利用活体小鼠进行简化的股骨内注射以实现连续骨髓分析

该技术旨在通过将珍贵的患者样本经口内途径安全地注射并移植到小鼠体内，随后进行骨髓抽吸，从而帮助我们更深入地理解正常造血过程及骨髓疾病的生物学机制。长期以来，人们已知在实验中将少量珍贵样本直接移植至小鼠骨髓比静脉注射更为高效。然而，由于缺乏实际的技术操作视频，该技术通常被认为是一项难度较高的操作。

本方案使得任何有价值的样本均可通过少量细胞轻松、安全地移植到小鼠体内。该技术需求广泛，借助本视频，任何人都能快速掌握。我们希望每位研究者都能熟练掌握此项技术，为科学进步作出重要贡献。

首先，使用 20 微升 FACS 缓冲液或冻存复苏液制备细胞悬液，细胞数量最多为 300 万。注射前将细胞悬液置于冰上保存。用聚维酮碘或氯己定消毒液和 70% 乙醇浸湿的纱布块，交替擦拭待注射股骨所在腿部三次，进行消毒。

用拇指和食指捏住股骨以固定腿部。用无名指或小指推动胫骨，使胫骨保持相对于股骨弯曲。确保正确体位，以保证注射成功。

使用无菌27G空针的边缘轻刺位于股骨上方的髌腱。为确保最佳插入点，将连接注射器的27G针头插入髌腱下方，牢固地置于股骨两髁之间，然后将针头向外、向上旋转，使其与股骨干平行对齐。

推进针头进入股骨骨髓腔时，以旋转方式移动针头。持续插入针头直至阻力明显减小。通过横向移动确认针头位置正确。

在骨髓腔内移动穿刺针的同时，向后拉动针筒活塞以产生负压。检查注射器内是否有血液或骨髓抽出，以确认穿刺针位于骨髓腔内。确认穿刺针位置正确后，缓慢拔出，然后将含有细胞的注射器通过同一穿刺路径插入。

更换针头时，务必记住第一次注射的进针深度和角度。将细胞成功注入股骨后，小心拔出针头和注射器，同时保持对注射器的压力。随后将小鼠从鼻罩中取出，放置在干净的纸巾上，以防止吸入垫料。

恢复期间，将小鼠置于加热垫或其他可控温的表面上。在将其放回小鼠架之前，确保小鼠已从麻醉中恢复。在接下来的24小时内，观察小鼠是否有痛苦或感染的迹象。

在抽取骨髓前，先进行操作准备：取一支0.5毫升27G注射器，用CSM润洗2至3次（即先吸入再推出CSM）。然后轻柔地从已麻醉的小鼠体内抽取骨髓，获得20至50微升骨髓液。随后将针头完全从股骨中取出，并将抽吸所得样本悬浮于500微升CSM中。

将小鼠从鼻罩中取出，放置在干净的纸巾上，以防止恢复期间吸入垫料。在将小鼠放回鼠架背部之前，需监测所有小鼠，确认其已从麻醉状态中恢复。在4°C条件下，以300×g离心5分钟，使骨髓细胞形成沉淀。

吸去上清液，向每管中加入ACK裂解缓冲液。涡旋振荡细胞以重悬，冰上放置5至10分钟。将细胞悬液通过尼龙网筛过滤至新管中。

用FACS缓冲液冲洗原始离心管，并通过尼龙滤网过滤，然后在4°C下以300×g离心5分钟，再次沉淀细胞。吸除沉淀细胞中的上清液，加入含有目标抗体的染色溶液。将离心管置于冰上孵育20分钟。

洗涤细胞，并根据实验设计进行后续分析。利用生物发光成像技术，可在对小鼠侵入性最小的情况下，轻松评估移植效果。此处观察了在异种移植小鼠模型中，于注射侧股骨部位移植人源K562细胞系并使用Acalook的成像结果。

移植CD34阳性HSPCs在移植后八周实现了超过10%至20%的人源细胞植入。类似地，移植脐带血来源的HSCs在移植后八周可实现高达10%的人源细胞植入。利用该方法，还成功实现了成人骨髓来源HSPCs、白血病干细胞、经CRISPR Cas9编辑的脐带血来源HSPCs以及患者来源的AML iPSCs的移植。