Name: 将胰腺导管腺癌重编程为多能性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: 了解将胰腺导管腺癌重编程为诱导多能干细胞的方法，用于建立稳定的iPSC细胞系。该技术有助于研究胰腺癌进展机制并发现早期诊断标志物。

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A.S 和 J.K 感谢癌症研究英国（Cancer Research UK）和俄勒冈健康与科学大学（OHSU）提供的资助（CRUK-OHSU 项目奖 C65925/A26986）。A.S 受英国医学研究理事会（MRC）职业发展奖（MR/N024028/1）支持。A.A 受沙特阿拉伯阿卜杜勒-阿齐兹国王科技城提供的博士奖学金资助（奖学金编号 1078107040）。J.K 受 MRF 新研究者资助（GCNCR1042A）以及奈特 CEDAR 资助（68182-933-000，68182-939-000）支持。我们感谢Keisuke Kaji教授慷慨提供重编程载体pSIN4-EF1a-O2S和pSIN4-CMV-K2M。为了开放获取的目的，作者已对本提交所产生的任何作者接受稿版本应用了知识共享署名（CC BY）许可。

所有实验方案均经俄勒冈健康与科学大学（OHSU）机构审查委员会批准。所有方法均按照相关指南和法规进行。涉及PDX肿瘤的动物实验均在获得OHSU机构动物使用与护理委员会（IACUC）批准后开展。本方案已在以下细胞中进行测试：来自患者来源的异种移植（PDX）模型的原代PDAC细胞、具有上皮形态的BxPc3细胞系（该细胞系分离自一名61岁女性腺癌患者的胰腺组织）、源自正常人胰腺导管上皮的H6C7永生化上皮细胞系，以及来自健康个体皮肤活检的原代人成纤维细胞。人PDAC样本取自俄勒冈胰腺组织登记研究（IRB00003609）。所有受试者均签署了知情同意书。原代人成纤维细胞由英国爱丁堡RBiomedical公司提供，其皮肤样本来自在英国爱丁堡皇家医院Little France院区接受常规手术的匿名供体，采集过程已获得供体同意并经伦理批准（编号09/MRE00/91）。所有慢病毒相关工作均在二级生物安全研究活动（GM207/16.6）条件下进行，并已获得爱丁堡大学健康与安全部门批准，同时已向苏格兰政府HSE主管机构报备。所有使用人胰腺细胞的重编程实验均在爱丁堡大学生物科学学院伦理委员会批准下进行（参考编号# asoufi-0002）。
1. 慢病毒的制备
<ol>
	<li>用于慢病毒制备时，准备高质量的包装质粒和表达质粒（无内毒素），浓度为1–2 µg/µL，包括psPAX2、pMDG34，以及两种含有RES的双顺反子载体：pSIN4-EF1a-O2S，由EF-1α启动子驱动表达OCT4和SOX2；pSIN4-CMV-K2M，在CMV增强子/启动子控制下表达KLF4和c-MYC35 （参见 材料表同时准备用作转染对照的 pWPT-GFP 质粒。</li>
	<li>解冻人胚胎肾细胞系（293T），并在GMEM培养基（Glasgow's Minimum Essential Medium）中培养，培养基中添加10%胎牛血清（FCS）、1×非必需氨基酸、1 mM丙酮酸钠和1 mM谷氨酰胺（见 材料表37 °C 和 5% CO2. 
	注意：建议使用解冻后四代以内的293T细胞。</li>
	<li>在转染前24小时，以每15 cm培养皿300万个细胞的密度接种293T细胞，共需三皿。建议在下午较晚时间（约16:00）接种细胞。</li>
	<li>次日（约16:00），当细胞融合度达到约40%–50%时，为三次转染反应准备以下试剂： 
	注意：由于移液误差，务必额外增加 10% 的体积。
	<ol>
		<li>标记三个15 mL塑料管，分别注明相应的慢病毒名称（pSIN4-EF1a-O2S、pSIN4-CMV-K2M和pwPT-GFP对照）。加入1.710 mL低血清培养基（见 材料表) 加入各管中。</li>
		<li>稀释90 µL转染试剂（参见 材料表) 加入1.710 mL低血清培养基中，涡旋混匀2秒，室温孵育5分钟。</li>
		<li>混合包装载体：psPAX2 5.1 µg 和 pMDG 2.4 µg（总计 7.5 µg）。</li>
		<li>将包装载体混合物加入转染培养基（来自步骤 1.4.2）中，涡旋振荡 2 秒。</li>
		<li>向步骤 (1.4.4) 的转染混合物中加入每种重编程载体各 7.5 µg：pSIN4-EF1a-O2S、pSIN4-CMV-K2M 以及 pwPT-GFP 对照，涡旋振荡 2 秒。 
		注意：使用表达载体与病毒载体的比例为1:1。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将转染管在室温下孵育15分钟。</li>
	<li>将步骤（1.4.5）中获得的转染-DNA 混合物逐滴加入培养基中，对 293T 细胞进行每种慢病毒的转染。轻轻晃动培养皿，确保混合物在整个表面均匀分布。</li>
	<li>将转染的细胞在37 °C、5% CO₂条件下孵育2 过夜孵育。 
	注意：使用针对病毒的废弃物容器，将废弃物放入金属垃圾桶中，用高压灭菌袋双层封装，并准备专用的病毒液体废弃物容器，加入消毒片剂。所有移液器、枪头和离心管均应丢弃至金属垃圾桶中。旧培养基应弃于病毒液体废弃物容器中。避免使用玻璃移液管和玻璃器皿，以防止病毒意外污染。</li>
	<li>转染后14-16小时，将培养基更换为30 mL新鲜的293T培养基。</li>
	<li>将转染的细胞在37 °C、5% CO₂条件下孵育2 在换液后培养60-72小时。每天观察细胞，并通过GFP荧光检测转染效率。 
	注意：理想情况下，转染效率应达到 &#62;通过GFP检测，转染效率应达到90%。对于其他病毒，应观察293T细胞明显的形态学变化，因为细胞在产生病毒颗粒时会趋于变圆。</li>
	<li>将每次病毒转染培养物的培养基收集至50 mL离心管中，于1932 x g离心，去除细胞碎片 g 4 °C 下离心 10 分钟。</li>
	<li>将每种慢病毒上清液通过0.45 µM针头滤器过滤，以去除较小的碎片，并收集至新的50 mL离心管中。</li>
	<li>将每份慢病毒上清液分装为6 mL等份，立即在液氮中速冻。</li>
	<li>将慢病毒分装样品保存于 -80 °C，直至使用前。</li>
</ol>
2. 重编程慢病毒转导
<ol>
	<li>解冻原代胰腺导管腺癌（PDAC）细胞，并在完全定义的无血清角质形成细胞培养基（KSFM）中培养，培养基中添加牛垂体提取物（BPE）、人重组表皮生长因子（EGF）（5 ng/mL）和霍乱毒素（50 ng/mL），置于37 °C、5% CO2、5% O2（低氧）的培养箱中（参见材料表）。</li>
	<li>解冻胰腺鳞状导管腺癌细胞系BxPc3，在添加10%胎牛血清（FCS）的RPMI 1640培养基中，于37 °C、5% CO2条件下培养。</li>
	<li>解冻胰腺导管上皮细胞H6C7，在添加BPE和EGF（5 ng/mL）的KSFM培养基中，于37 °C、5% CO2条件下培养。</li>
	<li>解冻人成纤维细胞（hFib），在添加10% FCS、1×非必需氨基酸、1 mM丙酮酸钠、1 mM谷氨酰胺和0.05 mM（终浓度）β-巯基乙醇的格拉斯哥最低必需培养基（GMEM）中，于37 °C、5% CO2条件下培养。</li>
	<li>在慢病毒转导前一天（建议为傍晚），准备6孔板中的两个孔，每孔分别接种100,000个PDAC、BxPc3、H6C7和hFib细胞。其中一个孔用OSKM慢病毒感染，另一孔作为未感染对照。 
	注意：每种细胞类型应使用单独的培养板。</li>
	<li>次日下午（约24小时后），确保细胞融合度至少达到70%，再进行下一步慢病毒感染操作。</li>
</ol>
3. 胰腺导管腺癌的慢病毒转导
<ol>
	<li>在37 °C病毒培养箱中解冻5 mL每种慢病毒上清液。</li>
	<li>准备两个15 mL离心管，每个管中加入2 mL预热的PDAC培养基。</li>
	<li>向第一个管中加入6&#160;mL每种重编程慢病毒（pSIN4-CMV-K2M和pSIN4-EF1a-O2S）以及12 µL的4.5 mg/mL聚凝胺（终浓度4.5 µg/mL，参见材料表），混匀。</li>
	<li>向第二个管中加入2 µL的4.5 mg/mL聚凝胺（终浓度4.5 µg/mL）。</li>
	<li>弃去每个孔中的培养基，并在室温下用PBS洗涤一次。</li>
	<li>将重编程感染液（管1）加入第一个孔中。</li>
	<li>将管2中的混合液加入第二个孔中。此孔作为未感染对照。</li>
	<li>将PDAC细胞置于37 °C、5% CO2, 和5% O2（低氧）培养箱中过夜培养。</li>
	<li>次日下午，弃去两孔中的培养基，并更换为新鲜的PDAC培养基。</li>
	<li>将细胞在37 °C、5% CO2, 和5% O2（低氧）条件下继续培养48 h。</li>
</ol>
4. BxPc3 细胞的慢病毒转导
<ol>
	<li>在37 °C病毒培养箱中解冻3 mL每种慢病毒上清液。</li>
	<li>准备两个15 mL离心管，每个管中加入2 mL BxPc3培养基。</li>
	<li>向第一个管中加入3 mL每种重编程慢病毒（pSIN4-CMV-K2M和pSIN4-EF1a-O2S）以及6 µL 4.5 mg/mL聚凝胺（终浓度4.5 µg/mL），混匀。</li>
	<li>向第二个管中加入2 µL 4.5 mg/mL聚凝胺（终浓度4.5 µg/mL）。</li>
	<li>弃去每个孔中的培养基，并用PBS洗涤一次。</li>
	<li>将重编程感染培养基（第1管）加入第一个孔中。</li>
	<li>将第2管的混合液加入第二个孔中，作为未感染对照。</li>
	<li>将感染后的BxPc3细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育过夜。</li>
	<li>次日下午，弃去两孔中的培养基，更换为新鲜的BxPc3培养基。</li>
	<li>将细胞在37 °C、5% CO2条件下继续孵育48 h。</li>
</ol>
5. 慢病毒感染 H6c7 细胞的转导
<ol>
	<li>在37 °C病毒培养箱中解冻4 mL每种慢病毒上清液。</li>
	<li>准备两个15 mL离心管，每个管中加入2 mL H6c7培养基。</li>
	<li>向第一个管中加入4 mL每种重编程慢病毒（pSIN4-CMV-K2M和pSIN4-EF1a-O2S）以及8 µL 4.5 mg/mL聚凝胺（终浓度4.5 µg/mL），混匀。</li>
	<li>向第二个管中加入2 µL 4.5 mg/mL聚凝胺（终浓度4.5 µg/mL）。</li>
	<li>弃去两个孔中的培养基，并用PBS洗涤一次。</li>
	<li>将重编程感染培养基（第1管）加入第一个孔中。</li>
	<li>将第2管的混合液加入第二个孔中，作为未感染对照组。</li>
	<li>将感染后的H6C7细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育过夜。</li>
	<li>次日下午，弃去两孔中的培养基，更换为新鲜的H6c7培养基。</li>
	<li>将细胞在37 °C、5% CO2条件下继续孵育48 h。</li>
</ol>
6. hFib 细胞的慢病毒转导
<ol>
	<li>在37 °C病毒培养箱中解冻每种慢病毒上清液各2 mL。</li>
	<li>准备两个15 mL离心管，每管加入2 mL hFib培养基。</li>
	<li>向第一管中加入每种重编程病毒各2 mL（pSIN4-CMV-K2M 和 pSIN4-EF1a-O2S），再加入4 µL 4.5 mg/mL的polybrene（终浓度为4.5 µg/mL），混匀。</li>
	<li>向第二管中加入2 µL 4.5 mg/mL的polybrene（终浓度为4.5 µg/mL），混匀。</li>
	<li>弃去每个孔中的培养基，并用PBS洗涤一次。</li>
	<li>将重编程感染液（第1管）加入第一个孔中。</li>
	<li>将第2管中的混合液加入第二个孔中，作为未感染对照组。</li>
	<li>将感染后的hFib细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育过夜。</li>
	<li>次日下午，弃去两孔中的培养基，更换为新鲜的hFib培养基。</li>
	<li>继续在37 °C、5% CO2条件下孵育细胞48小时。 
	注意：为实现高效的慢病毒转导，需谨慎滴定慢病毒用量，&#160;因为不同细胞类型的适宜用量差异较大。某些细胞类型可能需要多次转导。胰腺导管腺癌（PDAC）细胞系最多需要三次给药，而BxPc3、H6C7和hFib细胞系仅需一次给药即可完成重编程。</li>
</ol>
7. iMEF 饲养层细胞的制备
<ol>
	<li>通过将1%明胶储备液用PBS稀释，配制40 mL 0.2%明胶溶液。</li>
	<li>用2 mL 0.2%明胶溶液覆盖每个孔，对四个6孔板进行包被。</li>
	<li>将包被明胶的孔板置于37 °C、5% CO2条件下孵育至少30分钟。</li>
	<li>吸除多余的明胶溶液，并将孔板置于超净工作台中晾干。</li>
	<li>在37 °C水浴中轻轻摇动，解冻两管（每管约含400万细胞）辐照小鼠胚胎成纤维细胞（iMEFs）。 
	注意：为降低污染风险，操作时应避免水溅至管盖开口附近。用纸巾擦干管壁，并喷洒70%乙醇消毒。</li>
	<li>在组织培养超净台内，将每管解冻后的iMEFs逐滴加入含有10 mL预热hFib培养基的15 mL离心管中，并通过轻柔颠倒混匀。</li>
	<li>在室温下以309 × g离心3分钟，沉淀细胞，弃去上清液。将每管细胞沉淀重悬于12 mL hFib培养基中。</li>
	<li>每孔加入2 mL细胞悬液至明胶包被的6孔板中，通过轻轻多方向摇动孔板使细胞均匀分布。</li>
	<li>将孔板在37 °C、5% CO2条件下孵育过夜。 
	注意：重编程实验前24小时应制备新鲜的iMEF饲养层细胞板。</li>
</ol>
8. 将感染的细胞转移至iMEF饲养层
<ol>
	<li>弃去感染和未感染的PDAC、BxPc3、H6c7和hFib细胞的培养基，在室温下用PBS洗涤每个孔两次。</li>
	<li>向每孔加入0.5 mL胰蛋白酶，使细胞从培养板上解离。将PDAC细胞置于37 °C、5% CO2、5% O2（低氧）培养箱中孵育15分钟。</li>
	<li>将BxPc3细胞在37 °C和5% CO2条件下孵育5分钟。</li>
	<li>将H6c7和hFib细胞在37 °C和5% CO2条件下孵育4分钟。</li>
	<li>将每孔解离后的细胞悬液转移至相应标记为感染或未感染的15 mL离心管中。</li>
	<li>通过离心收集细胞，具体条件如下：PDAC细胞以300 × g 离心5分钟；BxPc3细胞以120 × g 离心5分钟；H6C7细胞以112 × g 离心4分钟；hFib细胞以161 × g 离心3分钟。所有离心步骤均在室温下进行。</li>
	<li>将每种细胞的沉淀重悬于1 mL相应的培养基中。</li>
	<li>用每种细胞对应的培养基对步骤7中准备的iMEF培养板进行两次洗涤，即：一块板用PDAC培养基洗涤，一块用BxPc3培养基洗涤，一块用H6C7培养基洗涤，另一块用hFib培养基洗涤。</li>
	<li>在iMEF六孔板的五个孔中，每孔接种50,000个感染细胞；在剩余的一个孔中接种50,000个未感染的对照细胞。 
	注意：可根据实验优化接种的感染细胞数量，范围为每孔1,000至50,000个细胞。</li>
	<li>将PDAC细胞在37 °C、5% CO2、5% O2（低氧）条件下过夜孵育。</li>
	<li>将BxPc3、H6C7和hFib细胞在37 °C和5% CO2条件下过夜孵育。</li>
	<li>次日，按如下方法配制重编程培养基：向400 mL改良伊格尔培养基（DMEM）中加入100 mL无血清替代物（终浓度25%）、5 mL 200 mM谷氨酰胺（终浓度1 mM）、5 mL 100倍非必需氨基酸（终浓度100 µM）和1.5 mL β-巯基乙醇（终浓度0.1 mM）。</li>
	<li>将重编程培养基分装为100 mL每份，于4 °C保存最多4周，或于-20 °C长期保存。</li>
	<li>使用前，向一份100 mL重编程培养基中加入100 µL 10 mg/mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（终浓度10 ng/mL）。</li>
	<li>将重编程培养基在37 °C水浴中预热。</li>
	<li>用预热的重编程培养基洗涤iMEF饲养层上的细胞两次。 
	向每孔加入2 mL重编程培养基。</li>
	<li>将重编程培养板转移至37 °C、5% CO2、3% O2（低氧）培养箱中。 
	注意：添加重编程培养基的当天记为重编程第1天。</li>
	<li>每天用新鲜的重编程培养基更换培养液，直至出现iPSC克隆。 
	注意：通过类似胚胎干细胞（ESC）的形态学特征识别iPSC克隆（即紧凑、边界清晰的克隆，细胞核质比高）。</li>
	<li>每日观察iPSC克隆，待形成足够数量后，以混合方式传代。 
	注意：确保iPSC克隆之间不相互接触，以免导致分化并影响其长期稳定性。</li>
	<li>为建立单克隆细胞系，先将iPSC混合群体传代约5次，然后挑选保持ESC样形态的健壮克隆。</li>
	<li>为鉴定完全重编程的iPSC克隆，可进行TRA-160活细胞染色（见材料表），并从iPSC克隆中提取RNA用于基因表达分析。</li>
</ol>
9. iPSC 克隆的传代
<ol>
	<li>在传代iPSC集落前24小时，按照步骤7所述准备足够数量的iMEF饲养层培养板。</li>
	<li>用预热的重编程培养基将iMEF饲养层培养板洗涤两次。</li>
	<li>向iMEF培养板的每孔中加入2 mL添加ROCK抑制剂（Y2）（10 µM）的重编程培养基。</li>
	<li>将iMEF培养板置于37 °C、5% CO2、3% O2的培养箱中孵育，直至使用。</li>
	<li>通过将0.5 M EDTA以1:1000比例稀释于PBS中（终浓度为0.5 mM），配制乙二胺四乙酸/磷酸盐缓冲液（EDTA/PBS）溶液。</li>
	<li>将每孔中的重编程培养基更换为0.5 mL EDTA/PBS溶液。</li>
	<li>根据细胞类型，在37 °C、5% CO2、3% O2培养箱中或室温下孵育。BxPc3和PDAC iPSC需在37 °C孵育15分钟，H6C7和hFib iPSC则需在室温孵育5分钟。</li>
	<li>在显微镜下观察iPSC细胞，直至整个集落中的细胞开始均匀地从饲养层上解离。</li>
	<li>将解离后的iPSC细胞悬液收集至15 mL离心管中，在室温下以300 × g离心5分钟。</li>
	<li>用1 mL添加Y2（10 µM）的重编程培养基重悬细胞沉淀。</li>
	<li>将每1 mL iPSC细胞悬液转移至iMEF培养板的三个孔中，接种于iMEF饲养层上。 
	注意：分种比例可能因收获的iPSC集落数量不同而有所变化。</li>
	<li>置于37 °C、5% CO2、3% O2的培养箱中孵育。</li>
</ol>
10. 使用 TRA-1-60 对 iPSC 克隆进行活体染色
<ol>
	<li>在重编程培养基中配制每孔 0.5 mL、浓度为 4 µg/mL 的 TRA-1-60 抗体。</li>
	<li>弃去重编程培养基，每孔加入 0.5 mL 抗体混合液。在 37 °C、5% CO2、3% O2 的培养箱中孵育 30 分钟。</li>
	<li>用重编程培养基洗涤细胞两次。</li>
	<li>使用 GFP 滤光片，通过细胞成像系统采集荧光图像。</li>
	<li>通过参考阴性对照通道评估图像质量。</li>
</ol>

Reprogramming PDAC and Pancreatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells

作者声明无利益冲突。

为了促进利用iPSC重编程技术研究癌症进展，目前已建立了一种用于重编程胰腺癌细胞的稳健方案。迄今为止，将癌细胞重编程为多能状态已被证明极具挑战性，仅有少数研究成功地从癌细胞中生成了iPSC32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46。其中大多数研究使用的是永生化癌细胞系而非来源于患者的原代细胞来生成iPSC系36,37,38,40,42,43,44,46。例如，曾尝试通过逆转录病毒导入OSKM因子对四种不同的肝癌细胞系进行重编程，但仅有一个细胞系成功实现了重编程41。然而，所获得的肝癌iPSC系在数次传代后即丧失了干性，表明癌细胞对OSKM介导的重编程具有高度抗性41。此前曾尝试使用慢病毒分别递送OSKM因子以重编程PDAC细胞，但仅获得一个iPSC系，且其依赖外源性OSKM表达，因此并未实现完全重编程37。另一项研究采用附加体型载体递送OSKM因子以避免基因组整合，但仅从PDAC细胞中成功获得一个iPSC克隆39。癌细胞重编程成功率有限，进一步加剧了iPSC技术在癌症研究中应用所面临的诸多挑战。
本文介绍了从两名不同患者的原发性胰腺导管腺癌（PDAC）样本以及一种已建立的PDAC细胞系（BxPc3）中生成诱导多能干细胞（iPSC）的方法。此外，还从胰腺导管上皮细胞系H6c7中成功获得了iPSC。据我们所知，这是首次成功建立来自BxPc3和H6c7的稳定iPSC细胞系的报道。按照本方案，该方法也已成功应用于来源于健康个体的原代人成纤维细胞，从而拓展了该技术在癌症研究以外领域的适用性。
该实验方案成功的关键要素之一是使用双顺反子慢病毒载体共表达OS和KM因子。这些载体包含内部核糖体进入位点2（IRES2），在一个载体中表达OCT4和SOX2，在另一个载体中表达KLF4和cMYC。多项研究显示，当使用单顺反子载体分别递送每个重编程因子时，各载体的摄取效率存在差异，从而影响OSKM因子的化学计量比和重编程效率47。使用双顺反子载体有助于缓解这一问题。此外，在慢病毒载体中使用IRES已被证明可显著提高重编程效率48。在此慢病毒系统中，OS的表达由EF1a启动子驱动，而KM的表达则受CMV启动子调控。已知CMV启动子易受DNA甲基化和组蛋白去乙酰化的高效沉默，而EF1a启动子则不易发生此类沉默49,50。因此，在重编程过程中KM因子早于OS因子被沉默，可能是该实验方案成功的关键因素之一。这与先前多项研究结果一致，即OSKM因子在重编程过程中的表达动态具有重要作用51,52,53,54,55。因此，相较于所有OSKM因子均由单一启动子驱动表达的多顺反子载体，双顺反子载体也更具优势56。其他有助于该实验方案成功的关键因素还包括慢病毒感染的剂量以及用于重编程的感染细胞数量，这些参数已针对每种细胞类型进行了优化调整。
综上所述，本文介绍了一种优化的重编程方法，可用于原代PDAC细胞以及其他细胞系和正常细胞的重编程。该方法将有助于扩展诱导多能干细胞（iPSC）重编程技术在癌症进展建模中的应用，并在此案例中用于发现早期PDAC生物标志物。

胰腺导管腺癌（PDAC）是最致命的恶性肿瘤之一，由于该疾病早期无明显症状，早期诊断仍然具有挑战性。大多数PDAC患者在确诊时已处于晚期转移阶段，此时可用的治疗选择极为有限1,2。这主要是因为缺乏可用于早期阶段的可靠生物标志物，例如那些可被方便检测到的、释放到血液中的蛋白质类标志物。
胰腺导管腺癌（PDAC）在其进展过程中可很早发生播散，当PDAC局限于胰腺时进行早期癌症检测与较好的预后相关3。然而，仅有不到十分之一的PDAC患者被诊断时处于有利预后阶段，从而能够接受手术切除。即便如此，这些少数可切除肿瘤的患者中，也有很大比例在12个月内出现肿瘤复发4。
在过去五十年中，外科手术技术、患者护理和治疗方式已取得显著进步5,6。然而，接受手术切除的胰腺导管腺癌（PDAC）患者的5年生存率仅略微提高至17%。尽管如此，这一数据仍优于未接受切除手术的患者，后者生存率几乎未变（0.9%）4,7。化疗是目前唯一可用于PDAC的替代治疗手段。然而，该选择极为有限，因为绝大多数PDAC患者对吉西他滨（Gemcitabine）等化疗药物表现出强烈耐药性7,8。其他药物，如厄洛替尼（Erlotinib），仅适用于具有特定突变的一小部分PDAC患者，而其中大多数患者仍对厄洛替尼耐药9。此外，大多数PDAC患者在接受化疗时伴随的不良副作用是该疗法的另一项不利因素10。近期有前景的策略表明，免疫检查点抑制剂（ICIs）和小分子激酶抑制剂（SMKIs）在治疗PDAC方面可能有效，但这些靶向治疗的持久应答仍仅限于少数患者11,12。总体而言，发现PDAC特异性的早期生物标志物可为早期诊断和治疗开辟新途径。
胰腺导管腺癌（PDAC）起源于胰腺上皮内瘤变（PanIN）癌前病变，这些病变由非侵袭性的胰腺导管上皮细胞增殖所致13,14。尽管PanIN的形成始于KRAS等癌基因的突变，但其向PDAC进展还需要额外的遗传和表观遗传改变。据估计，PanIN经历不同阶段发展为侵袭性PDAC大约需要10年时间13,15,16,17。这一时间窗口为实现PDAC的早期诊断提供了重要机遇。因此，已有大量研究致力于建立肿瘤异种移植动物模型和类器官培养体系以研究PDAC的进展过程18,19,20,21。这些模型在研究PDAC侵袭阶段方面非常有用，但难以模拟从早期PanIN阶段转变的过程。因此，建立能够重现PanIN早期进展过程的实验模型，对于发现早期检测生物标志物具有重要意义。
利用四种转录因子OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC（OSKM）将体细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs），揭示了细胞可塑性的程度22。癌症细胞的可塑性已有充分记录，将人类癌细胞重编程为iPSCs已被成功用于将细胞重置至其原始状态，消除在癌症进展过程中积累的许多表观遗传损伤23,24,25,26,27,28,29。因此，利用这种重编程策略调控癌细胞身份的可能性在癌症治疗中展现出巨大前景30,31。事实上，我们此前已证明，源自胰腺导管腺癌（PDAC）的iPSCs的分化能够重现PDAC通过早期PanIN阶段的进展过程32。通过鉴定PDAC早期至中期阶段特异的基因和通路，识别出可用于临床早期PDAC诊断的候选生物标志物32,33。然而，使用单个iPSC系发现的生物标志物在大多数PDAC患者中覆盖范围有限32。从其他PDAC患者中生成iPSC系所面临的挑战阻碍了发现更可靠生物标志物的能力。这归因于多种技术因素，包括OSKM递送的异质性，因为仅有少数人类原代PDAC细胞同时含有全部四种因子并成功响应重编程。本文提供了一种详细的实验方案，采用更高效且一致的双慢病毒系统递送OSKM，用于重编程原代PDAC细胞。

<table><tbody><tr><td>2-巯基乙醇（50 mM）</td><td>Thermo Fisher</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 抗人 TRA-1-60-R</td><td>BioLegend</td><td>330613</td><td></td></tr><tr><td>牛垂体提取物（BPE）</td><td>Thermo Fisher</td><td>13028014</td><td></td></tr><tr><td>BxPc3</td><td>ATCC</td><td>CRL-1687</td><td></td></tr><tr><td>霍乱弧菌来源的霍乱毒素</td><td>Merck&amp;nbsp;</td><td>C8052-1MG</td><td></td></tr><tr><td>大鼠尾胶原，I型溶液</td><td>Merck&amp;nbsp;</td><td>C3867</td><td></td></tr><tr><td>完全配制的定义型K-SFM培养基</td><td>Thermo Fisher</td><td>&amp;nbsp;10744-019</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 经组织培养处理的多孔板</td><td>Merck&amp;nbsp;</td><td>CLS3516</td><td></td></tr><tr><td>Corning 注射器滤器</td><td>Merck&amp;nbsp;</td><td>CLS431231</td><td></td></tr><tr><td>Corning 经组织培养处理的培养皿</td><td>Merck&amp;nbsp;</td><td>CLS430599</td><td></td></tr><tr><td>Day Impex&amp;nbsp;Virkon 杀病毒消毒片</td><td>Thermo Fisher</td><td>12328667</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;prime;s 磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Merck&amp;nbsp;</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS）&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD 转染试剂&amp;nbsp;</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;E2312</td><td></td></tr><tr><td>明胶溶液，B型，2% 溶于 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Merck&amp;nbsp;</td><td>G1393-100ML</td><td></td></tr><tr><td>格拉斯哥最低必需培养基（GMEM）</td><td>Merck&amp;nbsp;</td><td>G5154</td><td></td></tr><tr><td>人 EGF 重组蛋白</td><td>Thermo Fisher</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>人碱性成纤维细胞生长因子（FGF-2/bFGF）（154个氨基酸）重组蛋白，PeproTech</td><td>Thermo Fisher</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>人胰腺导管上皮细胞系（H6c7）</td><td>Kerafast</td><td>ECA001-FP</td><td></td></tr><tr><td>iMEF 饲养层细胞&amp;nbsp;</td><td>iXcells Biotechnologies</td><td>10MU-001-1V</td><td></td></tr><tr><td>角质形成细胞无血清培养基（KSFM）&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>17005-042</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut DMEM&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut 血清替代物&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（200 mM）</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸溶液（100倍浓缩）</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HP 0.45 &amp;mu;m 注射器滤器单元（无菌）</td><td>Merck&amp;nbsp;</td><td>SLHP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM 减血清培养基&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>pMDG&amp;nbsp;</td><td>AddGene</td><td>187440</td><td></td></tr><tr><td>聚凝胺（Hexadimethrine bromide）&amp;nbsp;</td><td>Merck&amp;nbsp;</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>pSIN4-CMV-K2M&amp;nbsp;</td><td>AddGene</td><td>21164</td><td></td></tr><tr><td>pSIN4-EF2-O2S&amp;nbsp;</td><td>AddGene</td><td>21162</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>AddGene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pWPT-GFP&amp;nbsp;</td><td>AddGene</td><td>12255</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基（ATCC 改良型）</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1049101</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Thermo Fisher</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>一次性无菌注射器（60 mL）&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>15899152</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express 酶（1倍浓度），含酚红</td><td>Thermo Fisher</td><td>12605036</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632（盐酸二氢盐）</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72304</td><td></td></tr></tbody></table>

将胰腺导管腺癌重编程为多能性

Reprogramming Pancreatic Ductal Adenocarcinoma to Pluripotency

利用转录因子诱导生成诱导性多能干细胞（iPSCs）已几乎可从任何分化的细胞类型中实现，并在科研和临床应用中展现出极高的价值。有趣的是，对胰腺导管腺癌（PDAC）等癌细胞进行iPSC重编程已被证明能够逆转其侵袭性PDAC表型，并克服癌症表观遗传组的异常。由PDAC细胞衍生的iPSCs在分化过程中可重现PDAC从早期胰腺上皮内瘤变（PanIN）前体开始的疾病进展过程，揭示PDAC进展早期发生的分子与细胞变化。因此，PDAC来源的iPSCs可用于模拟PDAC的最早期阶段，从而发现可用于早期检测的诊断标志物。这一点对于PDAC患者尤为重要，因为目前缺乏可靠的PanIN早期阶段生物标志物，导致大多数患者通常在晚期转移阶段才得以确诊。然而，将包括PDAC在内的癌细胞系重编程为多能状态仍面临挑战，过程繁琐且不同细胞系之间的效率差异显著。本文中，我们描述了一种使用双顺反子慢病毒载体从多种人源PDAC细胞系生成iPSCs的更为稳定一致的实验方案。所获得的iPSC细胞系具有良好的稳定性，无需依赖外源性重编程因子表达或诱导药物的持续存在。总体而言，该方案有助于高效生成多种PDAC来源的iPSCs，这对于发现更具特异性和代表性的PDAC早期生物标志物至关重要。

图1展示了来自PDAC、BxPc3、H6C7和hFib细胞的iPSC集落形态的代表性图像。图1中可见，PDAC-iPSC集落在重编程第25天开始形成，到第40天时出现形态更成熟的、具有典型胚胎干细胞样特征的iPSC集落（图1）。同样，BxPc3-iPSC集落在重编程第23天开始出现，并于第35天趋于成熟。H6C7-iPSC的形成过程与PDAC-iPSC相似，从第45天开始逐渐形成稳定集落。hFib-iPSC集落则在重编程第15天即开始形成。
<img alt="干细胞重编程，显微图像，显示iPSC在不同阶段的细胞形态。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65811/65811fig1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1： iPSC集落的代表性图像。 图像显示了来源于（A）PDAC、（B）BxPc3、（C）H6c7以及（D）hFib的具有hESC样形态的细胞集落。每幅图像上方标注了重编程天数。比例尺 = 100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65811/65811fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
分别对PDAC、BxPc3、H6C7和hFib细胞进行重编程，建立了单克隆iPSC细胞系。所有建立的iPSC细胞系均对TRA-1-60呈阳性染色，该标记物为未分化人胚胎干细胞表面标志物，证实这些细胞已成功重编程为多能状态（图2）。
<img alt="诱导性多能干细胞分化，TRA-160 标记物，显微镜图像，细胞分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65811/65811fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：克隆性iPSC细胞系的代表性图像。 图像来源于（A）胰腺导管腺癌（PDAC）、（B）BxPc3、（C）H6c7 和（D）人成纤维细胞（hFib），显示具有胚胎干细胞样形态（上排图像）以及 TRA-1-60 染色阳性（下排图像）。比例尺 = 100 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65811/65811fig2large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案描述了将胰腺导管腺癌（PDAC）细胞和正常胰腺导管上皮细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）的方法。我们提供了一套优化且详细的逐步操作流程，从慢病毒的制备到建立稳定的iPSC细胞系。

利用转录因子诱导生成诱导性多能干细胞（iPSCs）已几乎可从任何分化的细胞类型实现，并且已经……

研究胰腺导管腺癌（PDAC）或胰腺癌最具挑战性的方面之一，是缺乏能够模拟PDAC从早期PanIN阶段发展至侵袭性状态的实验模型。另一个挑战在于如何在实验上捕捉PDAC的可塑性与异质性。因此，利用PDAC诱导多能干细胞（iPS细胞）将有助于我们应对这些挑战，并拓展研究该疾病所需的实验工具。我们已建立了一种可靠的方案，可将胰腺导管腺癌（PDAC）细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPS细胞）。通过从更多胰腺导管腺癌患者中建立更多的iPS细胞系，我们能够研究胰腺癌从早期到晚期的演变过程，并分析这些细胞系之间的共性与差异。这将有助于我们发现覆盖更广泛患者的早期诊断标志物，并开发出靶向疾病不同状态的药物。通过对胰腺导管腺癌（PDAC）细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPS细胞）所引发的一个有趣问题是：与正常细胞相比，这种癌症为何对细胞命运转变具有如此强的抗性？这是否源于某些特定基因或基因突变，从而揭示了癌细胞身份的特征？首先，观察转染前24小时、在含有GMEM培养基的15厘米培养皿中的HEK293T细胞。将细胞在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育，直至其融合度达到40%至50%。用相应的慢病毒名称标记三个15毫升塑料管。每管中加入1.710毫升低血清培养基和90微升转染试剂。在将试管于室温孵育前，通过涡旋振荡混合管内成分。五分钟后，将包装载体混合物加入转染培养基中并涡旋振荡。随后，向相应的转染混合物中加入7.5 µg重编程载体和pWPT-GFP对照。在室温孵育15分钟前，将试管涡旋震荡2秒。将转染DNA混合物逐滴加入培养皿中，以用每种慢病毒感染293T细胞。将转染后的细胞在37°C和5%二氧化碳条件下孵育。14至16小时后，弃去原培养基，加入30毫升新鲜的293T培养基，继续在37°C孵育60至72小时。每天观察细胞状态，并检测转染效率。随后，将病毒转染后的培养物转移至15毫升离心管中，在4°C、1,932 ×g条件下离心10分钟。使用0.45微米注射器滤器将慢病毒上清液过滤至一个新的50毫升离心管中。在慢病毒转导前一天，准备六孔板中的两个孔，每孔接种100,000个PDAC细胞。另准备两个15毫升离心管，每管加入2毫升预热的PDAC培养基。在第一个离心管中加入 12 毫升重编程慢病毒。然后加入 12 微升聚凝胺，用移液器吹打混匀。在第二个离心管中加入 2 微升聚凝胺。现在小心吸出六孔板中每个孔的培养基，并在室温下用 PBS 洗涤一次。将来自 1 号管的重编程感染培养基加入第一孔，将来自 2 号管的混合液加入第二孔。将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳和5%氧气条件下孵育过夜。第二天，更换两个孔中的培养基为新鲜的PDAC培养基，并继续孵育最多48小时，如图所示。首先，每孔加入2毫升0.2%明胶溶液，对6孔板进行包被。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳环境中孵育30分钟。随后，将IMEFs逐滴加入含有10毫升预温 human fibroblast 培养基的15毫升离心管中，通过轻柔颠倒混匀。将细胞悬液在309 ×g下离心3分钟，弃去上清液，然后将沉淀重悬于12毫升 human fibroblast 培养基中。将2毫升细胞悬液加入经明胶包被的六孔板的每个孔中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养过夜。弃去感染慢病毒及未感染的PDAC培养基，用PBS洗涤细胞两次。然后加入500微升胰蛋白酶消化细胞，在37摄氏度、5%二氧化碳和5%氧气条件下孵育15分钟。将细胞悬液在300 G下离心5分钟，并将沉淀重悬于1毫升PDAC培养基中。用PDAC培养基洗涤IMEF培养板。然后，将每孔50,000个慢病毒转导的PDAC细胞接种至IMEF培养板的五个孔中，并按照先前所示的方法过夜培养。配制重编程培养基后，向100毫升重编程培养基中加入100微升碱性成纤维细胞生长因子。次日，用预热的重编程培养基将生长在IMED饲养层上的细胞洗涤两次。然后，每孔加入2毫升培养基，在37摄氏度、5%二氧化碳和3%氧气条件下孵育过夜。经过五次传代iPSC细胞池后，观察到细胞克隆保持稳定的、类似胚胎干细胞（ESC）的形态。胰腺导管腺癌细胞（PDAC）、BxPC-3、H6c7以及人成纤维细胞在重编程过程中形成成熟的类似胚胎干细胞形态所需的时间各不相同。分别从PDAC、BxPC-3、H6c7和人成纤维细胞的重编程过程中建立了单克隆iPSC细胞系。所有已建立的iPSC细胞系均对TRA-160呈阳性染色，证实其已重编程为多能状态。

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科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

胰腺癌干细胞（CSCs）可被扩增 体外...

研究胰腺癌干细胞特性以开发新的治疗策略

在此，我们描述了一种四阶段方案，用于将人类胚胎干细胞分化为NKX6-1阳性细胞。+ 胰腺前体细胞 体外...

高效地将多能干细胞分化为NKX6-1+胰腺前体细胞

本方案描述了在完全化学成分明确的条件下，利用非整合型附加体质粒方法将原代羊水及羊膜间充质干细胞重编程为诱导性多能干细胞的过程。详细介绍了细胞的提取、培养、重编程以及通过严格方法对所获得的诱导性多能干细胞进行表征的实验步骤。...

在无异种成分条件下将原代羊水及羊膜细胞重编程为多能性状态

本方案详细描述了在无饲养层条件下，从人胰腺细胞生成无足迹诱导多能干细胞（iPSCs）的过程，随后利用CRISPR/Cas9核糖核蛋白进行基因编辑，并对经修饰的单细胞克隆进行表征分析。...

利用CRISPR-Cas9系统高效生成和编辑人胰腺细胞来源的无饲养层iPSCs

本文介绍了一种详细的实验方案，通过解离的单细胞非克隆型单层培养方法，将人多能干细胞（hPSCs）分化为胰腺/十二指肠同源框蛋白1+（PDX1+）细胞，以生成胰腺谱系细胞。该方法适用于制备均一的hPSC来源细胞，并可用于基因操作与筛选。...

高效生成人多能干细胞在贴壁培养中分化为胰腺/十二指肠同源框蛋白1+ 后前肠/胰腺前体细胞

本文介绍一种具有临床相关性、高效且无需饲养层的重编程方法，利用编码重编程因子的修饰mRNA以及成熟的microRNA-367/302模拟物，将人原代成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞。文中还包括评估重编程效率、扩增单克隆iPSC集落以及验证多能性标志物TRA-1-60表达的方法。...

基于RNA的体细胞重编程将人原代成纤维细胞诱导为多能干细胞

原代腺泡细胞的分离、蛋白质表达或活性调控、培养及后续应用，在胰腺癌早期事件——腺泡细胞向导管样细胞转分化（ADM）的离体研究中具有广泛而重要的用途。...

模拟与调控三维细胞培养中的胰腺腺泡-导管化生

胰腺导管腺癌的患者来源类器官培养是一种快速建立的三维模型，能够高保真地代表上皮肿瘤细胞区室，为这种致命恶性肿瘤的转化研究提供了有力工具。本文中，我们提供了建立和扩增类器官以及利用这些模型进行相关生物学检测的详细方法。...

患者来源的胰腺导管腺癌类器官模型的分离与表征

本方案描述了一种改进的方法，可提高人多能干细胞（hPSCs）在平面单层培养中衍生的胰腺前体细胞共表达PDX1和NKX6.1转录因子的效率。该方法通过更换新鲜基质、调控细胞密度以及解离内胚层细胞来实现。...

人多能干细胞在二维培养系统中向胰腺β细胞前体的分化

本文介绍了一种定向分化及功能分析类β细胞的方法。我们描述了在生成胰岛素分泌型胰腺细胞前，人多能干细胞所需的最佳培养条件和传代方法。该六阶段分化过程从定型内胚层形成开始，最终获得能够响应葡萄糖刺激而分泌胰岛素的功能性类β细胞。...

从人多能干细胞生成功能性胰岛素分泌胰腺细胞的优化方案

我们提供一种微创方案，用于将人干细胞来源的胰腺干细胞胰岛移植到免疫缺陷小鼠的肌肉内 体内...

小鼠肌肉内移植人多能干细胞衍生的胰腺内分泌细胞

了解将胰腺导管腺癌重编程为诱导多能干细胞的方法，用于建立稳定的iPSC细胞系。该技术有助于研究胰腺癌进展机制并发现早期诊断标志物。

将胰腺导管腺癌重编程为多能性

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