Ex Vivo 钙成像用于癫痫的Drosophila模型

近年来，已发现许多癫痫候选基因，需通过动物实验加以验证。我们提供一系列研究癫痫相关神经活动的技术，包括全细胞记录、诱发电位兴奋性突触后电位（EPSP）记录，以及本文将重点介绍的离体钙成像技术。由于细胞培养或脑切片无法完全重现大脑及其神经网络的完整性，本实验的主要优势在于获取保持完整的脑组织，从而保护神经网络免受损伤。

我们建立了一种离体钙成像技术，并结合对震击敏感的类癫痫行为检测方法，可高效筛选与癫痫相关的基因，并在细胞水平上探究癫痫的潜在机制。我们采用分离的完整黑腹果蝇（Drosophila）脑组织进行钙成像，该方法可避免复杂的外科手术操作，同时保持神经网络的完整性。此外，与在体成像技术相比，这种离体方法还具有更高的信噪比优势。

首先，收集 tub-Gal4 杂交品系的处女蝇和 UAS-cac-RNAi 品系的雄蝇。将处女蝇与雄蝇转移至同一试管中以获取后代。羽化后 3 至 5 天，使用毛刷收集后代及 tub-Gal4>UAS-cac-RNAi 果蝇。

测试前一天，将果蝇转移至装有食物的新洁净小瓶中。随后，小心地将四到六只经二氧化碳麻醉的果蝇分别放入各自的新鲜小瓶中。将相机架设在三脚架上，并置于白板前方。

使用空瓶手动调节相机焦距。随后，将装有果蝇的瓶子在最高转速下涡旋震荡10秒。立即把瓶子放在白板上，观察果蝇是否出现类似癫痫的行为。

以果蝇恢复直立站立能力所需的时间来测量恢复时间。cac 基因敲低果蝇表现出类似癫痫行为的比例显著高于野生型果蝇。在一秒内恢复的敲低果蝇比例显著低于野生型果蝇。

首先，用充氧的生理盐水灌注外液溶液五分钟。用移液器将10微升解剖液转移至培养皿中。接着，使用注射器针头和显微镜，仔细解剖已麻醉的野生型和基因敲除果蝇的大脑。

用移液器将制备好的脑组织转移至含有五毫升外部溶液的记录皿中。使用C形固定器固定脑组织。随后，以20倍镜采集每份脑组织的共聚焦图像。

使用XYT扫描模式，并在额外4.5倍数字放大下识别蘑菇体神经元。将激光激发波长设为488纳米，激光功率为16微瓦，以获取全脑GCaMP6m荧光信号。随后，将扫描参数设为1,400速度，像素尺寸为256×256像素。

将采集速率设置为 5.3 赫兹，并记录三分钟。分析 5 至 8 个感兴趣区域的荧光信号。手动将蘑菇体神经元的胞体确定为感兴趣区域。

使用 ImageJ 标记已识别的神经元并测量其荧光强度。按所示方法分析 GCaMP6m 的荧光数据。将细胞内荧光强度增加 2 至 2.5 个标准差定义为小峰电位，将荧光强度增加超过 2.5 个标准差定义为大峰电位。

在果蝇的蘑菇体中观察到钙信号。cac 基因敲低的果蝇表现出的大峰数量多于小峰。