小鼠圆形精子细胞注射

圆形精子细胞注射可以解决一些非梗阻性无精子症患者的生殖问题，但其效率很低。本研究以小鼠为模型，寻找提高小鼠 ROSI 胚胎发育效率的方法。不完全的统计数据表明，全球只有不到 200 名人类 ROSI 受孕的胎儿被分娩。

了解 ROSI 技术潜力的转折点发生在 2015 年，当时 Tanaka 及其同事报告了通过 ROSI 技术成功生育了 14 个胎儿，为其临床应用和可行性注入了新的信心。目前 ROSI 研究的重点是表观遗传修饰异常和异常卵母细胞辅助激活，而准确识别圆形精子数据也是一项挑战。在我们实验室，小鼠 ROSI 胚胎的发育效率已经非常高，这与其他实验室相似。

然而，非啮齿类动物和人类一样，其发育效率仍然很新。未来，我们将专注于非啮齿类动物发育效率的提高。首先，在 5:00 PM 腹膜内注射 6 至 8 周龄雌性小鼠，每单位注射 7.5 国际单位的怀孕母马血清促性腺激素，并在 48 小时后注射人绒毛膜促性腺激素。

确保注射后不与雄性小鼠接触。对小鼠实施安乐死后，打开其腹腔。使用剪刀切断卵巢附近的输卵管，并将它们放入预热至 37 摄氏度的 M2 缓冲液中。

在正置显微镜的 10 倍物镜下，找到输卵管透明、增大的部分。然后，使用 1 毫升注射器固定输卵管，切开增大的部分，并收集卵母细胞冠状状丘丘复合物。要去除颗粒细胞，将卵母细胞复合物置于含有 0.1% 透明质酸酶的预热 M2作溶液中，然后通过口腔移液管轻轻吹气。

将卵母细胞连续转移到 KSOMaa 液滴中冲洗 3 次，然后放入 37 摄氏度、含 5% 二氧化碳的培养箱中。首先，获得一只安乐死的 8 至 10 周龄雄性 C57BL/6 小鼠。打开其腹腔，用剪刀轻轻切除睾丸附近的附睾。

将含有附睾的培养皿置于正置显微镜的 10 倍物镜下的 M2 培养基中。并使用 1 毫升注射器轻轻切除附睾，让精子流出。将悬浮液中流动的精子虹吸到含有 0.5 毫升 M2 缓冲液的试管底部。

对于圆形精子细胞分离，将解剖的睾丸转移到 M2 缓冲液中。使用 1 毫升注射器，在显微镜下轻轻切开白色膜，然后挤压并切除曲折的生精小管。提取悬浮液后，用 400 目筛过滤并离心过滤的细胞。

弃去上清液，将细胞与 200 μL Hoechst 33342 在 37 摄氏度下孵育 10 分钟。将含有染色细胞的流式细胞仪管放入流式细胞仪中。调整电压后，根据前向和侧向散射选择细胞群。

然后，根据前向散射和触发脉冲宽度去除细胞粘附。使用 355 纳米波长激光下的两个检测通道，对圆形精子细胞进行分类并将它们储存在 4 摄氏度。在显微镜下，小鼠圆形精子细胞的直径约为 10 微米，中间显示突起状核仁结构。

首先，从小鼠那里获得卵母细胞和圆形精子细胞。然后，准备适当直径的固定针和注射针。将卵母细胞放入 10 微升 M2 液滴中，含或不含细胞松弛素 B，以软化和储存配子。

然后，放置圆形精子细胞的 M2 液滴，并将手术皿安装在显微镜手术台上。调整注射位置并固定针头。使用聚乙烯吡咯烷酮 （PVP） 润湿并清洁注射针头。

接下来，将圆形精子细胞提取到注射针中。用固定针旋转卵母细胞，使卵母细胞的极体定向在 12 点钟位置。然后，小心地将注射针放在卵母细胞的三点钟位置。

使用 PiezoXpert 设备，在卵母细胞的透明带上打一个孔。然后，轻轻地将注射针水平推进到卵母细胞中并破裂卵母细胞膜。逐渐将圆形精子细胞注射到卵母细胞细胞质中。

抽出注射针头，在开口附近吸出少量卵母细胞膜以密封它。对于卵胞浆内单精子注射，将精子放在 PVP 跑道上。从尾部吸出精子，并将其颈部置于注射针口。

应用压电陶瓷将精子头与尾分开。然后，如前所述，用直径为 9 到 10 微米的注射针将精子注射到卵母细胞中。对于辅助卵母细胞活化，将卵母细胞置于 20 微升含有氯化锶六水合物的无钙和无镁 CZB 培养基液滴中。

然后，将它们转移到 KSOMaa 培养基中进行培养。同时，建立一个孤雌生殖激活组，而无需注射圆形精子细胞或精子进行胚胎学研究。活化后，转移到 KSOMaa 培养基中进行培养。

与胞浆内精子注射的胚胎相比，圆形精子细胞注射的胚胎显示出较低的发育效率。