Name: 小鼠咬肌冻结损伤建立口面部肌肉纤维化模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: 了解利用干冰冷冻损伤建立小鼠咬肌纤维化模型的方法，用于研究口面部肌肉再生机制。该模型可对比咬肌与胫骨前肌的不同再生能力，为探索肌肉纤维化病理提供可靠工具。

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本研究由四川省卫生健康委员会（资助编号：21PJ063）和国家自然科学基金（资助编号：82001031）资助。

本研究中所有动物实验均经四川大学华西口腔医学院伦理委员会（WCHSIRB-D-2020-114）审查和批准。雄性C57BL/6小鼠（5周龄）饲养于湿度可控（53 ± 2%）和温度可控（23 ± 2 °C）的环境中，并维持12小时光照/12小时黑暗循环。有关本实验方案中使用的所有材料、试剂和仪器的详细信息，请参见材料表。
1. 冻伤
<ol>
	<li>麻醉：使用浸有异氟烷的棉球对小鼠进行镇静，并以 50 mg/kg 剂量腹腔注射替来他明-唑拉西泮。术前和术后镇痛通过腹腔注射美洛昔康实现，剂量为 1 mg/kg。使用兽用眼膏保护小鼠眼睛。在整个手术过程中，将维持在 38 °C 的加热垫置于手术单下方，为动物提供体温支持。将小鼠侧卧于手术台上后，用胶带固定（图 1）。通过眼睑反射、翻正反射和足底回缩反射的消失来评估麻醉是否充分。 
	注意：使用异氟烷麻醉时，一手握住小鼠，另一手持异氟烷浸湿的棉球。确保棉球与动物保持一定距离，以避免引起不适或皮肤刺激。</li>
	<li>术前脱毛：使用电动剃刀剃除小鼠小腿和面部的毛发，然后用棉签将脱毛膏涂抹于皮肤表面，覆盖咬肌和胫前肌区域。1–2 分钟后，用含乙醇的外科擦拭巾清洗掉脱毛膏（图 2A 和 图 2G）。&#160;手术区域使用碘伏溶液擦洗三遍，再用 75% 乙醇消毒。   
	注意：仅使用电动剃刀不足以彻底脱毛，尤其是在咬肌区域。涂抹脱毛膏时应避免用量过多。清洗脱毛膏时应轻柔擦拭皮肤，以防造成皮肤灼伤。</li>
	<li>暴露手术区域：在开始手术前，用手术单覆盖非手术区域。对于咬肌（MAS），首先沿下颌骨下缘进行触诊。从下颌骨边缘起始 5 mm 处，沿口角至耳屏连线做一条 7 mm 长的切口（虚线表示 图 2B 中切口的位置）。</li>
	<li>对于胫前肌（TA），首先沿小腿部位触诊，定位胫骨前缘。从膝关节至踝关节，使用手术刀在皮肤上距胫骨前缘后方 2 mm 处做切口（虚线表示 图 2H 中切口的位置）。每只小鼠若左侧 MAS 和 TA 肌肉被损伤，则使用对侧相应肌肉作为对照。 
	注意：该切口应非常表浅，以确保在切开过程中不损伤肌肉。面部切口不应过于靠近耳屏，否则会暴露腮腺，导致后续冷冻过程中出现大量出血。</li>
	<li>干冰冷冻：使用预冷的镊子夹住一块干冰，分别沿咬肌和胫前肌的长轴方向放置（图 2C 和 图 2I）。将干冰直接接触肌肉表面持续 5 s。移除干冰后，立即确认肌肉呈现僵硬且苍白的白色（图 2D 和 图 2J），并在 22–25 s 内恢复至正常颜色和质地，与邻近未损伤肌肉相似（图 2E 和 图 2K）。 
	注意：夹持干冰的镊子必须预先冷却，以防止干冰迅速升华。必须使用计时器精确控制 5 s 的冷冻损伤时间以及 22–25 s 的肌肉恢复时间。任何恢复时间短于 22 s 或长于 25 s 的肌肉样本均应弃用。此步骤需要反复练习。</li>
	<li>伤口闭合：待肌肉完全恢复后，使用至少三针 7-0 缝线关闭皮肤切口（图 2F 和 图 2L）。</li>
	<li>复苏：缝合完成后，将小鼠放入带有保温支持的笼子中，并持续监测，直至所有翻正反射完全恢复。</li>
</ol>
2. 肌肉组织采集
<ol>
	<li>使用过量异氟烷对小鼠实施安乐死，随后进行颈椎脱位。取双侧咀嚼肌（MAS）和胫骨前肌（TA）用于组织学分析。</li>
	<li>咀嚼肌（MAS）解剖：切开小鼠面部皮肤，移除腮腺以暴露MAS肌的后部。从其前附着点开始，沿下颌骨向后解剖至后附着点。白色虚线区域表示暴露的MAS部分（图3A）。 
	注意：MAS肌由深层和浅层两个部分组成，均紧密附着于下颌骨表面。解剖过程中务必使剪刀紧贴下颌骨，以确保MAS的完整分离。需仔细区分位于颧骨与下颌骨之间的颧下颌肌与MAS的边界。</li>
	<li>胫骨前肌（TA）解剖：从踝关节至膝关节切开皮肤，去除筋膜以暴露TA肌。使用显微解剖镊尖端分离TA肌腱，并向上滑动至膝关节处，以切断附着于胫骨的肌纤维。随后，在踝关节处切断肌腱（图3B）。 
	注意：在小鼠踝关节周围存在多个肌腱；需通过练习识别TA肌腱，其为最大且最靠近胫骨的肌腱。</li>
	<li>预冷异戊烷：准备两个隔热容器；将小容器中加入异戊烷，大容器中加入液氮。在肌肉解剖前10分钟，将盛有异戊烷的小容器置于液氮大容器内（图3D）。</li>
	<li>包埋模具准备：为每个样本制作一个圆柱形锡箔模具，并填充最佳切割温度（OCT）包埋剂。</li>
	<li>新鲜冷冻：将肌肉浸入OCT中，保持其垂直于OCT包埋剂表面（图3C）。使用持针器将模具转移至预冷的异戊烷中。等待约40秒，直至OCT变为白色且完全固化（图3D）。 
	注意：确保模具位置不宜过低，否则异戊烷会混入OCT中，影响肌肉冷冻效果。模具中OCT的液面高度应与肌肉样本高度相近。避免使用过多OCT，以确保快速且高效的冷冻过程。</li>
	<li>样本储存：将新鲜冷冻的肌肉样本存放于明确标记的24孔板中。应立即进行切片，或于-80 °C长期保存备用。</li>
</ol>
3. 组织学分析
<ol>
	<li>使用冷冻切片机将肌肉样本切成10 µm厚的切片，并贴附于表面处理过的载玻片上。</li>
	<li>将载玻片置于冰冻丙酮中固定20分钟，随后在通风橱中室温下晾干20分钟。</li>
	<li>用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤载玻片，每次5分钟，共洗3次。 
	注意：从本步骤开始，所有载玻片均需置于湿盒中，以防止干燥。</li>
	<li>天狼星红染色
	<ol>
		<li>通过将0.5 g天狼星红粉末溶解于500 mL饱和苦味酸溶液中，配制天狼星红工作液。</li>
		<li>在室温下用天狼星红工作液染色1小时。</li>
		<li>用0.5%乙酸溶液洗涤载玻片，每次5分钟，共洗2次。</li>
		<li>染色完成后，样本应先在95%乙醇中脱水15秒，再在无水乙醇中脱水1分钟。最后使用中性树胶封片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫组织化学染色
	<ol>
		<li>在室温下用含0.3% Triton的PBS溶液对切片进行透化处理20分钟，随后用PBS洗涤。</li>
		<li>对于Pax7染色，使用试剂盒配套的封闭试剂进行封闭；对于laminin和Pdgfrα染色，在室温下用含5%牛血清白蛋白（BSA）和5%驴血清的PBS溶液封闭1小时。</li>
		<li>在4 °C条件下，用抗Pax7、laminin和Pdgfrα的一抗抗体孵育切片过夜，随后用PBS洗涤3次，每次5分钟。</li>
		<li>在室温下用荧光标记的二抗抗体孵育切片1小时，随后用PBS洗涤3次，每次5分钟。</li>
		<li>在室&#160;温下用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）孵育3分钟，随后用PBS洗涤3次，每次5分钟。</li>
		<li>在切片上滴加封片剂，盖上盖玻片，并用指甲油密封边缘。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Establishing an Orofacial Muscle Fibrosis Model in Mice via a Freezing Injury

<ol><li>Yoshioka, K., Kitajima, Y., Seko, D., Tsuchiya, Y., Ono, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+body+region+specificity+in+murine+models+of+muscle+regeneration+and+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">The body region specificity in murine models of muscle regeneration and atrophy.</a> Acta Physiologica. 231 (1), e13553(2021).</li>
<li>Worley, M. L., Patel, K. G., Kilpatrick, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleft+lip+and+palate%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Perinatology%22%5BJournal%5D)">Cleft lip and palate.</a> Clinics in Perinatology. 45 (4), 661-678 (2018).</li>
<li>Pai, B. C. J., Hung, Y. -T., Wang, R. S. H., Lo, L. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outcome+of+patients+with+complete+unilateral+cleft+lip+and+palate%3A+20-year+follow-up+of+a+treatment+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Outcome of patients with complete unilateral cleft lip and palate: 20-year follow-up of a treatment protocol.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 143 (2), 359e-367e (2019).</li>
<li>Parsaei, Y., Chandler, L., Smetona, J. T., Lopez, J., Steinbacher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aesthetic+repair+of+unilateral+cleft+lip+using+the+modified+inferior+triangle+and+adjunctive+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Aesthetic repair of unilateral cleft lip using the modified inferior triangle and adjunctive techniques.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 149 (1), 70e-73e (2022).</li>
<li>Schubert, F. R., Singh, A. J., Afoyalan, O., Kioussi, C., Dietrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+roll+the+eyes+and+snap+a+bite+-+function%2C+development+and+evolution+of+craniofacial+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+In+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">To roll the eyes and snap a bite - function, development and evolution of craniofacial muscles.</a> Seminars In Cell & Developmental Biology. 91, 31-44 (2019).</li>
<li>Vyas, B., Nandkishore, N., Sambasivan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+cranial+mesoderm%3A+developmental+trajectory+and+evolutionary+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">Vertebrate cranial mesoderm: developmental trajectory and evolutionary origin.</a> Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 77 (10), 1933-1945 (2020).</li>
<li>Sambasivan, R., Kuratani, S., Tajbakhsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+eye+on+the+head%3A+the+development+and+evolution+of+craniofacial+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An eye on the head: the development and evolution of craniofacial muscles.</a> Development. 138 (12), 2401-2415 (2011).</li>
<li>Cheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Head+muscle+fibro-adipogenic+progenitors+account+for+the+tilted+regeneration+towards+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Head muscle fibro-adipogenic progenitors account for the tilted regeneration towards fibrosis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 589, 131-138 (2022).</li>
<li>Pavlath, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+among+muscle+precursor+cells+in+adult+skeletal+muscles+with+differing+regenerative+capacities%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity among muscle precursor cells in adult skeletal muscles with differing regenerative capacities.</a> Developmental Dynamics. 212 (4), 495-508 (1998).</li>
<li>Camacho-Alonso, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+lingual+musculature+in+rats+using+myoblasts+over+porcine+bladder+acellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Diseases%22%5BJournal%5D)">Regeneration of lingual musculature in rats using myoblasts over porcine bladder acellular matrix.</a> Oral Diseases. 27 (6), 1580-1589 (2021).</li>
<li>LeBoff, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinician%27s+guide+to+prevention+and+treatment+of+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoporosis+International%22%5BJournal%5D)">The clinician's guide to prevention and treatment of osteoporosis.</a> Osteoporosis International. 33 (10), 2049-2102 (2022).</li>
<li>Julien, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+contribution+of+skeletal+muscle+mesenchymal+progenitors+to+bone+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Direct contribution of skeletal muscle mesenchymal progenitors to bone repair.</a> Nature Communications. 12 (1), 2860(2021).</li>
<li>Mahdy, M. A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycerol-induced+injury+as+a+new+model+of+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Glycerol-induced injury as a new model of muscle regeneration.</a> Cell and Tissue Research. 374 (2), 233-241 (2018).</li>
<li>Guardiola, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+acute+skeletal+muscle+regeneration+by+cardiotoxin+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Induction of acute skeletal muscle regeneration by cardiotoxin injection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (119), 54515(2017).</li>
<li>Larouche, J. A., Wallace, E. C., Spence, B. D., Buras, E., Aguilar, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+mapping+of+immune+and+stem+cell+dysregulation+after+volumetric+muscle+loss%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal mapping of immune and stem cell dysregulation after volumetric muscle loss.</a> JCI Insight. 8 (7), e162835(2023).</li>
<li>Anderson, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+a+critical+size+threshold+for+volumetric+muscle+loss+in+the+mouse+quadriceps%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Determination of a critical size threshold for volumetric muscle loss in the mouse quadriceps.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 25 (2), 59-70 (2019).</li>
<li>Lukjanenko, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+disrupts+muscle+stem+cell+function+by+impairing+matricellular+WISP1+secretion+from+fibro-adipogenic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Aging disrupts muscle stem cell function by impairing matricellular WISP1 secretion from fibro-adipogenic progenitors.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 433-446.e7 (2019).</li>
<li>Dong, J., Dong, Y., Chen, Z., Mitch, W. E., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathway+to+muscle+fibrosis+depends+on+myostatin+stimulating+the+differentiation+of+fibro%2Fadipogenic+progenitor+cells+in+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The pathway to muscle fibrosis depends on myostatin stimulating the differentiation of fibro/adipogenic progenitor cells in chronic kidney disease.</a> Kidney International. 91 (1), 119-128 (2017).</li>
<li>Lemos, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nilotinib+reduces+muscle+fibrosis+in+chronic+muscle+injury+by+promoting+TNF-mediated+apoptosis+of+fibro%2Fadipogenic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors.</a> Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).</li>
<li>Joe, A. W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+injury+activates+resident+fibro%2Fadipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).</li>
<li>Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibro-adipogenic+progenitors+cross-talk+in+skeletal+muscle%3A+the+social+network%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+In+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: the social network.</a> Frontiers In Physiology. 10, 1074(2019).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

研究骨骼肌再生有多种损伤模型，包括使用物理、化学和手术刺激的方法10,11,12,13,14,15,16。其中，心脏毒素和氯化钡是两种最广泛用于启动肌肉再生的化学物质10,11，但它们通常在约7天时引起短暂的纤维化，并在3周后完成再生12,14。局部注射甘油适用于模拟伴有异位脂肪积聚的肌肉疾病，例如杜氏肌营养不良症<sup class="xref...

口面部肌肉在咀嚼、言语、呼吸和面部表情等日常生理活动中起着关键作用1。然而，在先天性口面部畸形中，这些肌肉会出现萎缩性和纤维化改变，导致身体健康受损以及社会认知功能障碍2。目前，面部重建手术仍是首选治疗方法，但术后仍有30%-70%的患者存在肌肉缺失和肌肉功能障碍3,4。口面部肌肉再生失败被认为与内在因素有关，仅靠手术无法纠正这些因素。
口面部肌肉的出现是一种进化上的新特征，伴随着复杂的脊椎动物头部和分腔心脏的形成5,6。与源自体节的四肢肌肉不同，口面部肌肉起源于鳃弓7。这些系统发育和个体发育特征可能使其具有独特的再生行为8。已有报道称，在胫骨前肌（TA）经历相同程度损伤后已完全再生时，咬肌（MAS）却出现了严重的纤维化1,9。然而，其再生的潜在机制仍不清楚。
本研究建立了小鼠咬肌的冷冻损伤模型，以促进对口面部肌肉再生的研究。我们选择损伤后14天作为评估纤维化表型的时间点，因为这是两种肌肉之间可辨别差异最早出现的时间点。咬肌在损伤后的完全再生至少需要40周1。本研究结果一致显示，在损伤后14天，与胫骨前肌（TA）的正常再生相比，咬肌（MAS）在冷冻损伤后表现出显著的胶原沉积。借助该模型，可进一步开展关于肌肉萎缩和纤维化的机制研究，从而有助于开发潜在的治疗策略，促进术后口面部肌肉的再生。

<table><tbody><tr><td>1 mL 注射器</td><td>中国四川成都施丰医疗器械有限公司</td><td>1毫升注射器</td><td>/</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Chron Chemicals</td><td>丙酮</td><td>/</td></tr><tr><td>黏附显微镜载玻片</td><td>Citotest Scientific</td><td>188105</td><td>/</td></tr><tr><td>动物脱毛剂</td><td>菲基因科学</td><td>PH1877</td><td>/</td></tr><tr><td>BSA（牛血清白蛋白）</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>A8010</td><td>/</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>C0065</td><td>/</td></tr><tr><td>驴抗山羊 Alexa Fluor 488</td><td>Abcam</td><td>ab150129</td><td>1:200</td></tr><tr><td>驴血清</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>SL050</td><td>/</td></tr><tr><td>干冰</td><td>Sinrro 技术公司（中国四川成都）</td><td>米粒状干冰</td><td>/</td></tr><tr><td>IFKine Red 驴抗兔</td><td>Abbkine Scientific Company</td><td>A24421</td><td>1:200</td></tr><tr><td>绝缘桶（大）</td><td>热敏器</td><td>D600</td><td>/</td></tr><tr><td>绝缘筒（小型）</td><td>Polar Ware</td><td>250B</td><td>/</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>中国广东深圳RWD生命科技有限公司</td><td>R510-22</td><td>/</td></tr><tr><td>异戊烷</td><td>MACKLIN</td><td>M813375</td><td>/</td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9393</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>液氮</td><td>Sinrro 技术公司（中国四川成都）</td><td>/</td><td>/</td></tr><tr><td>M.O.M试剂盒</td><td>Vector Laboratories</td><td>BMK-2202</td><td></td></tr><tr><td>小鼠&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;成都达硕生物科技有限公司（中国四川成都）</td><td>5周龄</td><td>/</td></tr><tr><td>封片剂</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>S2100</td><td>/</td></tr><tr><td>中性树胶</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>G8590</td><td>/</td></tr><tr><td>Pax7</td><td>发育研究杂交瘤库&amp;nbsp;</td><td>Pax7</td><td>1:5</td></tr><tr><td>Pdgfra</td><td>R&amp;amp;D系统</td><td>AF1062</td><td>1:40</td></tr><tr><td>Sirus Red 染色试剂盒</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>G1472</td><td>/</td></tr><tr><td>手术器械（镊子、剪刀、持针器、手术刀和缝合线）</td><td>中国江苏宿迁卓越医疗仪器有限公司</td><td>/</td><td>/</td></tr><tr><td>Tissue-tek OCT</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>/</td></tr><tr><td>Triton</td><td>上海思吉睿生物科技</td><td>ABIO-Biofroxx-0006A</td><td>/</td></tr><tr><td>Zoletil</td><td>Virbac</td><td>Zoletil 50</td><td>/</td></tr></tbody></table>

小鼠咬肌冷冻损伤以建立口面部肌肉纤维化模型

Freezing Injury in Mouse Masseter Muscle to Establish an Orofacial Muscle Fibrosis Model

口面部肌肉是骨骼肌组织的一个亚群，具有独特的进化历程和发育起源。与源自体节的四肢肌肉不同，口面部肌肉起源于鳃弓，并完全由颅神经嵴细胞贡献形成。最近一项研究发现，口面部肌肉群的再生过程也存在差异。然而，其潜在的调控机制仍有待揭示。目前的骨骼肌再生模型主要集中在四肢和躯干肌肉。在本实验方案中，采用干冰诱导小鼠咬肌和胫骨前肌产生冷冻损伤，以建立口面部肌肉纤维化模型。两种肌肉中肌肉卫星细胞和成纤维-脂肪生成祖细胞的时间动态存在差异，导致肌纤维再生受损以及细胞外基质过度沉积。借助该模型，可进一步深入研究口面部区域的肌肉再生机制，为口面部疾病患者开发治疗策略提供依据。

HE 染色和 Sirius Red 染色（图 4 和 补充图 S1）显示，在该冷冻损伤模型中，胫骨前肌（TA）实现了完全的肌肉再生。相比之下，MAS 表现出肌纤维再生受损以及细胞外基质过度沉积。完整状态下的 MAS 和 TA 肌肉组织学图像见图 4A、B，其中肌纤维排列整齐，纤维化区域仅出现在间质及不同肌束之间。损伤后 14 天，TA 肌肉的结构仍基本保持与其完整对照组一致（图 4G-J），而 MAS 肌肉的结构则严重紊乱（图 4C-F）。在 MAS 肌肉的前部、中部和后部横截面上，几乎所有肌纤维的位置均被纤维化区域取代（图 ...

本实验方案的目的是建立一种口面部肌肉纤维化模型。通过比较小鼠咬肌与胫骨前肌在冷冻损伤后的组织学特征，证实了咬肌发生纤维化。该模型将有助于进一步研究口面部肌肉纤维化潜在的机制。

口面部肌肉是骨骼肌组织的一个亚群，具有独特的进化路径和发育起源。与体节来源的……

目前关于骨骼肌再生的研究主要集中在四肢和躯干肌肉，而口腔面部肌肉再生的特征和机制在很大程度上仍未被探索。本研究的目的是建立一种更简便且可靠的小鼠模型，以促进对口腔面部区域肌肉再生的进一步研究。近期的研究进展表明，口腔面部肌肉构成骨骼肌中一个独特的亚群，具有特殊的进化路径和发育起源。它们与四肢肌肉相比也表现出不同的再生能力。有必要深入研究口面部肌肉的再生过程，以阐明这些显著差异背后的机制。本研究提出了一种快速且可重复的方法，用于研究口面部肌肉的再生。整个冷冻损伤过程耗时20分钟，每只小鼠的取材过程仅需10分钟，且小鼠对损伤耐受良好，无任何运动功能障碍。由于本模型允许从形态学、组织学及分子调控等多个方面，对纤维化的咬肌与完全再生的胫骨前肌进行后续比较，因此为我们深入探究其潜在机制提供了一个强有力的工具。未来的研究将聚焦于定植的肌肉干细胞与多种微环境细胞之间改变的因果关系，并相应地开发针对口面部肌肉纤维化过程的干预措施。首先，将麻醉后的小鼠置于手术台上。使用棉签将脱毛膏涂抹于皮肤表面，覆盖咬肌和胫骨前肌区域。等待一到两分钟后，用外科擦拭巾洗去糊状物。为了暴露咬肌，首先沿下颌骨下缘进行触诊。从下颌骨边缘起始五毫米处，沿口角至耳屏的连线切开皮肤。进行冷冻操作时，使用预冷的镊子夹取一块干冰。将干冰沿咬肌的长轴方向直接放置于肌肉表面，保持五秒钟。移除干冰后，立即确认肌肉呈现僵硬且苍白的状态，并在22至25秒内恢复至正常的颜色和质地。待肌肉完全恢复后，使用至少三针7-0缝线闭合皮肤切口。对于胫骨前肌，沿小腿触诊以确定胫骨前缘的位置。从该边缘后方2毫米处开始，沿皮肤从膝部至踝部做切口。进行冷冻操作时，使用预冷的镊子夹取一块干冰。将干冰沿胫骨前肌的长轴方向直接放置于肌肉表面，保持五秒钟。移除干冰后，立即确认肌肉组织变得僵硬且呈苍白色，随后在22至25秒内恢复至正常的颜色和质地。缝合皮肤伤口后，将小鼠置于温度维持在约 38 摄氏度的加热板上。持续监测，直至小鼠恢复翻正反射。通过为每个样本制作圆柱形锡箔，准备包埋模具。用最佳切割温度（OCT）包埋剂填充模具。然后准备两个隔热桶，将异戊烷加入小桶中，液氮加入大桶中。在肌肉解剖前10分钟，将小桶放入较大的桶内。首先准备小鼠以进行解剖。切开小鼠面部的皮肤，暴露咬肌。切除腮腺以充分暴露咬肌的后部。从咬肌在下颌骨前部的附着点开始，向后分离至其在下颌骨后部的附着点。随后将肌肉组织浸入OCT包埋剂中，使其垂直于切面方向固定。使用针持将模具转移至预冷的异戊烷中。等待40秒，直至OCT变为白色且完全凝固。将新鲜冷冻的肌肉样本存放于已标记的24孔板中。立即在 20 摄氏度下对样本进行切片，或在 -80 摄氏度下保存以长期使用。接着，从踝关节到膝关节切开皮肤，去除筋膜以暴露胫骨前肌。用显微解剖镊的尖端分离胫骨前肌的肌腱，并向膝关节方向滑动，以折断附着于胫骨的纤维，然后在踝关节处切断肌腱。HE染色和天狼星红染色显示，胫骨前肌在冷冻损伤后14天表现出完全再生，形态与完整对照组相似。相比之下，咬肌在冷冻损伤14天后表现出肌纤维再生受损，并伴有过度的细胞外基质沉积。损伤后14天的Pax7免疫组织化学染色显示细胞核密集，但肌肉卫星细胞未呈比例增加。在损伤后14天，于胫骨前肌中检测到大量位于中央区域的肌纤维。而在咬肌的损伤区域，肌纤维的轮廓几乎不可见，取而代之的是Pdgfr-alpha+FAPs的浸润。

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小鼠咬肌冷冻损伤以建立口面部肌肉纤维化模型

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