Name: 对实验性自身免疫性脑脊髓炎中的中枢神经系统炎症、脱髓鞘和轴突损伤进行评分 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T14:35:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: 学习实验性自身免疫性脑脊髓炎模型中脊髓炎症、脱髓鞘和轴突损伤的组织学评分方法。该方案通过量化神经丝轻链水平评估中枢神经系统损伤，为研究多发性硬化症病理机制提供更敏感的评估手段。

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我们感谢斯坦福大学的 Raymond Sobel 博士向我们展示其对脑和脊髓组织进行大体取材和固定的实验方法。我们感谢多伦多表型基因组学中心的 Kyle Roberton 和 Milan Ganguly 教授包埋技术，并为我们切片了大量脑和脊髓组织。我们感谢犹他大学的 Matthew Cussick 博士和 Robert Fujinami 博士分享其用于评估脊髓软脑膜下和血管周围炎症的评分方案。我们感谢 Shalina Ousman 分享 CD45 抗体的克隆。我们感谢 Xiofang Lu 在组织处理仪和组织包埋工作站方面的培训，以及其在圣迈克尔医院生物医学研究 Keenan 研究中心对这些设备的维护。本研究得到了加拿大 MS 协会生物医学基金（资助编号：SED）的支持。Carmen Ucciferri 获得加拿大政府研究生奖学金的支持。Nuria Alvarez-Sanchez 获得 Keenan 博士后奖学金的支持。&#160;

Histological Staining of Spinal Cord for Assessing EAE Disease Severity

<ol><li>Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28EAE%29+as+a+model+for+multiple+sclerosis+%28MS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS).</a> Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).</li>
<li>Rasouli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+GM-CSF+in+T+is+increased+in+multiple+sclerosis+and+suppressed+by+IFN-beta+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Expression of GM-CSF in T is increased in multiple sclerosis and suppressed by IFN-beta therapy.</a> J Immunol. 194 (11), 5085-5093 (2015).</li>
<li>Zrzavy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+%27homeostatic%27+microglia+and+patterns+of+their+activation+in+active+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Loss of 'homeostatic' microglia and patterns of their activation in active multiple sclerosis.</a> Brain. 140 (7), 1900-1913 (2017).</li>
<li>Kutzelnigg, A., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+of+multiple+sclerosis+and+related+inflammatory+demyelinating+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Handb+Clin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Pathology of multiple sclerosis and related inflammatory demyelinating diseases.</a> Handb Clin Neurol. 122, 15-58 (2014).</li>
<li>Glatigny, S., Bettelli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28EAE%29+as+animal+models+of+multiple+sclerosis+%28MS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as animal models of multiple sclerosis (MS).</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 8 (11), (2018).</li>
<li>Kipp, M., Nyamoya, S., Hochstrasser, T., Amor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis+animal+models%3A+A+clinical+and+histopathological+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis animal models: A clinical and histopathological perspective.</a> Brain Pathol. 27 (2), 123-137 (2017).</li>
<li>Nikic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reversible+form+of+axon+damage+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis.</a> Nat Med. 17 (4), 495-499 (2011).</li>
<li>Croxford, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytokine+GM-CSF+the+inflammatory+signature+of+CCR2%2B+monocytes+and+licenses+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The cytokine GM-CSF the inflammatory signature of CCR2+ monocytes and licenses autoimmunity.</a> Immunity. 43 (3), 502-514 (2015).</li>
<li>Jones, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+and+pathological+outcomes+in+MOG+35-55+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Behavioral and pathological outcomes in MOG 35-55 experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Neuroimmunol. 199 (1-2), 83-93 (2008).</li>
<li>Zuo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+gray+matter+demyelination+is+associated+with+leptomeningeal+neutrophil+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Age-dependent gray matter demyelination is associated with leptomeningeal neutrophil accumulation.</a> JCI Insight. 7 (12), 158144(2022).</li>
<li>Bannerman, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+pathology+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%3A+Studies+in+thy1-yfp+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Motor neuron pathology in experimental autoimmune encephalomyelitis: Studies in thy1-yfp transgenic mice.</a> Brain. 128, 1877-1886 (2005).</li>
<li>Cahill, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aged+hind-limb+clasping+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+models+aspects+of+the+neurodegenerative+process+seen+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Aged hind-limb clasping experimental autoimmune encephalomyelitis models aspects of the neurodegenerative process seen in multiple sclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (45), 22710-22720 (2019).</li>
<li>Stromnes, I. M., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Active induction of experimental allergic encephalomyelitis.</a> Nat Protoc. 1 (4), 1810-1819 (2006).</li>
<li>Stromnes, I. M., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Passive induction of experimental allergic encephalomyelitis.</a> Nat Protoc. 1 (4), 1952-1960 (2006).</li>
<li>Drohomyrecky, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor-delta+acts+within+peripheral+myeloid+cells+to+limit+the+expansion+of+myelin-reactive+T+cells+during+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28EAE%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor-delta acts within peripheral myeloid cells to limit the expansion of myelin-reactive T cells during experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE).</a> J. Immunol. 10, 2588-2601 (2019).</li>
<li>Osorio-Querejeta, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+innovative+animal+monitoring+device+for+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28%26%2334%3BI+am+D+EAE%26%2334%3B%29%3A+A+more+detailed+evaluation+for+improved+results%5BTitle%5D)+AND+%22Mult+Scler+Relat+Disord%22%5BJournal%5D)">The innovative animal monitoring device for experimental autoimmune encephalomyelitis (&#34;I am D EAE&#34;): A more detailed evaluation for improved results.</a> Mult Scler Relat Disord. 63, 103836(2022).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+diverse+assessment+indicators+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Induction and diverse assessment indicators of experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Vis Exp. (187), e63866(2022).</li>
<li>Shahi, S. K., Freedman, S. N., Dahl, R. A., Karandikar, N. J., Mangalam, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scoring+disease+in+an+animal+model+of+multiple+sclerosis+using+a+novel+infrared-based+automated+activity-monitoring+system%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Scoring disease in an animal model of multiple sclerosis using a novel infrared-based automated activity-monitoring system.</a> Sci Rep. 9, 19194(2019).</li>
<li>Kluver, H., Barrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+combined+staining+of+cells+and+fibers+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 12 (4), 400-403 (1953).</li>
<li>Disanto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+neurofilament+light%3A+A+biomarker+of+neuronal+damage+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Serum neurofilament light: A biomarker of neuronal damage in multiple sclerosis.</a> Ann Neurol. 81 (6), 857-870 (2017).</li>
<li>Novakova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+disease+activity+in+multiple+sclerosis+using+serum+neurofilament+light+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Monitoring disease activity in multiple sclerosis using serum neurofilament light protein.</a> Neurology. 89 (22), 2230-2237 (2017).</li>
<li>Pouzol, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Act-1004-1239%2C+a+first-in-class+CXCR7+antagonist+with+both+immunomodulatory+and+promyelinating+effects+for+the+treatment+of+inflammatory+demyelinating+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Act-1004-1239, a first-in-class CXCR7 antagonist with both immunomodulatory and promyelinating effects for the treatment of inflammatory demyelinating diseases.</a> FASEB J. 35 (3), 21431(2021).</li>
<li>Breakell, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obinutuzumab-induced+B-cell+depletion+reduces+spinal+cord+pathology+in+a+CD20+double+transgenic+mouse+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Obinutuzumab-induced B-cell depletion reduces spinal cord pathology in a CD20 double transgenic mouse model of multiple sclerosis.</a> Int J Mol Sci. 21 (18), 6864(2020).</li>
<li>Aharoni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effect+of+glatiramer+acetate+on+neurofilament+light+chain+leakage+and+glutamate+excess+in+an+animal+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effect of glatiramer acetate on neurofilament light chain leakage and glutamate excess in an animal model of multiple sclerosis.</a> Int J Mol Sci. 22 (24), 13419(2021).</li>
<li>Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+distinguish+phosphorylated+and+nonphosphorylated+forms+of+neurofilaments+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (19), 6126-6130 (1983).</li>
<li>Mouse spinal brain map. , Available from: 
 <a target="_blank" href="Https://Mousespinal.Brain-Map.Org/Imageseries/Showref.Html">Https://Mousespinal.Brain-Map.Org/Imageseries/Showref.Html</a> (2023).</li>
<li>Kuhle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+neurofilament+is+associated+with+progression+of+brain+atrophy+and+disability+in+early+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Serum neurofilament is associated with progression of brain atrophy and disability in early MS.</a> Neurology. 88 (9), 826-831 (2017).</li>
<li>Benkert, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+neurofilament+light+chain+for+individual+prognostication+of+disease+activity+in+people+with+multiple+sclerosis%3A+A+retrospective+modelling+and+validation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Serum neurofilament light chain for individual prognostication of disease activity in people with multiple sclerosis: A retrospective modelling and validation study.</a> Lancet Neurol. 21 (3), 246-257 (2022).</li>
<li>D'Souza, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OGR1%2FGPR68+modulates+the+severity+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+regulates+nitric+oxide+production+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">OGR1/GPR68 modulates the severity of experimental autoimmune encephalomyelitis and regulates nitric oxide production by macrophages.</a> PLoS One. 11 (2), 0148439(2016).</li>
<li>Imagej. , Available from: 
 <a target="_blank" href="Https://www.imagej.nih.gov/lj/download.html">Https://www.imagej.nih.gov/lj/download.html</a> (2023).</li>
<li>Openmicroscopy. , Available from: 
 <a target="_blank" href="Https://www.openmicroscopy.org/bio-formats/downloads">Https://www.openmicroscopy.org/bio-formats/downloads</a> (2023).</li>
<li>Doroshenko, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor-delta+deficiency+in+microglia+results+in+exacerbated+axonal+injury+and+tissue+loss+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor-delta deficiency in microglia results in exacerbated axonal injury and tissue loss in experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Front Immunol. 12, 570425(2021).</li>
<li>Soulika, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+and+progression+of+axonopathy+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Initiation and progression of axonopathy in experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Neurosci. 29 (47), 14965-14979 (2009).</li>
<li>Trapp, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transection+in+the+lesions+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Axonal transection in the lesions of multiple sclerosis.</a> N Engl J Med. 338 (5), 278-285 (1998).</li>
<li>Lassmann, H., Bradl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%3A+Experimental+models+and+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis: Experimental models and reality.</a> Acta Neuropathol. 133 (2), 223-244 (2017).</li>
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脊髓组织学染色是评估实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）疾病严重程度的重要工具，特别是在疾病急性期后的恢复阶段，当不同治疗组之间存在疾病恢复程度差异时尤为有用。通过免疫细胞浸润（CD45）、髓鞘（LFB）以及轴突损伤（SMI-32）的染色，有助于阐明小鼠临床评分变化的潜在原因。本文所述的组织学染色方案可反映炎症情况，以及髓鞘和轴突损伤的程度。此外，所示结果验证了血清神经丝轻链（sNF-L）检测作为评估EAE中总体神经元损伤程度的一种方法的可靠性。
该分析的关键参数是确保研究人员对切片的身份信息设盲，并且在不同小鼠的脊髓各节段进行等效取样。这是因为炎症的严重程度在脊髓较低节段可能更为显著。另一个关键参数是实验组的大小。通常在实验终点时，每组需采集6至8只小鼠的脊髓和脑组织，以便检测出治疗干预或基因型效应量较小时组间的显著差异。还需确保所选小鼠的平均评分能够代表整个组的平均分值。关于问题排查，初学者在操作本方案时常遇到的一个问题是脊髓固定时间不足，导致其难以从脊柱中完整挤出。若出现这种情况，可使用精细剪刀沿棘突剪开，手动解剖脊柱并打开椎管以暴露脊髓组织。或者，可将组织额外固定数天，这不会影响抗体染色的效果。本文所述的抗体克隆在经福尔马林固定长达2周的组织中仍可有效工作。
包埋脊髓组织片段需要技巧和练习。建议佩戴眼部放大镜，并将灯光对准包埋工作站，以便更清楚地观察切片是否呈横断面或纵切面。在大体取材时，将脊髓片段的长度控制在2 mm以内，有助于使其呈横断面放置。另一个初学者常遇到的问题是，在过夜孵育过程中Luxol固蓝（LFB）染液蒸发，导致载玻片一半染色、一半未染色。为防止蒸发，玻璃染色缸应先用热塑性封膜密封，再用塑料薄膜包裹。如果发生蒸发且切片染色不均，建议使用碳酸锂将载玻片完全褪色后，重新在LFB中过夜染色。另一个常见问题是，在LFB染色后未彻底褪去灰质的蓝色。在进行后续步骤前，必须在显微镜下仔细检查各个切片，确保灰质褪色程度充分。此外，尽管CD45和SMI-32免疫组化（IHC）染色效果通常稳定，但对于每一批新到的抗体，仍应在预实验中优化抗体浓度。可通过在阳性对照切片（EAE脊髓组织）上测试一系列不同浓度的抗体来完成。首次染色时还应设置阴性对照，即仅加入二抗而不加一抗。最后，在图像分析过程中，对单个图像进行阈值设定至关重要，因为染色在不同载玻片或切片之间可能存在不均一性。
本方案使用免费提供的软件。若无切片机、包埋机或超薄切片机，可将这些步骤委托给提供此类服务的医院病理科核心实验室。此外，若无切片扫描仪，可使用配备视频摄像头的光学显微镜来保存脊髓或脑区的TIFF图像。对于基于显微镜的工作流程，应在低倍镜下（40倍放大）采集Luxol固蓝（LFB）或LFB/苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色切片图像；对于CD45和SMI-32免疫染色，则需至少采集四个视野图像，分别位于脊髓的腹侧、背侧和外侧区域（CD45染色为200倍放大，SMI-32染色为400倍放大）。可对这些图像进行图像分析，以类似本文所述方法定量染色结果。
选择何种组织学方法来评估EAE评分，取决于各组之间临床评分的差异程度。例如，如果EAE临床评分存在显著差异（一组发生EAE而另一组未发生），这通常与外周介导的炎症差异有关。在这种情况下，对LFB/H&amp;#38;E染色切片上的脱髓鞘病灶进行评分已足够，并能揭示组间差异。如果各组在发病时的临床评分较为接近，而主要差异体现在临床恢复程度上（例如图5A中的实验），则最好采用此处所述的完整组织学流程，包括对脑干和小脑中的脑部炎症进行评分，以判断疾病慢性化差异是源于炎症还是组织损伤。&#160; 如果通过CD45计数发现炎症存在差异，可进一步开展免疫组化（IHC）研究，对T细胞（抗CD3）、浸润的单核细胞/巨噬细胞（Mac3）以及小胶质细胞（Iba-1/TMEM119）进行染色（推荐的抗体克隆见补充表3）。小胶质细胞的活化表现为双标Iba-1+TMEM-19+ 小胶质细胞中Iba-1染色强度增加，以及小胶质细胞突起的回缩增加，后者可通过Sholl分析在切片上进行评估32。此外，还可应用流式细胞术或单细胞RNA测序等技术，对脑和脊髓中免疫细胞群体的频率和表型进行更深入的表征。
计数 SMI-32+ 轴突是一种检测实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）32,33 和多发性硬化症（MS）34 中轴突损伤的敏感方法。SMI-32 可识别神经丝重链或中链的非磷酸化形式，该形式会在被切断的神经元终球中积聚。另一种检测受损轴突的方法是使用淀粉样前体蛋白（APP）进行染色，APP 可因轴突运输受阻而在轴突内积聚33。尽管 SMI-32 和 APP 的染色模式均反映轴突损伤，但二者通常不重叠，表明它们检测的是不同的病理变化33。此外，还可通过检测血清神经丝轻链（sNF-L）来补充组织学对轴突损伤的评估，sNF-L 是评估脊髓和大脑中持续性轴突损伤的一种快速且敏感的指标。该方法的优势在于可在活体小鼠中于半天内完成检测。此方法的缺点是试剂盒价格昂贵，且所需仪器高度专业化。销售 sNF-L 试剂盒的公司为无法获得 SIMOA 仪器的研究者提供付费检测服务。评估轴突损伤的另一种方法是通过计数脊髓组织切片中甲苯胺蓝染色的轴突数量12，或计数脊髓白质区域中由 SMI-31 检测到的神经丝束数量32，以评估轴突丢失情况。这两种方法均比 SMI-32 染色或 sNF-L 检测更为耗时费力。
如果不同组之间的EAE临床评分存在差异，但炎症、脱髓鞘和轴突损伤的评分未能显示组间差异，则可考虑使用GFAP对星形胶质细胞活化进行染色（推荐的抗体克隆见补充表3）。星形胶质细胞活化与GFAP染色增强相关，已有研究表明，在某些EAE模型（包括DA大鼠的慢性EAE模型）中，GFAP染色增强与EAE病情进展相关35。
综上所述，本方案描述了进行实验性自身免疫性脑脊髓炎组织学评分的方法，并提供了一套分析流程。

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是研究人类脱髓鞘疾病多发性硬化症（MS）最常用的小鼠模型。1经典的多发性硬化症（MS）炎症病理，包括产生干扰素-γ（IFN-γ）和白细胞介素-17（IL-17）的辅助性T细胞浸润2，炎性单核细胞的浸润3血管周围和软脑膜下炎性脱髓鞘病变的形成4，以及轴突损伤的发生4 在中枢神经系统（CNS）中也观察到实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的表现5,6,7,8,9EAE与MS在免疫机制上的相似性使其成为测试多种已获批的免疫疗法对MS疗效及作用机制的合适临床前模型，这些疗法包括那他珠单抗（natalizumab）、芬戈莫德（fingolimod）、富马酸二甲酯（dimethyl fumarate）和醋酸格拉替雷（glatiramer acetate）（详见综述于1,5）。某些EAE方案可模拟进行性多发性硬化病理的其他方面，除轴突损伤外，还包括脑部软脑膜下炎症的形成、慢性脱髓鞘、脊髓萎缩、突触及神经元丢失6,10,11,12因此，EAE可用于筛选治疗多发性硬化症的神经保护疗法的有效性。
可通过多种方式在啮齿类动物中诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）。最常用的诱导方法是主动免疫，即用髓鞘抗原（完整蛋白或肽段）与完全弗氏佐剂（CFA）乳化后对啮齿类动物进行免疫，并在CFA中添加灭活的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）13。根据小鼠品系的不同，通常在免疫当天（第0天）和第2天给予百日咳毒素（PTX），以提高疾病的发生率13。此外，EAE也可通过过继转移来自经髓鞘抗原/CFA致敏小鼠的髓鞘特异性T细胞至健康小鼠体内来诱导14&#160;，或在过表达针对主要髓鞘抗原的T细胞受体的小鼠中自发产生5。
EAE疾病的严重程度和进展通常采用离散的5分制临床评分标准进行评估：1分——尾巴无力，2分——后肢或足部无力，3分——单侧或双侧后肢完全瘫痪，4分——前肢无力，5分——濒死或死亡13。该临床评分系统在记录疾病初期出现的上升性瘫痪进展方面是可靠的，但在反映中枢神经系统炎症发作后恢复程度方面敏感性较低。例如，在EAE评分中，行走困难的小鼠和虽能轻松行走但存在足部抓握无力的小鼠均被评分为2分。即使炎症反应已经消退，由于存在永久性的轴突损伤或丢失，在EAE的急性后期评分仍可能保持较高水平9。已有多种尝试开发更精细的评分系统、行为学测试、后肢力量和抓握力测量方法以及红外监测系统&#160;，以更准确地捕捉EAE中临床缺陷的差异9,16,17,18；然而，这些更复杂的评分方法仍无法区分炎症与组织损伤对潜在神经功能缺陷的各自贡献。因此，评估EAE严重程度的金标准方法是同时进行临床评分和组织病理学评分。
本文介绍了一种对小鼠脊髓和脑组织进行解剖并包埋于石蜡中的实验方案，该方法能够捕捉实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）中病灶形成的随机过程。同时提供了一种使用Luxol快蓝（Luxol fast blue, LFB）对切片进行染色的方案，该染色法最初由Kluver和Barrera19建立，可用于检测中枢神经系统（CNS）中的髓鞘。切片可单独使用LFB染色（用于脱髓鞘分析），或联合苏木精和伊红（H&amp;#38;E）进行复染，以帮助观察和评分炎性病灶。此外，本文还提供了利用 commercially available 抗体、免疫组织化学（IHC）技术以及公开可获取的软件，对脊髓中总白细胞（CD45）、髓鞘丢失程度以及受损轴突数量（SMI-32）进行定量分析的实验流程。用于定量脊髓中白细胞的方案同样适用于脑组织中白细胞的定量分析。
脑部轴突丢失与损伤的组织学评估相较于脊髓更为困难，因为脑内白质纤维束并非彼此平行排列。血清神经丝轻链（sNF-L）的检测已成为一种有前景的生物标志物&#160;多发性硬化症中的神经元损伤20,21近期研究已将该技术拓展应用于EAE。22,23,24本文介绍了一种利用单分子免疫阵列分析法（SIMOA）在活体小鼠中检测血清神经丝轻链（sNF-L）的方法。该方法仅需少量血清样本，可在半日内完成活体小鼠的检测，从而快速评估待测疗法对中枢神经系统（CNS）损伤的整体影响。文中所述所有方法均适用于任何性别和品系的小鼠。

<table><tbody><tr><td>10% 中性缓冲福尔马林</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td>用于固定脊髓和脑组织标本</td></tr><tr><td>1000 mL 玻璃烧杯</td><td>Pyrex</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon 管</td><td>Starstedt</td><td>62.554.100</td><td>用于脊髓和脑组织的固定与储存</td></tr><tr><td>250 mL 锥形瓶</td><td>Pyrex</td><td>4980</td><td></td></tr><tr><td>500 mL 玻璃烧杯</td><td>Pyrex</td><td>1003</td><td></td></tr><tr><td>92 mm × 16 mm 培养皿</td><td>Starstedt</td><td>82-1473-001</td><td>用于组织大体检查步骤</td></tr><tr><td>95% 乙醇</td><td>Commercial Alcohols</td><td>P016EA95</td><td>用于脱水和再水化步骤</td></tr><tr><td>ABC Elite 试剂盒</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK6100</td><td>用于免疫组织化学标记</td></tr><tr><td>Aqua Hold 2 防扩散笔</td><td>Cole Parmer</td><td>UZ-75955-53</td><td>用于免疫组织化学染色中在组织切片周围画圈</td></tr><tr><td>亲和素/生物素封闭试剂盒</td><td>Vector Laboratories</td><td>SP-2001</td><td></td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>生物素化兔抗大鼠 IgG</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-4000</td><td>用于 CD45 染色</td></tr><tr><td>C57BL/6J 小鼠</td><td>Jackson Laboratory</td><td>Stock # 664</td><td>本研究中所展示实验使用的小鼠品系</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Sorvall ST Plus</td><td></td></tr><tr><td>CitriSolv</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-121</td><td>用于脱蜡，是二甲苯的替代品</td></tr><tr><td>DAB 试剂盒</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td>用于免疫组织化学显色</td></tr><tr><td>ddH₂O</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>一次性手术刀</td><td>Magna</td><td>M92-10</td><td>用于脊髓和脑组织的大体检查</td></tr><tr><td>DWK Life Sciences（Wheaton）玻璃染色缸</td><td>Cole Parmer</td><td>UZ-48585-60</td><td>用于组织化学染色和洗涤</td></tr><tr><td>DWK Life Sciences（Wheaton）玻璃染色架</td><td>Cole Parmer</td><td>10061392</td><td>用于免疫组织化学和组织化学</td></tr><tr><td>伊红 Y</td><td>Bioshop</td><td>173772-87-1</td><td>用于细胞质染色</td></tr><tr><td>Feather 切片机刀片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-634-1C</td><td>用于石蜡切片</td></tr><tr><td>滤纸</td><td>Whatman</td><td>1001110</td><td>用于过滤福尔马林（在大体检查过程中）和Luxol快蓝染液</td></tr><tr><td>精细外科剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14160-10</td><td>用于剪开脑组织和颅骨</td></tr><tr><td>通风橱</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco DPBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>14190944</td><td></td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>BioShop</td><td>ACE333.4</td><td>用于Luxol快蓝染色步骤</td></tr><tr><td>Histoplex 组织学容器</td><td>Starplex Scientific</td><td>565-060-26</td><td>用于脊髓和脑组织的固定</td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>Fisher Chemicals</td><td>H325-500</td><td>用于去除组织中的内源性过氧化物酶</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>Kimtech Science Kimwipes 纸巾</td><td>Kimberly Clark Professional</td><td>34155</td><td>用于免疫组织化学</td></tr><tr><td>镜头纸</td><td>VWR</td><td>52846-001</td><td>用于在处理过程中将脊髓组织固定在包埋盒内</td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>碳酸锂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>554-13-3</td><td>Luxol快蓝染色后的褪蓝步骤</td></tr><tr><td>Luxol蓝</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1328-51-4</td><td>用于中枢神经系统髓鞘染色</td></tr><tr><td>M.O.M 免疫检测试剂盒</td><td>Vector Laboratories</td><td>BMK-2202</td><td>用于SMI-32染色</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A454.2</td><td>用于固定</td></tr><tr><td>Mayer's 苏木精</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>26381-02</td><td>用于细胞核染色</td></tr><tr><td>带齿微型Adson镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td>用于解剖过程中翻起颅骨</td></tr><tr><td>微量离心机&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>Model 5417R</td><td></td></tr><tr><td>Microvette 毛细管 CB 300 Z</td><td>Starstedt</td><td>16.440.100</td><td>用于血液采集</td></tr><tr><td>显微镜盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12545A</td><td>用于封片</td></tr><tr><td>小型摇床</td><td>VWR</td><td>12620-938</td><td>用于配制缓冲液</td></tr><tr><td>NF 光检测试剂盒</td><td>Quanterix</td><td>103186</td><td>可用于检测小鼠或人血清中的可溶性神经丝蛋白</td></tr><tr><td>丁腈手套</td><td>VWR</td><td>76307-462</td><td>安全防护</td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000</td><td>封闭试剂</td></tr><tr><td>正常兔血清</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-5000</td><td>封闭试剂</td></tr><tr><td>OmniSette 组织包埋盒</td><td>Fisher Scientific</td><td>M4935FS</td><td>用于脊髓和脑组织的包埋</td></tr><tr><td>p1000 移液器及吸头</td><td>various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p200 移液器及吸头</td><td>various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>石蜡包埋工作站</td><td>Leica Biosystems</td><td>Model EG1160</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast 组织浸润/包埋介质</td><td>Leica Biosystems</td><td>39601006</td><td>用于脊髓和脑组织的包埋</td></tr><tr><td>Permount 封片介质</td><td>Fisher Chemicals</td><td>SP15-100</td><td>用于将盖玻片封固在载玻片上</td></tr><tr><td>pH 计</td><td>Fisher Scientific</td><td>13636AB315B</td><td>用于调节缓冲液的 pH 值</td></tr><tr><td>塑料移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-20</td><td>用于调节缓冲液的 pH 值</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>BioShop</td><td>7447-40-7</td><td>用于配制 PBS</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>BioShop</td><td>7778-77-0</td><td>用于配制 PBS</td></tr><tr><td>高压锅</td><td>Nordic Ware</td><td>Tender Cooker</td><td></td></tr><tr><td>纯化大鼠抗小鼠 CD45</td><td>Vector Laboratories</td><td>553076</td><td>用于检测白细胞</td></tr><tr><td>试剂级酒精 100%</td><td>VWR</td><td>89370-084</td><td>用于脱水和再水化步骤</td></tr><tr><td>试剂级酒精 70%</td><td>VWR</td><td>64-17-5</td><td>用于脱水和再水化步骤</td></tr><tr><td>旋转式切片机</td><td>Leica Biosystems</td><td>Model RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Simoa 仪器</td><td>Quanterix</td><td>HD-X</td><td></td></tr><tr><td>切片扫描仪</td><td>Zeiss</td><td>AxioScan.Z1</td><td></td></tr><tr><td>SMI-32 小鼠 IgG1 抗体</td><td>Biolegend</td><td>801701</td><td>用于检测受损的轴突</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>BioShop</td><td>7647-14-5</td><td>用于配制 PBS</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠&amp;nbsp;</td><td>Bioshop</td><td>7558-79-4</td><td>用于配制 PBS</td></tr><tr><td>标准 Adson 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11150-10</td><td>用于解剖步骤</td></tr><tr><td>Superfrost Plus 显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>用于收集组织切片</td></tr><tr><td>外科耐用剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14110-15</td><td>用于剪开脊柱、体壁和皮肤</td></tr><tr><td>组织处理机</td><td>Leica Biosystems</td><td>Model TP1020</td><td></td></tr><tr><td>三水合柠檬酸钠</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>03-04-6132</td><td>用于抗原修复</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>BioBasic</td><td>9005-64-5</td><td>用于洗涤切片</td></tr><tr><td>X-P Pierce XP-100 板封膜</td><td>Excel Scientific</td><td>12-140</td><td>用于sNF-L检测</td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Fisher Chemicals</td><td>1330-20-7</td><td>用于脱蜡和透明化切片</td></tr><tr><td>漏斗</td><td>Cole Parmer</td><td>RK-63100-64</td><td>用于在组织大体检查前过滤福尔马林</td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>Any</td><td></td><td>用于配制溶液</td></tr><tr><td>烘箱</td><td>Any</td><td></td><td>用于切片后烘烤组织切片</td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>Bemis</td><td>13-374-10</td><td>用于密封LFB染色缸</td></tr><tr><td>微波炉</td><td>Any</td><td></td><td>处理时间可能因微波炉型号而异</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td>用于配制封闭缓冲液</td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408--129</td><td>用于储存小鼠血清样本</td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Any</td><td></td><td>用于准备sNF-L检测样本</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Any</td><td></td><td>用于加热sNF-L检测中的酶底物</td></tr></tbody></table>

评估实验性自身免疫性脑脊髓炎中的中枢神经系统炎症、脱髓鞘及轴突损伤

Scoring Central Nervous System Inflammation, Demyelination, and Axon Injury in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是一种常见的基于免疫的多发性硬化症（MS）模型。该疾病可通过使用髓鞘蛋白成分与完全弗氏佐剂（CFA）对啮齿类动物进行主动免疫，或通过将经髓鞘蛋白/CFA致敏的啮齿类动物体内获得的髓鞘特异性效应T细胞转移至未致敏的受体动物体内而诱导产生。EAE的严重程度通常采用5分制临床评分标准进行评估，该标准用于衡量上升性瘫痪的程度，但此评分系统在评估EAE恢复程度方面并不理想。例如，在某些EAE模型（如髓鞘少突胶质细胞糖蛋白[MOG]多肽诱导的EAE模型）中，尽管炎症已经消退，临床评分仍可能维持在较高水平。因此，有必要将临床评分与组织学评分相结合，后者还可用于研究中枢神经系统（CNS）内细胞损伤的潜在机制。
本文介绍了一种简单的实验方案，用于制备和染色小鼠的脊髓和脑组织切片，并对脊髓中的炎症、脱髓鞘及轴突损伤进行评分。该用于评估脊髓白细胞浸润的方法也可应用于实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型中脑部炎症的评分。此外，还描述了一种利用小分子检测法（SIMOA）测定小鼠血清中可溶性神经丝轻链（sNF-L）的方案，该指标可&#160;反映活体小鼠中枢神经系统总体损伤的程度。

图3 显示具有代表性的免疫组化和组织化学染色结果，包括急性（左）和较陈旧（右）的EAE病灶。代表性CD45染色以苏木精复染的结果如图所示 图 3A，B.  图3C–F 显示LFB染色的示例，包含（图 3C，D）或不包含（图3E，F) H&amp;E 复染。尽管苏木精对免疫细胞无特异性，但免疫细胞的细胞核染色较深，可与中枢神经系统固有细胞相区分。 图3G，H 显示 SMI-32 的代表性染色结果+ 轴突，用苏木精复染。注意在较老的EAE病灶中该染色的着色增强。
在活动性小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）中，有髓神经纤维束的损伤最常发生在脊髓，这是该疾病导致瘫痪的主要原因7,9。因此，在组织学分析中，优先评估脊髓中炎症和组织损伤的存在情况。EAE病灶在脊髓的不同区域（前部、侧部或背侧）（图2A、B）以及不同节段（骶段、腰段、胸段、颈段）随机出现。所描述的包埋方法可确保对整个脊髓中的病灶进行良好取样。包埋的切片数量多于实际分析的数量，因为部分切片可能在处理或切片过程中受损。为确保具有代表性的取样，每只小鼠的脊髓颈段、胸段和腰段各至少分析3个代表性切片。所有样本的身份信息均设为盲法，以确保分析人员在选择代表性切片时不受偏倚影响。
为了快速了解EAE组织学严重程度的差异，可对选定切面的脊髓象限中是否存在软脑膜下脱髓鞘病变进行评分（图2A、B）。这是一种快速的方法，可在扫描图像或光学显微镜下完成。当一组小鼠EAE严重而另一组较轻时，该分析方法足以检测出不同组间EAE组织学严重程度的差异。例如，在 图4 所示实验中，使用MOG p35-55/CFA联合PTX在雌性野生型（WT）小鼠和OGR1基因敲除（OGR1 KO）小鼠中诱导EAE。WT组小鼠出现严重EAE并完全瘫痪，而OGR1基因敲除组则表现为轻度疾病。这种临床评分的差异与存在软脑膜下病变的象限比例差异相对应（图4C）。
在评估脱髓鞘病灶时，结合髓鞘染色的百分面积分数进行评分至关重要，以全面反映自身免疫攻击过程中髓鞘和/或有髓轴突的丢失程度。图4中的示例显示，OGR1小鼠与野生型（WT）小鼠之间的髓鞘百分比面积分数也存在显著差异（图4D）。此外，髓鞘百分比面积分数与患EAE小鼠的累积EAE评分呈显著相关性（图4E），因此可作为评估该疾病整体组织损伤的良好指标。需要注意的是，本方案无法区分髓鞘染色的强度。若需获取染色强度信息，应针对髓鞘蛋白（如蛋白脂质蛋白或髓鞘碱性蛋白）进行免疫荧光染色，并定量分析其染色强度。
如果对照组中EAE病情均较为严重，则脊髓四分之一区域中含有炎性/脱髓鞘病变的比例会更高。此时，对炎症进行评分的一种更敏感方法是计数CD45+细胞的数量+ 每立方毫米白细胞数2 白质（参见代表性染色图 图3A）。此处描述的CD45抗体克隆可检测所有浸润性白细胞，仅偶尔染色在EAE中上调CD45表达的少量小胶质细胞（见空心箭头） 图3B因此可用于有效捕获外周免疫细胞的浸润。
在长期EAE研究（>20天）中，建议同时进行轴突损伤分析。脊髓切片中的SMI-32染色是一种检测受损轴突的敏感方法。尽管脊髓中的炎症会随时间减轻，且幸存的轴突可重新髓鞘化，但存活的轴突仍表现出不同程度的残留损伤9（图3G、H）。例如，在C57BL6/J小鼠的MOG p35-55诱导EAE模型中，轴突损伤和丢失的程度是炎症过程消退后决定临床评分的关键因素9。图5展示了一项EAE实验的结果示例，该实验比较了野生型（WT）小鼠与骨髓细胞系中缺乏一种称为过氧化物酶体增殖物激活受体-δ（PPAR-δ）基因的小鼠（LysMCre: Ppardfl/fl）在雄性和雌性中的表现。在雄性小鼠中，WT组恢复了后肢功能，但LysMCre: Ppardfl/fl组雄性小鼠的临床评分仍保持较高水平。相比之下，在雌性小鼠的实验中，两个实验组在整个观察期间均表现出高评分。初看之下，这一结果提示PPAR-δ在EAE中具有性别特异性作用；然而，脊髓的病理学评分显示，无论雄性还是雌性，LysMCre: Ppardfl/fl组小鼠的轴突损伤均较相应的WT小鼠更为严重（图5B）。在雌性小鼠中未观察到基因型对临床评分的显著影响，可能是因为WT雌性小鼠本身倾向于出现更严重的轴突损伤，从而导致慢性神经功能缺损。
在同一实验中，雌性 LysMCrePpardfl/fl 雌性小鼠的小脑中发现更广泛的T细胞浸润，这为脑部炎症评分在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）中的应用提供了实例。在EAE中，脑部炎症主要出现在小脑和脑干图6A，D，G），但也可能存在于脑膜中（在海马体下方可见） 图6C），靠近脑室（图6F），以及其他白质纤维束，包括视神经和胼胝体（图6B，E）。通过计数每平方毫米特定脑区（如小脑白质）内的CD45阳性细胞数量，对脑部炎症进行评分。2 使用与脊髓方案中所述相同的方法对组织区域进行取材。在此处概述的取材方法中，于小脑中部进行切割，从而获得如图所示的小脑与脑干的观视角度。 图6A.
使用SIMOA检测方法测量sNF-L已成为评估复发缓解型多发性硬化症（MS）中持续性轴突损伤及治疗反应的有用生物标志物20,21,27,28。用于检测人类sNF-L的同一SIMOA检测试剂盒也可用于测量小鼠sNFL22,23,24。为了探究该检测方法在EAE模型中检测轴突损伤的效果，在EAE实验终点检测了雌性C57BL6/J小鼠的sNF-L水平，并与无EAE的同性别健康对照小鼠进行比较。结果发现，EAE小鼠的sNF-L水平显著高于健康小鼠（图7A），且这些水平与脊髓中SMI-32+轴突的密度呈相关性（图7B）。与组织学评分法评估轴突损伤相比，SIMOA检测更快捷（从小鼠采血到获得结果仅需略超过半天时间），因此可快速反馈治疗在活体小鼠中的效果。该检测方法的另一优势在于其能够反映脊髓和大脑中的轴突损伤情况。
<img alt="染色组织切片的组织学切片；显微镜分析；组织研究制备。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65738/65738fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：脑和脊髓切片的代表性石蜡包埋块。5个冠状脑切片和脊髓横切片（厚度1.5–2 mm）包埋于同一蜡块中，以便一次性切片。应至少包埋15个脊髓切片，以确保有足够数量的切片可供分析时选择。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65738/65738fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="组织学分析、脊髓横切面、染色细胞结构示意图、研究研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65738/65738fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：胸段脊髓水平的脑膜炎症评分及髓鞘面积百分比。（A,B）显示了MOG p35-55诱导的EAE雌性C57BL6/J小鼠胸段脊髓的图像，经LFB/H&amp;E染色。图中展示了用于观察四个象限的方法以及脱髓鞘病灶的示例（以虚线勾画）。A图中的小鼠四个象限均存在融合性脱髓鞘病灶（4/4），而B图中的小鼠仅一个象限受累（1/4）。B图中的小鼠其他象限虽存在一定程度的炎症，但尚未形成融合性病灶，因此不予计分。（C–E）LFB图像在ImageJ中转换为灰度图及阈值化处理图像的示例。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65738/65738fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="脊髓组织的组织学分析；CD45、LFB/伊红、SMI-32 染色；显微图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65738/65738fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：脊髓切片经 CD45、LFB H&amp;E、LFB 及 SMI-32 染色。显示脊髓中早期（A,C,E,G）和晚期（B,D,F,H）软膜下病灶的示例，分别使用 CD45 抗体（A,B）、LFB/H&amp;E（C,D）、单独 LFB（E,F）以及 SMI-32 抗体（G,H）进行染色。黑色箭头指示各相应抗体染色细胞的示例。白色箭头指示被染成 CD45+ 的小胶质细胞样细胞。比例尺 = 50 µm。该图展示了雌性 C57BL6/J 小鼠在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）期间脊髓病灶的代表性染色结果，并突显了不同脊髓节段病理表现的差异。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65738/65738fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="多发性硬化症研究图表与结果；脱髓鞘分析、临床评分、显微镜检查。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65738/65738fig04v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：EAE中病灶评分与脱髓鞘百分比的应用。 图示为一项EAE实验示例，其中在C57BL6/J遗传背景下缺乏卵巢癌G蛋白偶联受体1（OGR1）基因的雌性小鼠，其临床EAE严重程度低于野生型（WT）C57BL6/J雌性小鼠。通过MOG p35-55/CFA联合PTX免疫诱导EAE，并按以下临床评分标准进行评分：1 = 尾巴麻痹；2 = 后肢和足部无力；3 = 后肢麻痹；4 = 前肢无力；5 = 濒死状态。（A）随时间变化的小鼠平均临床评分±标准误（SEM）。（B）示腰髓腹侧LFB/H&amp;E染色示例。比例尺 = 50 µm。（C）包含脱髓鞘病灶的象限百分比的平均值±SEM。（D）各组脱髓鞘百分比的平均值±SEM。（E）显示了另一项在C57BL6/J小鼠中由MOG p35-55诱导的EAE实验结果，其中每只小鼠的EAE评分在30天观察期内累计，并与脊髓中的脱髓鞘百分比进行相关性分析。相关性分析采用Spearman检验。图（A–D）改编自Souza C等人的研究29。图（E）数据为原始数据。*P&lt;0.05，**P&lt;0.01，***P&lt;0.001。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65738/65738fig04largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="临床评分和炎症柱状图；Ppard^fl/fl 与 LysM^cre:Ppard^fl/fl；雄性/雌性分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65738/65738fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：应用 SMI-32 染色以理解基因型对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）临床表型的影响。该图展示了一项 EAE 实验的示例，其中在 C57BL6/J 背景下的雄性和雌性野生型（携带 Ppard 基因的 floxed 等位基因）与髓系特异性 Ppard 突变小鼠（LysMCre: Ppardfl/fl）被 MOG p35-55/CFA 和 PTX 免疫，并持续观察 45 天。（A）显示小鼠的平均临床评分及其标准误（SEM）。（B）显示脊髓中 SMI-32+ 轴突数量、软脑膜下病变所占象限百分比、血管周围套袖现象所占象限百分比以及小脑组织每 mm2 内 CD3 阳性病灶数量的组织学评分结果（均值 ± SEM）。该实验表明基因型对 SMI-32 染色结果具有影响。本图改编自 Drohomyrecky 等人.15。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65738/65738fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示脑区的神经解剖图：视神经、海马、脑干、小脑。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65738/65738fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：雌性C57BL6/J小鼠中由MOG p35-55诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）脑冠状切片中CD45+/苏木精染色的示例。CD45+病灶呈棕色。 （A）冠状切片中脑干内的CD45+ 病灶。比例尺 = 150 μm。（B–G）CD45+ 病灶在视神经（B）、海马下方的脑膜延伸区域（C）、脑干（D）、胼胝体（E）、靠近脑室的内侧缰核（F）以及小脑（G）中的示例。比例尺：（B–G） = 50 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65738/65738fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="血清神经丝轻链水平分析与轴突计数的相关性，p值为0.044。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65738/65738fig07v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图7"> 
图7：MOG p35-55诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠血清中sNF-L水平。（A）在一项实验的终点采集雌性对照组和EAE小鼠的血清样本，检测神经丝轻链（NFL）水平。数据采用双尾Mann-Whitney检验进行分析。（****p 值 &lt; 0.0001）。（B）在实验终点获取脊髓组织切片，并使用SMI-32抗体染色。测定每单位白质组织区域内阳性细胞数量，并通过Spearman检验分析其与终点血清NF-L水平的相关性。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65738/65738fig07largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充表1：组织处理中所用浸液的说明。 使用自动处理仪可将包埋盒自动移入这些系列浸液中。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65738/JOVESupplementaryTable1.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表2：Luxol快蓝与苏木精-伊红染色步骤。 本表列出了Luxol快蓝与苏木精-伊红染色方案的操作顺序。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65738/JOVESupplementaryTable2.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表3：用于免疫组织化学染色的抗体。 本文描述了本方案中所使用的抗体，以及可用于进一步研究炎症、小胶质细胞活化和星形胶质细胞活化的其他抗体。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65738/SupplementaryJOVETable3_Revised(1).zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表4：如何将.czi文件转换为TIFF文件。 请注意，最好使用高分辨率图像，但如果计算机的工作内存有限，也可以保存中等分辨率的图像。在分析过程中必须使用相同分辨率的图像。此外，请注意该序列中的最后一张图像是载玻片标签，应避免读取标签内容，以确保分析过程处于盲态。30,31 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65738/SupplementaryJOVETable4.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件</a>

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是多发性硬化症的动物模型。本文介绍了一种对EAE小鼠脊髓中的炎症、脱髓鞘和轴突损伤进行评分的方法。此外，还提供了一种定量检测小鼠血清中可溶性神经丝轻链水平的方法，有助于在活体小鼠中评估轴突损伤。

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是一种常见的基于免疫的多发性硬化症（MS）模型。该疾病可通过在啮齿类动物中诱导产生……

我们致力于研究自身免疫以及多发性硬化症（MS）是如何发生的。本研究采用多种方法，探讨与MS相关的风险因素如何导致自身免疫的发生。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是一种可用于研究各种风险因素对自身免疫影响的MS小鼠模型。我们最近发现了肥胖这一多发性硬化症风险因素在小鼠中导致自身免疫性炎症加剧的生物学通路。在EAE模型中的研究对于揭示这些机制至关重要。EAE疾病的严重程度通常采用五分制临床评分系统进行评估，然而该量表的敏感性有限，且无法区分临床缺陷是由炎症还是组织损伤所引起。脊髓和脑组织的组织学检查是评估实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）中炎症和组织损伤的金标准方法。本方案提供了一种简单的方法，用于测量EAE期间脊髓和脑组织中的炎症及组织损伤。我们的方案可与临床评分联合使用，以更全面地表征EAE的严重程度。本方案检测EAE的关键组织病理学特征，包括免疫细胞浸润、脱髓鞘、脊髓中的轴突损伤以及脑部炎症。此外，还包括检测小鼠血清中的神经丝轻链（neurofilament light），该指标可反映中枢神经系统损伤的程度。该综合方案相较于仅使用单一标记物，可对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）进行更详细的表征。首先，用镊子夹住已处死小鼠头部顶端的皮肤，然后用手术剪做一个2.5厘米的切口。用手指将头部皮肤向两侧推开，以暴露下方的颅骨。然后，使用标准的Adson镊子夹住眼眶以固定头部。用精细剪刀从颈椎到嗅球沿中线在颅骨上进行小段剪切。使用带齿的Adson镊子将打开的颅骨向外翻折，以暴露下方的大脑。用非惯用手固定脑组织。将惯用手持闭合的剪刀，从颈椎处取出脊髓，并轻柔地将脑组织从颅骨中推出，同时剪断脑神经。将脑组织置于含有10毫升10%中性缓冲福尔马林的锥形管中。接下来，沿小鼠躯干中线从颈部至尾部切开毛皮。用手指将皮肤向两侧推开，以暴露脊柱。使用手术剪在股骨与髋部连接处沿脊柱向下剪开，然后从髋部向颈部方向分别剪开脊柱两侧的体壁。将含有脊髓的脊柱放入盛有脑组织和甲醛的同一管中。首先，用剪刀剪取一小片滤纸，放入培养皿中。接着，将含有经固定的小鼠脑组织和脊柱的甲醛溶液倒入铺有滤纸的漏斗中。将脑和脊髓转移至一个空的培养皿中。使用解剖刀将脑组织切成六个冠状切片。用镊子将脑组织样本转移至培养皿中滤纸的一侧。使用手术刀将脊髓切成三段，然后在尾端处切割骶椎段，直至脊髓暴露可见。用非惯用手提起胸椎段。惯用手持带齿Adson镊子，将镊尖闭合，轻轻以扭转动作将其末端推入脊柱较小的开口中。接着，使用镊子轻轻将暴露的脊髓从椎管中取出，将脊髓组织置于含有滤纸的培养皿中。用手术刀将三段脊髓切成更小的横截面组织块。将这些组织块放置在含有脑组织块的滤纸同一侧。折叠滤纸以包裹组织块，并将其放入已标记的包埋盒中。将包埋盒转移至含有福尔马林的标本瓶内。孵育后，将包埋盒从标本容器中转移至自动组织处理机的第一个福尔马林浴中，并运行过夜。次日，从组织处理机中取出包埋盒，转移至石蜡包埋工作站的温热保存室。倒入石蜡，使其覆盖模具底部。使用精细镊子将脑部冠状切片和脊髓横切片放入模具底部的石蜡中。将模具转移至冷却台面数秒钟，以固定脑组织和标本。再将模具移回加热台面，用热石蜡注满模具至顶部。将标有样本编号的盒盖放置在模具上。在盒盖上方倒入石蜡。将模具转移至冷却站，使石蜡凝固。待蜡块完全冷却后，将其固定于旋转式切片机上。修整蜡块，并对每个石蜡包埋块切取5 µm厚的切片。将石蜡切片条转移至42 °C的水浴中。 将切片从水浴中收集到标记好的载玻片上。将载玻片放入塑料载玻片架中，在37摄氏度的干燥烘箱中过夜烘烤。扫描后，打开Image J软件，然后将切片的TIFF图像拖放到软件中进行分析。将脊髓切片分为四个象限进行观察，并对每个象限内是否存在脱髓鞘病变进行评分。该切片评分为4分，因为四个象限均存在病变。该切片评分为1分，因为病变仅出现在一个象限。CD45 染色表明病灶中存在白细胞。与陈旧病灶相比，新发病灶含有更多的 CD45 阳性细胞。相反，新发病灶中的 SMI-32 阳性轴突数量可能少于陈旧病灶。野生型组小鼠出现严重EAE症状并完全瘫痪，而OGR1基因敲除组小鼠仅出现轻微疾病。这种临床评分的差异与脊髓中软脑膜下脱髓鞘病变及髓鞘染色面积百分比的变化相对应。此外，OGR1基因敲除小鼠与野生型小鼠之间的髓鞘分数百分比也存在显著差异，并且与累积EAE评分呈相关性。在EAE中，脑部的炎症主要局限于小脑和脑干。脑部其他区域也可能出现炎症，包括脑膜、脑室周围以及视神经和胼胝体等其他白质束。通过小分子阵列检测法测定的血清神经丝轻链显示，与健康小鼠相比，EAE小鼠的血清神经丝轻链水平升高，且这些升高的水平与脊髓中SMI-32阳性神经纤维的密度相关。

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科研

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免疫学与感染

对实验性自身免疫性脑脊髓炎中的中枢神经系统炎症、脱髓鞘和轴突损伤进行评分

本视频展示了多发性硬化动物模型——DA大鼠慢性复发性实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导方法及临床评分。该疾病通过用包含全鼠脊髓组织与完全弗氏佐剂的乳剂免疫大鼠而诱导，其临床表现与人类疾病相似。...

慢性复发性实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导与临床评分

本视频演示了通过注射髓鞘来源的多肽并联合佐剂以激活自身反应性T细胞来诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的方法。这些T细胞会迁移至脑部。同时给予百日咳毒素以增加血脑屏障的通透性，使这些T细胞及其他免疫细胞得以进入脑组织。这些免疫细胞引发脱髓鞘，导致神经传导受损，从而诱发EAE。...

小鼠模型中实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导

在本视频中，采用实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）建立小鼠多发性硬化模型。将含有神经元肽和佐剂的乳剂注射至小鼠体内，引发免疫反应，激活自身反应性T细胞。随后注射百日咳毒素（PTX）以增加血脑屏障通透性，使自身反应性T细胞得以浸润脑组织。此类浸润启动信号级联反应，最终导致髓鞘损伤，模拟多发性硬化症的脱髓鞘病变状态。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是多发性硬化症的一种成熟动物模型。通过用髓鞘寡突胶质细胞糖蛋白肽35-55（MOG35-55）免疫C57BL/6小鼠，可诱导中枢神经系统中自身反应性免疫细胞引发的上行性弛缓性瘫痪。本文将讨论疾病诱导与监测的相关方案。...

髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG35-55）诱导的C57BL/6小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）

本文描述了实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型的诱导与评分方法，以及在疾病不同阶段，通过流式细胞术和定量PCR分别检测淋巴结、脾脏、血液和脊髓中免疫细胞分布和mRNA细胞因子水平的评估方法。...

小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导及疾病依赖性免疫细胞在不同组织中分布的评估

本文介绍了在体内实验性自身免疫性脑脊髓炎过程中研究神经血管单元功能障碍的实验方案。我们重点阐述了如何测定血脑屏障通透性以及与白细胞穿越胶质界膜相关的明胶酶活性。...

在体内可视化实验性自身免疫性脑脊髓炎期间神经血管单元内皮和胶质屏障的损伤

本文提供了一种在小鼠中诱导主动实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的实验方案。同时介绍了一种分离和表征中枢神经系统（CNS）中浸润性淋巴细胞的方法，以展示淋巴细胞在CNS自身免疫性疾病发生过程中的作用。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎期间中枢神经系统淋巴细胞浸润的流式细胞术分析

本实验方案描述了在小鼠模型中使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎，并通过临床评分系统监测疾病进程。通过小鼠股骨显微计算机断层扫描分析和开放旷场实验，对实验性自身免疫性脑脊髓炎相关症状进行全面评估，以系统分析疾病发展过程。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导及多种评估指标

迄今为止，尚无能够从同一只小鼠中同时分离出所有主要中枢神经系统常驻细胞类型的实验方案。本方案适用于正常小鼠及实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠，可用于研究神经炎症期间复杂的细胞网络，同时减少所需实验小鼠的数量。...

从成年自身免疫性脑脊髓炎小鼠中同时分离主要的中枢神经系统常驻细胞类型

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是一种多发性硬化症（MS）的动物模型，与人类疾病相似，均具有强烈的体液自身免疫反应。本文报道一种简单且灵活的ELISA实验方案，用于定量检测EAE免疫小鼠血清中的自身抗体。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型中自身反应性抗体的定量分析

学习实验性自身免疫性脑脊髓炎模型中脊髓炎症、脱髓鞘和轴突损伤的组织学评分方法。该方案通过量化神经丝轻链水平评估中枢神经系统损伤，为研究多发性硬化症病理机制提供更敏感的评估手段。

评估实验性自身免疫性脑脊髓炎中的中枢神经系统炎症、脱髓鞘及轴突损伤

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