Name: 使用光转换追踪肺转移瘤的肿瘤细胞播散 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T14:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 23 s
Description: 了解利用光转换技术追踪肺转移瘤中肿瘤细胞再播散的方法。该技术通过选择性光转换手术方案，实现原位追踪乳腺癌细胞从肺部转移灶扩散至第三器官的全过程。

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作者感谢Wade Koba在微型计算机断层扫描（S10RR029545）方面的协助，感谢分析成像中心的Vera DesMarais和Hillary Guzik在显微镜技术方面的培训与帮助，感谢爱因斯坦-蒙特菲奥里癌症中心、美国国家癌症研究所（P30CA013330、R01CA21248、R01CA255153）、格鲁斯-利珀生物光子学中心、癌症研究综合成像项目、惠康基金会亨利爵士博士后奖学金（221647/Z/20/Z）以及METAvivor职业发展奖的支持。

本方案中描述的所有操作均按照脊椎动物使用指南和相关规定进行，并已事先获得阿尔伯特·爱因斯坦医学院机构动物护理和使用委员会的批准。
手术前，需使用表达光转化/光转换蛋白的癌细胞在小鼠体内建立肺转移模型；已有多种建立肺转移的实验方案被发表26,27,28。
1. 手术准备
<ol>
	<li>准备独立的工作区域，分别用于小鼠准备（脱毛和插管）、手术和恢复。</li>
	<li>将所有手术器械在高压灭菌器中灭菌。 
	注意：由于本手术采用仅使用尖端的技术，可使用热珠灭菌器对器械进行重复灭菌，以用于后续操作。</li>
	<li>打开加热手术平台，并使其升温并稳定在 37–40 °C。</li>
	<li>使用 5% 异氟烷诱导麻醉，随后将异氟烷浓度降低至 3%。在整个操作过程中定期进行足趾夹捏试验，以评估麻醉深度是否充分。</li>
	<li>将麻醉后的小鼠置于右侧卧位。在左上胸部/体侧区域（见图1A）涂抹脱毛膏以去除毛发。用浸湿的纱布或纸巾擦拭，清除毛发和脱毛膏。必要时重复操作，直至手术区域所有毛发完全清除。 
	注意：脱毛膏在小鼠皮肤上停留时间不得超过 20 秒，以免损伤皮肤。</li>
	<li>用 2-0 丝线在 22 G 导管基部上方约 3 mm 处打双结，线尾留长约 2 英寸。</li>
	<li>按照先前描述的方法29,30用该导管对小鼠进行插管。为确认插管成功，将充气球囊连接至导管末端并轻轻挤压。 
	注意：成功插管的小鼠在挤压球囊时会出现双侧胸部抬起现象。</li>
	<li>用 2-0 丝线在小鼠鼻部周围打双结，牢固固定，以确保插管导管位置不变。</li>
</ol>
2. 暴露肺部的手术操作
注意：所有手术步骤（图1），包括光转化过程，均应在通风橱或层流柜中进行，以避免手术区域受到污染。
<ol>
	<li>使用抗菌皂洗手，并戴上新的无菌手套。 
	注意：由于该手术仅使用枪头操作，因此也可使用非无菌手套。建议使用基于酒精的消毒剂对非无菌手套进行消毒。</li>
	<li>配制0.1 mg/kg剂量的丁丙诺啡（0.03 mg/mL），皮下注射以镇痛。 
	注意：如果多模式镇痛（包括局部麻醉药和非甾体抗炎药）预计不会干扰所关注的生物学过程，则应与丁丙诺啡联合使用。</li>
	<li>在小鼠双眼上涂抹眼膏以防止角膜损伤。</li>
	<li>将小鼠置于加热的手术平台上，保持右侧卧位。</li>
	<li>将呼吸机连接至气管插管导管。操作时需稳固定管，因轻微移动亦可影响导管位置，导致通气不良。</li>
	<li>观察双侧胸廓稳定且由呼吸机控制的起伏运动。</li>
	<li>用标签胶带将四肢固定在手术平台上。通过在小鼠背部放置另一条胶带，并将背部皮肤和毛发固定到手术平台上，以稳定手术区域。图1A).</li>
	<li>打开已灭菌的手术器械。</li>
	<li>用氯己定溶液擦拭小鼠皮肤，以消毒手术部位。</li>
	<li>在胸骨左侧约 7 mm、肋缘下约 7 mm 处确定区域。用镊子提起该区域的皮肤，使用锋利的显微解剖剪做一直径约 10 mm 的环形切口，注意仅切割皮肤。</li>
	<li>去除肋骨上的软组织（图1B）。使用电凝笔在两端烧灼任何主要血管。 
	注意：除了切除皮肤上10 mm圆形切口下方的所有软组织外，从周边区域额外去除一些非肌肉软组织有助于后续操作步骤的进行。</li>
	<li>用一只手使用镊子抬起6th 或 7th 肋骨。另一只手使用钝头显微解剖剪的一侧刀刃——与胸壁平行倾斜，圆头朝下——小心刺穿第6肋th 或 7th 肋间肌进入胸腔（图1C根据需要轻轻旋转剪刀，进行切割，在肋间隙处形成一个约10 mm的切口，注意避免触碰肺组织或剪到肋骨。</li>
	<li>向肋间切口轻轻喷射压缩空气，以增加肺与胸壁之间的间隙。操作前应先将气流对准手腕或手部释放，以调节至合适的气流强度并清除喷嘴中的碎屑，随后以短促的 bursts 方式对准切口喷射，避免损伤肺组织。</li>
	<li>用一只手使用镊子抬起6th 或 7th 肋骨。另一只手握住牵开器并保持闭合状态，将其插入肋间切口。调整牵开器叶片的方向，使其与胸壁平行，注意避免接触肺组织本身（图1D).</li>
	<li>一旦牵开器就位，缓慢松开手柄，使牵开器张开并暴露肺组织（图1E). 图2A 显示光转换前暴露的肺转移灶的代表性图像，包括肉眼观察下的外观，以及在宽场照明下FITC（绿色，未光转换）和TRITC（红色，光转换）荧光通道中的表现。</li>
</ol>
3. 肺转移灶光转化
注意：以下步骤的详细信息和变异情况可在讨论部分找到。
<ol>
	<li>轻轻滴加 2–3 滴预热至 37 °C 的无菌 PBS 到暴露的肺组织上，以防止组织干燥。</li>
	<li>将一片带有小切口的无菌铝箔覆盖在小鼠上方，使切口正对暴露的肺组织，并调整切口大小，仅暴露胸腔开放部分及周围数毫米的软组织和皮肤，以确保仅对暴露的肺组织进行光转化。</li>
	<li>将一个带有切口的盒子盖在小鼠和铝箔上方，确保切口正对暴露的肺组织。</li>
	<li>将光转化灯直接置于盒子的切口上方（图 1F）。</li>
	<li>打开光转化灯，持续照射暴露的肺组织 6 分钟。 
	注意：使用呼吸机上的生理监测程序持续监测小鼠的生命体征。</li>
	<li>光转化完成后，关闭光源，并从小鼠上方移除光源、盒子和铝箔遮罩。</li>
</ol>
4. 关闭胸壁的操作步骤
<ol>
	<li>重复步骤 2.13，将肺组织与胸壁分离。</li>
	<li>小心握住牵开器手柄并挤压，使叶片闭合。</li>
	<li>将闭合的牵开器从肋间隙中缓慢移出，注意避免触碰肺组织。</li>
	<li>使用 5-0 丝线，采用连续单纯缝合方式关闭肋间切口，缝合时应包含切口两侧的肋骨（图 1G）。拉紧缝线，确保伤口边缘对合良好，恢复胸壁的完整性（图 1H）。注意不要过度收紧缝线，以免撕裂肋间肌。</li>
	<li>通过将缝线两端打四次结的方式固定缝线。尽可能贴近结处剪断缝线残端。</li>
	<li>使用外科缝合钉关闭皮肤。</li>
	<li>使用带有 28 G 针头的 1 mL 胰岛素注射器抽出胸腔内多余空气。通过触诊定位剑突，在其稍下方进针，针尖朝向左肩方向推进，经膈肌进入胸腔。回抽注射器至约 1 mL；将针头从小鼠体内拔出，并排出注射器中的空气。重复此操作 3–4 次。 
	注意：操作时应避免刺破任何内脏器官。此外，必须使用 1 mL 注射器并重复抽吸 3–4 次，而不可使用更大容量的注射器试图一次性抽尽空气。使用大容量注射器可能在胸腔内产生过强负压，导致肺组织膨胀和损伤。</li>
	<li>关闭异氟烷气体。</li>
	<li>继续以 100% 氧气通气，直至小鼠出现苏醒迹象。</li>
	<li>当小鼠出现苏醒迹象后，将气管插管导管从呼吸机上断开，剪断鼻部周围的缝线，拔出插管。</li>
	<li>解除固定胶带，将小鼠转移至置于加热灯下方约 60 厘米处的清洁笼具中，持续监测直至完全恢复。若小鼠出现呼吸困难或活动能力丧失，使用 5% 异氟烷麻醉 5 分钟，通过夹捏脚趾观察反射消失确认麻醉充分后，采用颈椎脱位法实施安乐死。</li>
	<li>当小鼠完全从麻醉中苏醒并开始活动后，准备另一剂剂量为 0.1 mg/kg 的丁丙诺啡，皮下注射以进行术后镇痛。</li>
	<li>术后确保小鼠单独饲养。在饮水中添加抗生素（恩诺沙星，终浓度 0.4 mg/mL）。</li>
	<li>术后 3 天内，每日检查小鼠两次，观察是否有痛苦迹象。疼痛管理方案为每 4–6 小时皮下注射一次 0.1 mg/kg 丁丙诺啡（0.03 mg/mL）。若小鼠出现感染、无法活动或呼吸困难等症状，应实施安乐死。术后第三天起，可改为每日检查一次。</li>
</ol>
5. 利用组织透明化技术对光转换细胞进行样品处理与检测
<ol>
	<li>光转化手术后3至5天（或根据所需时间）用5%异氟烷麻醉小鼠，诱导后将异氟烷浓度从5%降至2.5%，通过轻捏脚趾无反射确认麻醉充分，随后进行终末经心脏灌注，先灌注10 mL室温磷酸盐缓冲液（PBS），再灌注10 mL冷却至4 °C的4%多聚甲醛，操作步骤如前所述31。</li>
	<li>取下目标器官，并按照先前所述方法进行光学透明化处理31。</li>
	<li>按照先前所述方法使用光片显微镜对透明化组织进行成像31。或者，将透明化组织置于玻璃底培养皿中，使用共聚焦、转盘或双光子显微镜在FITC和TRITC通道下成像，以分别观察绿色（未光转化）和红色（光转化）细胞。</li>
</ol>
6. 利用组织解离进行样本处理及光转化细胞的检测
<ol>
	<li>用5%异氟烷麻醉小鼠5分钟，通过轻捏脚趾观察反射消失以确认麻醉充分，并在光转化后3-5天通过颈椎脱位处死小鼠。</li>
	<li>收集并消化目标器官，操作步骤如前所述13。</li>
	<li>将消化后的组织接种于培养板中，并置于培养箱中过夜，使其贴壁，操作如前所述13。</li>
	<li>次日，在FITC和TRITC通道中对已贴壁的细胞进行成像，以观察绿色（未光转化）和红色（光转化）细胞，操作如前所述13。</li>
</ol>

Examining Tumor Cell Dissemination from Lung Metastases

<ol><li>Dillekås, H., Rogers, M. S., Straume, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+90%25+of+deaths+from+cancer+caused+by+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Medicine%22%5BJournal%5D)">Are 90% of deaths from cancer caused by metastases.</a> Cancer Medicine. 8 (12), 5574-5576 (2019).</li>
<li>Gupta, G. P., Massagué, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+metastasis%3A+building+a+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer metastasis: building a framework.</a> Cell. 127 (4), 679-695 (2006).</li>
<li>Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis%3A+from+dissemination+to+organ-specific+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization.</a> Nature Reviews. Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).</li>
<li>Paget, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+secondary+growths+in+cancer+of+the+breast%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">The distribution of secondary growths in cancer of the breast.</a> Cancer Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).</li>
<li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-seeding+circulating+tumor+cells+promote+the+proliferation+and+metastasis+of+human+osteosarcoma+by+upregulating+interleukin-8%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Self-seeding circulating tumor cells promote the proliferation and metastasis of human osteosarcoma by upregulating interleukin-8.</a> Cell Death & Disease. 10 (8), 575(2019).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-derived+exosomes+promote+tumor+self-seeding+in+hepatocellular+carcinoma+by+transferring+miRNA-25-5p+to+enhance+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Tumor-derived exosomes promote tumor self-seeding in hepatocellular carcinoma by transferring miRNA-25-5p to enhance cell motility.</a> Oncogene. 37 (36), 4964-4978 (2018).</li>
<li>Kim, M. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+self-seeding+by+circulating+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor self-seeding by circulating cancer cells.</a> Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+self-seeding+by+circulating+tumor+cells+in+nude+mouse+models+of+human+osteosarcoma+and+a+preliminary+study+of+its+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Research+and+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Tumor self-seeding by circulating tumor cells in nude mouse models of human osteosarcoma and a preliminary study of its mechanisms.</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 140 (2), 329-340 (2014).</li>
<li>Dondossola, E., Crippa, L., Colombo, B., Ferrero, E., Corti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromogranin+A+regulates+tumor+self-seeding+and+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Chromogranin A regulates tumor self-seeding and dissemination.</a> Cancer Research. 72 (2), 449-459 (2012).</li>
<li>Brown, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+blood+vessels+provide+exit+routes+for+metastatic+tumor+cell+dissemination+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice.</a> Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).</li>
<li>Pereira, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+metastases+can+invade+local+blood+vessels%2C+exit+the+node%2C+and+colonize+distant+organs+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice.</a> Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).</li>
<li>Coste, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematogenous+dissemination+of+breast+cancer+cells+from+lymph+nodes+is+mediated+by+tumor+microenvironment+of+metastasis+doorways%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Hematogenous dissemination of breast cancer cells from lymph nodes is mediated by tumor microenvironment of metastasis doorways.</a> Frontiers in Oncology. 10, 571100(2020).</li>
<li>Borriello, L., Condeelis, J., Entenberg, D., Oktay, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+cell+re-dissemination+from+lung+metastases-a+mechanism+for+enhancing+metastatic+burden%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Breast cancer cell re-dissemination from lung metastases-a mechanism for enhancing metastatic burden.</a> Journal of Clinical Medicine. 10 (11), 2340(2021).</li>
<li>Ullah, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+history+of+metastatic+breast+cancer+reveals+minimal+seeding+from+axillary+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Evolutionary history of metastatic breast cancer reveals minimal seeding from axillary lymph nodes.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1355-1370 (2018).</li>
<li>Gundem, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolutionary+history+of+lethal+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The evolutionary history of lethal metastatic prostate cancer.</a> Nature. 520 (7547), 353-357 (2015).</li>
<li>Brown, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+analysis+of+metastatic+progression+in+breast+cancer+using+somatic+mutations+and+copy+number+aberrations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic analysis of metastatic progression in breast cancer using somatic mutations and copy number aberrations.</a> Nature Communications. 8, 14944(2017).</li>
<li>Kalhor, R., Mali, P., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapidly+evolving+homing+CRISPR+barcodes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapidly evolving homing CRISPR barcodes.</a> Nature Methods. 14 (2), 195-200 (2017).</li>
<li>Kalhor, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+barcoding+of+whole+mouse+via+homing+CRISPR%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR.</a> Science. 361 (6405), eaat9804(2018).</li>
<li>McKenna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-organism+lineage+tracing+by+combinatorial+and+cumulative+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing.</a> Science. 353 (6298), aaf7907(2016).</li>
<li>Junker, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+clonal+analysis+using+CRISPR%2FCas9+induced+genetic+scars%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Massively parallel clonal analysis using CRISPR/Cas9 induced genetic scars.</a> bioRxiv. , 056499(2017).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bone+microenvironment+invigorates+metastatic+seeds+for+further+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The bone microenvironment invigorates metastatic seeds for further dissemination.</a> Cell. 184 (9), 2471.e20-2486.e20 (2021).</li>
<li>Kedrin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+metastatic+behavior+through+a+mammary+imaging+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window.</a> Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).</li>
<li>Grau, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporally+controlled+induction+of+gene+expression+in+vivo+allows+tracking+the+fate+of+tumor+cells+that+traffic+through+the+lymphatics%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporally controlled induction of gene expression in vivo allows tracking the fate of tumor cells that traffic through the lymphatics.</a> International Journal of Cancer. 147 (4), 1190-1198 (2020).</li>
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<li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).</li>
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<li>Hsu, C. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EZ+Clear+for+simple%2C+rapid%2C+and+robust+mouse+whole+organ+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">EZ Clear for simple, rapid, and robust mouse whole organ clearing.</a> eLife. 11, e77419(2022).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

本文描述了一种在肺部选择性光转化肿瘤细胞的手术方案。该技术使研究人员能够选择性地标记肺部的肿瘤细胞，并通过后续在体内重新识别这些细胞来追踪其命运，从而促进对肺转移灶转移过程的研究。利用该方案，我们能够在接受过光转化手术的小鼠的脑、肝以及未进行光转化的右肺中观察到光转化后的细胞，表明这些细胞从光转化的肺转移灶重新扩散到了这些三级部位。在未接受光转化的小鼠器官中未发现任何红色细胞，表明细胞的天然自发荧光强度不足以与光转化的肿瘤细胞相混淆。
仔细关注实验的某些方面可以提高该操作的成功率。首先，在建立肺转移模型时，必须考虑转移形成方案以及光转化/光转换蛋白的选择。已有报道指出，某些荧光蛋白具有免疫原性33,34,35,36。因此，表达此类蛋白的癌细胞在免疫健全的小鼠中可能无法自发转移。事实上，我们观察到，将6DT1-Dendra2细胞原...

转移是癌症相关死亡的主要原因1。&#160;当原发肿瘤的细胞扩散至全身并在远处器官中增殖形成临床可检测的肿瘤时，即产生转移性癌症2,3。
尽管转移通常被认为是一个单向过程，即肿瘤细胞从原发性肿瘤扩散并定植于远端器官4，但越来越多的临床和实验证据表明，这一过程实际上更为复杂且具有多向性。已有研究表明，循环肿瘤细胞可以重新定植原发性肿瘤（如果原发灶仍然存在）5,6,7,8,9，而已有转移灶中的肿瘤细胞也可迁移至第三部位，形成新的病灶10,11,12,13。事实上，近期基因组分析的证据显示，部分转移病灶并非源自原发性肿瘤，而是来源于其他转移灶——这一现象被称为&#34;转移灶间转移&#34;或&#34;转移灶向转移灶的再定植&#34;14,15,16。即使在原发性肿瘤被切除后，转移灶向转移灶的再定植仍可持续推动疾病进展，增加转移负荷，并降低患者的生活质量和生存率。因此，深入理解转移灶间再定植的机制，对于优化转移性肿瘤患者的治疗策略至关重要。
尽管转移灶之间的播散可能具有严重的临床意义，但由于后勤和技术上的限制，目前对此了解甚少。人类研究受限于临床样本的匮乏。临床上很少对转移性病灶进行手术切除或活检，也很少对看似健康的器官进行活检，而这些器官中可能潜伏着单个播散的肿瘤细胞。这意味着人类研究通常只能依赖于尸体解剖样本，这些样本来自原发肿瘤仍保留或先前已被切除但尚可供研究人员获取的个体。当此类样本可用时，必须通过测序方法对癌症进展的谱系进行分析14。然而，对配对的原发肿瘤和转移灶进行的群体测序缺乏全面谱系追踪所需的灵敏度。例如，对某一病灶的群体测序可能发现一个亚克隆，但在其配对的其他病灶中均无法检测到该亚克隆。在这种情况下，人们将无法确定该亚克隆的来源：它可能以低于检测限的频率存在于原发肿瘤或其他转移灶中，也可能是在该转移病灶最初定植后才出现的。单细胞测序虽然提高了灵敏度，但其高昂的成本限制了该技术的大规模应用。这些研究的回顾性性质也意味着它们难以揭示短暂的转移事件以及疾病在不同时间点的动态变化。
在动物模型中，近期的技术进步使得能够以高空间和时间分辨率进行前瞻性系统发育谱系追踪17,18,19,20。这些技术利用 CRISPR/Cas9 基因组编辑，构建携带可进化条形码的细胞——即随时间累积的可遗传突变。通过测序，可根据每个细胞条形码的突变特征追溯其谱系关系17,18,19,20。事实上，此类技术已开始用于描绘转移灶之间播散过程的图谱。在最近的一项研究中，Zhang 等人证明，乳腺癌和前列腺癌的骨转移细胞可从骨骼再次扩散，继而向多个器官播种形成继发性转移灶21。
尽管这些新方法在生成癌症进展的详细高分辨率系统发育图谱方面具有巨大潜力，但对于研究转移灶之间播种事件的精确时间及其促进或抑制因素的研究人员而言，这些方法却极不实用。填补这些知识空白对于深化我们对转移性癌症的理解和治疗至关重要，但目前明显缺乏能够促进此类研究的技术。为满足这一需求，我们近期开发了一种新技术，并在本文中予以介绍。该技术可让我们通过光转换特异性标记转移部位（肺）中的肿瘤细胞，并随后在继发器官中重新识别这些细胞。利用该技术，我们近期发现乳腺癌细胞会从肺转移灶再次扩散并播种至继发器官13。该技术还可用于在较窄的时间窗口内确定再次扩散事件的发生时间，并对再次扩散的肿瘤细胞进行定量，从而促进对再次扩散细胞的器官趋向性及其促进或抑制因素的研究。
尽管已有研究利用光转化和局部可诱导的cre/lox系统，通过一种荧光蛋白永久替换另一种荧光蛋白来标记和追踪肿瘤细胞11,22,23，但据我们所知，目前尚无针对肺部——在患有14种最常见癌症的男性和女性中，肺是转移最常见的部位之一24——优化的时空标记肿瘤细胞的方法。本实验方案可适用于任何类型的癌细胞及任何肺转移模型构建方法，因此对转移研究领域的科研人员具有广泛适用性。所有用于构建肺转移模型的癌细胞均应表达光转化或光切换蛋白，研究人员可根据自身具体需求和资源选择合适的蛋白。在本研究中，我们使用了稳定表达光转化绿色至红色荧光蛋白Dendra2（6DT1-Dendra2细胞）25且该蛋白与组蛋白H2B融合标记的6DT1乳腺癌细胞。我们将5.0 × 104个6DT1-Dendra2细胞注射至雌性Rag2-/-小鼠的第四对乳腺脂肪垫中。注射后12至16天可触及原发肿瘤，且在整个实验期间未进行切除。自发性肺转移灶在肿瘤细胞注射后19至26天内形成。光转化手术在肿瘤细胞注射后26至29天之间进行。由于肺转移负荷，小鼠在术后72小时内被处死。

<table><tbody><tr><td>0-30 V，0-3 A 电源供应器</td><td>MPJA</td><td>9616 PS</td><td></td></tr><tr><td>12 VDC，1.2 A 非稳压插头电源</td><td>MPJA</td><td>17563 PD</td><td></td></tr><tr><td>28 G 1 mL BD 胰岛素注射器</td><td>BD</td><td>329410</td><td></td></tr><tr><td>400 nm 发光二极管阵列灯</td><td>LedEngin 公司</td><td>897-LZPD0UA00</td><td>光转换灯，定制（包括以下各个部件）</td></tr><tr><td>5-0 编织丝线缝合线，带 RB-1 切割针</td><td>Ethicon, Inc.</td><td>774B</td><td></td></tr><tr><td>9 cm 2-0 丝线结</td><td>Ethicon, Inc.</td><td>LA55G</td><td></td></tr><tr><td>拜耳灵100（恩诺沙星）</td><td>拜耳（Santa Cruz Biotechnology）</td><td>sc-362890Rx</td><td>饮水中使用的抗生素</td></tr><tr><td>布托啡诺</td><td>Hospira</td><td>0409-2012-32</td><td>镇痛剂</td></tr><tr><td>电缆（电缆组件）2.5 JK-ST 72&quot; ZIP CD</td><td>穆瑟</td><td>172-0250</td><td></td></tr><tr><td>氯己定溶液</td><td>Durvet</td><td>7-45801-10258-3</td><td>氯己定消毒液</td></tr><tr><td>压缩空气罐</td><td>Falcon</td><td>DPSJB-12</td><td></td></tr><tr><td>超细显微解剖剪 4&quot; 直型锐缘/锐缘 24 毫米</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5912</td><td>锋利的微型解剖剪</td></tr><tr><td>光纤照明光源</td><td>O.C. White 公司</td><td>FL3000</td><td>小鼠插管过程中使用</td></tr><tr><td>Gemini电凝套装</td><td>哈佛仪器</td><td>726067</td><td>电烙笔</td></tr><tr><td>Germinator 500</td><td>CellPoint Scientific</td><td>GER&amp;nbsp;5287-120V</td><td>珠式灭菌器</td></tr><tr><td>格拉夫钳</td><td>Roboz</td><td>RS-5135</td><td></td></tr><tr><td>高功率LED——单色紫外90瓦</td><td>穆瑟</td><td>LZP-D0UA00</td><td></td></tr><tr><td>红外加热灯</td><td>Braintree Scientific</td><td>HL-1</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷 SOL 250 mL PVL</td><td>Covetrus</td><td>29405</td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>异氟烷蒸发器</td><td>SurgiVet</td><td>VCT302</td><td></td></tr><tr><td>带锁止装置的雅各布森持针器</td><td>Kalson Surgical</td><td>T1-140</td><td></td></tr><tr><td>标签胶带</td><td>Fisher Scientific</td><td>S68702</td><td></td></tr><tr><td>LED照明反射器 CREE MP-L 单透镜反射器 &amp;和 LOC PIN</td><td>穆瑟</td><td>928-C11395TM</td><td></td></tr><tr><td>长棉签棒</td><td>Medline Industries</td><td>MDS202055</td><td></td></tr><tr><td>Masscool / Soccket 478 / Intel Pentium 4/Celeron 最高支持 3.4GHz / 滚珠轴承 / 铜芯 / CPU 散热风扇</td><td>CompUSA</td><td>#S457-1023</td><td></td></tr><tr><td>微型解剖剪 4&quot; 直型钝端/钝端</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5980</td><td>钝头显微解剖剪</td></tr><tr><td>小鼠呼吸机</td><td>Kent Scientific&amp;nbsp;</td><td>PS-02</td><td>PhysioSuite</td></tr><tr><td>Nair 脱毛乳液</td><td>亚马逊</td><td>B001RVMR7K</td><td>脱毛膏</td></tr><tr><td>Personnet小型牵开器</td><td>Roboz</td><td>RS-6504</td><td>牵开器</td></tr><tr><td>1×磷酸盐缓冲液</td><td>Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td>PBS</td></tr><tr><td>pLenti.CAG.H2B-Dendra2.W</td><td>Addgene</td><td>51005</td><td>Dendra2 慢病毒</td></tr><tr><td>Puralube</td><td>Henry Schein 动物健康</td><td>008897</td><td>眼部润滑剂</td></tr><tr><td>啮齿类动物插管架</td><td>Braintree Scientific</td><td>RIS 100</td><td></td></tr><tr><td>小型动物肺部膨胀球囊</td><td>哈佛仪器</td><td>72-9083</td><td></td></tr><tr><td>用于小鼠的多功能外科手术平台 SurgiSuite（带加热功能）</td><td>Kent Scientific</td><td>SURGI-M02</td><td>加热手术平台</td></tr><tr><td>测试导线 48&quot; 测试引线香蕉插头 - 黑色</td><td>穆瑟</td><td>565-1440-48-0</td><td></td></tr><tr><td>测试导线 48&quot; 测试导线香蕉插头 - 红色</td><td>穆瑟</td><td>565-1440-48-2</td><td></td></tr><tr><td>气管导管&amp;nbsp;</td><td>Exelint International</td><td>26746</td><td>22 G 导管</td></tr><tr><td>兽用伤口闭合系统套件</td><td>Clay Adams</td><td>IN015</td><td>兽医外科缝合器套装</td></tr></tbody></table>

利用光转换技术追踪肺转移灶中肿瘤细胞的播散

Tracking Tumor Cell Dissemination from Lung Metastases Using Photoconversion

转移——癌症的系统性扩散——是癌症相关死亡的首要原因。尽管转移通常被认为是一个单向过程，即原发性肿瘤的细胞扩散并形成转移灶，但已有转移灶中的肿瘤细胞也可以再次扩散，在第三部位形成新的病灶，这一过程被称为&#34;转移灶来源的转移&#34;或&#34;转移灶到转移灶的播种&#34;。转移灶到转移灶的播种可能增加转移负荷，并降低患者的生活质量和生存率。因此，深入了解这一现象背后的机制，对于优化转移性癌症患者的治疗策略至关重要。
关于转移灶之间的播散，目前所知甚少，部分原因在于技术和操作上的限制。对转移灶间播散的研究主要依赖测序方法，而这些方法对于研究转移灶间播散事件发生的确切时间或影响其发生促进或抑制因素的研究人员而言，可能并不实用。这凸显了目前尚缺乏能够有效支持转移灶间播散研究的方法学体系。为解决这一问题，我们开发了一种小鼠手术方案，并在本文中予以详细描述：该方案可实现对肺转移灶的选择性光转化，从而特异性地标记从肺部再播散至第三部位的肿瘤细胞，并追踪其命运。据我们所知，这是目前唯一一种无需基因组分析即可研究肿瘤细胞再播散及肺部转移灶间播散的方法。

本方案中所述手术步骤的示意图如下所示 图1简而言之，小鼠经麻醉后，去除左侧胸壁的毛发。随后对小鼠进行气管插管并实施机械通气，以确保在胸腔开放期间小鼠能够持续获得氧气。清除软组织以暴露肋骨，于第6肋处做一剪口th 或 7th 肋间肌。将牵开器插入肋间切口并释放，以撑开相邻的肋骨，暴露左肺及其表面任何可光转化的转移灶。随后将肺组织及转移灶暴露于蓝光下，以实现对可见病灶的光转化。光转化完成后，移除牵开器，缝合肋骨，关闭表层皮肤。最后，排出胸腔内多余空气，以减轻肺部压力，使小鼠恢复自主呼吸。
此处所述方案可适用于多种不同的光转化/光切换蛋白。确保光转化后的细胞在光转化通道中达到最大荧光强度，有助于在其他器官中识别这些细胞。光转化后达到最大荧光强度所需的具体条件应通过实验确定，因为这些条件可能因实验的其他因素而异，例如所使用的光转化蛋白种类以及用于光转化的光照强度。 图2B，C 展示在蓝光照射时间...

我们介绍一种研究肿瘤细胞从肺转移灶重新扩散的方法，该方法包括一种选择性光转化肺转移灶的手术方案，随后在三级器官中鉴定重新扩散的肿瘤细胞。

转移——癌症的系统性扩散——是癌症相关死亡的首要原因。尽管通常认为转移是一个单向过程……

最近的证据表明，已有的转移病灶可作为播散性肿瘤细胞的来源，进而形成新的病灶。这一过程被称为转移灶间的再转移，可能增加肿瘤负荷，并降低癌症患者的生活质量和生存率。本方法旨在研究转移灶间的再转移过程及其影响因素。该技术已帮助我们的实验室确定乳腺癌细胞可以从肺转移灶扩散，并使我们能够研究促进或抑制转移的因素。这些发现可能为未来减缓转移性癌症进展的研究提供指导。肺是常见的转移部位，但目前仅有极少数技术可用于在活体条件下研究肿瘤细胞的动态变化。该技术能够实现对活体小鼠中肿瘤细胞的追踪，有助于研究肺癌转移的特异性扩散途径及相关治疗方法。转移性癌症通常是一种无法治愈且致命的疾病。该技术可用于研究抑制其扩散的方法，从而开发出延长患者生命的治疗手段。手术准备小鼠后，确定目标区域，即胸骨左侧7毫米处，约位于肋缘上方7毫米。用镊子提起已确定区域上的皮肤，使用锋利的显微解剖剪做一直径10毫米的环形切口，仅切割皮肤。随后去除肋骨上方的软组织，并使用电灼笔对两端的任何主要血管进行电灼止血。用镊子抬起第六或第七根肋骨，使用钝头显微解剖剪的一侧刀片刺穿肋间肌。然后轻轻旋转剪刀，在肋间隙处做一个约10毫米的切口，同时避免接触肺组织和肋骨。轻柔地在手腕或手部释放压缩空气，以确定合适的气流强度，并清除喷嘴中的碎屑。然后对切口处短促吹入空气，以避免造成肺损伤。用镊子提起第六或第七根肋骨，将牵开器插入肋间切口，使其叶片与胸壁平行。随后小心松开手柄，使牵开器逐渐张开，缓慢暴露肺组织。现在将2至3滴预热至37摄氏度的无菌PBS滴加到暴露的肺组织上，以防止其干燥。将一片带有小孔的铝箔覆盖在小鼠上方，使其正对暴露的肺组织。确保小孔仅暴露胸腔开放区域及邻近组织，以便进行靶向肺部光转化。接下来，将一个带有切口的盒子置于小鼠和铝箔上方，确保切口与暴露的肺组织对齐。将光转化灯直接放置在盒子切口的正上方。然后打开光转化灯，持续照射暴露的肺组织六分钟。光转化后，关闭光源并移除灯箱，以及小鼠周围的铝箔遮罩。通过在手腕处排气，将肺组织与胸壁分离，随后在胸部切口处再次排气。牢固握住牵开器手柄，并挤压使其叶片闭合。小心地将闭合的牵开器从肋间移出，注意避免接触肺组织。然后使用5-0丝线以连续单纯缝合方式关闭肋间切口，确保将切口两侧的肋骨均纳入缝合。拉紧缝线，使切口边缘对齐，恢复胸壁的完整性。通过四次打结固定缝线。将缝线尾端尽可能贴近打结处剪除，并使用外科缝钉关闭皮肤。为排出胸腔内多余空气，将带有28号针头的1毫升注射器插入剑突下方。将注射器回抽至约一毫升处。将注射器从小鼠体内取出并排出空气。图示为暴露于蓝光前表达dendra2的暴露肺转移灶的图像。对表达 dendra2 的肺转移灶暴露于蓝光后发现，在离体和在体样本中，六分钟的照射时间均能在光转化通道中产生最强的信号。在接受蓝光照射手术的小鼠中，三种组织类型中均检测到了发生光转化和未发生光转化的细胞。而在未接受蓝光照射手术的小鼠组织中，仅发现未发生光转化的肿瘤细胞。

tracking-tumor-cell-dissemination-from-lung-metastases-using

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

使用光转换追踪肺转移瘤的肿瘤细胞播散

本文描述了在转移性乳腺癌细胞生长和转移过程中，对其表达的萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的生物发光反应进行构建、可视化及定量的方法。 体内.

体内 双底物生物发光成像

扩散荧光断层成像为临床前研究提供了一种相对低成本且潜在高通量的方法 体内...

小动物中用于癌症生物标志物定位的计算机断层扫描引导时域漫射荧光断层成像

本研究报道的新方案通过联合方法实现了在小鼠中以单细胞分辨率选择性检测肺转移灶 原位 肺灌注与固定及X-Gal染色...

通过联合方法在单细胞分辨率下实现小鼠肺转移灶的优化可视化 原位 肺组织灌注与X-Gal染色 lacZ-标记的肿瘤细胞

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ex vivo 肺转移及其微环境的活体成像

我们描述了一种利用表达绿色荧光蛋白和荧光素酶报告基因的慢病毒颗粒对患者来源的异种移植瘤（PDXs）进行稳定标记的方法。该方法可用于追踪PDXs在原发部位的生长情况，并能够通过活体成像检测自发性及实验性转移灶。 体内...

用于肿瘤生长与转移研究的乳腺癌患者来源异种移植瘤的可示踪报告标记

需要一种动物模型来解析循环肿瘤细胞（CTCs）在癌症转移过程中促进肺部定植的作用。在此，我们建立并成功实施了一种体内检测方法，专门用于验证CTC表面聚合纤连蛋白（polyFN）组装对肺部定植的必要性。...

肺组织中循环肿瘤细胞可视化肺定植检测方法的建立

我们描述了一种用于临床前体内追踪癌症转移的实验方案。该方法基于一种放射性核素-荧光双模报告系统，结合了可通过无创[18F]四氟硼酸盐-PET检测的钠碘同向转运体以及用于简化体外验证的荧光蛋白。该方法不仅适用于肿瘤生物学研究，还可广泛应用于其他领域的临床前体内细胞示踪。...

放射性核素-荧光报告基因成像技术用于追踪啮齿类动物肿瘤模型中的肿瘤进展

本文展示了从正常、炎症及恶性小鼠皮肤中 体内 定量白细胞迁移出的实验方法。我们对两种模型进行了直接比较：经皮 FITC 应用与 原位...

量化白细胞通过小鼠皮肤和肿瘤淋巴管的迁移

所述方法结合了实验性尾静脉转移模型与活体动物实时成像技术，可实现对乳腺癌转移灶形成和生长的实时监测，同时还能对肺部转移灶的数量和大小进行定量分析。...

联合使用尾静脉转移实验与活体实时成像技术定量分析乳腺癌肺部转移定植及负荷

本文介绍了一种用于小鼠胸腔的永久性植入式光学窗口的外科手术植入方案，该窗口可实现肺部的高分辨率活体成像。由于该窗口具有长期稳定性，因此特别适用于研究肺部动态的细胞过程，尤其是肿瘤细胞播散后缓慢发展的转移进程等生物学事件。...

用于研究癌细胞肺转移的永久性窗口

该论文描述了一种方法，用于建立原位注射乳腺肿瘤后自发性肺转移模型，并对转移级联各阶段进行纵向生长监测，适用于干预转移过程的各个阶段。...

体内成像检测原位注射乳腺肿瘤细胞的自发性肺转移

了解利用光转换技术追踪肺转移瘤中肿瘤细胞再播散的方法。该技术通过选择性光转换手术方案，实现原位追踪乳腺癌细胞从肺部转移灶扩散至第三器官的全过程。

利用光转换技术追踪肺转移灶中肿瘤细胞的播散

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