Name: 用于结构和生化研究的人溶质载体的高通量表达和纯化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-29T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: 学习人溶质载体的高通量表达与纯化方法，用于结构和生化研究。本流程可高效获得纯化蛋白，支持药物发现与疾病机制探索。

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本工作在 RESOLUTE 项目内完成。RESOLUTE 项目获得了创新药物计划 2 联盟（IMI 2 Joint Undertaking）根据资助协议编号 777372 提供的资金支持。该联盟获得了欧盟“地平线 2020”研究与创新计划以及欧洲制药工业协会联合会（EFPIA）的支持。本文仅反映作者的观点，IMI、欧盟或 EFPIA 均不对其中所含信息的任何使用承担责任。pHTBV 质粒由 Frederick Boyce 教授（哈佛大学）惠赠。

Strategies for Expressing and Purifying Solute Carrier Transporters

作者声明不存在竞争性财务利益。

由于缺乏对转运蛋白功能的系统性表征，靶向溶质载体（SLC）的治疗策略开发一直受到阻碍。尽管SLC在正常生理及病理生理过程中具有多种重要作用，但针对这一蛋白家族的药物数量却远少于G蛋白偶联受体（GPCR）和离子通道63。RESOLUTE是一个国际性合作项目，旨在开发前沿的研究技术与工具，以加速并提升当前SLC研究的水平。作为RESOLUTE项目的一部分，我们建立了这些用于高效克隆、质粒筛选以及大规模表达与纯化人源SLC蛋白的实验方案。
本文描述了可扩展的SLC克隆与表达方法，这些方法已成功用于系统性研究人类SLC转运蛋白，包括假定的和孤儿SLC转运蛋白。值得注意的是，通过该方法纯化的SLC蛋白已在后续研究中成功应用于转运蛋白的结构、生物化学、功能、结合分子的生成以及小分子结合等研究。我们常规使用该方法纯化出毫克量级的多种SLC蛋白，在最佳条件下，整个实验流程（包括克隆和组织培养步骤）可在4至5周内完成。
我们的方法在经济性和并行性方面进行了优化，可系统地评估多个靶点。然而，通过使用...

膜蛋白长期以来一直是研究人员和制药工业共同关注的研究靶点。其中，溶质载体（SLC）家族是人类基因组中编码的400多个继发性转运蛋白基因组成的家族1。这些转运蛋白参与多种分子的导入和导出，包括离子2、神经递质3、脂类4,5,6,7、氨基酸8、营养物质9,10,11以及药物12。由于底物范围广泛，这些蛋白还通过毒素的转运13、滥用药物的转运及其抑制作用14,15或有害突变16等方式参与多种病理生理过程。细菌同源蛋白已被用作多个SLC家族基本转运机制的原型17,18,19,20,21,22,23,24,25。与人类蛋白相比，原核生物正源蛋白通常在结构明确的大肠杆菌（Escherichia coli）表达系统中表达效果更好26,27，并且在较小的去垢剂中更稳定，有利于获得有序晶体用于X射线晶体学分析28。然而，序列和功能上的差异使得这些远缘相关蛋白在药物发现中的应用变得复杂29,30。因此，通常需要直接研究人类蛋白，以阐明靶向SLC药物的作用机制31,32,33,34,35。尽管近年来冷冻电子显微镜（Cryo-EM）的进步使得SLC蛋白在更接近天然状态下的结构表征成为可能36,37，但这些蛋白在表达和纯化方面的困难仍然是开发靶向治疗药物和诊断工具的主要挑战。
为缓解这一挑战，RESOLUTE 联盟（re-solute.eu）开发了用于大规模表达和纯化人类 SLC 家族蛋白的资源与方案38。从密码子优化的基因出发，我们建立了SLC构建体的高通量克隆与筛选方法。这些方法被系统地应用于整个SLC家族，将基因克隆至BacMam病毒表达系统中，并在人源细胞系中检测蛋白表达情况39，所用技术基于此前报道的高通量克隆与表达检测方法40。简而言之，SLC 基因从 pDONR221 质粒克隆至 pHTBV1.1 载体中。该构建体随后用于将目的基因转座至杆状病毒载体（bacmid），以转染昆虫细胞，该载体包含巨细胞病毒（cytomegalovirus）启动子及增强子元件，可在哺乳动物细胞中实现表达。所获得的杆状病毒可用于转导哺乳动物细胞，以表达目标 SLC 蛋白。
我们进一步开发了用于大规模表达和稳定纯化选定溶质转运蛋白（SLC）的标准化方法（图1）。该方案包含多个检查点，以促进有效的问题排查并减少实验间的变异性。值得注意的是，通过Strep标签和绿色荧光蛋白（GFP）标签的辅助，实现了对蛋白表达与定位的常规监测，以及针对各个靶标的小规模纯化条件优化41,42。
最终，这些化学纯度高且结构均一的蛋白质样品可用于X射线晶体学或冷冻电子显微镜（Cryo-EM）进行结构解析、生化靶点结合实验、作为抗原免疫以生成结合分子，以及通过重组到化学成分明确的脂质体中开展无细胞功能研究。

<table><tbody><tr><td>3C 蛋白酶</td><td>本实验室制备</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 或 100 kDa 截留分子量离心浓缩管</td><td>Sartorius</td><td>VS0242</td><td></td></tr><tr><td>5-环己基-1-戊基-&amp;beta;-D-麦芽糖苷</td><td>Anatrace</td><td>C325</td><td>CYMAL-5</td></tr><tr><td>96 孔杆状病毒基因组纯化试剂盒</td><td>Millipore</td><td>LSKP09604</td><td>Montage 质粒小提试剂盒</td></tr><tr><td>96 孔板（2 mL）</td><td>Greiner Bio-One</td><td>780271</td><td></td></tr><tr><td>粘性塑料封膜</td><td>Qiagen</td><td>19570</td><td>Tape Pads</td></tr><tr><td>琼脂糖凝胶过滤色谱柱</td><td>Cytiva</td><td>29091596</td><td>Superose 6 Increase 10/300 GL</td></tr><tr><td>苯并核酸酶（Benzonase DNA酶）</td><td>本实验室制备</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BisTris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B9754</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇半琥珀酸三羟甲基氨基甲烷盐</td><td>Anatrace</td><td>CH210</td><td>CHS</td></tr><tr><td>钴金属亲和树脂</td><td>Takara Bio</td><td>635653</td><td>TALON 金属亲和树脂</td></tr><tr><td>D-(+)-生物素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>851209</td><td></td></tr><tr><td>葡聚糖-琼脂糖凝胶过滤色谱柱</td><td>Cytiva</td><td>28990944</td><td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td></tr><tr><td>皂苷</td><td>Apollo Scientific</td><td>BID3301</td><td></td></tr><tr><td>杜恩斯组织研磨器（40 mL）</td><td>DWK Life Sciences</td><td>357546</td><td></td></tr><tr><td>无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>4693132001</td><td>cOmplete，无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Thermo Fisher</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基胆碱磷酸酯（Fos-Choline-12）</td><td>Anatrace</td><td>F308S</td><td>FS-12</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>糖基双氢麦角甾醇</td><td>Anatrace</td><td>GDN101</td><td>GDN</td></tr><tr><td>重力流层析柱</td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-06479-25</td><td></td></tr><tr><td>HEK293 培养基</td><td>Thermo Fisher</td><td>12338018</td><td>FreeStyle 293 培养基</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Apollo Scientific</td><td>BI8181</td><td></td></tr><tr><td>亲水性中性硅胶超高效液相色谱柱</td><td>Sepax</td><td>231300-4615</td><td>Unix-C SEC-300 4.6 x 150</td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56750</td><td></td></tr><tr><td>昆虫细胞转染试剂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71259</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>月桂基麦芽糖新戊二醇</td><td>Anatrace</td><td>NG310</td><td>LMNG</td></tr><tr><td>六水合氯化镁</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>微型表达摇床</td><td>Glas-Col</td><td>107A DPMINC24CE</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>n-癸基-&amp;beta;-D-麦芽糖苷</td><td>Anatrace</td><td>D322</td><td>DM</td></tr><tr><td>n-十二烷基-β-D-麦芽吡喃糖苷</td><td>Anatrace</td><td>D310</td><td>DDM</td></tr><tr><td>n-十二烷基-N,N-二甲基胺-N-氧化物</td><td>Anatrace</td><td>D360</td><td>LDAO</td></tr><tr><td>n-壬基-&amp;beta;-D-葡萄吡喃糖苷</td><td>Anatrace</td><td>N324S</td><td>NG</td></tr><tr><td>n-辛基-d17-&amp;beta;-D-葡萄吡喃糖苷</td><td>Anatrace</td><td>O311D</td><td>OGNG</td></tr><tr><td>八乙二醇单十二醚&lt;br/&gt;</td><td>Anatrace</td><td>O330</td><td>C12E8</td></tr><tr><td>辛基葡萄糖新戊二醇</td><td>Anatrace</td><td>NG311</td><td>OGNG</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>聚氧乙烯(10)十二醚</td><td>Anatrace</td><td>AP1210</td><td>C12E10</td></tr><tr><td>聚氧乙烯(9)十二醚</td><td>Anatrace</td><td>APO129</td><td>C12E9</td></tr><tr><td>组织培养板用多孔透气封膜</td><td>VWR</td><td>60941-084</td><td>生物培养用棉绒膜</td></tr><tr><td>蛋白酶 K</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>重组酶混合物</td><td>Thermo Fisher</td><td>11791020</td><td>Gateway LR Clonase II</td></tr><tr><td>无血清昆虫细胞培养基</td><td>Gibco</td><td>10902088</td><td>Sf-900 II 无血清培养基</td></tr><tr><td>丁酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>303410</td><td></td></tr><tr><td>24 头探头超声破碎仪</td><td>Sonics</td><td>630-0579</td><td></td></tr><tr><td>超声破碎仪主机</td><td>Sonics</td><td>VCX 750</td><td></td></tr><tr><td>Strep-Tactin 树脂</td><td>IBA Life Sciences</td><td>2-5030-025</td><td>Strep-TactinXT 4Flow 高容量树脂</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>单十二烷酸蔗糖酯</td><td>Anatrace</td><td>S350</td><td>DDS</td></tr><tr><td>悬浮培养适应型 HEK293 细胞</td><td>Thermo Fisher</td><td>A14527</td><td>Expi293F</td></tr><tr><td>转染试剂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>70967</td><td>GeneJuice 转染试剂</td></tr></tbody></table>

用于结构与生化研究的人类溶质载体的高通量表达与纯化

High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies

溶质载体（SLCs）是一类膜转运蛋白，负责介导多种内源性和外源性底物的进出，包括离子、营养物质、代谢物、神经递质以及药物。尽管SLCs已成为颇具吸引力的治疗靶点和疾病标志物，但目前的药物对其靶向作用仍相对有限。由于对这类膜整合蛋白的结构、功能及生理学认知尚不充分，针对这些转运蛋白的药物研发进展受到阻碍，而这一局限的根本原因在于此类蛋白在表达与纯化方面的技术困难。本文展示了利用以下方法获取高纯度、毫克级人源SLC转运蛋白的技术方案&#160;密码子优化的基因序列。结合对表达载体设计的系统性探索和高通量表达，这些方案可确保目标蛋白的结构完整性和生物化学活性得以保留。我们还强调了真核细胞表达、亲和纯化以及尺寸排阻色谱过程中这些蛋白的关键操作步骤。最终，该工作流程可获得高纯度、功能活性稳定的目标蛋白，适用于高分辨率结构解析、转运研究、小分子结合活性检测以及高通量筛选。 体外 筛选

SLC 基因可从 RESOLUTE pDONR 质粒克隆至 BacMam 载体，用于哺乳动物表达 
所述克隆、表达和纯化方案已在多种蛋白折叠类型的多种 SLC 转运蛋白中成功应用。然而，该流程包含多个用于监测进展的关键节点，以便根据表达水平、蛋白折叠情况、脂质和去垢剂依赖性稳定性以及对缓冲液条件的敏感性差异进行优化。
SLC克隆与小规模表达过程中的检测点 
在克隆步骤中，应使用琼脂糖凝胶电泳以确认PCR产物和酶切产物的正确大小。类似地，可通过菌落PCR反应验证Gateway反应和转座反应的结果。图 2A，B）。如有需要，可使用标准技术监测杆状病毒的产生49,50,51,...

对人源膜转运蛋白进行结构与生化研究需要获得毫克量级的稳定、完整且均一的蛋白质。本文介绍了利用密码子优化基因进行人源溶质载体转运蛋白的筛选、表达和纯化的可扩展方法。

溶质载体（SLCs）是一类膜转运蛋白，负责介导多种内源性和外源性底物的进出，包括离子、营养物质、……

溶质转运蛋白（solute carriers，SLC）负责摄取营养物质，并参与人类疾病的发生。然而，由于对这类蛋白的研究尚不充分，目前靶向 SLC 的药物非常有限。我们开发了高效的方法，用于 SLC 的克隆、表达与纯化。我们的工作流程可获得高纯度蛋白质，从而支持生化与结构研究，并最终为药物发现项目提供重要见解。由于溶质转运蛋白（SLC）在生物学过程、疾病发生及药物递送中具有多种重要作用，近年来受到越来越多关注，已成为极具吸引力的治疗靶点。由私营与公共部门共同推动的IMI重点项目建立了开放的Nexus资源与数据，以推动在SLC功能、生理学、病理学及治疗靶向方面的全新发现。传统上，SLC 难以研究，因为它们是具有多种底物和不同转运机制的整合膜蛋白。近年来，冷冻电镜（cryo-EM）、Bacmid 表达系统以及新型去垢剂试剂的应用推动了膜蛋白研究领域的重大突破。生化与结构研究需要高纯度的蛋白质样品。然而，人类溶质载体在过表达时产量往往较低，且纯化后不稳定。因此，在过去，每个靶点都需要花费数年时间来开发单独的结构以制备用于下游应用的蛋白质样品。我们的方法经过优化，可实现多个靶点或单个靶点的不同构建体的并行、高效成本研究。因此，它在实验灵活性、成本、时间和实验室资源之间进行了精心平衡。此外，本文及坚定的网络门户中提供的所有实验方案和资源均开放获取。首先，在96孔板中加入150纳克溶质载体（Solute carrier，SLC）克隆和100纳克载体，用10毫摩尔/升、pH为8的Tris溶液将反应体系补至8微升。然后加入 2 µL 重组酶混合液，在室温下孵育 1 小时。孵育结束后，加入 1 µL 蛋白酶 K，在 37°C 下孵育 30 分钟。将 4 µL 反应混合物加入 50 µL 化学感受态的大肠杆菌 MAC1 细胞中，采用热激法转化细胞。转化后，将细菌悬液涂布于LB琼脂平板上。使用适当的引物及菌落PCR的标准操作流程，鉴定含有SLC基因插入片段的PHTBV 1.1载体的菌落。首先在室温水浴中解冻冷冻的溶质转运蛋白（solute carriers）或SLC细胞沉淀。通过将135毫升基础缓冲液与三片蛋白酶抑制剂混合片混合，制备溶解缓冲液。待片剂溶解后，用该溶解缓冲液重悬沉淀。然后加入DNA，并将悬液转移至冰上预冷的下源匀浆器中。将匀浆器保持在冰上，通过上下移动活塞约20次使溶液充分匀浆。接着，加入去垢剂储备液至终浓度为1%。将溶解混合液转移至50毫升锥形管中，在4摄氏度下缓慢旋转孵育。孵育一小时后，离心混合物并收集上清液。用基础缓冲液平衡4至6毫升床体积的Strep-Tactin树脂。然后将平衡后的树脂加入溶解的上清液中，在4摄氏度下旋转孵育两小时。将溶液倒入重力流柱中，让溶液自然流过。用相当于树脂床体积30倍的Strep洗涤缓冲液，分三次等量洗涤树脂。接着，加入3至5毫升洗脱缓冲液，孵育15分钟，然后收集洗脱液。通过紫外吸收光谱法测定蛋白质浓度。混合所需洗脱组分，并加入三摩尔C蛋白酶。在4°C下缓慢旋转孵育过夜。第二天，用尺寸排阻层析缓冲液平衡 2 至 4 毫升树脂床体积的钴金属亲和树脂。将平衡后的钴金属亲和树脂加入过夜的 3C 反应混合物中，在 4 摄氏度下旋转孵育。一小时后，将溶液倒入重力流柱中，收集穿流液。在4°C条件下，以3000 G离心力使用100千道尔顿截留分子量的离心过滤器浓缩穿流组分。用SEC缓冲液平衡碱性SEC柱。将样品注入进样环，并运行SEC程序，调节流速使柱压低于柱制造商规定的限值。使用组分收集器，在整个SEC运行过程中收集每份300微升的组分。合并峰值组分后，测定280纳米处的吸光度。然后将样品在截留分子量为100千道尔顿的滤膜中浓缩至所需体积。通过SDS-PAGE电泳分析初始小规模SLC蛋白表达。GFP标记的SLC荧光显微镜观察证实蛋白特异性定位于细胞膜，并伴有显著的细胞内积累。化学和结构均一的蛋白在尺寸排阻色谱中产生单一单分散的A280峰。

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生物化学

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真核生物硼酸盐转运蛋白的表达、增溶与纯化

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