从二维（2D）单层培养到三维（3D）多细胞共培养：构建适用于多种应用的皮肤模型

我们的挑战是在化妆品或医学应用之前测试成分的细胞毒性。商业化的3D皮肤模型仅包含约几种游离的细胞类型，无法反映真实皮肤的复杂性，而皮肤具有多种具有重要功能的细胞类型，这给准确评估成分的影响带来了困难。我们的研究结果表明，与常用方法相比，限制细胞黏附法能够生成形态更佳的球状结构。

此外，该方法所需操作更少，可确保更高的球体稳定性。在我们的皮肤等效模型中，最多使用四种皮肤细胞，而通常商业模型最多仅包含三种细胞类型。常见的二维细胞模型在模拟真实相互作用方面准确性不足，而尽管商业化的三维皮肤等效模型能提供更好的组织代表性，但其成本限制了广泛使用。

因此，我们自主建立的模型能够在更接近真实情况的平台上进行初步的低成本实验。我们的实验方案概述了经济、简便的方法，用于构建定制化的三维皮肤模型，包括球状模型和等效模型。与商业化的模型相比，我们的模型在外观和组成上具有可调节性，可根据研究需求进行个性化定制。这些方法易于实施，无需特殊技能或设备，即使是初学者研究人员也能轻松重复操作。

我们的目标是突出构建各种三维细胞模型的简便性。在强调认证商用模型在研究中的价值的同时，我们着重指出使用球体等逼真模型的重要性，展示自制模型如何在采用认证模型之前帮助预先筛选测试条件。首先，从含有角质形成细胞、成纤维细胞和黑色素细胞的培养瓶中移除相应的培养基。

用 5 至 10 毫升 PBS 轻柔洗涤细胞。根据培养瓶的大小，加入 0.5 至 2 毫升胰蛋白酶-EDTA 溶液。将培养瓶置于 37°C 条件下孵育。

使用显微镜观察并控制细胞从表面的脱落。将脱落的细胞悬浮于两倍体积的胰蛋白酶中和液中以灭活胰蛋白酶，然后将悬液转移至15毫升离心管中。接着，用移液器吸取约20微升的皮肤细胞悬液至1.5毫升离心管中。

借助血细胞计数板对细胞进行计数。随后，在室温下以 300 G 离心 5 分钟。然后吸去大部分上清液，并将细胞沉淀用剩余液体中的少量液体重新悬浮。

向重悬的细胞中加入等体积的新鲜培养基。在另一个15毫升离心管中，制备细胞悬液。当角质形成细胞、黑素细胞、成纤维细胞和肥大细胞在各自相应的培养基中培养时，均呈现其典型的形态。

开始悬滴法时，用移液器吸取20微升预先配制好的皮肤细胞悬液，滴加到培养皿盖上。然后用培养皿的底部盖住皿盖，并轻轻翻转，以形成悬滴。向培养皿中加入无菌水，防止完全培养基在液滴中蒸发。

将液滴在 37 摄氏度条件下孵育 48 至 72 小时。接着，用完全培养基填充新培养板的各孔。使用无菌剪切过的移液器吸头，将细胞球转移至多孔板的孔中。

将转移后的细胞球在37摄氏度条件下于多孔板中孵育一天，然后进行实验。对于限制性细胞黏附法，首先向U型底板的每孔中加入100 µL含1%表面活性剂的PBS溶液。接着，将含有该溶液的培养板在37摄氏度孵育24小时。

现在准备细胞悬液并调整至所需细胞密度。将表面活性剂从孔中移取至溶液中，然后向每孔接种50微升细胞悬液。最后，在37°C条件下孵育培养板24小时，以形成细胞聚集体。

由 10,000 个细胞组成的球体更容易操作，因为它们在孔板中清晰可见。较大的球体稳定性降低。不同类型的细胞会形成不同颜色的球体。

在悬滴法转移过程中，完美的球形结构容易发生形变。需要精确操作以减少变形，从而获得完整的细胞聚集体。操作不准确或经验不足会导致球体受损。

首先，在离心管中混合水、10 倍浓度的 PBS 和 1 摩尔的氢氧化钠。接着，用移液器将 500 微升适当浓度的真皮细胞溶液转移至 2 毫升离心管中。在室温下以 300 ×g 离心 3 分钟。

离心完成后，用移液器吸出上清液，并将细胞轻轻重悬于水、PBS 和氢氧化钠的混合液中。然后向混合液中加入 200 µL 胶原溶液。用移液器吹打悬浮液，使其充分混匀。

接下来，将500 µL制备好的混合物移液至24孔板的插入物中。对于无角质层的模型，将500 µL混合物直接移液至不含插入物的孔中。在室温下孵育10分钟后，将板转移至培养箱中继续孵育30分钟。

用移液器向每个孔中加入500微升PBS缓冲液，以冲洗水凝胶表面。接着，将200微升角质形成细胞悬液与等体积的黑素细胞悬液在添加了补充物的DMEM培养基中混合。然后，轻轻将总共500微升的细胞悬液移入每个孔中。

将培养板在37摄氏度下孵育2至5天。每48小时更换一次培养基，并使用光学显微镜监测细胞生长情况。由此构建出具有可区分真皮和表皮的等效三维模型，可进行实时监测。

观察到处于不同细胞生长阶段的角质形成细胞，这些是活体等效物的指标。还可观察到具有可识别颗粒的肥大细胞。