Name: 从斑马鱼幼虫中分离肠道进行单细胞RNA测序 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: 了解从斑马鱼幼虫肠道分离细胞进行单细胞RNA测序的新方法。该技术可识别上皮、基质、血液、肌肉、免疫细胞及肠神经节，为研究胃肠道发育与疾病提供可靠手段。

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本工作由索菲亚基金会友人（SSWO WAR-63）资助。

所有斑马鱼的饲养和实验均按照伊拉斯姆斯医学中心（Erasmus MC）的机构指南和动物福利法规进行。根据荷兰法规，使用受精后5天的斑马鱼幼鱼属于无需正式伦理审批的实验类别。
1. 获取受精后5天（dpf）的野生型及tg(phox2bb:GFP)幼鱼
<ol>
	<li>设置野生型斑马鱼的繁殖，并在15 cm培养皿中用HEPES缓冲的E3培养基（以下简称E3）收集50枚卵。将这些鱼用作荧光激活细胞分选（FACs）的阴性对照。</li>
	<li>设置tg(phox2bb:GFP)斑马鱼的繁殖，并在15 cm培养皿中的E3培养基中收集约300枚卵。</li>
	<li>将受精卵置于E3培养基中（每皿最多50枚卵），在28.5 °C的培养箱中以14小时光照/10小时黑暗的循环条件下培养。</li>
	<li>在受精后1天（1 dpf）时去除未受精卵，让受精卵继续发育至5天（5 dpf）。</li>
	<li>在受精后1天（1 dpf）时挑选tg(phox2bb:GFP)转基因幼鱼。</li>
</ol>
2. 野生型完整幼虫的解离
<ol>
	<li>用0.016%三卡因麻醉5 dpf幼鱼。</li>
	<li>在含有1 mL 10x胰蛋白酶-EDTA溶液的培养皿中，用剃刀片将30条斑马鱼切成小块。</li>
	<li>将切碎的斑马鱼转移至微量离心管中，加入10x胰蛋白酶-EDTA溶液至总体积为2 mL，冰上放置3小时。每隔1小时用P1000移液器吹打混匀，以促进组织解离。</li>
</ol>
3. 肠道分离
<ol>
	<li>在解剖显微镜下，将6-10条用0.016%三卡因麻醉的5 dpf幼鱼并排放置于1.8%琼脂糖平板（25 mL E3中含0.45 g琼脂糖）上。</li>
	<li>用一根昆虫针固定斑马鱼头部。</li>
	<li>用纸巾彻底去除残留的E3溶液。</li>
	<li>使用另一根昆虫针分离肠道，注意不要扰动其他器官。确保卵黄已完全去除（补充图S1A）。</li>
	<li>肠道分离后，检查并根据需要去除所有非肠道组织（如皮肤、脂肪、肝脏）。</li>
	<li>用镊子收集肠道，放入预冷的含磷酸盐缓冲液（PBS）和10%胎牛血清（FCS）的微量离心管中，置于冰上。 
	&#8203;注意：应至少分离244个肠道，总解剖时间控制在3小时内。两人并行操作可实现此目标。</li>
</ol>
4. 肠道解离
<ol>
	<li>在取出所有肠道组织后，立即将微量离心管以最高速度（13,800 × g）离心30秒。</li>
	<li>吸除PBS/10% FCS，但保留少量液体（约100 µL），以防止肠道组织干燥。加入500 µL含有CaCl2和MgCl2的HBSS溶液，其中含2.17 mg/mL木瓜蛋白酶，用于细胞解离。</li>
	<li>加入2.5 µL半胱氨酸（1 M）以激活木瓜蛋白酶。</li>
	<li>将肠道组织置于37 °C水浴中孵育10分钟。在孵育5分钟时，用移液器轻轻吹打混匀一次，以促进酶解消化组织。</li>
	<li>使用预先用0.5 mL PBS/10% FCS润湿的35 µm细胞筛，将细胞转移至FACS管中。</li>
	<li>分次每次0.5 mL，共加入2 mL PBS/10% FCS洗涤细胞筛。</li>
	<li>在4 °C下以700 × g离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀重悬于300 µL PBS/10% FCS中。</li>
	<li>加入终浓度为1 µg/mL的4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（1:1,000稀释），标记死细胞，并孵育5分钟，以便在流式细胞分选（FACS）过程中排除死细胞。</li>
</ol>
5. FACS 富集
<ol>
	<li>使用野生型样本在流式细胞仪上记录3,000 个细胞，以设定待分选细胞群的门控参数（补充图 S1B-E）。</li>
	<li>使用100 µm 喷嘴，将分选精度设置为纯度模式，并将含有 200 µL PBS/5% FCS 的收集管放入 FACS 仪器中。</li>
	<li>加载肠道细胞悬液，并通过排除双联体（图 2B）和死细胞（图 2C），将活的（DAPI 阴性）单细胞分选至收集管中（图 2C）。 
	注意：对于 tg(phox2bb) 斑马鱼，GFP+ 细胞的比例仅作参考，所有活的单细胞均会被分选。</li>
	<li>细胞分选后，立即将收集管置于冰上保存。</li>
	<li>使用血细胞计数板对细胞悬液进行计数，并用台盼蓝进行活力检测。若细胞活力至少达到 80%，则继续下一步操作。</li>
	<li>此时细胞已准备好用于单细胞 RNA 测序（scRNAseq）（例如 10x Genomics Chromium 平台）。每样本使用约 20,000 个细胞。</li>
</ol>

Processing Gut Cells from Zebrafish Larvae for Single-Cell RNA Sequencing

<ol><li>Saldana-Morales, F. B., Kim, D. V., Tsai, M. T., Diehl, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Healthy+intestinal+function+relies+on+coordinated+enteric+nervous+system%2C+immune+system%2C+and+epithelium+eesponses%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Healthy intestinal function relies on coordinated enteric nervous system, immune system, and epithelium eesponses.</a> Gut Microbes. 13 (1), 1-14 (2021).</li>
<li>Sitrin, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSitrin%2C+M+%22The+Gastrointestinal+System%22">The Gastrointestinal System</a>. , (2014).</li>
<li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organisation+of+the+autonomic+nervous+system%3A+peripheral+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Autonomic+Neuroscience%3A+Basic+and+Clinical%22%5BJournal%5D)">The organisation of the autonomic nervous system: peripheral connections.</a> Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 130 (1-2), 1-5 (2006).</li>
<li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enteric+nervous+system+and+neurogastroenterology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The enteric nervous system and neurogastroenterology.</a> Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 9 (5), 286-294 (2012).</li>
<li>Obata, Y., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+microbiota+and+the+immune+system+on+the+development+and+organization+of+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The effect of microbiota and the immune system on the development and organization of the enteric nervous system.</a> Gastroenterology. 151 (5), 836-844 (2016).</li>
<li>Heuckeroth, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hirschsprung+disease+-+integrating+basic+science+and+clinical+medicine+to+improve+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hirschsprung disease - integrating basic science and clinical medicine to improve outcomes.</a> Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 15 (3), 152-167 (2018).</li>
<li>Antonucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+intestinal+pseudo-obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Chronic intestinal pseudo-obstruction.</a> World Journal of Gastroenterology. 14 (19), 2953-2961 (2008).</li>
<li>De Giorgio, R., Sarnelli, G., Corinaldesi, R., Stanghellini, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+our+understanding+of+the+pathology+of+chronic+intestinal+pseudo-obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Advances in our understanding of the pathology of chronic intestinal pseudo-obstruction.</a> Gut. 53 (11), 1549-1552 (2004).</li>
<li>Bianco, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+neuromyopathies%3A+highlights+on+genetic+mechanisms+underlying+chronic+intestinal+pseudo-obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Enteric neuromyopathies: highlights on genetic mechanisms underlying chronic intestinal pseudo-obstruction.</a> Biomolecules. 12 (12), 1849(2022).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li>
<li>Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+growth+and+differentiation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Intestinal growth and differentiation in zebrafish.</a> Mechanisms of Development. 122 (2), 157-173 (2005).</li>
<li>Wallace, K. N., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+and+conserved+aspects+of+gut+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish.</a> Developmental Biology. 255 (1), 12-29 (2003).</li>
<li>Harrison, C., Wabbersen, T., Shepherd, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+visualization+of+the+development+of+the+enteric+nervous+system+using+a+Tg%28-8.3bphox2b%3AKaede%29+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">In vivo visualization of the development of the enteric nervous system using a Tg(-8.3bphox2b:Kaede) transgenic zebrafish.</a> Genesis. 52 (12), 985-990 (2014).</li>
<li>Kuil, L. E., Chauhan, R. K., Cheng, W. W., Hofstra, R. M. W., Alves, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+a+model+organism+for+studying+enteric+nervous+system+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: a model organism for studying enteric nervous system development and disease.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 629073(2020).</li>
<li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Integration+of+Single-Cell+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Integration of Single-Cell Data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li>
<li>Kuil, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+characterization+of+the+larval+zebrafish+enteric+nervous+system+at+a+single+cell+transcriptomic+level%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Unbiased characterization of the larval zebrafish enteric nervous system at a single cell transcriptomic level.</a> iScience. 26 (7), 107070(2023).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+differential+transcriptomes+and+cell+types+in+zebrafish+larvae+intestine+and+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Unraveling differential transcriptomes and cell types in zebrafish larvae intestine and liver.</a> Cells. 11 (20), 3290(2022).</li>
<li>Jin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdx1b+protects+intestinal+cell+fate+by+repressing+signaling+networks+for+liver+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Cdx1b protects intestinal cell fate by repressing signaling networks for liver specification.</a> Journal of Genetics and Genomics. 49 (12), 1101-1113 (2022).</li>
<li>Willms, R. J., Jones, L. O., Hocking, J. C., Foley, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+atlas+of+microbe-responsive+processes+in+the+zebrafish+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A cell atlas of microbe-responsive processes in the zebrafish intestine.</a> Cell Reports. 38 (5), 110311(2022).</li>
<li>Kline, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKline%2C+M+%22Fishing+for+answers%3A+Isolating+enteric+neurons+and+identifying+putative+ENS+mutants%22">Fishing for answers: Isolating enteric neurons and identifying putative ENS mutants</a>. , Iowa State University. https://doi.org/10.31274/etd-180810-5368 (2016).</li>
<li>Allan, K., DiCicco, R., Ramos, M., Asosingh, K., Yuan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+a+single+cell+suspension+from+zebrafish+retinal+tissue+for+flow+cytometric+cell+sorting+of+Muller+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Preparing a single cell suspension from zebrafish retinal tissue for flow cytometric cell sorting of Muller glia.</a> Cytometry A. 97 (6), 638-646 (2020).</li>
<li>Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+zebrafish+brain-derived+neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres.</a> Journal of Visualized Experiments. 53617 (108), 53617(2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种利用流式细胞分选（FACS）技术分离和解离5天龄斑马鱼幼鱼肠道的方法。通过该方法，我们成功地从tg(phox2bb:GFP)斑马鱼品系中收集并分析了不同类型的肠细胞，并结合10x Genomics Chromium平台进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析（图2D）。我们选择该转基因品系，是因为GFP标记可作为肠神经系统（ENS）细胞存活的指示，从而确认这些细胞也能被有效分离。然而需要强调的是，本方法可轻松拓展至其他感兴趣的斑马鱼品系，因为我们仅利用phox2bb信号用于评估神经元的存活状态，而非用于特异性筛选某一细胞亚群。由于本研究采用无偏倚策略以收集5 dpf时期存在的全部肠细胞，分选标准主要依赖于识别存活的单个细胞。这也是我们使用整条幼鱼来建立可靠且一致的门控策略的原因。考虑到分离单个肠道所耗费的人力，若在本实验的时间范围内额外分离大量肠道作为阴性对照，将不具备可行性。因此，尽管我们承认整条幼鱼中的细胞类型与肠道组织中的细胞类型存在差异，且采用了不同的解离方法，但值得注意的是，用于分选肠道细胞的门控策略可首先通过整条幼鱼样本进行初...

胃肠道（GI）是一个复杂的系统，在整体健康和生理功能中起着至关重要的作用。它负责营养物质的消化与吸收，以及代谢废物的排出1,2。胃肠道由多种细胞类型组成，包括上皮细胞、平滑肌细胞、免疫细胞以及肠神经系统（ENS），这些细胞之间密切相互作用，共同调控并维持肠道的正常功能3,4,5。胃肠道发育过程中的缺陷可能对营养吸收、微生物群组成、肠-脑轴以及肠神经系统等多个方面产生广泛影响，从而导致多种肠神经肌肉疾病，例如先天性巨结肠症和慢性假性肠梗阻6,7。这些疾病的主要特征是由于卡哈尔间质细胞、平滑肌细胞以及肠神经系统等关键细胞发生改变，引起严重的肠道运动功能障碍6,8,9。然而，胃肠道发育及其功能障碍背后的分子机制目前仍知之甚少。
斑马鱼因其快速的胚胎发育、在胚胎期和幼体期具有透明性以及易于进行遗传操作，成为研究胃肠道发育与功能障碍的宝贵模式生物10,11,12,13,14。目前已开发出多种表达荧光蛋白的转基因斑马鱼品系。其中一种典型品系为tg(phox2bb:GFP)斑马鱼，常用于研究肠神经系统（ENS），因为所有phox2bb+细胞（包括肠神经元）均被标记15,16。本文中，我们利用tg(phox2bb:GFP)斑马鱼品系，介绍一种针对受精后5天（dpf）幼鱼肠道组织进行分离以开展单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析的方法（图1）。

<table><tbody><tr><td>10x 胰蛋白酶 (0.5%)-EDTA (0.2%)</td><td>Sigma</td><td>59418C</td><td></td></tr><tr><td>带细胞筛帽的5 mL 圆底管</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 5 mL 圆底管（FACS 管），带扣盖</td><td>BD Biosciences</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Cell Ranger v3.0.2</td><td>10X Genomics</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>货号#D-9542</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Olympus SZX16</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSAria III 分选仪</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>含 CaCl&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt; 和 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 的 HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025050</td><td></td></tr><tr><td>昆虫针</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000-25</td><td></td></tr><tr><td>L-半胱氨酸</td><td>Sigma</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>MS-222，三卡因</td><td>Supelco</td><td>A5040-250G</td><td></td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶</td><td>Sigma</td><td>P4762</td><td></td></tr><tr><td>Seurat v3</td><td>Stuart 等&amp;nbsp;（2019）</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>货号#T8154</td><td></td></tr></tbody></table>

斑马鱼幼虫肠道分离用于单细胞rna测序

Gut Isolation from Zebrafish Larvae for Single-cell RNA Sequencing

胃肠道（GI）在维持生命方面执行多种重要功能。影响其发育的先天性缺陷可导致肠神经肌肉系统疾病，这凸显了理解胃肠道发育及其功能障碍相关分子机制的重要性。在本研究中，我们介绍了一种从受精后5天的斑马鱼幼鱼中分离肠道以获得活体组织的方法，&#160;可用于单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析的活细胞。该方案基于斑马鱼肠道的手动解剖，随后使用木瓜蛋白酶进行酶解离。接着对细胞进行荧光激活细胞分选，收集活细胞用于scRNA-seq。利用此方法，我们成功鉴定了多种肠道细胞类型，包括上皮细胞、基质细胞、血细胞、肌肉细胞、免疫细胞以及肠神经元和胶质细胞。因此，我们认为该方法是利用斑马鱼研究健康与疾病状态下胃肠道组成的宝贵资源。

通过本方案，我们成功地从5 dpf幼鱼中完整分离并解离了整个肠道。使用木瓜蛋白酶（papain）作为解离酶，显著提高了细胞活力，从而在244个分离的肠道样本中捕获到46,139个单个活细胞事件（占所有细胞的6.4%）（图2A）。以野生型整条幼鱼作为对照，确保分选过程得到优化，实现有效的细胞识别与分选。由于仅对活的单细胞进行分选，因此可使用整条幼鱼作为对照（补充图S1B-E）。所有分选出的肠细胞随后被送入单细胞RNA测序（scRNA-seq）平台。共测序获得9,858个细胞，每个细胞平均读长数为21,106。在scRNA-seq数据分析中，我们采用了Seurat V317。总共鉴定出48个聚类，代表12种不同的细胞类型，包括上皮细胞、间质细胞、血细胞、肌肉细胞、免疫细胞以及肠神经元和胶质细胞18。
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本文介绍了一种从受精后5天的斑马鱼幼鱼中分离肠道以进行单细胞RNA测序分析的方法。

斑马鱼幼虫肠道分离用于单细胞RNA测序

胃肠道（GI）道执行多种维持生命所必需的功能。影响其发育的先天性缺陷可导致肠神经...

我们的研究旨在探究多种鱼类幼体在胃肠道发育和功能障碍过程中发生的转录组交换。本文提供了一种新方案，可实现斑马鱼肠道内不同细胞类型的分离，该方法在理解胃肠道健康与疾病方面具有潜在应用价值。近年来，人们日益关注发育和疾病过程中前部神经系统与其他肠道细胞类型之间相互作用的研究。利用单细胞RNA测序等先进技术解析这些复杂的动态过程，有望揭示前部神经肌病的关键机制，从而实现更精准的诊断与治疗。通过本方案，我们成功鉴定出多种肠道细胞类型，包括上皮细胞、间质细胞、血细胞、肌肉细胞、免疫细胞，甚至肠神经节细胞——此前采用类似方法尚未能以如此丰富的数量捕获这些细胞类型。因此，我们提供了一种可靠的技术手段，可用于研究胃肠道在发育及功能障碍过程中的组成变化。从相应的繁殖体系中获取野生型和转基因斑马鱼卵。取一个直径15厘米的培养皿，其中含有HEPES缓冲的E2培养基或E3培养基，从目标斑马鱼繁殖体系中收集适量的受精卵。将受精卵置于E3培养基中，在28°C条件下孵育，并维持适当的明暗循环。在受精后一天（DPF）时，移除未受精的卵，并让已受精的卵继续发育至五天 DPF。在一天 DPF 时挑选转基因斑马鱼幼体。在进行全幼体解离前，使用 0.016% 三卡因麻醉五天 DPF 的野生型幼体，并将 30 条麻醉后的幼体转移至含有 1 毫升 10 倍浓度胰蛋白酶-EDTA 溶液的培养皿中。然后，使用刀片在培养皿中将幼虫切成小块。将切碎的幼虫转移至含有 2 毫升 10 倍浓度胰蛋白酶-EDTA 溶液的微量离心管中，并将试管置于冰上静置 3 小时。每隔 1 小时，用 P1000 移液器将管内液体上下吹打，以促进组织解离。首先，用 HEPES 缓冲的 E3 培养基或 E3 培养基制备 1.8% 琼脂糖平板。在解剖显微镜下操作，将六至十条麻醉后的幼鱼并排放置在琼脂糖平板上。用一根昆虫针固定每条幼鱼的头部。然后，用纸巾吸去平板上残留的 E3 培养基。使用另一根昆虫针，从幼虫中分离出肠道，同时不干扰其他任何器官。确保彻底去除卵黄。分离后，检查肠道并清除所有非肠道组织，如皮肤、脂肪或肝脏。使用镊子收集肠道，并将其转移至预置于冰上的微量离心管中的含10% FCS的PBS溶液中。在所有肠道解剖完成后立即进行离心，将微量离心管以13,800 ×g离心30秒。弃去上清液，保留约100微升液体在管中，以防止肠道组织干燥。向管中的肠组织加入 500 微升木瓜蛋白酶溶液。加入 2.5 微升 1 摩尔的半胱氨酸以激活木瓜蛋白酶。然后将含有肠组织的管置于 37 摄氏度水浴中孵育 10 分钟。五分钟后，将内容物上下吹打至半量，以促进酶解组织消化。通过预先润湿的35微米细胞筛网，将解离的细胞转移至荧光激活细胞分选（FACS）管中。加入含10% FCS的PBS溶液0.5毫升，重复洗涤数次，最终洗涤总体积达2毫升。在4°C条件下，以700G离心收集的滤液5分钟，弃去上清液。在含有10% FCS的300微升PBS中加入终浓度为1微克/毫升的DAPI。将此混合液加入沉淀中并重悬，以标记死细胞。然后，将样品置于冰上孵育5分钟，以确保在后续的FACS分析中排除死细胞。为了对从斑马鱼幼鱼中分离的肠道细胞进行荧光激活细胞分选（FACS），使用野生型完整幼鱼样品，在流式细胞仪上记录3,000个细胞，以设定待分选细胞群的门控参数。使用100微米喷嘴，并将分选精度设置为四路纯度。将含有200微升PBS（含5%胎牛血清）的收集管放入流式细胞分选仪中。加载从分离的肠道组织制备的细胞悬液，排除双联体和死细胞后，将活细胞或DAPI阴性单细胞分选至收集管中。细胞分选后立即将收集管置于冰上。使用台盼蓝进行活率检测，用血细胞计数板对悬液中的细胞数量进行计数。细胞现已准备好用于单细胞RNA测序。每个样本使用约20,000个细胞。

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Developmental Biology

发育生物学

从斑马鱼幼虫中分离肠道进行单细胞RNA测序

高质量完整RNA的分离是许多实验室实验方案中的关键步骤。在此，我们展示了从完整的斑马鱼胚胎中提取RNA并合成cDNA，以用于后续多种实验操作，包括基因表达微阵列分析。...

从斑马鱼胚胎中提取RNA及用于基因表达分析的cDNA合成

本视频介绍了一种通过机械破碎脑组织从幼年斑马鱼脑中分离神经元、巨噬细胞和小胶质细胞的实验方案。分离得到的纯化细胞群体可进一步用于基因组学分析。...

从斑马鱼幼鱼中分离脑细胞：一种获取完整神经元、巨噬细胞和小胶质细胞的技术

本方案描述了一种从斑马鱼胚胎中分离单个细胞、富集目标细胞、在基于微流控的单细胞多重系统中捕获斑马鱼细胞，以及检测单个细胞基因表达的方法。...

斑马鱼胚胎单细胞的分离与表征

本文介绍了一种分离幼体斑马鱼性腺组织的实验方案，该方法将有助于开展斑马鱼性别分化与维持机制的研究。...

斑马鱼幼体性腺组织的解剖

本文介绍一种从myc诱导的T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）斑马鱼模型中分离侧群细胞的技术。该侧群细胞检测方法具有高灵敏度，虽针对斑马鱼T-ALL描述，但也可适用于其他良性和恶性斑马鱼细胞类型。...

斑马鱼中Myc诱导的T细胞急性淋巴细胞白血病侧群细胞的分离

本方案介绍了一种从斑马鱼胚胎、幼体或分选细胞中进行全转录组分析的方法。我们包括了RNA的分离、RNA测序数据的通路分析，以及基于qRT-PCR的基因表达变化验证。...

斑马鱼RNA测序基因表达数据的样本制备与分析

我们介绍一种从幼年斑马鱼大脑中分离神经元、巨噬细胞和小胶质细胞的方案，适用于生理和病理条件。分离后，从这些细胞中提取RNA，以分析其基因表达谱。该方案可获得高质量的RNA，用于后续的qPCR和转录组学等分析。...

从幼年斑马鱼大脑中分离神经元、巨噬细胞和小胶质细胞及其RNA提取

我们介绍一种用于分析小鼠早期胚胎中microRNA表达谱的技术。该方案克服了细胞起始量少以及小RNA富集困难的挑战。本检测方法可用于分析小鼠早期胚胎不同细胞谱系中miRNA表达随时间的变化。...

从小鼠早期胚胎中制备小RNA测序文库

单个细胞核的分离依赖于细胞膜的解离和基于去垢剂的透化处理，这些步骤需要优化，且容易引入技术性假象。我们展示了一种无需去垢剂和酶的快速分离完整细胞核的方案，可直接从完整组织中获取适用于单细胞核RNA测序（snRNA-Seq）或ATAC-seq的细胞核。...

使用去污剂和酶解-free方法从完整组织中分离细胞核

本文介绍一种用于对齐和冷冻切片多个斑马鱼（Danio...

用于空间转录组学分析的斑马鱼幼虫切片的空间紧凑排列

了解从斑马鱼幼虫肠道分离细胞进行单细胞RNA测序的新方法。该技术可识别上皮、基质、血液、肌肉、免疫细胞及肠神经节，为研究胃肠道发育与疾病提供可靠手段。

斑马鱼幼虫肠道分离用于单细胞RNA测序

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