用于结构与生化研究的人类溶质载体的高通量表达与纯化

溶质转运蛋白（solute carriers，SLC）负责摄取营养物质，并参与人类疾病的发生。然而，由于对这类蛋白的研究尚不充分，目前靶向 SLC 的药物非常有限。我们开发了高效的方法，用于 SLC 的克隆、表达与纯化。

我们的工作流程可获得高纯度蛋白质，从而支持生化与结构研究，并最终为药物发现项目提供重要见解。由于溶质转运蛋白（SLC）在生物学过程、疾病发生及药物递送中具有多种重要作用，近年来受到越来越多关注，已成为极具吸引力的治疗靶点。由私营与公共部门共同推动的IMI重点项目建立了开放的Nexus资源与数据，以推动在SLC功能、生理学、病理学及治疗靶向方面的全新发现。

传统上，SLC 难以研究，因为它们是具有多种底物和不同转运机制的整合膜蛋白。近年来，冷冻电镜（cryo-EM）、Bacmid 表达系统以及新型去垢剂试剂的应用推动了膜蛋白研究领域的重大突破。生化与结构研究需要高纯度的蛋白质样品。

然而，人类溶质载体在过表达时产量往往较低，且纯化后不稳定。因此，在过去，每个靶点都需要花费数年时间来开发单独的结构以制备用于下游应用的蛋白质样品。我们的方法经过优化，可实现多个靶点或单个靶点的不同构建体的并行、高效成本研究。

因此，它在实验灵活性、成本、时间和实验室资源之间进行了精心平衡。此外，本文及坚定的网络门户中提供的所有实验方案和资源均开放获取。首先，在96孔板中加入150纳克溶质载体（Solute carrier，SLC）克隆和100纳克载体，用10毫摩尔/升、pH为8的Tris溶液将反应体系补至8微升。

然后加入 2 µL 重组酶混合液，在室温下孵育 1 小时。孵育结束后，加入 1 µL 蛋白酶 K，在 37°C 下孵育 30 分钟。将 4 µL 反应混合物加入 50 µL 化学感受态的大肠杆菌 MAC1 细胞中，采用热激法转化细胞。

转化后，将细菌悬液涂布于LB琼脂平板上。使用适当的引物及菌落PCR的标准操作流程，鉴定含有SLC基因插入片段的PHTBV 1.1载体的菌落。首先在室温水浴中解冻冷冻的溶质转运蛋白（solute carriers）或SLC细胞沉淀。

通过将135毫升基础缓冲液与三片蛋白酶抑制剂混合片混合，制备溶解缓冲液。待片剂溶解后，用该溶解缓冲液重悬沉淀。然后加入DNA，并将悬液转移至冰上预冷的下源匀浆器中。

将匀浆器保持在冰上，通过上下移动活塞约20次使溶液充分匀浆。接着，加入去垢剂储备液至终浓度为1%。将溶解混合液转移至50毫升锥形管中，在4摄氏度下缓慢旋转孵育。

孵育一小时后，离心混合物并收集上清液。用基础缓冲液平衡4至6毫升床体积的Strep-Tactin树脂。然后将平衡后的树脂加入溶解的上清液中，在4摄氏度下旋转孵育两小时。

将溶液倒入重力流柱中，让溶液自然流过。用相当于树脂床体积30倍的Strep洗涤缓冲液，分三次等量洗涤树脂。接着，加入3至5毫升洗脱缓冲液，孵育15分钟，然后收集洗脱液。

通过紫外吸收光谱法测定蛋白质浓度。混合所需洗脱组分，并加入三摩尔C蛋白酶。在4°C下缓慢旋转孵育过夜。

第二天，用尺寸排阻层析缓冲液平衡 2 至 4 毫升树脂床体积的钴金属亲和树脂。将平衡后的钴金属亲和树脂加入过夜的 3C 反应混合物中，在 4 摄氏度下旋转孵育。一小时后，将溶液倒入重力流柱中，收集穿流液。

在4°C条件下，以3000 G离心力使用100千道尔顿截留分子量的离心过滤器浓缩穿流组分。用SEC缓冲液平衡碱性SEC柱。将样品注入进样环，并运行SEC程序，调节流速使柱压低于柱制造商规定的限值。

使用组分收集器，在整个SEC运行过程中收集每份300微升的组分。合并峰值组分后，测定280纳米处的吸光度。然后将样品在截留分子量为100千道尔顿的滤膜中浓缩至所需体积。

通过SDS-PAGE电泳分析初始小规模SLC蛋白表达。GFP标记的SLC荧光显微镜观察证实蛋白特异性定位于细胞膜，并伴有显著的细胞内积累。化学和结构均一的蛋白在尺寸排阻色谱中产生单一单分散的A280峰。