Name: 建立用于癌症研究的生理性人血管化微肿瘤模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-15T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 了解血管化微肿瘤芯片平台的建立方法，用于模拟人体肿瘤微环境并研究肿瘤生物学、药物疗效及免疫治疗。该技术整合多种人源细胞类型，在动态流动条件下形成新生血管网络，支持肿瘤细胞外渗和免疫细胞相互作用的高分辨率成像，为癌症转化医学和个性化治疗研究提供可靠的体外模型。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢 Christopher Hughes 博士实验室成员对本文所述实验步骤提供的宝贵意见，同时感谢 Abraham Lee 博士实验室的合作者们在平台设计与制造方面给予的支持。本研究工作获得了以下资助项目的支持：UG3/UH3 TR002137、R61/R33 HL154307、1R01CA244571、1R01 HL149748、U54 CA217378（CCWH）和 TL1 TR001415 以及 W81XWH2110393（SJH）。

Preparing a Microfluidics-Based Vascularized Human Micro-Tumor Model

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2023%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2023.</a> CA Cancer J Clin. 73 (1), 17-48 (2023).</li>
<li>Hachey, S. J., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+tumor+chip+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Applications of tumor chip technology.</a> Lab Chip. 18 (19), 2893-2912 (2018).</li>
<li>Ewald, M. L., Chen, Y. H., Lee, A. P., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vascular+niche+in+next+generation+microphysiological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">The vascular niche in next generation microphysiological systems.</a> Lab Chip. 21 (17), 3615-3616 (2021).</li>
<li>Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+microfluidic+organ-chips+for+drug+screening%2C+disease+models+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Vascularized microfluidic organ-chips for drug screening, disease models and tissue engineering.</a> Curr Opin Biotechnol. 52, 116-123 (2018).</li>
<li>Shirure, V. S., Hughes, C. C. W., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+vascularized+organoid-on-a-chip+models%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Engineering vascularized organoid-on-a-chip models.</a> Annu Rev Biomed Eng. 23, 141-167 (2021).</li>
<li>Del Piccolo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-on-chip+modeling+of+organ-specific+cancer+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Tumor-on-chip modeling of organ-specific cancer and metastasis.</a> Adv Drug Deliv Rev. 175, 113798(2021).</li>
<li>Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+cancer+in+microfluidic+human+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips.</a> Nat Rev Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).</li>
<li>Sobrino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+microtumors+in+vitro+supported+by+perfused+vascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">3D microtumors in vitro supported by perfused vascular networks.</a> Sci Rep. 6, 31589(2016).</li>
<li>Phan, D. T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vascularized+and+perfused+organ-on-a-chip+platform+for+large-scale+drug+screening+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A vascularized and perfused organ-on-a-chip platform for large-scale drug screening applications.</a> Lab Chip. 17 (3), 511-520 (2017).</li>
<li>Hachey, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+vascularized+micro-tumor+model+of+human+colorectal+cancer+recapitulates+in+vivo+responses+to+standard-of-care+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">An in vitro vascularized micro-tumor model of human colorectal cancer recapitulates in vivo responses to standard-of-care therapy.</a> Lab Chip. 21 (7), 1333-1351 (2021).</li>
<li>Hachey, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Human+Vascularized+Micro-Tumor+Model+of+Patient-Derived+Colorectal+Cancer+Recapitulates+Clinical+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">A Human Vascularized Micro-Tumor Model of Patient-Derived Colorectal Cancer Recapitulates Clinical Disease.</a> Transl Res. 255, 97-108 (2023).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+in+vitro+vascularized+micro-organ+and+micro-tumor+models+are+reproducible+organ-on-a-chip+platforms+for+studies+of+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Human in vitro vascularized micro-organ and micro-tumor models are reproducible organ-on-a-chip platforms for studies of anticancer drugs.</a> Toxicology. 445, 152601(2020).</li>
<li>Jahid, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+Design+of+CDC42+Effector+Interaction+Inhibitors+for+the+Treatment+of+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Structure-based Design of CDC42 Effector Interaction Inhibitors for the Treatment of Cancer.</a> Cell Rep. 39 (4), 110760(2022).</li>
<li>Hsu, Y. H., Moya, M. L., Hughes, C. C. W., George, S. C., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+platform+for+generating+large-scale+nearly+identical+human+microphysiological+vascularized+tissue+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic platform for generating large-scale nearly identical human microphysiological vascularized tissue arrays.</a> Lab Chip. 13 (15), 2990-2998 (2013).</li>
<li>Moya, M. L., Hsu, Y. H., Lee, A. P., Christopher, C. W. H., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+perfused+human+capillary+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+-+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">In vitro perfused human capillary networks.</a> Tissue Eng - Part C: Methods. 19 (9), 730-737 (2013).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+on-chip+microfluidic+pressure+regulator+that+facilitates+reproducible+loading+of+cells+and+hydrogels+into+microphysiological+system+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">An on-chip microfluidic pressure regulator that facilitates reproducible loading of cells and hydrogels into microphysiological system platforms.</a> Lab Chip. 16 (5), 868-876 (2016).</li>
<li>Phan, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier-on-a-chip%3A+Microphysiological+systems+that+capture+the+complexity+of+the+blood-central+nervous+system+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier-on-a-chip: Microphysiological systems that capture the complexity of the blood-central nervous system interface.</a> Exp Biol Med. 242 (17), 1669-1678 (2017).</li>
<li>Kurokawa, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+endothelial+cells+for+three-dimensional+microphysiological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells for three-dimensional microphysiological systems.</a> Tissue Eng Part C: Methods. 23 (8), 474-484 (2017).</li>
<li>Romero-López, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulating+the+human+tumor+microenvironment%3A+Colon+tumor-derived+extracellular+matrix+promotes+angiogenesis+and+tumor+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Recapitulating the human tumor microenvironment: Colon tumor-derived extracellular matrix promotes angiogenesis and tumor cell growth.</a> Biomaterials. 116, 118-129 (2017).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+Image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7 (10), R100(2006).</li>
<li>Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computational+tool+for+quantitative+analysis+of+vascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+one%22%5BJournal%5D)">A computational tool for quantitative analysis of vascular networks.</a> PLoS one. 6 (11), e27385(2011).</li>
<li>Corliss, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REAVER%3A+A+program+for+improved+analysis+of+high-resolution+vascular+network+images%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">REAVER: A program for improved analysis of high-resolution vascular network images.</a> Microcirculation. 27 (5), e12618(2020).</li>
<li>Urban, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+learning+for+drug+discovery+and+cancer+research%3A+Automated+analysis+of+vascularization+images%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE%2FACM+Trans+Comput+Biol+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Deep learning for drug discovery and cancer research: Automated analysis of vascularization images.</a> IEEE/ACM Trans Comput Biol Bioinform. 16 (3), 1029-1035 (2019).</li>
<li>COMSOL Multiphysics. , Stockholm, Sweden. www.comsol.com (2023).</li>
</ol>

CCWH 对 Aracari Biosciences, Inc. 持有股权利益，该公司正在将本文所述技术的某一版本商业化。该安排的条款已由加利福尼亚大学尔湾分校根据其利益冲突政策进行审查并批准。不存在其他利益冲突。

人体几乎每一种组织都通过血管系统获取营养物质和氧气，因此血管系统在构建真实的疾病模型和药物筛选中具有关键作用 体外此外，多种恶性肿瘤和疾病状态均以血管内皮功能障碍和通透性增高为特征3值得注意的是，在癌症中，肿瘤相关血管通常灌注不良、结构紊乱且具有通透性，从而成为治疗药物和免疫细胞向肿瘤递送的屏障。此外，血管系统还为癌细胞转移至远端组织提供了通道，并促进细胞间通讯，抑制免疫应答的同时进一步推动癌细胞的生长与扩散。这些现象凸显了血管微环境在治疗耐药性和癌症进展中的关键作用，也表明在临床前研究中准确模拟肿瘤微环境的必要性。然而，传统的 体外 现有的模型系统往往缺乏适当的间质和血管成分，或未能引入动态流动条件。为解决当前模型系统的这些不足，本文介绍了一种构建特征明确的微生理系统的方法，该系统可支持活体灌注人源微肿瘤（VMT）的形成，用于生理学肿瘤学研究。重要的是，VMT模型能够模拟肿瘤相关异常血管及肿瘤-间质相互作用的关键特征，因此非常适合用于仿生疾病建模和治疗效果评估10.
<p class="jove_...

癌症仍然是全球主要的健康问题之一，也是美国的第二大死因。仅在2023年，美国国家卫生统计中心预计美国将出现超过190万例新发癌症病例和超过60万例癌症死亡病例1，凸显出对有效治疗策略的迫切需求。然而，目前进入临床试验的抗癌药物中，仅有5.1%最终获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准。有前景的候选药物在临床试验中失败的部分原因在于临床前药物研发阶段使用了非生理性的模型系统，例如二维（2D）和类球体培养系统2。这些传统癌症模型缺乏肿瘤微环境中的关键组分，如间质生态位、相关免疫细胞以及灌注性血管系统，而这些因素正是决定治疗耐药性和疾病进展的关键。因此，亟需建立一种能够更真实模拟人体in vivo肿瘤微环境的新型模型系统，以提高临床前研究成果向临床应用转化的成功率。
组织工程领域正在迅速发展，为在实验室环境中研究人类疾病提供了更先进的方法。其中一项重要进展是微生理系统（microphysiological systems, MPS）的出现，这类系统也被称为器官芯片或组织芯片，是能够模拟健康或疾病状态的功能性微型人体器官3,4,5。在此背景下，肿瘤芯片作为一种基于三维微流控技术的体外（in vitro）人源肿瘤模型，已被开发用于肿瘤学研究2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13。这些先进的模型整合了动态肿瘤微环境中的生化与生物物理信号，使研究人员能够在更接近生理条件的情境下研究肿瘤行为及其对治疗的反应。然而，尽管已有诸多进展，目前仍仅有少数研究团队成功构建出具有活性且功能完整的血管系统，尤其是能够在生理流体剪切力作用下自发形成结构的血管网络3,4,5,6。引入功能性血管网络至关重要，因为它可模拟影响药物或细胞递送的物理屏障，实现不同微环境中细胞的归巢行为，以及肿瘤细胞、基质细胞和免疫细胞的跨内皮迁移过程。通过整合这一特征，肿瘤芯片能够更真实地再现体内（in vivo）肿瘤微环境中所观察到的复杂性。
为解决这一尚未满足的需求，我们开发了一种新型药物筛选平台，可在微流控装置内实现微血管网络的形成8,9,10,11,12,13,14,15,16该基础器官芯片平台被称为血管化微器官（VMO），可适用于几乎任何器官系统，以模拟原始组织的生理特性，用于疾病建模、药物筛选和个性化医疗应用。VMO通过在腔室内共培养内皮集落形成细胞来源的内皮细胞（ECFC-EC）、HUVEC或iPSC-EC（以下统称EC）以及多种间质细胞建立，其中包括可重塑基质的正常人肺成纤维细胞（NHLF）和包裹并稳定血管的周细胞。此外，VMO还可通过将肿瘤细胞与相关间质细胞共培养，构建血管化微肿瘤（VMT），从而建立癌症模型系统。8,9,10,11,12,13，或称肿瘤芯片模型。通过在动态流动环境中共培养多种细胞类型，可形成灌注的微血管网络 从头合成 在装置的组织腔室中，血管发生过程受到间质流速的严格调控14,15培养基通过流体静压差驱动流经装置的微流控通道，仅通过微血管为组织腔周围的细胞提供营养，其通透性系数为1.2 × 10-7 cm/s，与毛细血管中观察到的情况相似 体内8.
将自组织微血管整合到VMT模型中代表了一项重大突破，因为它：1）模拟了血管化肿瘤组织的结构与功能 体内；2）可模拟转移的关键步骤，包括肿瘤-内皮细胞及基质细胞间的相互作用；3）构建具有生理选择性的屏障，用于调控营养物质和药物递送，从而提升药物筛选效果；4）可直接评估具有抗血管生成和抗转移能力的药物。通过模拟 体内 在复杂的三维微环境中实现营养物质、药物和免疫细胞的递送，VMO/VMT 平台是一种具有生理相关性的模型，可用于药物筛选以及癌症、血管或器官特异性生物学的研究。重要的是，VMT 支持多种类型肿瘤的生长，包括结肠癌、黑色素瘤、乳腺癌、胶质母细胞瘤、肺癌、腹膜癌病、卵巢癌和胰腺癌8,9,10,11,12,13除了成本低、易于建立并适用于高通量实验外，该微流控平台还完全兼容光学成像，可用于实时分析肿瘤-间质相互作用及其对刺激或治疗药物的响应。系统中每种细胞类型均标记有不同荧光标记物，从而可在整个实验过程中直接可视化并追踪细胞行为，为动态肿瘤微环境提供了一个观察窗口。我们先前已证明，VMT 能更真实地模拟 体内 肿瘤生长、结构、异质性、基因表达特征以及药物反应，优于标准培养方式10重要的是，VMT 支持患者来源细胞（包括癌细胞）的生长与研究，相较于标准的球状体培养，能更真实地模拟原发肿瘤的病理特征，并进一步推动个体化医疗的发展11本文概述了建立VMT的方法，展示了其在人类癌症研究中的应用价值。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;制备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷，95%&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>175617-100G</td><td></td></tr><tr><td>Greiner Bio-One&amp;nbsp;&amp;mu;透明底96孔聚苯乙烯微孔板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655096</td><td></td></tr><tr><td>甲醇 &amp;ge;99.8% ACS</td><td>VWR 化学品 BDH</td><td>BDH1135-1LP</td><td></td></tr><tr><td>MILTEX 无菌一次性活检穿孔器（带推杆），直径 1 mm</td><td>Integra Miltex</td><td>33-31AA-P/25</td><td></td></tr><tr><td>PDMS 膜</td><td>PAX Industries</td><td>HT-6240</td><td></td></tr><tr><td>等离子清洗机 PDC-001</td><td>Harrick Plasma</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Smooth-Cast 385</td><td>Smooth-On</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>SP Bel-Art 实验室伴侣透明聚碳酸酯柜式真空干燥器</td><td>Bel-Art</td><td>F42400-4031</td><td></td></tr><tr><td>带冷凝环的标准盖，96孔板</td><td>VWR</td><td>82050-827</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 硅弹性体试剂盒（PDMS）</td><td>道</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;细胞培养/加样&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioTek Lionheart FX 全自动显微镜</td><td>安捷伦&amp;nbsp;</td><td>CYT5MFAW</td><td></td></tr><tr><td>CELLvo 人内皮祖细胞</td><td>StemBioSys</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>I型胶原，大鼠尾部</td><td>Enzo Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胶原酶来自 &lt;em&gt;Clostridium histolyticum&lt;/em&gt; （4型）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>康宁·汉克&amp;rsquo;不含钙和镁的1倍平衡盐溶液</td><td>康宁</td><td>21-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>康宁&amp;nbsp;含L-谷氨酰胺、4.5 g/L葡萄糖和丙酮酸钠的DMEM培养基</td><td>康宁</td><td>10013CV</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>不含钙、镁的DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 内皮细胞生长培养基-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>牛血浆纤维蛋白原</td><td>Neta Scientific</td><td>SIAL-341573</td><td></td></tr><tr><td>人血浆纤维连接蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>异硫氰酸荧光素&amp;ndash;葡聚糖（70kDa）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD70S-1G</td><td></td></tr><tr><td>猪皮明胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>来自绵羊睾丸的透明质酸酶（4型）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6254</td><td></td></tr><tr><td>小鼠层粘连蛋白</td><td>Gibco</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP8</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>NHLF &amp;ndash; 正常人肺成纤维细胞</td><td>Lonza</td><td>CC-2512</td><td></td></tr><tr><td>尼康 Eclipse Ti</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>0.1 M 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中含 4% 多聚甲醛</td><td>电子显微镜科学公司&amp;nbsp;</td><td>15735-90-1L</td><td></td></tr><tr><td>外周血单个核细胞（PBMCs）</td><td>Lonza</td><td>CC-2702</td><td></td></tr><tr><td>PBS，pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>优质级胎牛血清（FBS），经热灭活</td><td>Avantor Seradigm</td><td>97068-091</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Invitrogen</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>Quick-RNA Microprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>R1051</td><td></td></tr><tr><td>牛血浆凝血酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100（电泳级），</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express 酶（1X），酚红</td><td>Gibco</td><td>12605028</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.05%），酚红</td><td>Gibco</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>Vasculife</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>LL-0003</td><td></td></tr></tbody></table>

建立一种用于癌症研究的生理性人源血管化微肿瘤模型

Establishing a Physiologic Human Vascularized Micro-Tumor Model for Cancer Research

缺乏能够模拟实体瘤肿瘤微环境的经验证癌症模型 体外 仍是癌症临床前研究和治疗开发中的一个重大瓶颈。&#160;为解决这一问题，我们开发了带血管化的微肿瘤（VMT），又称肿瘤芯片，这是一种可真实模拟复杂人类肿瘤微环境的微生理系统。该VMT形成 从头合成 在微流控平台上，通过多种人类细胞类型在动态生理流动条件下的共培养，构建出一种组织工程化微肿瘤。该微肿瘤结构包含一个活体灌注的血管网络，可像新形成的血管一样，为生长中的肿瘤团块提供支持。 体内重要的是，药物和免疫细胞必须穿过内皮层才能到达肿瘤，这需要进行建模 体内 治疗递送与疗效的生理屏障。由于VMT平台具有光学透明性，可通过直接观察组织内荧光标记的细胞，实现对免疫细胞外渗和转移等动态过程的高分辨率成像。此外，VMT保留 体内 肿瘤异质性、基因表达特征和药物反应。几乎所有类型的肿瘤均可适配于该平台，来自新鲜手术组织的原代细胞可在VMT中生长并响应药物治疗，为真正实现个体化医疗铺平了道路。本文概述了建立VMT并将其用于肿瘤学研究的方法。这一创新性方法为研究肿瘤及药物反应开辟了新的可能性，为科研人员推进癌症研究提供了强有力的工具。

按照本文所述方案，使用购自商业渠道的内皮细胞（EC）、正常人肺成纤维细胞（NHLF）以及用于血管化肿瘤模型（VMT）的三阴性乳腺癌细胞系 MDA-MB-231 建立了血管化组织器官模型（VMO）和血管化肿瘤模型（VMT）。已建立的 VMO 还通过灌注癌细胞以模拟转移过程。在每种模型中，共培养第 5 天时，组织腔内因重力驱动的流动而自发形成血管网络，作为物质输送的通道 在体 如向基质微环境递送营养物质、治疗药物、癌细胞或免疫细胞图4）。VMOs 首先通过将标记 mCherry 的 EC 引入组织腔室建立，如图所示 图 4A （培养第0天），细胞分布均匀。在血管微器官（VMO）培养的第2天，内皮细胞开始伸展并形成管腔（图4B），到第4天，EC已与外部微流控通道吻合并形成连续的血管网络（图4C）在血管形成吻合并排列于外侧通道后，用70 kD的FITC-葡聚糖灌注VMO组织以确认血管通畅性（...

本方案介绍了一种具有生理相关性的“器官芯片”肿瘤模型，可用于高效开展基础性和转化性人类癌症研究，推动药物筛选、疾病建模及个体化医学的发展，并详细描述了该模型的加载、维持和评估操作流程。

缺乏能够体外重现实体瘤肿瘤微环境的经验证癌症模型，仍是临床前研究中的一个重大瓶颈……

我们的肿瘤芯片平台旨在生理学上模拟人类血管化微肿瘤的生长，使我们能够回答基础研究和转化研究中的诸多问题，包括肿瘤生物学基础、药物疗效、肿瘤应答性、潜在的免疫学过程、可能的免疫治疗干预以及个体化治疗策略等。将临床前研究成果有效转化为强有力的癌症治疗方法，关键在于能否真实地复制疾病状态和模型系统。本方案详细阐述了建立血管化微肿瘤（VMT）以在体外模拟肿瘤微环境的过程。该VMT忠实地再现了人类肿瘤的关键特征，能够产生具有临床相关性的研究结果。我们的模型使我们能够开展具有生理相关性的转化型人类癌症研究。具体而言，与其它模型相比，本实验方案引入了动态流动条件，能够整合免疫细胞和免疫治疗，并进一步支持个体化医疗方法的融入。我们正在采用VMT模型推动临床前和临床领域的个性化医疗计划。该模型加深了我们对细胞间相互作用中影响治疗耐药性和癌症进展的微环境因素的理解。此外，VMT在发现针对患者的个性化治疗方案以提升临床诊疗水平方面展现出广阔前景。首先，将HBSS细胞解离试剂、EGM-2和DMEM置于37摄氏度水浴中预热10至15分钟。在4摄氏度条件下过夜解冻凝血酶和层粘连蛋白，纤维蛋白原则在室温下解冻。取1.5 µL凝血酶加入一个500 µL微量离心管中。将经过紫外线灭菌的高通量培养板放入干燥器中30分钟，以去除微流控芯片中滞留的空气。将T75培养瓶置于显微镜下，使用4倍物镜观察，以确认细胞汇合度和转导效率。用5毫升HBSS缓冲液洗涤细胞两次。然后向培养瓶中加入1毫升解离试剂，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1至2分钟。用手掌轻轻拍打培养瓶，于显微镜下观察，确认所有细胞均已脱落。用9毫升适当的培养基洗涤细胞，并将悬液收集至15毫升锥形管中。立即取出少量等分试样，进行细胞计数。将细胞悬液在 300 g、4 °C 条件下离心 3 至 5 分钟。然后弃去上清液，并将沉淀物在冰上用适当的培养基重新悬浮。根据给定的公式计算所需的细胞数量。将细胞重悬于浓度为 1 × 10⁶ 个细胞/毫升的溶液中，并使用以下公式计算所需的细胞体积。按照演示方法，离心所需体积的细胞悬液。然后，在已计算好的纤维蛋白原体积中，于冰上重悬沉淀。首先，将经紫外线灭菌的高通量培养板和凝血酶分装液放入组织培养超净台中。将制备好的细胞-纤维蛋白混合物置于冰上，以减缓凝结过程。使用P20移液器吸取六微升细胞-纤维蛋白混合液。然后将移液器吸头轻轻插入凝血酶分装液中，轻柔吹打混匀两次，避免引入气泡。将高通量板倾斜抬起，迅速将移液枪吸头插入其中一个加样口。以平稳流畅的动作将移液枪按钮压至第一档，将细胞-纤维蛋白混合物注入组织腔室中。确保凝胶完全穿过整个腔室。轻轻将酶标板平放，不要取下移液器吸头或移动移液器。使用手从P20上取下吸头，并将其留在加样孔中。两分钟后，以轻柔的旋转动作从加样孔中取出吸头，并将板盖盖在酶标板上。将培养板在37摄氏度下孵育15至20分钟，以实现凝胶聚合。将微流控装置置于显微镜载物台上，观察细胞在整个腔室内的均匀分布情况，并确保无气泡存在。将P20移液器吸头插入M1或M3孔中，缓慢排出4 µL层粘连蛋白，以包被整个上层表面。按照之前演示的方法移除移液枪头，将培养板在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育10分钟。向位于A行和B行的未连接储液池的孔中加入275微升EGM-2完全培养基。将P200移液枪头插入含有275微升EGM-2的孔的培养基入口孔中，缓慢排出75微升培养基，观察培养基流经通道并在另一侧冒出气泡。移除移液枪头后，将枪头中剩余的培养基推入培养基储液池中。向G行和H行的低侧孔中各加入50微升培养基，完全覆盖孔底。按照演示方法，将培养板孵育1至2小时。在显微镜下观察培养基通道中是否存在气泡，并通过向通道中重新加入75微升培养基来去除气泡。用肉眼检查培养基入口或出口处是否有气泡。然后将P200移液器吸头插入孔中，通过提起活塞将气泡抽出。在带血管的微器官（VMO）中，内皮细胞最初在组织腔内均匀分布，但到第2天时，它们开始伸展并形成管腔。到第4天，内皮细胞与外部微流控通道吻合，形成连续的血管网络。通过向微血管网络灌注FITC-葡聚糖并观察到极少泄漏，证实了紧密的血管屏障功能。将 MDA-MB-231 癌细胞灌注到 BMO 中后，细胞会黏附于血管内皮层，并随后迁移至细胞外空间，在灌注后 24 小时内形成多个微转移灶。通过延时显微成像技术，观察到 T 细胞在 45 分钟内迁移至 VMO 的细胞外空间。在具有完整血管结构的血管化微肿瘤中，T 细胞在灌注后迅速黏附于血管壁。

establishing-physiologic-human-vascularized-micro-tumor-model-for

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

建立用于癌症研究的生理性人血管化微肿瘤模型

我们介绍了用于构建和运行一种可重现异质性肿瘤微环境的微流控装置的实验流程...

用于重建肿瘤微环境的微流控装置 体外

本文介绍一种将人脐带血来源的内皮集落形成细胞（ECFCs）和骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）包埋于胶原蛋白/纤连蛋白凝胶中，皮下植入免疫缺陷小鼠的方法。该细胞与凝胶的组合可形成功能性人源血管网络，并与小鼠的脉管系统相连接。...

在免疫缺陷小鼠中构建人类微血管网络的生物工程方法

本文描述了用于构建人类三维肿瘤组织作为测试系统的方法。这些技术基于脱细胞生物血管化支架（BioVaSc）、原代人类细胞和肿瘤细胞系，可在静态条件下以及流动生物反应器的动态条件下进行培养。...

人类三维组织工程 体外 肿瘤检测系统

大脑是一个具有独特特性的部位，其特性无法通过 体外 或异位分析。通过使用立体定位固定仪和低压注射泵进行颅内注射，可可靠地建立具有可重复位置和生长特征的原位小鼠模型。...

创建解剖学上精确且可重复的人脑肿瘤颅内异种移植模型

利用三维人类生物凝胶培养系统，可将多形性胶质母细胞瘤的患者来源异种移植瘤微型化为活体微肿瘤。这种模拟体内环境的三维肿瘤检测方法适用于药物反应测试和分子谱型分析，包括激酶组学分析。...

利用三维人类生物凝胶培养系统和患者来源的胶质母细胞瘤细胞生成微肿瘤用于激酶组学分析和药物反应测试

我们描述了一种显微外科手术方法，用于构建动静脉（AV）回路，作为血管化研究的模型 体内...

小型动物模型中的动静脉环（AV环）用于研究血管生成与带血管组织工程

该方案描述了如何在球状体中构建可灌注的血管网络。通过设计球状体周围的微环境，可诱导血管生成，并将球状体与微流控装置中的微通道连接。该方法实现了对球状体的灌注，这是三维培养领域长期期待的技术。...

微流控装置中具有组织模型的可灌注血管网络

我们提供了一种建立静脉畸形小鼠异种移植模型的详细方案。该模型基于皮下注射携带TIE2和/或PIK3CA基因激活突变的患者来源内皮细胞。异种移植病灶能够高度模拟静脉畸形患者组织的组织病理学特征。...

一种静脉畸形的患者来源异种移植模型

本实验方案的目的是将乳腺上皮细胞以多细胞球体的形式直接生物打印到预先形成的内皮细胞网络上，快速构建三维乳腺-内皮共培养模型，可用于药物筛选研究。...

直接在内皮网络上生物打印三维多细胞乳腺球体

本方案描述了一种利用现成材料和原代人乳腺组织构建体外微生理系统以研究乳腺癌的方法。...

使用微生理系统在人乳腺组织中建立乳腺癌模型

了解血管化微肿瘤芯片平台的建立方法，用于模拟人体肿瘤微环境并研究肿瘤生物学、药物疗效及免疫治疗。该技术整合多种人源细胞类型，在动态流动条件下形成新生血管网络，支持肿瘤细胞外渗和免疫细胞相互作用的高分辨率成像，为癌症转化医学和个性化治疗研究提供可靠的体外模型。

建立一种用于癌症研究的生理性人源血管化微肿瘤模型

探索更多视频