Name: 激光捕获显微切割从口腔粘膜下纤维化样本中分离具有形态学和空间信息的细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: 学习激光捕获显微切割技术，从口腔粘膜下纤维化石蜡样本中精确分离上皮和间质细胞，结合多组学分析揭示恶性转化机制，为口腔癌预测模型提供形态学与空间信息支持。

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本工作得到了中国国家自然科学基金（81671006，81300894）、中国医学科学院医学科学创新基金（2019-I2M-5-038）、国家临床重点专科建设项目（PKUSSNKP-202102）以及北京大学医学部优秀博士研究生创新基金（BMU2022BSS001）的资助。

本研究经北京大学口腔医学院机构审查委员会批准。已获得患者的知情同意。本研究中使用的组织样本均已去标识化。研究方案如图1所示。
1. 样品制备
<ol>
	<li>使用切片机将福尔马林固定石蜡包埋的口腔黏膜下纤维化组织切成连续的3 µm和10 µm厚度切片。</li>
	<li>将切片在水中展平，然后捞至载玻片上。将3 µm切片和10 µm切片分别固定于粘附性显微镜载玻片（载玻片A）和PEN膜载玻片（载玻片B）上。</li>
	<li>将载玻片置于60 °C的加热板上，烘烤2小时。</li>
</ol>
2. 苏木精-伊红染色
<ol>
	<li>将载玻片 A 和 B 放入二甲苯（注意）中 10 分钟，并重复此步骤三次。</li>
	<li>将载玻片 A 和 B 按 100%、100%、90%、80% 和 70% 的顺序依次置于梯度乙醇溶液中，每种浓度中各 1 分钟。</li>
	<li>将载玻片 A 和 B 放入超纯蒸馏水中 30 秒。</li>
	<li>将载玻片 A 和 B 放入苏木精染液（Harris hematoxylin）中染色 90 秒。</li>
	<li>将载玻片 A 和 B 放入超纯蒸馏水中 30 秒，并重复此步骤三次。</li>
	<li>将载玻片 A 和 B 放入分化-苏木精溶液（div-hematoxylin，注意）中 2 秒。</li>
	<li>将载玻片 A 和 B 放入超纯蒸馏水中 30 秒，并重复此步骤三次。</li>
	<li>将载玻片 A 和 B 放入 1% 返蓝溶液中 2 秒。</li>
	<li>将载玻片 A 和 B 放入超纯蒸馏水中 30 秒，并重复此步骤三次。</li>
	<li>将载玻片放入伊红染液（eosin）中 2 秒。</li>
	<li>将载玻片 A 和 B 放入超纯蒸馏水中 30 秒，并重复此步骤三次。</li>
	<li>将载玻片按 70%、80%、90%、100% 和 100% 的顺序依次在梯度乙醇溶液中脱水，每种浓度中各 2 秒。</li>
	<li>将载玻片 A 放入二甲苯中 3 分钟，并重复此步骤两次。</li>
	<li>向载玻片 A 滴加一滴封片剂（注意），并加盖盖玻片。</li>
</ol>
3. 组织学形态观察与激光捕获显微切割
<ol>
	<li>启动激光显微切割系统及软件（图2）。</li>
	<li>将载玻片A放置在载物台上，观察组织学形态，以确定激光显微切割的目标区域。</li>
	<li>取下载玻片A，将载玻片B倒置放置在载物台上。</li>
	<li>点击卸载按钮（图2），推出收集装置。将聚合酶链式反应（PCR）管插入收集装置中，并确保管子固定稳妥。点击确定按钮（图3）。</li>
	<li>通过点击标记为收集装置：管盖的相应红色圆圈来选择一个管盖。选中的圆圈将变为绿色。</li>
	<li>点击绘制按钮和绘制+切割按钮，使用鼠标勾画目标区域。</li>
	<li>点击开始切割按钮以捕获目标区域；捕获的样本将由管盖收集（图4）。</li>
	<li>点击下降按钮，确保捕获的样本已被收集（图5）。</li>
	<li>点击样本按钮以捕获下一个样本。</li>
	<li>点击卸载按钮，卸下含有捕获样本的PCR管。</li>
</ol>

Capturing Oral Submucous Fibrosis Tissue Samples for Spatial-Omics Analysis

<ol><li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+submucous+fibrosis%3A+A+clinicopathological+study+of+674+cases+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Pathology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oral submucous fibrosis: A clinicopathological study of 674 cases in China.</a> Journal of Oral Pathology & Medicine. 48 (4), 321-325 (2019).</li>
<li>Cai, X., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinicopathological+factors+associated+with+progression+of+oral+submucous+fibrosis%3A+A+population-based+retrospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Oncology%22%5BJournal%5D)">Clinicopathological factors associated with progression of oral submucous fibrosis: A population-based retrospective study.</a> Oral Oncology. 130, 105949(2022).</li>
<li>Ray, J. G., Chatterjee, R., Chaudhuri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+submucous+fibrosis%3A+A+global+challenge.+Rising+incidence%2C+risk+factors%2C+management%2C+and+research+priorities%5BTitle%5D)+AND+%22Periodontology+2000%22%5BJournal%5D)">Oral submucous fibrosis: A global challenge. Rising incidence, risk factors, management, and research priorities.</a> Periodontology 2000. 80 (1), 200-212 (2019).</li>
<li>Shih, Y. H., Wang, T. H., Shieh, T. M., Tseng, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+submucous+fibrosis%3A+A+Review+on+etiopathogenesis%2C+diagnosis%2C+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Oral submucous fibrosis: A Review on etiopathogenesis, diagnosis, and therapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 2940(2019).</li>
<li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+preliminary+exploration+of+immune+microenvironment+in+oral+leukoplakia+concomitant+with+oral+submucosal+fibrosis%3A+A+comparative+immunohistochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Pathology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">The preliminary exploration of immune microenvironment in oral leukoplakia concomitant with oral submucosal fibrosis: A comparative immunohistochemical study.</a> Journal of Oral Pathology & Medicine. , (2023).</li>
<li>Warnakulasuriya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+potentially+malignant+disorders%3A+A+consensus+report+from+an+international+seminar+on+nomenclature+and+classification%2C+convened+by+the+WHO+Collaborating+Centre+for+Oral+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Diseases%22%5BJournal%5D)">Oral potentially malignant disorders: A consensus report from an international seminar on nomenclature and classification, convened by the WHO Collaborating Centre for Oral Cancer.</a> Oral Diseases. 27 (8), 1862-1880 (2021).</li>
<li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+nomogram+prediction+model+for+malignant+transformation+of+oral+potentially+malignant+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Oncology%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a nomogram prediction model for malignant transformation of oral potentially malignant disorders.</a> Oral Oncology. 123, 105619(2021).</li>
<li>Murthy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+transformation+rate+of+oral+submucous+fibrosis%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Malignant transformation rate of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis.</a> Journal of Clinical Medicine. 11 (7), 1793(2022).</li>
<li>Kujan, O., Mello, F. W., Warnakulasuriya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+transformation+of+oral+submucous+fibrosis%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Diseases%22%5BJournal%5D)">Malignant transformation of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis.</a> Oral Diseases. 27 (8), 1936-1946 (2020).</li>
<li>Qin, X., Ning, Y., Zhou, L., Zhu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+submucous+fibrosis%3A+Etiological+mechanism%2C+malignant+transformation%2C+therapeutic+approaches+and+targets%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Oral submucous fibrosis: Etiological mechanism, malignant transformation, therapeutic approaches and targets.</a> International Journal of Molecular Sciences. 24 (5), 4992(2023).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+and+spatial+dissection+of+precancerous+lesions+underlying+the+initiation+process+of+oral+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Discovery%22%5BJournal%5D)">Single-cell and spatial dissection of precancerous lesions underlying the initiation process of oral squamous cell carcinoma.</a> Cell Discovery. 9 (1), 28(2023).</li>
<li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delineating+the+dynamic+evolution+from+preneoplasia+to+invasive+lung+adenocarcinoma+by+integrating+single-cell+RNA+sequencing+and+spatial+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Delineating the dynamic evolution from preneoplasia to invasive lung adenocarcinoma by integrating single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics.</a> Experimental & Molecular Medicine. 54 (11), 2060-2076 (2022).</li>
<li>Ji, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+analysis+of+composition+and+spatial+architecture+in+human+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Multimodal analysis of composition and spatial architecture in human squamous cell carcinoma.</a> Cell. 182 (2), 497-514 (2020).</li>
<li>Van den Bossche, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironment-driven+intratumoral+heterogeneity+in+head+and+neck+cancers%3A+clinical+challenges+and+opportunities+for+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Resistance+Updates%22%5BJournal%5D)">Microenvironment-driven intratumoral heterogeneity in head and neck cancers: clinical challenges and opportunities for precision medicine.</a> Drug Resistance Updates. 60, 100806(2022).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+in+the+risk+assessment+of+oral+leukoplakia+through+morphology-related+copy+number+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+China.+Life+sciences%22%5BJournal%5D)">Improvement in the risk assessment of oral leukoplakia through morphology-related copy number analysis.</a> Science China. Life sciences. 64 (9), 1379-1391 (2021).</li>
<li>Watkins, T. B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pervasive+chromosomal+instability+and+karyotype+order+in+tumour+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pervasive chromosomal instability and karyotype order in tumour evolution.</a> Nature. 587 (7832), 126-132 (2020).</li>
<li>Odell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy+and+loss+of+heterozygosity+as+risk+markers+for+malignant+transformation+in+oral+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Diseases%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy and loss of heterozygosity as risk markers for malignant transformation in oral mucosa.</a> Oral Diseases. 27 (8), 1993-2007 (2021).</li>
<li>Wood, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+road+to+invasion-examining+the+similarities+and+differences+in+the+genomes+of+associated+oral+pre-cancer+and+cancer+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">The genomic road to invasion-examining the similarities and differences in the genomes of associated oral pre-cancer and cancer samples.</a> Genome Medicine. 9 (1), 53(2017).</li>
<li>Venugopal, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+proteomics+based+on+2D+gel+electrophoresis+and+mass+spectrometry+with+validations%3A+Identification+of+a+biomarker+compendium+for+oral+submucous+fibrosis-An+indian+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Personalized+Medicine%22%5BJournal%5D)">Integrated proteomics based on 2D gel electrophoresis and mass spectrometry with validations: Identification of a biomarker compendium for oral submucous fibrosis-An indian study.</a> Journal of Personalized Medicine. 12 (2), 208(2022).</li>
<li>Kundu, P., Pant, I., Jain, R., Rao, S. G., Kondaiah, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+DNA+methylation+changes+in+oral+submucous+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Diseases%22%5BJournal%5D)">Genome-wide DNA methylation changes in oral submucous fibrosis.</a> Oral Diseases. 28 (4), 1094-1103 (2022).</li>
<li>Cai, X., Zhang, H., Li, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-target+pharmacological+mechanisms+of+Salvia+miltiorrhiza+against+oral+submucous+fibrosis%3A+A+network+pharmacology+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Multi-target pharmacological mechanisms of Salvia miltiorrhiza against oral submucous fibrosis: A network pharmacology approach.</a> Archives of Oral Biology. 126, 105131(2021).</li>
<li>Xiao, X., Hu, Y., Li, C., Shi, L., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+content+abnormality+in+oral+submucous+fibrosis+concomitant+leukoplakia%3A+A+preliminary+evaluation+of+the+diagnostic+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Cytopathology%22%5BJournal%5D)">DNA content abnormality in oral submucous fibrosis concomitant leukoplakia: A preliminary evaluation of the diagnostic and clinical implications.</a> Diagnostic Cytopathology. 48 (11), 1111-1114 (2020).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+non-coding+RNA+expression+profile+associated+with+malignant+progression+of+oral+submucous+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Long non-coding RNA expression profile associated with malignant progression of oral submucous fibrosis.</a> Journal of Oncology. 2019, 6835176(2019).</li>
<li>Lunde, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+chromosomal+changes+in+potentially+malignant+and+malignant+oral+mucosal+lesions+from+South+and+Southeast+Asia+using+array-comparative+genomic+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genomics+%26+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Profiling of chromosomal changes in potentially malignant and malignant oral mucosal lesions from South and Southeast Asia using array-comparative genomic hybridization.</a> Cancer Genomics & Proteomics. 11 (3), 127-140 (2014).</li>
<li>Sun, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+resolved+metabolomics+to+discover+tumor-associated+metabolic+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Spatially resolved metabolomics to discover tumor-associated metabolic alterations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (1), 52-57 (2019).</li>
<li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copy+number+alteration+profiling+facilitates+differential+diagnosis+between+ossifying+fibroma+and+fibrous+dysplasia+of+the+jaws%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oral+Science%22%5BJournal%5D)">Copy number alteration profiling facilitates differential diagnosis between ossifying fibroma and fibrous dysplasia of the jaws.</a> International Journal of Oral Science. 13 (1), 21(2021).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案报告了一种通过激光显微切割技术获取具有形态学和空间信息的OSF组织样本的流程，以用于后续的空间组学分析。从代表性结果中，我们鉴定了不同形态学相关样本之间存在的多种CNA模式。
口腔黏膜下纤维性变（OSF）是一种常见的口腔潜在恶性疾患（OPMD），为口腔鳞状细胞癌的癌前病变6。已有研究报道，基因组不稳定性与OPMD的发生及其恶性转化相关17,18。多项研究基于基因组学、转录组学和蛋白质组学数据，报道了与OSF进展及恶性转化相关的染色体改变、基因表达差异以及表观遗传学变异19,20,21,22,23</su...

口腔黏膜下纤维化（OSF）是一种慢性、隐匿性发展的疾病，主要发生于颊黏膜，导致张口受限1。尽管OSF是一种多因素疾病，但咀嚼槟榔是其主要病因2,3。由于这一习惯具有明显的地域性，OSF主要集中于东南亚和南亚地区的人群中3。OSF常见的组织病理学特征包括口腔黏膜上皮下方结缔组织中异常的胶原沉积、血管狭窄及闭塞1。OSF的上皮组织可表现为萎缩或增生，若合并口腔白斑时，甚至可出现异型增生4,5。
口腔黏膜下纤维性变（OSF）被世界卫生组织定义为一种常见的口腔潜在恶性病变（OPMD），具有进展为口腔鳞状细胞癌的可能性，其恶性转化率为4%-6%6,7,8,9。OSF发生恶性转化的机制十分复杂10。上皮组织的异常增生，包括发育不良和萎缩，会增加癌变风险；而间质中衰老的成纤维细胞可能通过活性氧（ROS）及其他分子诱导上皮-间质转化（EMT），从而参与OSF的恶性进展过程10。
空间组学分析技术生成了包含形态学和空间信息的多组学数据，这些数据有助于揭示癌症的发病机制11,12,13。本文介绍了一种利用激光显微切割技术从福尔马林固定石蜡包埋的口腔黏膜下纤维性变（OSF）组织中捕获与形态相关细胞群体的实验方案。对这些样本进行多组学分析，可克服组织内异质性带来的挑战，加深对OSF恶性转化分子病理学及作用机制的理解14。

<table><tbody><tr><td>黏附显微镜载玻片</td><td>CITOTEST</td><td>REF.188105</td><td></td></tr><tr><td>分化苏木精染液</td><td>YiLi</td><td>20230326</td><td></td></tr><tr><td>伊红溶液</td><td>BASO</td><td>BA4098</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>PEKING REAGENT</td><td>No.32061</td><td></td></tr><tr><td>哈里斯苏木精染色液</td><td>YiLi</td><td>20230326</td><td></td></tr><tr><td>加热板</td><td>LEICA</td><td>HI1220</td><td></td></tr><tr><td>激光捕获显微切割系统</td><td>LEICA</td><td>LMD7</td><td>设备</td></tr><tr><td>激光显微切割微系统</td><td>LEICA</td><td>8.2.3.7603</td><td>软件</td></tr><tr><td>封片封固介质</td><td>LEICA</td><td>REF.3801731</td><td></td></tr><tr><td>显微镜盖玻片</td><td>CITOTEST</td><td>REF.10212450C</td><td></td></tr><tr><td>切片机</td><td>LEICA</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>PCR管</td><td>AXYGEN</td><td>16421959</td><td></td></tr><tr><td>PEN膜载玻片</td><td>LEICA</td><td>No.11505158</td><td></td></tr><tr><td>返蓝溶液</td><td>YiLi</td><td>20230326</td><td></td></tr><tr><td>超纯蒸馏水</td><td>Invitrogen</td><td>REF.10977-015</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>PEKING REAGENT</td><td>No.33535</td><td></td></tr></tbody></table>

通过激光显微切割从口腔黏膜下纤维化样本中分离具有形态学和空间信息的细胞

Isolation of Cells with Morphological and Spatial Information from Oral Submucous Fibrosis Samples by Laser Capture Microdissection

口腔黏膜下纤维化（OSF）是口腔中一种常见的潜在恶性病变。在组织病理学切片中常可见上皮萎缩以及固有层和黏膜下层的纤维化。已有研究提出，上皮异常增生、上皮萎缩和衰老的成纤维细胞可能与OSF的恶性转化相关。然而，由于潜在恶性口腔病变和口腔鳞状细胞癌具有高度异质性，难以明确OSF恶性转化的具体分子机制。本文介绍一种利用激光显微切割技术从福尔马林固定石蜡包埋组织切片中获取少量携带形态学特征和空间信息的上皮或间充质细胞的方法。通过显微镜，可精确捕获微尺度（约500个细胞）的异常增生或萎缩上皮组织以及上皮下纤维化组织。所提取的细胞可用于基因组或转录组测序，从而获得包含形态学和空间信息的基因组与转录组数据。该方法消除了整体OSF组织测序中的异质性问题，以及非病变区域细胞带来的干扰，实现了对OSF组织的精确空间组学分析。

通过对口腔黏膜下纤维化（OSF）组织进行激光显微切割，我们分别采集了发育异常的上皮、发育异常上皮下方的间质、萎缩性上皮以及萎缩性上皮组织下方的间质样本（图1）。通过提取DNA并进行低深度全基因组测序，我们得以分析与形态学相关的拷贝数变异（CNA）15。CNA是一种常见的基因组不稳定性形式，与口腔潜在恶性病变（OPMD）向恶性转化风险增加相关15,16。我们在四类样本中检测到不同的CNA模式。如图6所示，上皮样本中存在CNA，而间质样本中未检测到CNA。尽管样本来自同一患者，发育异常上皮中的CNA模式与萎缩性上皮中的CNA模式并不相同。在发育异常上皮中检测到染色体3和8上的CNA，而在萎缩性上皮中仅在染色体8上以较低频率检测到CNA。
<p class="jove_content biglegend" fo:keep-together.within-...

口腔黏膜下纤维化组织的激光显微切割技术可从组织学感兴趣区域精确提取细胞，从而结合形态学和空间信息对多组学数据进行分析。

口腔黏膜下纤维化（OSF）是口腔中一种常见的潜在恶性病变。上皮萎缩和固有层纤维化……

我们的主要研究方向是恶性转化的机制，以及口腔潜在恶性病变（如口腔白斑和口腔黏膜下纤维化）的预测模型开发。我们采用基因组学、转录组学、蛋白质组学及其他多组学测序分析，并结合深度学习人工智能模型，研究口腔潜在恶性病变向口腔癌发展的过程。目前的测序和多组学分析大多基于冷冻样本，但口腔潜在恶性病变的组织样本多为福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织，通常来自活检。因此，亟需建立基于石蜡包埋样本的实验技术。口腔潜在恶性病变和鳞状细胞癌的石蜡组织样本数量众多，来源广泛，是极具价值的研究资源。我们的实验方案有助于充分利用这些资源，以深入理解疾病发生及恶性转化的机制。首先，使用切片机将福尔马林固定、石蜡包埋的口腔黏膜下纤维化组织切成厚度分别为 3 和 10 µm 的连续切片，然后将切片在水中展平。将三微米切片置于粘附显微镜载玻片（即载玻片A）上，将十微米切片置于PEN膜载玻片（即载玻片B）上。将两张载玻片置于60摄氏度的加热板上。两小时后，将载玻片A和B放入二甲苯中10分钟，然后依次在梯度乙醇浓度中各浸泡1分钟进行水化。接着，将载玻片置于超纯蒸馏水中30秒。将切片浸入Harris苏木精染色液中90秒。再次用超纯蒸馏水洗涤切片三次，每次30秒。随后，将切片浸入分化苏木精溶液中2秒。将切片重新放入超纯蒸馏水中30秒，重复三次。接着将切片A和B浸入1% re-blue溶液中2秒。用蒸馏水洗涤切片后，将其放入伊红溶液中2秒。再次将切片浸入超纯蒸馏水中30秒，然后进行脱水并逐步提高乙醇浓度。接着，将切片A浸入二甲苯中3分钟。最后，在切片A上滴加一滴封片剂，并用玻璃盖玻片覆盖。首先，打开激光显微切割系统及软件。将载有染色的三微米口腔黏膜下纤维化组织切片的载玻片 A 放置在载物台上。观察组织学形态，以确定激光显微切割的目标区域。取下玻片 A，将玻片 B 的组织面朝下放置在载物台上。接着，单击卸载按钮以推出收集装置。将 PCR 管插入收集装置中，并确保管子固定到位，然后单击确定按钮。单击相应的红色圆圈以选择盖片，标记收集装置的管盖，等待所选圆圈变为绿色后，单击“绘制”按钮和“绘制并切割”按钮，使用鼠标勾画出感兴趣区域。单击“开始切割”以捕获感兴趣区域，该区域将被盖片收集。然后，按下下方按钮，确保已捕获的样本被成功收集。点击样本按钮以采集下一个样品。最后，点击卸载以取出含有已采集样品的PCR管。本研究中，通过激光显微切割口腔黏膜下纤维化组织，捕获了具有不同形态的上皮和间质组织。上皮样本中存在拷贝数变异，而间质样本中则未发现。在发育异常的上皮中，染色体3和染色体8均观察到拷贝数变异模式；而在萎缩性上皮中，仅在染色体8上以较低频率检测到拷贝数变异。

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Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

激光捕获显微切割从口腔粘膜下纤维化样本中分离具有形态学和空间信息的细胞

激光捕获显微技术，又称激光显微切割（LMD），可使用户从冷冻或...

哺乳动物组织的激光显微切割

该视频展示了以微米级精度对三维类器官共培养模型进行激光显微切割的过程。在三维类器官模型中，成纤维细胞等间质成分与癌源性上皮细胞进行三维共培养。该三维模型作为一种实验工具，可在接近生理条件的环境中研究肿瘤侵袭及癌-间质相互作用。...

激光显微切割：一种从三维类器官培养模型中分离侵袭性结直肠癌细胞的技术

对合成的组织工程结直肠癌模型中激光显微切割的细胞及其间质进行分子谱分析，代表了一种新颖且可操控的方法，可用于表征和解析肿瘤侵袭前沿的肿瘤细胞与癌相关间质细胞之间界面处独特的生物学特性。...

结直肠癌细胞三维模型中侵袭性肿瘤微环境的分子谱分析 离体 成纤维细胞

显微解剖已广泛用于组织内DNA、RNA和蛋白质的检测。激光捕获显微切割（LCM）是最常用的方法，但一种新的研磨技术——中解剖（mesodissection）最近也已出现。我们展示了从中解剖的结核分枝杆菌Mycobacterium...

一种用于回收的新型显微解剖方法 结核分枝杆菌 福尔马林固定石蜡包埋肺肉芽肿中的特异性转录本

本文演示了使用激光捕获显微切割技术，通过直接或间接免疫组织化学方法分离单个多巴胺能神经元或腹侧被盖区。讨论了使用红外激光从玻璃载玻片上分离组织，以及结合红外和紫外激光从膜载玻片上分离组织的参数。...

激光捕获显微切割——分离单个多巴胺能神经元及完整腹侧被盖区的示范操作

对特定组织中部分细胞的基因表达进行分析是一项重大挑战。本文介绍了如何通过将快速免疫标记方法与激光显微切割技术相结合，从特定细胞群体中分离高质量的总RNA。...

使用激光捕获显微切割结合快速免疫标记法从特定细胞亚群中分离RNA

本文介绍了一种用于特定植物细胞类型转录谱分析的激光显微切割技术方案。尽管该方案适用于不同物种和细胞类型，但重点是芸苔族Boechera属中与有性生殖和无融合生殖相关的雌性生殖系中极难获取的细胞。...

激光辅助显微切割（LAM）作为单细胞类型转录谱分析的工具

本实验方案的目的是利用激光显微切割技术（LCM），从未经固定、新鲜切除的人类肠道组织中分离肠神经节，并获得高完整性的RNA样本。该方案包括制备速冻的人类肠道组织样本、冷冻切片、乙醇染色与脱水、激光显微切割以及RNA提取等步骤。...

优化激光显微切割技术以分离新鲜冷冻人组织中的肠神经节

激光显微切割（LMD）是一种灵敏且高度可重复的技术，可用于揭示介导胶质瘤异质性和侵袭性的分子通路。本文中，我们描述了一种优化的实验方案，通过激光显微切割从胶质瘤组织中分离特定区域，并随后进行转录组学分析。...

激光捕获显微切割胶质瘤亚区域用于肿瘤内异质性、肿瘤微流及侵袭的空间与分子特征分析

本方案描述了一种高通量工作流程，利用人工智能对染色的薄组织切片图像中经病理学确认的兴趣区域进行分割，以通过激光显微切割富集组织学分辨的细胞群体。该策略包含一种新算法，可将标记感兴趣细胞群体的边界直接传输至激光显微镜。...

工业化的、人工智能引导的激光显微切割技术用于肿瘤微环境的微尺度蛋白质组学分析

学习激光捕获显微切割技术，从口腔粘膜下纤维化石蜡样本中精确分离上皮和间质细胞，结合多组学分析揭示恶性转化机制，为口腔癌预测模型提供形态学与空间信息支持。

通过激光显微切割从口腔黏膜下纤维化样本中分离具有形态学和空间信息的细胞

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