建立一种用于癌症研究的生理性人源血管化微肿瘤模型

我们的肿瘤芯片平台旨在生理学上模拟人类血管化微肿瘤的生长，使我们能够回答基础研究和转化研究中的诸多问题，包括肿瘤生物学基础、药物疗效、肿瘤应答性、潜在的免疫学过程、可能的免疫治疗干预以及个体化治疗策略等。将临床前研究成果有效转化为强有力的癌症治疗方法，关键在于能否真实地复制疾病状态和模型系统。本方案详细阐述了建立血管化微肿瘤（VMT）以在体外模拟肿瘤微环境的过程。

该VMT忠实地再现了人类肿瘤的关键特征，能够产生具有临床相关性的研究结果。我们的模型使我们能够开展具有生理相关性的转化型人类癌症研究。具体而言，与其它模型相比，本实验方案引入了动态流动条件，能够整合免疫细胞和免疫治疗，并进一步支持个体化医疗方法的融入。

我们正在采用VMT模型推动临床前和临床领域的个性化医疗计划。该模型加深了我们对细胞间相互作用中影响治疗耐药性和癌症进展的微环境因素的理解。此外，VMT在发现针对患者的个性化治疗方案以提升临床诊疗水平方面展现出广阔前景。

首先，将HBSS细胞解离试剂、EGM-2和DMEM置于37摄氏度水浴中预热10至15分钟。在4摄氏度条件下过夜解冻凝血酶和层粘连蛋白，纤维蛋白原则在室温下解冻。取1.5 µL凝血酶加入一个500 µL微量离心管中。

将经过紫外线灭菌的高通量培养板放入干燥器中30分钟，以去除微流控芯片中滞留的空气。将T75培养瓶置于显微镜下，使用4倍物镜观察，以确认细胞汇合度和转导效率。用5毫升HBSS缓冲液洗涤细胞两次。

然后向培养瓶中加入1毫升解离试剂，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1至2分钟。用手掌轻轻拍打培养瓶，于显微镜下观察，确认所有细胞均已脱落。用9毫升适当的培养基洗涤细胞，并将悬液收集至15毫升锥形管中。

立即取出少量等分试样，进行细胞计数。将细胞悬液在 300 g、4 °C 条件下离心 3 至 5 分钟。然后弃去上清液，并将沉淀物在冰上用适当的培养基重新悬浮。

根据给定的公式计算所需的细胞数量。将细胞重悬于浓度为 1 × 10⁶ 个细胞/毫升的溶液中，并使用以下公式计算所需的细胞体积。按照演示方法，离心所需体积的细胞悬液。

然后，在已计算好的纤维蛋白原体积中，于冰上重悬沉淀。首先，将经紫外线灭菌的高通量培养板和凝血酶分装液放入组织培养超净台中。将制备好的细胞-纤维蛋白混合物置于冰上，以减缓凝结过程。

使用P20移液器吸取六微升细胞-纤维蛋白混合液。然后将移液器吸头轻轻插入凝血酶分装液中，轻柔吹打混匀两次，避免引入气泡。

将高通量板倾斜抬起，迅速将移液枪吸头插入其中一个加样口。以平稳流畅的动作将移液枪按钮压至第一档，将细胞-纤维蛋白混合物注入组织腔室中。确保凝胶完全穿过整个腔室。

轻轻将酶标板平放，不要取下移液器吸头或移动移液器。使用手从P20上取下吸头，并将其留在加样孔中。两分钟后，以轻柔的旋转动作从加样孔中取出吸头，并将板盖盖在酶标板上。

将培养板在37摄氏度下孵育15至20分钟，以实现凝胶聚合。将微流控装置置于显微镜载物台上，观察细胞在整个腔室内的均匀分布情况，并确保无气泡存在。将P20移液器吸头插入M1或M3孔中，缓慢排出4 µL层粘连蛋白，以包被整个上层表面。

按照之前演示的方法移除移液枪头，将培养板在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育10分钟。向位于A行和B行的未连接储液池的孔中加入275微升EGM-2完全培养基。将P200移液枪头插入含有275微升EGM-2的孔的培养基入口孔中，缓慢排出75微升培养基，观察培养基流经通道并在另一侧冒出气泡。移除移液枪头后，将枪头中剩余的培养基推入培养基储液池中。向G行和H行的低侧孔中各加入50微升培养基，完全覆盖孔底。按照演示方法，将培养板孵育1至2小时。

在显微镜下观察培养基通道中是否存在气泡，并通过向通道中重新加入75微升培养基来去除气泡。用肉眼检查培养基入口或出口处是否有气泡。然后将P200移液器吸头插入孔中，通过提起活塞将气泡抽出。

在带血管的微器官（VMO）中，内皮细胞最初在组织腔内均匀分布，但到第2天时，它们开始伸展并形成管腔。到第4天，内皮细胞与外部微流控通道吻合，形成连续的血管网络。通过向微血管网络灌注FITC-葡聚糖并观察到极少泄漏，证实了紧密的血管屏障功能。

将 MDA-MB-231 癌细胞灌注到 BMO 中后，细胞会黏附于血管内皮层，并随后迁移至细胞外空间，在灌注后 24 小时内形成多个微转移灶。通过延时显微成像技术，观察到 T 细胞在 45 分钟内迁移至 VMO 的细胞外空间。在具有完整血管结构的血管化微肿瘤中，T 细胞在灌注后迅速黏附于血管壁。