孵育30分钟。孵育结束后，用一毫升染色缓冲液将每根试管中的细胞洗涤两次，磁珠洗涤一次。接着，将涡旋混匀后的试管在室温下以200 G离心10分钟。弃去上清液后，将沉淀重悬于500微升染色缓冲液中。将DAPI管置于60摄氏度水浴中孵育5分钟，随后在冰上孵育15分钟，以诱导染料的摄入。向悬浮液中加入5 µL DAPI，并孵育至检测前。根据表格所示，在5个标记好的FACS管中分别制备细胞和抗体悬浮液。孵育前轻轻涡旋混匀各管。随后，每管用1毫升染色缓冲液洗涤两次。将涡旋后的管在室温下以200 ×g离心10分钟。然后，将剩余的沉淀重悬于500微升染色缓冲液中。首先，标记两个新的流式管分别为混合管一和混合管二。根据下表所示配制细胞和抗体悬液，用于流式细胞术分析。将试管孵育30分钟后，用1毫升染色缓冲液洗涤每支试管两次。将涡旋混匀的试管在室温下以200 G离心10分钟。然后，将沉淀重悬于500微升染色缓冲液中。用 200 至 500 微升胎牛血清（FBS）包被 48 孔板的孔，孵育一小时。随后吸除残留的 FBS，每孔加入 200 至 500 微升含 10% MSC 的培养基。为准备单细胞分选样品，向两个新的 FACS 管中各加入一毫升 FBS。轻轻滚动离心管，使FBS均匀覆盖管内壁表面。根据分选实验表格，在混合管一和混合管二中分别制备细胞和抗体悬液。然后在室温下避光孵育30分钟。用染色缓冲液洗涤后，在室温下以 200 G 离心 10 分钟。然后将沉淀重悬于 500 µL 染色缓冲液中，并在分选前加入 5 µL DAPI 孵育 15 分钟。为设置补偿矩阵，请使用单染补偿管。在仪器软件的工具栏中点击实验，然后点击补偿设置，接着创建补偿对照。接下来点击未染色样本管，再在流式细胞仪对话框中选择参数。通过编辑每个参数的数值来调整电压。在采集仪表板中点击“load”，然后点击“acquire”。将P1门拖动至细胞群，并将其应用于所有补偿对照，以设置每个参数的电压和阴性门。现在，分别加载单染补偿管。记录数据并保存。选择当前实验，右键单击，然后依次选择“计算补偿值”、“链接并保存”。运行混合管并记录10,000个细胞。根据适当的设门策略，对目标分选细胞群设置门控。接下来，将收集板装入仪器，并设定每孔目标细胞数，范围为2,500至5,000个细胞。然后，选择单细胞分选纯度掩模。将分选后的细胞群体收集到收集装置中，并在分选实验期间保持其处于冰上。最后，将培养板转移至含5%二氧化碳的培养箱中，以维持细胞在37摄氏度的培养环境。多参数流式细胞术检测结果图显示，CD90 FITC抗体的FITC同型对照未见表达。CD90和CD73标志物呈阳性表达，CD45呈阴性表达，与未染色对照及FMO对照结果相当。免疫表型分析展示了早期传代细胞中ISCT推荐的标志物及CD44的标志物分布情况，据此确定亲本细胞群体为间充质干细胞（MSCs）。使用晚期传代的SHEDs进行高表达和低表达单细胞分选。分选后收集于48孔板中的细胞表现出与其亲代细胞相似的贴壁和增殖能力。在脂肪生成诱导因子存在条件下，分选后的细胞可发生分化。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

人脱落乳牙免疫表型间充质干细胞的单细胞分选

从大鼠股骨和胫骨中分离出MSCs，并通过磁性细胞分选进行富集。通过流式细胞术确认分选细胞表面标志物的表达。这些细胞还在克隆密度下培养以形成单个克隆，然后使用克隆环分离这些克隆。...

大鼠间充质干细胞（MSCs）的分离与富集及单克隆来源MSCs的分离

所述方法通过使用以下任一方式分离和表征人牙髓干细胞（hDPSCs） 牙髓组织的酶解离（DPSC-ED） 或 牙髓组织外植体中干细胞的直接迁出（DPSC-OG）。随后 体外...

利用两种不同方法分离、鉴定及比较源自恒牙的人牙髓干细胞的分化特性

本文介绍一种用于纯化已定向分化为定型内胚层的人胚胎干细胞的方法，旨在提升后续应用及进一步分化的效率。...

一种快速高效地纯化由人胚胎干细胞分化而来的内胚层细胞的方法

本方案描述了对从人牙囊中提取的牙源性干细胞进行瞬时基因工程改造的方法。所采用的非病毒性修饰策略可为改进治疗用干细胞产品提供基础。...

人牙囊干细胞的分离、鉴定及基于微小RNA的遗传修饰

在此，我们介绍一种用于表征巨核细胞分化的免疫表型分析策略，并展示该策略如何利用荧光激活细胞分选仪对处于不同发育阶段的巨核细胞进行分选。该方法可应用于人类原代组织，也可用于体外培养生成的巨核细胞 体外.

从人类原代来源或分化样本中对人巨核细胞进行免疫表型分析和细胞分选 体外 来自造血祖细胞

本方案介绍了一种快速、高效且温和的方法，适用于从持续生长的小鼠门齿、小鼠磨牙以及人类牙齿中分离单细胞，以进行单细胞RNA测序分析。...

从小鼠和人类牙齿中快速分离单个细胞

本方案重点介绍通过酶消化法从牙髓中分离、培养和保存多能干细胞的方法。此外，还展示了这些细胞向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化的潜能，强调了操作过程中精确性和一致性的关键作用。...

从人类乳牙和恒牙中分离、培养及鉴定牙髓干细胞

下颌骨骨髓来源的间充质干细胞在多种分化、自我更新及免疫调节方面具有重要功能。它们已成为基因治疗、组织工程和再生医学中前体细胞的关键来源。本文介绍一种从大鼠下颌骨骨髓中分离间充质干细胞的独特方法。...

大鼠下颌骨骨髓间充质干细胞的分离与培养技术

本方案描述了一种经济高效的方法，用于纯化、扩增和表征小鼠来源的高度均一的骨髓间充质干细胞（BMSCs）。该方法有助于获得大量具有高增殖和分化潜能的BMSCs，可支持小鼠模型研究并推动临床前研究的进展。...

小鼠骨髓间充质干细胞的分离、扩增及基于流式细胞术的表型分析

本方案描述了一种基于磁珠的分选方法，该方法使用藻红蛋白（PE）标记的流式细胞术抗体和抗PE微珠，以分离特定的间充质干细胞亚群。在测试条件下，该方法可获得高纯度的目标标志物阳性细胞，同时保持基于CCK-8的增殖/代谢活性，且无需昂贵的细胞分选仪或针对特定目标的定制磁珠。...

利用间接磁珠法分离和鉴定表达podoplanin的间充质干细胞亚群

学习使用荧光激活细胞分选技术对人脱落乳牙间充质干细胞进行单细胞分选与免疫表型分析，实现99%高纯度分离，为干细胞移植和再生医学研究提供精准可靠的实验方法。

从人脱落乳牙中分选免疫表型鉴定的间充质干细胞的单细胞分离技术

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