Name: 离体 癫痫 果蝇 模型的钙成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: 学习离体钙成像技术用于癫痫研究，利用GCaMP6表达的成年果蝇完整脑组织监测癫痫样活动。该方法可定量分析神经元钙信号，为癫痫基因筛选和细胞机制研究提供可靠平台。

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本研究受到广东省基础与应用基础研究基金（资助号：2022A1515111123，项目负责人：Jing-Da Qiao）以及广州医科大学科研能力提升计划（Jing-Da Qiao）的支持。本研究还受到广州医科大学学生创新能力提升计划（资助编号：02-408-2304-02038XM）的支持。

1. 碰撞敏感性检测方案
<ol>
	<li>通过 Gal4/UAS 系统将 tub-Gal4 驱动品系与 UAS-cac-RNAi 品系杂交，建立实验果蝇21。收集 tub-Gal4 品系的处女蝇以及 UAS-cac-RNAi 品系的雄蝇，随后将处女蝇与雄蝇转移至同一培养瓶中以获得子代。 
	注意：tub-Gal4 驱动品系可实现 cac 基因的全身性敲低。将 UAS-cac-RNAi 品系作为对照组。</li>
	<li>羽化后 3–5 天，使用 100% CO2（CO2 麻醉设备）轻轻麻醉果蝇，并用毛刷收集 tub-Gal4&#62;UAS-cac-RNAi 果蝇和 UAS-cac-RNAi 果蝇。在测试前 1 天将这些果蝇转移至新的洁净培养基瓶中，以确保其状态良好。</li>
	<li>使用 CO2 轻轻麻醉果蝇。麻醉后，小心地将 4–6 只果蝇分别放入独立的全新培养瓶中。让果蝇从麻醉状态恢复约 1 小时，再进行后续测试。 
	注意：每种基因型至少进行五次重复实验，每次实验包含六个果蝇培养瓶。</li>
	<li>设置录像设备。将一台相机（720–1080P，至少 30–60 帧/秒，自动对焦锁定）安装在三脚架上，并置于白板前方。使用空培养瓶手动调节相机焦距，以确保拍摄画面清晰准确。</li>
	<li>使用涡旋振荡器诱导机械性惊厥样行为。将每个含有 4–6 只果蝇的培养瓶放置在涡旋振荡器上，在最高档位（2800 rpm）下精确振荡 10 秒。振荡结束后，立即将培养瓶放置于白板上。</li>
	<li>观察果蝇并记录其表现出的任何惊厥样行为。 
	注意：果蝇中观察到的惊厥样行为包括三个阶段：惊厥期（表现为翅膀振动）、麻痹期和恢复期24。发生惊厥的果蝇数量占测试果蝇总数的比例定义为惊厥率。
	<ol>
		<li>测量恢复时间，即从振荡结束至果蝇恢复直立站立能力所需的时间25。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 钙成像实验方案 离体 脑
<ol>
	<li>建立 tub-Gal4&#62;UAS-GCaMP6m 和 tub-Gal4&#62;UAS-GCaMP6m/cac-RNAi 分别生成果蝇品系。利用Gal4/UAS双元表达系统产生果蝇21 以实现对钙活动的监测 离体 脑</li>
	<li>按照提供的配方制备解剖溶液（表1)26.
	<ol>
		<li>按照所述方法配制外部溶液 表1用 NaOH 调节 pH 至 7.2，并调节渗透压至 250–255 mOsm/L。 
		注意：外部溶液可在 4 °C 下保存 1 周。</li>
		<li>配制解离溶液时，将9单位的木瓜蛋白酶悬浮液和L-赖氨酸（2 mg/mL）加入600 µL的外部溶液中。涡旋混匀后静置15分钟，直至溶液澄清。 
		注意：建议在4小时内使用解剖液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用含95%氧气和5%二氧化碳的充氧盐溶液对外部溶液进行灌注，持续5分钟后再使用。用移液器将约10 µL的解剖液转移至培养皿中。该溶液将为脑组织解剖和成像提供必要的条件。</li>
	<li>仔细解剖两者的脑组织 tub-Gal4&#62;UAS-GCaMP6m 和 tub-Gal4&#62;UAS-GCaMP6m/cac-RNAi 使用注射器针头和显微镜分离导管。按照既定方案进行脑组织解剖27.</li>
	<li>使用移液器将制备好的脑组织转移至含有5 mL新鲜外部溶液的记录皿中，并使用C形固定器固定脑组织&#160;在记录培养皿中恢复 3-5 分钟。 
	注意：C调弦轴架由直径为7 mm的金属半圆环构成，其上穿有间距为0.5 mm的平行纤维。</li>
	<li>共聚焦成像系统设置与图像采集
	<ol>
		<li>使用20倍物镜对每只脑组织进行共聚焦成像采集 xyt 扫描模式在20倍光学放大基础上，通过额外的4.5倍数字放大识别蘑菇体神经元。 
		注意：每个 离体 大脑可成像超过1小时。</li>
		<li>使用488 nm激光激发，激光功率为16 µW，采集全脑GCaMP6m荧光信号。扫描参数设置为速度400，像素尺寸为256像素 × 256像素。采用5.3 Hz的采集速率，持续记录3分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在每只大脑中确定5-8个感兴趣区域（ROI），并分析荧光信号。手动将蘑菇体神经元的细胞体确定为感兴趣区域28.
	<ol>
		<li>使用ImageJ对已识别的神经元进行标记，并测量其荧光强度。通过%ΔF/F = (F1-F0)/(F0-B)公式分析GCaMP6m的荧光数据。将细胞内荧光信号较基线水平升高2至2.5个标准差定义为小幅度尖峰，荧光信号升高超过基线水平2.5个标准差定义为大幅度尖峰。采用Student's t检验分析钙尖峰的频率。 
		注意：F0 定义为感兴趣区域（ROIs）前 5 个初始帧的平均荧光强度作为基线，F1 定义为特定时间点的荧光强度，B 定义为无荧光背景。神经元的时间生理活动也有助于将其与噪声信号区分开来。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Monitoring Epileptiform Events in Drosophila via Calcium Imaging

<ol><li>Thijs, R. D., Surges, R., O'brien, T. J., Sander, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epilepsy+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Epilepsy in adults.</a> Lancet. 393 (10172), 689-701 (2019).</li>
<li>Ellis, C. A., Petrovski, S., Berkovic, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epilepsy+genetics%3A+Clinical+impacts+and+biological+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Epilepsy genetics: Clinical impacts and biological insights.</a> Lancet Neurol. 19 (1), 93-100 (2020).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epilepsy-associated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Seizure%22%5BJournal%5D)">Epilepsy-associated genes.</a> Seizure. 44, 11-20 (2017).</li>
<li>Oliver, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes4epilepsy%3A+An+epilepsy+gene+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Genes4epilepsy: An epilepsy gene resource.</a> Epilepsia. 64 (5), 1368-1375 (2023).</li>
<li>Rogawski, M. A., Loscher, W., Rho, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+action+of+antiseizure+drugs+and+the+ketogenic+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of action of antiseizure drugs and the ketogenic diet.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 6 (5), 022780(2016).</li>
<li>Ademuwagun, I. A., Rotimi, S. O., Syrbe, S., Ajamma, Y. U., Adebiyi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage+gated+sodium+channel+genes+in+epilepsy%3A+Mutations%2C+functional+studies%2C+and+treatment+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurol%22%5BJournal%5D)">Voltage gated sodium channel genes in epilepsy: Mutations, functional studies, and treatment dimensions.</a> Front Neurol. 12, 600050(2021).</li>
<li>Leweke, F. M., Louvel, J., Rausche, G., Heinemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+pentetrazol+on+neuronal+activity+and+on+extracellular+calcium+concentration+in+rat+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsy+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of pentetrazol on neuronal activity and on extracellular calcium concentration in rat hippocampal slices.</a> Epilepsy Res. 6 (3), 187-198 (1990).</li>
<li>Yang, W., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of neural activity.</a> Nat Methods. 14 (4), 349-359 (2017).</li>
<li>Hewapathirane, D. S., Dunfield, D., Yen, W., Chen, S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+seizure+activity+in+a+novel+developmental+seizure+model%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of seizure activity in a novel developmental seizure model.</a> Exp Neurol. 211 (2), 480-488 (2008).</li>
<li>Ishimoto, H., Sano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+calcium+imaging+for+visualizing+brain+responses+to+endocrine+signaling+in+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in drosophila.</a> J Vis Exp. 136, 57701(2018).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Moisescu, D. G., Ashley, C. C., Campbell, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+the+calcium-sensitive+photoproteins+aequorin+and+obelin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of the calcium-sensitive photoproteins aequorin and obelin.</a> Biochim Biophys Acta. 396 (1), 133-140 (1975).</li>
<li>Blinks, J. R., Prendergast, F. G., Allen, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoproteins+as+biological+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Photoproteins as biological calcium indicators.</a> Pharmacol Rev. 28 (1), 1-93 (1976).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+gcamp+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved gcamp calcium indicators.</a> Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
<li>Svoboda, K., Helmchen, F., Denk, W., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spread+of+dendritic+excitation+in+layer+2%2F3+pyramidal+neurons+in+rat+barrel+cortex+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spread of dendritic excitation in layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex in vivo.</a> Nat Neurosci. 2 (1), 65-73 (1999).</li>
<li>Rochefort, N. L., Jia, H., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+in+the+living+brain%3A+Prospects+for+molecular+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging in the living brain: Prospects for molecular medicine.</a> Trends Mol Med. 14 (9), 389-399 (2008).</li>
<li>Russell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+signals+in+vivo%3A+A+powerful+tool+in+physiology+and+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium signals in vivo: A powerful tool in physiology and pharmacology.</a> Br J Pharmacol. 163 (8), 1605-1625 (2011).</li>
<li>Neher, E., Sakaba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+roles+of+calcium+ions+in+the+regulation+of+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release.</a> Neuron. 59 (6), 861-872 (2008).</li>
<li>Streit, A. K., Fan, Y. N., Masullo, L., Baines, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+neuronal+activity+in+drosophila+can+identify+anticonvulsive+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of neuronal activity in drosophila can identify anticonvulsive compounds.</a> PLoS One. 11 (2), 0148461(2016).</li>
<li>Parker, L., Howlett, I. C., Rusan, Z. M., Tanouye, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seizure+and+epilepsy%3A+Studies+of+seizure+disorders+in+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Seizure and epilepsy: Studies of seizure disorders in drosophila.</a> Int Rev Neurobiol. 99, 1-21 (2011).</li>
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<li>Liu, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+strategies+based+on+behavioral+and+electrophysiological+methods+for+epilepsy-related+gene+screening+in+the+drosophila+model%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Efficient strategies based on behavioral and electrophysiological methods for epilepsy-related gene screening in the drosophila model.</a> Front Mol Neurosci. 16, 1121877(2023).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+the+odor-evoked+distributed+neural+activity+in+the+drosophila+mushroom+body%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of the odor-evoked distributed neural activity in the drosophila mushroom body.</a> Neuron. 29 (1), 267-276 (2001).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unc13b+variants+associated+with+partial+epilepsy+with+favourable+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Unc13b variants associated with partial epilepsy with favourable outcome.</a> Brain. 144 (10), 3050-3060 (2021).</li>
<li>Ganetzky, B., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indirect+suppression+involving+behavioral+mutants+with+altered+nerve+excitability+in+drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Indirect suppression involving behavioral mutants with altered nerve excitability in drosophila melanogaster.</a> Genetics. 100 (4), 597-614 (1982).</li>
<li>Roemmich, A. J., Schutte, S. S., O'dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+whole-cell+recordings+in+adult+drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Ex vivo whole-cell recordings in adult drosophila brain.</a> Bio Protoc. 8 (14), 2467(2018).</li>
<li>Gu, H., O'dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+cell+recordings+from+brain+of+adult+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole cell recordings from brain of adult drosophila.</a> J Vis Exp. (6), 248(2007).</li>
<li>Qiao, J., Yang, S., Geng, H., Yung, W. H., Ke, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Input-timing-dependent+plasticity+at+incoming+synapses+of+the+mushroom+body+facilitates+olfactory+learning+in+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Input-timing-dependent plasticity at incoming synapses of the mushroom body facilitates olfactory learning in drosophila.</a> Curr Biol. 32 (22), 4869-4880 (2022).</li>
<li>Liu, C. -Q., Lin, Y. -M., Zhang, X. -X., Peng, R. -C., Qiao, J. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+CACNA1A+deficiency+against+seizure+in+the+CACNA1A-CELSR2+digenic+knockdown+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Research+Square%22%5BJournal%5D)">Protective effect of CACNA1A deficiency against seizure in the CACNA1A-CELSR2 digenic knockdown flies.</a> Research Square. , (2023).</li>
<li>Uchitel, O. D., Inchauspe, C. G., Urbano, F. J. D. i, Guilmi, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cav2.1+voltage+activated+calcium+channels+and+synaptic+transmission+in+familial+hemiplegic+migraine+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Paris%22%5BJournal%5D)">Cav2.1 voltage activated calcium channels and synaptic transmission in familial hemiplegic migraine pathogenesis.</a> J Physiol Paris. 106 (1-2), 12-22 (2012).</li>
<li>Le Roux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cacna1a-associated+epilepsy%3A+Electroclinical+findings+and+treatment+response+on+seizures+in+18+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Paediatr+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cacna1a-associated epilepsy: Electroclinical findings and treatment response on seizures in 18 patients.</a> Eur J Paediatr Neurol. 33, 75-85 (2021).</li>
<li>Alehabib, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+molecular+spectrum+of+p%2Fq+type+calcium+channel+cav2.1+in+epileptic+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+J+Rare+Dis%22%5BJournal%5D)">Clinical and molecular spectrum of p/q type calcium channel cav2.1 in epileptic patients.</a> Orphanet J Rare Dis. 16 (1), 461(2021).</li>
<li>Li, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cacna1a+mutations+associated+with+epilepsies+and+their+molecular+sub-regional+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cacna1a mutations associated with epilepsies and their molecular sub-regional implications.</a> Front Mol Neurosci. 15, 860662(2022).</li>
<li>Indelicato, E., Boesch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+genotype+to+phenotype%3A+Expanding+the+clinical+spectrum+of+cacna1a+variants+in+the+era+of+next+generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurol%22%5BJournal%5D)">From genotype to phenotype: Expanding the clinical spectrum of cacna1a variants in the era of next generation sequencing.</a> Front Neurol. 12, 639994(2021).</li>
<li>Saras, A., Tanouye, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+of+the+calcium+channel+gene+cacophony+suppress+seizures+in+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations of the calcium channel gene cacophony suppress seizures in drosophila.</a> Plos Genetics. 12 (1), e1005784(2016).</li>
<li>Cozzolino, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+epileptiform+activity+in+zebrafish+by+statistical-based+integration+of+electrophysiology+and+2-photon+ca2%2B+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Evolution of epileptiform activity in zebrafish by statistical-based integration of electrophysiology and 2-photon ca2+ imaging.</a> Cells. 9 (3), 769(2020).</li>
<li>Mituzaite, J., Petersen, R., Claridge-Chang, A., Baines, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+seizure+induction+methods+in+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Characterization of seizure induction methods in drosophila.</a> eNeuro. 8 (4), (2021).</li>
<li>Miller, D. E., Cook, K. R., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+joy+of+balancers%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Genetics%22%5BJournal%5D)">The joy of balancers.</a> Plos Genetics. 15 (11), e1008421(2019).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

钙离子作为一种关键的第二信使，在化学和电刺激引发的多种生理及病理生理反应中发挥着核心作用。此外，由人类基因编码的突触前P/Q型钙通道的拓扑结构元件 CACNA1A 基因已被确定为介导多种神经递质（包括谷氨酸）释放的关键因子30,31,32，且与癫痫密切相关33,34. 之前，行为的 Cac 基因敲低果蝇未表现出某些突变体中报道的严重表型，甚至在特定双突变果蝇中显示出抑制效应35 本研究的结果表明 cac 基因敲低果蝇比野生型果蝇更容易发生癫痫发作。这一观察结果与以下事实相符：携带相关突变的患者及其他动物模型也表现出类似的表型。 CACNA1A 功能缺失型变异与癫痫相关28...

癫痫是一种复杂的慢性神经系统疾病，其特征是反复出现自发性和无诱因的发作以及异常的神经元网络活动，全球已有超过7000万人受到影响，使其成为最常见的神经系统疾病之一1，并给家庭和社会带来沉重负担。鉴于癫痫的影响，已有大量研究致力于揭示发作的病因，其中遗传因素已被确认为多种类型癫痫或癫痫综合征的主要病因2。过去几十年来，基因组技术的进步极大地加速了与癫痫相关新基因的发现，这些基因在发作发生中起着关键作用，包括离子通道基因和非离子通道基因3,4。然而，基因与癫痫表型之间的潜在机制及功能分析尚未完全阐明。识别与癫痫相关的基因及其作用机制，为高效管理患者提供了可能5,6。
胞质钙信号是神经元活动和突触传递中的关键因素。自20世纪70年代以来，钙成像技术已被用于监测神经元活动12,13，作为神经元兴奋性的标志物，其应用包括脑切片7、in vivo8,9以及ex vivo10等多种模型11。近年来，成像技术的进步结合基因编码钙指示剂（GECIs）（如GCaMP6）的应用，已在全脑范围和单细胞分辨率水平上彻底改变了癫痫的研究14,15,16，实现了高度的时空精确性。动作电位和突触传递过程中分别观察到了钙浓度的变化和瞬时波动14，表明细胞内钙水平的改变与神经元的电兴奋性之间存在严格的相关性17,18。钙成像还被应用于发育性癫痫模型9，并在果蝇（Drosophila）中用于抗惊厥化合物的筛选19。
黑腹果蝇 已成为癫痫等科学研究领域中一种强大的模式生物，因其具有复杂的分子遗传学和行为学检测方法20,21,22此外，先进的遗传学工具在 黑腹果蝇 已促进遗传编码的钙离子指示剂 GCaMP6 的表达。例如，基于 Gal4 和 UAS 的双元转录系统能够以时空可控的方式特异性地表达 GCaMP6。由于 果蝇 是一种微小的生物体， 体内 钙成像需要熟练的操作技能来进行外科手术干预，该手术仅通过一个小窗口暴露大脑背侧的一小部分14,23同时， 离体 完整大脑中的钙成像 果蝇 可用于监测全脑感兴趣区域（ROIs）。
本研究中，我们采用表达GCaMP6的成年Drosophila进行ex vivo钙成像，以监测癫痫样活动。CACNA1A是一个已知的癫痫相关基因，cac属于Cav2通道，是CACNA1A的同源基因。我们首先解剖cac基因敲低果蝇tub-Gal4&#62;GCaMP6m/cac-RNAi 的脑组织，并利用共聚焦显微镜以xyt扫描模式进行成像。随后，通过计算量化自发性癫痫样事件的指标（如%ΔF/F值和GCaMP6荧光的钙信号事件），分析感兴趣区域（ROIs）钙信号的变化。此外，我们还使用涡旋仪施加机械刺激，对cac基因敲低果蝇进行诱发 seizure 行为测试，以验证钙成像结果。总体而言，该实验方案通过ex vivo钙成像为研究成年Drosophila中的痫性发作事件提供了有力工具，有助于在细胞水平上探索癫痫的潜在机制。

<table><tbody><tr><td>毛刷</td><td>Panera</td><td>AAhc022-2</td><td>用于操作果蝇</td></tr><tr><td>氯化钙 (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>SP8; Zeiss, Jena, Germany.</td><td>N/A</td><td>用于钙成像</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 麻醉仪</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>用于麻醉果蝇</td></tr><tr><td>C型固定夹</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>自制，用于固定脑组织</td></tr><tr><td>培养管</td><td>Biologix</td><td>51-0500</td><td>直径2.5 cm，高9.5 cm</td></tr><tr><td>Fiji 软件</td><td>National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA</td><td>版本：2.14.0</td><td>用于数据分析</td></tr><tr><td>果蝇存放盒</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>自制，用于处理果蝇</td></tr><tr><td>果蝇品系</td><td>cac-RNAi</td><td>27244</td><td>来自布卢明顿果蝇资源中心（Bloomington Drosophila Stock Center）</td></tr><tr><td>果蝇品系</td><td>GCaMP6m</td><td>42750</td><td>来自布卢明顿果蝇资源中心（Bloomington Drosophila Stock Center）</td></tr><tr><td>果蝇品系</td><td>tub-Gal4</td><td>N/A</td><td>来自广州医科大学 Sion-Frech Hoffmann 研究所</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>高分辨率相机</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>用于记录类似癫痫行为实验</td></tr><tr><td>L-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5626</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁溶液 (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶悬浮液</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS003126</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLW1480/02D</td><td>用于解剖</td></tr><tr><td>移液器</td><td>Thermo Scientific</td><td>4640010, 4640030, 4640050, 4640060</td><td>用于转移定量液体及解剖后的脑组织</td></tr><tr><td>氯化钾 (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>记录用培养皿</td><td>Thermo Scientific</td><td>150682- Glass Based Dish</td><td>用于承载脑组织并进行钙成像</td></tr><tr><td>碳酸氢钠 (NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠 (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠 (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25550</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠 (NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>SHANG GUANG</td><td>XTZ-D</td><td>用于操作果蝇和解剖</td></tr><tr><td>注射器针头</td><td>pythonbio</td><td>HCL0693</td><td>用于解剖</td></tr><tr><td>三脚架</td><td>WEIFENG</td><td>45634732523</td><td>用于记录类似癫痫行为实验</td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich</td><td>Z653438</td><td>用于进行类似癫痫行为实验</td></tr><tr><td>白板</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>自制，泡沫垫或纸张作为背景</td></tr></tbody></table>

ex vivo 钙成像用于癫痫的drosophila模型

Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy

癫痫是一种以反复发作的癫痫发作为特征的神经系统疾病，部分与遗传因素相关，全球受影响人数超过7000万。尽管癫痫具有重要的临床意义，但对中枢神经系统神经活动的功能分析仍有待进一步发展。近年来，成像技术的进步结合基因编码钙指示剂（如GCaMP6）的稳定表达，已在全脑范围和单细胞分辨率水平上彻底改变了癫痫的研究方式。Drosophila melanogaster（黑腹果蝇）因其成熟的分子遗传学工具和行为学检测手段，已成为研究癫痫潜在分子与细胞机制的重要模型。本研究中，我们提出了一种新颖且高效的方案，用于在表达GCaMP6的成年Drosophila中进行离体（ex vivo）钙成像，以监测癫痫样活动。通过制备已知癫痫相关基因cac敲低果蝇的完整脑组织，利用共聚焦显微镜进行钙成像，继而在击晕敏感性癫痫样行为检测之后识别其神经活动特征。cac基因敲低果蝇表现出更高的癫痫样行为发生率以及异常的钙活动，包括较野生型果蝇出现更多大幅尖峰和更少小幅尖峰。钙活动特征与癫痫样行为之间存在相关性。该方法可作为高效筛选癫痫致病基因及在细胞水平上探索癫痫潜在机制的有效手段。

采用本方案，我们发现 cac 敲低果蝇的类惊厥行为发生率显著高于野生型果蝇（17.00 ± 2.99 [n = 6] 对比 4.50 ± 2.03 [n = 6]; P = 0.0061；Student's t检验， 图1A）。大多数 tub-Gal4&gt;UAS-cac-RNAi 1-5 秒内恢复的果蝇，而 UAS-cac-RNAi 2秒内恢复的果蝇。恢复百分比 cac 敲低果蝇在1秒内失去活动能力的比例显著低于野生型果蝇（88.08 ± 1.89 [n = 6] 对比 96.50 ± 1.82 [n = 6]; P = 0.0093；Student's t检验， 图1B）。如图所示 图2，果蝇蘑菇体中观察到钙信号。小尖峰发生的频率较低 cac 基因敲低果蝇（<...

在此，我们介绍一种实验方案 离体 在表达GCaMP6的成年个体中进行钙成像 果蝇 以监测癫痫样活动。该方案为研究成人中的发作事件提供了一种有价值的工具 果蝇 通过 离体 钙成像，可用于探索癫痫在细胞水平的潜在机制。

Ex Vivo 钙成像用于癫痫的Drosophila模型

癫痫是一种神经系统疾病，以反复发作为特征，部分与遗传因素相关，影响全球超过7000万人。

近年来，已发现许多癫痫候选基因，需通过动物实验加以验证。我们提供一系列研究癫痫相关神经活动的技术，包括全细胞记录、诱发电位兴奋性突触后电位（EPSP）记录，以及本文将重点介绍的离体钙成像技术。由于细胞培养或脑切片无法完全重现大脑及其神经网络的完整性，本实验的主要优势在于获取保持完整的脑组织，从而保护神经网络免受损伤。我们建立了一种离体钙成像技术，并结合对震击敏感的类癫痫行为检测方法，可高效筛选与癫痫相关的基因，并在细胞水平上探究癫痫的潜在机制。我们采用分离的完整黑腹果蝇（Drosophila）脑组织进行钙成像，该方法可避免复杂的外科手术操作，同时保持神经网络的完整性。此外，与在体成像技术相比，这种离体方法还具有更高的信噪比优势。首先，收集 tub-Gal4 杂交品系的处女蝇和 UAS-cac-RNAi 品系的雄蝇。将处女蝇与雄蝇转移至同一试管中以获取后代。羽化后 3 至 5 天，使用毛刷收集后代及 tub-Gal4>UAS-cac-RNAi 果蝇。测试前一天，将果蝇转移至装有食物的新洁净小瓶中。随后，小心地将四到六只经二氧化碳麻醉的果蝇分别放入各自的新鲜小瓶中。将相机架设在三脚架上，并置于白板前方。使用空瓶手动调节相机焦距。随后，将装有果蝇的瓶子在最高转速下涡旋震荡10秒。立即把瓶子放在白板上，观察果蝇是否出现类似癫痫的行为。以果蝇恢复直立站立能力所需的时间来测量恢复时间。cac 基因敲低果蝇表现出类似癫痫行为的比例显著高于野生型果蝇。在一秒内恢复的敲低果蝇比例显著低于野生型果蝇。首先，用充氧的生理盐水灌注外液溶液五分钟。用移液器将10微升解剖液转移至培养皿中。接着，使用注射器针头和显微镜，仔细解剖已麻醉的野生型和基因敲除果蝇的大脑。用移液器将制备好的脑组织转移至含有五毫升外部溶液的记录皿中。使用C形固定器固定脑组织。随后，以20倍镜采集每份脑组织的共聚焦图像。使用XYT扫描模式，并在额外4.5倍数字放大下识别蘑菇体神经元。将激光激发波长设为488纳米，激光功率为16微瓦，以获取全脑GCaMP6m荧光信号。随后，将扫描参数设为1,400速度，像素尺寸为256×256像素。将采集速率设置为 5.3 赫兹，并记录三分钟。分析 5 至 8 个感兴趣区域的荧光信号。手动将蘑菇体神经元的胞体确定为感兴趣区域。使用 ImageJ 标记已识别的神经元并测量其荧光强度。按所示方法分析 GCaMP6m 的荧光数据。将细胞内荧光强度增加 2 至 2.5 个标准差定义为小峰电位，将荧光强度增加超过 2.5 个标准差定义为大峰电位。在果蝇的蘑菇体中观察到钙信号。cac 基因敲低的果蝇表现出的大峰数量多于小峰。

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离体 癫痫 果蝇 模型的钙成像

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Drosophila 体内 钙成像：神经元活动功能成像的一种方法

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体内钙成像利用突触定位钙传感器在黑腹果蝇中的应用

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本文描述了一种可调节的 离体 Ca成像的实验方案2+ 卵子激活过程中 果蝇.

成像钙离子 果蝇 在卵子激活时

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我们介绍了利用表面组织粘合剂固定样品，对Drosophila幼虫嗅觉神经元进行钙成像的实验方案。该方法提高了实验稳定性，有助于开展可靠的活体（in-vivo）和离体（ex-vivo）实验。通过定制的R语言脚本分析钙信号，为深入的神经生理学研究提供了高效平台。...

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Drosophila 嗅觉中枢对气味刺激反应的钙成像

学习离体钙成像技术用于癫痫研究，利用GCaMP6表达的成年果蝇完整脑组织监测癫痫样活动。该方法可定量分析神经元钙信号，为癫痫基因筛选和细胞机制研究提供可靠平台。

Ex Vivo 钙成像用于癫痫的Drosophila模型

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