小鼠圆形精子细胞注射
January 26th, 2024
在这里，我们介绍了一种在小鼠中进行圆形精子细胞注射 （ROSI） 的方法，该技术在研究胚胎发育的潜在机制方面具有很有前途的临床应用和实用性。
圆形精子细胞注射可以解决一些非梗阻性无精子症患者的生殖问题，但其效率很低。本研究以小鼠为模型，寻找提高小鼠 ROSI 胚胎发育效率的方法。不完全的统计数据表明，全球只有不到 200 名人类 ROSI 受孕的胎儿被分娩。
了解 ROSI 技术潜力的转折点发生在 2015 年，当时 Tanaka 及其同事报告了通过 ROSI 技术成功生育了 14 个胎儿，为其临床应用和可行性注入了新的信心。目前 ROSI 研究的重点是表观遗传修饰异常和异常卵母细胞辅助激活，而准确识别圆形精子数据也是一项挑战。在我们实验室，小鼠 ROSI 胚胎的发育效率已经非常高，这与其他实验室相似。
然而，非啮齿类动物和人类一样，其发育效率仍然很新。未来，我们将专注于非啮齿类动物发育效率的提高。首先，在 5:00 PM 腹膜内注射 6 至 8 周龄雌性小鼠，每单位注射 7.5 国际单位的怀孕母马血清促性腺激素，并在 48 小时后注射人绒毛膜促性腺激素。
确保注射后不与雄性小鼠接触。对小鼠实施安乐死后，打开其腹腔。使用剪刀切断卵巢附近的输卵管，并将它们放入预热至 37 摄氏度的 M2 缓冲液中。
在正置显微镜的 10 倍物镜下，找到输卵管透明、增大的部分。然后，使用 1 毫升注射器固定输卵管，切开增大的部分，并收集卵母细胞冠状状丘丘复合物。要去除颗粒细胞，将卵母细胞复合物置于含有 0.1% 透明质酸酶的预热 M2作溶液中，然后通过口腔移液管轻轻吹气。
将卵母细胞连续转移到 KSOMaa 液滴中冲洗 3 次，然后放入 37 摄氏度、含 5% 二氧化碳的培养箱中。首先，获得一只安乐死的 8 至 10 周龄雄性 C57BL/6 小鼠。打开其腹腔，用剪刀轻轻切除睾丸附近的附睾。
将含有附睾的培养皿置于正置显微镜的 10 倍物镜下的 M2 培养基中。并使用 1 毫升注射器轻轻切除附睾，让精子流出。将悬浮液中流动的精子虹吸到含有 0.5 毫升 M2 缓冲液的试管底部。
对于圆形精子细胞分离，将解剖的睾丸转移到 M2 缓冲液中。使用 1 毫升注射器，在显微镜下轻轻切开白色膜，然后挤压并切除曲折的生精小管。提取悬浮液后，用 400 目筛过滤并离心过滤的细胞。
弃去上清液，将细胞与 200 μL Hoechst 33342 在 37 摄氏度下孵育 10 分钟。将含有染色细胞的流式细胞仪管放入流式细胞仪中。调整电压后，根据前向和侧向散射选择细胞群。
然后，根据前向散射和触发脉冲宽度去除细胞粘附。使用 355 纳米波长激光下的两个检测通道，对圆形精子细胞进行分类并将它们储存在 4 摄氏度。在显微镜下，小鼠圆形精子细胞的直径约为 10 微米，中间显示突起状核仁结构。
首先，从小鼠那里获得卵母细胞和圆形精子细胞。然后，准备适当直径的固定针和注射针。将卵母细胞放入 10 微升 M2 液滴中，含或不含细胞松弛素 B，以软化和储存配子。
然后，放置圆形精子细胞的 M2 液滴，并将手术皿安装在显微镜手术台上。调整注射位置并固定针头。使用聚乙烯吡咯烷酮 （PVP） 润湿并清洁注射针头。
接下来，将圆形精子细胞提取到注射针中。用固定针旋转卵母细胞，使卵母细胞的极体定向在 12 点钟位置。然后，小心地将注射针放在卵母细胞的三点钟位置。
使用 PiezoXpert 设备，在卵母细胞的透明带上打一个孔。然后，轻轻地将注射针水平推进到卵母细胞中并破裂卵母细胞膜。逐渐将圆形精子细胞注射到卵母细胞细胞质中。
抽出注射针头，在开口附近吸出少量卵母细胞膜以密封它。对于卵胞浆内单精子注射，将精子放在 PVP 跑道上。从尾部吸出精子，并将其颈部置于注射针口。
应用压电陶瓷将精子头与尾分开。然后，如前所述，用直径为 9 到 10 微米的注射针将精子注射到卵母细胞中。对于辅助卵母细胞活化，将卵母细胞置于 20 微升含有氯化锶六水合物的无钙和无镁 CZB 培养基液滴中。
然后，将它们转移到 KSOMaa 培养基中进行培养。同时，建立一个孤雌生殖激活组，而无需注射圆形精子细胞或精子进行胚胎学研究。活化后，转移到 KSOMaa 培养基中进行培养。
与胞浆内精子注射的胚胎相比，圆形精子细胞注射的胚胎显示出较低的发育效率。
概述
本文介绍了一种在小鼠中进行圆形精细胞注射（ROSI）的方法，旨在提高胚胎发育效率。该技术具有潜在的临床应用，可用于解决非阻塞性无精症。
关键研究组成部分
科学领域
- 生殖生物学
- 胚胎发育
- 辅助生殖技术
背景
- ROSI针对非阻塞性无精症患者的生殖问题。
- ROSI的效率目前较低，全球范围内只有不到200个人类胚胎被成功分娩。
- 2015年，有报道通过ROSI出生了14个胚胎，这是一项重大进展。
- 当前研究重点在于表观遗传修饰和卵母细胞活化的挑战。
研究目的
- 提高小鼠模型中ROSI的胚胎发育效率。
- 研究通过ROSI进行胚胎发育的机制。
- 为ROSI的临床可行性理解做出贡献。
使用的方法
- 使用小鼠模型进行ROSI技术。
- 研究胚胎发育效率。
- 分析表观遗传修饰。
- 在识别圆形精细胞数据方面的挑战。
主要结果
- 小鼠模型中ROSI胚胎的高胚胎发育效率。
- 在多个实验室观察到的相似结果。
- 对ROSI技术临床应用重新产生信心。
- 识别当前研究领域的关键挑战。
结论
- ROSI在特定患者群体中改善生殖结果方面显示出前景。
- 需要进一步研究以解决现有挑战并提高效率。
- 理解表观遗传因素对推进ROSI技术至关重要。
常见问题
Executive Industry Relevance
Round spermatid injection (ROSI) enables the generation of viable embryos from haploid precursor cells, providing a unique tool for dissecting mechanisms of fertilization and early embryonic development. This technique is strategically positioned to accelerate mouse model generation and facilitate the production of genetically modified lines, directly impacting preclinical research pipelines. Despite its promise, ROSI's translational value is currently limited by low efficiency and unresolved safety validation, underscoring the need for rigorous mechanistic de-risking before broader adoption.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of fertilization mechanisms and early developmental pathways in controlled genetic backgrounds.
- Supports biological de-risking by allowing direct assessment of haploid cell contribution to embryogenesis.
- Facilitates functional validation of genetic modifications in germline transmission studies.
Screening & Assay Development
- Provides a platform for standardizing oocyte activation and embryonic development assays in mouse models.
- Enables reproducible preparation of embryos for downstream phenotypic or molecular screening.
- Supports quantitative assessment of developmental efficiency across genetic backgrounds or interventions.
Translational & Preclinical Research
- Accelerates generation of genetically modified mouse lines for disease modeling and preclinical studies.
- Offers a system for evaluating epigenetic and developmental consequences of germline manipulations.
- Supports risk-adjusted advancement of reproductive technologies by clarifying mechanistic bottlenecks.
Pipeline & Workflow Integration
ROSI is positioned at the intersection of early discovery and preclinical model generation, enabling rapid hypothesis testing and functional validation in vivo.
- Discovery Biology: Facilitates mechanistic studies of fertilization and embryogenesis using defined genetic inputs.
- Screening: Standardizes embryo production for comparative developmental assays and intervention testing.
- Analytics: Delivers quantitative readouts of developmental efficiency and viability for cross-condition benchmarking.
- Translational Research: Bridges basic reproductive biology with preclinical model development for disease studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for generating and validating genetically engineered mouse lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in germline transmission and developmental outcomes.
- Operational Value: Enables standardized, scalable embryo production for research pipelines.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making for advancing reproductive and genetic engineering technologies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of model generation and mechanistic studies.
Implementation Considerations
- Requires specialized expertise in micromanipulation and reproductive biology.
- Demands access to advanced microscopy, flow cytometry, and embryo culture infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptation to non-rodent systems remains challenging due to lower efficiency and safety uncertainties.
- Practical limitations include identification of round spermatids and optimization of oocyte activation protocols.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:34
Preparation of Mouse Oocytes for Round Spermatid Injection to Study Embryological Events
3:09
Preparation of Murine Round Spermatids and Spermatozoa for Oocyte-Injection and Embryological Studies
5:29
Injection of Mouse Round Spermatids into Oocytes to Study Embryonic Development in Mice
