Name: 小鼠圆形精子细胞注射 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 了解小鼠圆形精子细胞注射技术，用于提高胚胎发育效率并研究非梗阻性无精子症的辅助生殖方法。该技术为临床应用提供了重要实验基础。

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我们衷心感谢赵文洁在通过流式细胞术分选圆形精子细胞过程中提供的宝贵帮助，以及感谢王芳在小鼠胚胎移植方面的专业支持。本工作部分得到了吉林省自然科学基金（编号：YDZJ202301ZYTS461）的资助。我们感谢 Bullet Edits Limited 对 manuscript 的语言编辑和校对工作。

本实验所用的 B6D2F1 (C57BL/6 x DBA/2)、C57BL/6 和 ICR 小鼠均购自北京维通利华实验动物技术有限公司（中国北京）。所有动物处理均遵循经吉林大学第一医院实验动物伦理委员会批准的实验程序和标准（批准编号：20200435）。
1. 相关试剂的准备
<ol>
	<li>商业采购部分试剂，其余试剂自行配制。
	<ol>
		<li>获取 M2一种用于 体外 来自供应商的圆头精子细胞（RS）、精子和卵母细胞的处理</li>
		<li>制备 Ca2+无C.L. Chatot、C.A. Ziomek和B.D. Bavister（CZB）培养基用于AOA，按照先前发表的方案进行20.</li>
		<li>从供应商处获取添加氨基酸的钾离子优化培养基（KSOMaa）溶液，用于胚胎培养。</li>
		<li>将0.1 g透明质酸酶溶解于1 mL胚胎水中，配制终浓度为0.1%（1 g/L）的透明质酸酶工作液。取10 µL浓缩储存液，溶于990 mL M中2，可在 4 °C 下保存 1 周。</li>
		<li>通过将1.2 g聚乙烯吡咯烷酮（PVP，平均分子量为360,000）溶解于10 mL M中，配制质量浓度为12%的PVP溶液2所得溶液可在 4 °C 下保存 1 周。</li>
		<li>将细胞松弛素B（CB）储存液（2 µL）溶于18 µL DMSO中，于-20 °C保存。取5 µL浓缩储存液，溶于995 mL M中2所得溶液可在 4 °C 下保存 1 周。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 卵母细胞的制备
<ol>
	<li>将6-8周龄的雌性B6D2F1小鼠在新环境中适应至少1周。下午5点经腹腔注射7.5 IU孕马血清促性腺激素（PMSG），48小时后注射7.5 IU人绒毛膜促性腺激素（HCG）。注射后确保小鼠不与雄性接触。 
	注意：指定时间（下午5点）并非强制要求，仅为方便实验安排。注射后14小时为次日早上7点，此时卵母细胞已成熟，便于操作，因此将注射时间安排在傍晚。注射开始时间可根据实验室日常作息进行调整。</li>
	<li>HCG注射后14小时，采用颈椎脱臼法处死小鼠。打开腹腔，找到子宫。沿子宫两侧定位卵巢，用剪刀剪断靠近卵巢处的输卵管。对另一侧重复相同操作，并将输卵管置于预先在37 °C预热的M2培养液中。</li>
	<li>在正置显微镜（10倍）下，找到输卵管的膨大部分，其外观呈透明肿胀状。使用1 mL注射器固定输卵管，同时剪下膨大部分，收集卵母细胞-冠丘复合体（OCCCs）。</li>
	<li>将OCCCs放入预热的含0.1%透明质酸酶的M2操作液中，通过口控移液器轻轻吹打去除颗粒细胞。 
	注意：如需处理，OCCCs在0.1%透明质酸酶中停留时间应尽量短暂，约2分钟。</li>
	<li>去除颗粒细胞后，将卵母细胞转移至KSOMaa培养液中，清洗3次，随后置于二氧化碳培养箱中备用（37 °C，5% CO2）。</li>
</ol>
3. 圆形精子细胞和精子的制备
<ol>
	<li>分别从雄性C57BL/6小鼠（8-10周龄）的睾丸和附睾中收集圆形精子细胞和精子。
	<ol>
		<li>对于精子，通过颈椎脱位法处死小鼠。打开腹腔，找到位于睾丸附近的附睾，并用剪刀轻轻将其切除。</li>
		<li>将附睾置于M2培养基中，并在正置显微镜（10倍）下使用1 mL注射器轻轻刺破，使精子自然流出。</li>
		<li>用移液管吸取流出的精子与M2悬浮液，转移至含有0.5 mL M2的离心管底部，让精子自然向上游动。将其放置一旁以备后续使用。</li>
		<li>对于圆形精子细胞，从腹腔中取出睾丸并放入M2培养基中。在正置显微镜（10倍）下，使用1 mL注射器轻轻刺破白色包膜，挤出曲细精管。</li>
		<li>使用两个1 mL注射器小心地分离曲细精管。收集悬浮液，并用400目筛网（38 µm）过滤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将过滤后的细胞离心，弃去上清液，加入200 µL Hoechst 33342进行染色，随后在37 °C下孵育10分钟。</li>
	<li>进行荧光激活细胞分选（FACS），以区分圆形精子细胞与其他细胞类型。将染色后的细胞放入流式细胞仪专用管中，进行圆形精子细胞的筛选。
	<ol>
		<li>不同型号的流式细胞仪具有不同的调节参数，操作过程中可与技术支持人员沟通。第一步，根据前向散射光（FSS）和侧向散射光（SSC；参见补充表1）调整电压并选择细胞群体。</li>
		<li>第二步，根据FSC和触发脉冲宽度去除细胞黏连。</li>
		<li>第三步，选择目标单倍体圆形精子细胞。Hoechst 33342可结合DNA，不同倍性的细胞表现出不同的荧光强度。将激发波长设为355 nm，在355 nm激光下选择两个检测通道：460/50和670/30，用于分选圆形精子细胞。随后，将分选得到的圆形精子细胞储存于4 °C冰箱中以备后续使用。 
		注意：也可直接在显微镜下根据形态学特征选择圆形精子细胞，但需要经过训练以确保选择的准确性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 圆形精子细胞注射（ROSI）
<ol>
	<li>使用配备显微操作系统的倒置显微镜进行ROSI操作。</li>
	<li>在初始准备步骤中，按照先前描述的方法21制备持卵针和注射针。注射针的内径应保持在6–7 µm之间，适用于提取圆形精子细胞；持卵针的内径为20 µm，用于固定卵母细胞。</li>
	<li>在后续准备步骤中，通过放置含有CB的10 µL M2液滴以软化卵母细胞，并另置10 µL M2液滴用于保存圆形精子细胞，从而构建注射用液滴环境。使用PVP液滴润湿并清洁注射针。 
	注意：此处添加CB并非必要步骤，但添加CB可显著提高注射后的存活率。</li>
	<li>使用注射针提取圆形精子细胞。</li>
	<li>用持卵针旋转卵母细胞，使卵母细胞的极体位于12点或6点位置。</li>
	<li>将注射针小心置于卵母细胞3点位置，紧贴透明带。使用PiezoXpert装置在透明带上打孔。将强度由小逐渐调大，此处约为强度 = 5，速度 = 15。</li>
	<li>轻柔推进注射针穿过透明带，水平进入卵母细胞内部。当针尖通过卵母细胞中心时，施加压电脉冲（强度 = 1，速度 = 1），导致卵母细胞膜破裂，并将圆形精子细胞逐步注入卵母细胞胞质中。</li>
	<li>撤出注射针，并在开口附近吸取少量卵母细胞膜以封闭穿刺口。此步骤至关重要，若未成功封闭，则会导致胞质泄漏和卵母细胞死亡。 
	注意：值得注意的是，ROSI操作需在圆形精子细胞注射前或后进行卵母细胞激活（AOA），相关内容我们将在后续章节中讨论。</li>
</ol>
5. 细胞质内精子注射（ICSI）
<ol>
	<li>ICSI的操作步骤与ROSI相同，唯一区别在于ICSI注射针的直径为9-10 µm。</li>
	<li>将精子置于PVP跑道上以降低其游动速度，便于精子提取。</li>
	<li>进行ICSI时分离精子头部与尾部。从尾部吸入精子，并将精子颈部精确置于注射针口处。使用压电装置（可根据需要使用多次，强度=5，速度=15）分离精子头部与尾部。</li>
</ol>
6. 辅助卵母细胞激活（AOA）
<ol>
	<li>根据实验方案，制备不含钙和镁的CZB培养基。</li>
	<li>使用六水合氯化锶（SrCl26H2O)，分子量为266.62，配制成10 mM浓度。配制方法：将0.26662 g SrCl26H2O，加入1 mL 胚胎水中。使用时，取10 µL浓缩储存液加入990 µL的Ca2+无CZB培养基，立即使用。</li>
	<li>将卵母细胞置于 Ca2+含 SrCl 的无钙锌平衡培养基26H2O用于激活；每个液滴体积为20 µL，每次放置20个卵母细胞。孵育20分钟。</li>
	<li>同时，建立一个不注射圆头精子细胞或精子的孤雌激活组。需要注意的是，孤雌激活组未进行统计学分析，对照组为ICSI。</li>
</ol>
7. 胚胎移植
<ol>
	<li>将结扎后的ICR雄性与雌性小鼠按1:2的比例同笼饲养。次日清晨检查雌性小鼠阴道栓情况，选取有阴道栓的雌鼠用于胚胎移植。</li>
	<li>将前一天早晨获得的2细胞期胚胎进行注射，并于次日下午进行移植。</li>
	<li>在雌性小鼠背部做切口，暴露白色脂肪组织及卵巢，在直立显微镜（10倍）下定位输卵管膨大部分。</li>
	<li>使用1 mL注射器在输卵管膨大部分穿刺开口，通过口吸移液管吸取胚胎，并轻柔地将胚胎沿子宫方向注入。使用5-0（0.09–0.11 mm）粗细的缝合线及4 × 10型号的弯针进行缝合，缝合分为两层，分别缝合腹膜层和外层皮肤。</li>
	<li>根据实验计划对代孕小鼠实施剖宫产。采用颈椎脱位法处死小鼠，以酒精消毒后打开腹腔。轻柔且迅速地剪开子宫，切开羊膜腔以暴露胎鼠和胎盘。剪除脐带，从靠近胎鼠的一侧剪断；胎鼠由同期哺乳的母鼠进行喂养。 
	注意：由于需要准确计算出生率，剖宫产在评估繁殖能力方面更为准确。自然分娩时，子代可能被母鼠吞食，导致统计数据不准确。剖宫产操作针对早期移植的代孕小鼠进行，在分娩前实施安乐死并完成手术。</li>
</ol>
8. 统计分析
<ol>
	<li>使用 GraphPad Prism 5 进行分析。数据以均值 ± 标准差表示；P &#60; 0.05 表示具有统计学差异，P &#60; 0.01 表示具有显著统计学差异。</li>
</ol>

Murine Round Spermatid Injection Procedure to Study Embryonic Development

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</ol>

作者声明不存在财务或其他利益冲突。

辅助卵母细胞激活 
ROSI 的一个关键前提是辅助卵母细胞激活（AOA），因为圆头精子细胞本身无法启动卵母细胞的激活。目前，在小鼠中最成熟的方法是使用氯化锶23,24，而在人类应用中最为先进的方法则是电激活13,14。卵母细胞激活的时机也极为重要。文献报道显示，在小鼠中最佳的激活策略是先激活卵母细胞，然后再注射圆头精子细胞25。这与传统的受精过程相反，后者是精子首先进入卵母细胞，随后释放磷脂酶 C ζ 以激活卵母细胞26。Satoshi Kishigami 及其同事开展的专门研究表明，ROSI 在预先激活或后激活的卵母细胞中形成雄性原核的能力存在差异。为了实现高效的后代出生率，两种操作都必须在卵母细胞进入 G1 期之前完成25。
注射针的直径 
在ROSI的背景下，需要注意的是，注射针直径较大并不一定意味着更好的结果。所使用的注射针直径为6-7 µm，略小于圆形精子细胞。因此，当吸吮圆形精子细胞时，细胞膜会受到挤压作用，可能导致细胞核直接暴露。这种直接暴露可能有利于细胞骨架解聚以及雄性原核的后续形成27。
封闭处理 
小鼠卵母细胞的胞质黏度较其他物种更低。即使细胞膜出现微小破损，也容易导致胞质外流，从而引起卵母细胞退化28。为降低该风险，在将圆形精子细胞注入卵母细胞胞质并退出注射针后，必须在卵母细胞膜开口附近吸取少量细胞膜，以封闭该间隙，此操作类似于ICSI过程中的步骤21。这一封闭过程可显著降低卵母细胞退化的风险。
ROSI 作为模型的应用 
除了临床应用之外，ROSI 技术作为研究模型还具有多种其他用途。它可加快小鼠的繁殖周期29，挽救因父源性 Xist 基因缺失导致的雌性小鼠致死表型17，通过将圆形精子细胞注入单倍体孤雌生殖的二细胞期卵裂球来产生小鼠后代15，生成转基因小鼠后代16，以及在儿童接受癌症治疗前保存其生育能力30,31。对小鼠 ROSI 技术的深入研究将显著推动生殖健康领域的科研进展。
文章的局限性 
本文作为一篇方法学指南存在若干局限性，包括未在显微镜下直接比较选择RS进行注射，以及被认为缺乏创新性。

精子发生的最后阶段涉及将圆形的精子细胞转化为结构完整的精子，其特征是具有明显的头部、颈部和细长的尾部结构1。这一转化过程伴随着细胞形态的显著变化，包括细胞核内染色质的浓缩、组蛋白被鱼精蛋白取代、顶体的形成、线粒体鞘的发育、中心粒的迁移与消失、尾部结构的形成以及细胞残余物的清除2。
1992年，首例通过卵胞浆内单精子注射（ICSI）技术成功诞生的人类胎儿出生3。自此以后，研究人员开始探索利用具有与成熟精子相同单倍体遗传组成的圆型精子细胞（round spermatids）来使卵母细胞受精并维持可存活妊娠的可能性2,4。随后，1996年，首例通过圆型精子细胞注射（ROSI）技术孕育的人类胎儿顺利出生5,6。值得注意的是，由于小鼠卵母细胞膜在注射过程中易受损伤，小鼠中的ICSI和ROSI研究进展落后于人类。这一问题随着压电膜穿刺装置（Piezo membrane-breaking device）的引入得以成功解决。因此，1995年，首只通过ROSI技术诞生的小鼠成功出生。此外，针对其他多种动物的ROSI研究也正在进行中7,8。
目前，ROSI 的研究主要集中在以下几个方面：临床应用、机制解析、提高发育效率的策略，以及 ROSI 技术的更广泛用途。在临床应用方面，尽管1996年已有通过ROSI技术诞生首例人类胎儿的报道，但其发展过程伴随着一系列成功与失败9,10,11,12。迄今为止，ROSI技术尚未实现广泛的临床应用，主要原因在于其效率较低，且通过ROSI技术孕育的胎儿安全性仍需进一步验证。不完全统计数据显示，全球范围内通过ROSI技术出生的人类胎儿不足200例。2015年，Tanaka 及其同事报道了通过ROSI技术成功诞生14例胎儿的案例，成为理解ROSI技术潜力的一个转折点，重新增强了人们对其临床应用可行性的信心13,14。ROSI技术在解决生殖生物学难题方面具有重要意义，尤其适用于非梗阻性无精症患者。除了临床应用外，ROSI还是一种研究胚胎发育复杂机制的重要工具15,16,17。
已有大量动物研究致力于探究导致ROSI在实现完全胚胎发育过程中效率低下的潜在因素。这些因素包括辅助卵母细胞激活（AOA）方法的选择及其实施时机、基因组稳定性异常，尤其是表观遗传修饰的异常。需要认识到，圆形精子细胞是未成熟的生殖细胞，在多种生理特性上与成熟精子存在显著差异。Mizuki Sakamoto及其同事指出，来源于圆形精子细胞的H3K27me3与染色质可及性降低相关，并导致ROSI胚胎中基因表达受损18。在Jing Wang及其同事的一项相关研究中，ROSI胚胎在原核阶段的重编程缺陷主要与负责次要合子基因组激活的一组基因的异常表达有关19。他们还发现，引入选择性常染色质组蛋白赖氨酸甲基转移酶2抑制剂A366，可能使整体发育率提高约两倍。
小鼠是研究胚胎发育最有价值的模式动物之一。本文详细阐述了如何在小鼠中进行ROSI操作。该综合性实验方案涵盖了合适小鼠的选择、详细的促排卵诱导步骤、AOA技术、显微注射技术以及代孕小鼠的准备。此外，我们对两种注射方案对出生效率的影响进行了比较分析：AOA后进行ROSI（A-ROSI；第一种方案）与ROSI后进行AOA（ROSI-A；第二种方案）。我们旨在帮助研究人员更精确地开展小鼠ROSI实验，为其临床应用及胚胎发育机制的基础研究提供更有力的支持。

<table><tbody><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>西格玛</td><td>C7902&amp;nbsp;</td><td>CZB 液体的配制</td></tr><tr><td>葡萄糖&amp;nbsp;</td><td>西格玛</td><td>G6152&amp;nbsp;</td><td>CZB 液体的配制</td></tr><tr><td>HEPES-Na（碱性）&amp;nbsp;</td><td>西格玛</td><td>H3784&amp;nbsp;</td><td>CZB 液体的配制</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>碧云天&amp;nbsp;</td><td>C1025</td><td>FACS</td></tr><tr><td>人绒毛膜促性腺激素（HCG）</td><td>宁波第二激素厂</td><td>HCG</td><td>促排卵药物</td></tr><tr><td>透明质酸酶</td><td>西格玛</td><td>H3506</td><td>去除卵母细胞周围的颗粒细胞</td></tr><tr><td>KCl&amp;nbsp;</td><td>西格玛</td><td>P5405</td><td>CZB 液体的配制</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>西格玛</td><td>P5655&amp;nbsp;</td><td>CZB 液体的配制</td></tr><tr><td>KSOMaa</td><td>Caisson 实验室</td><td>IVL04-100ML</td><td>含氨基酸的优化钾盐单纯培养基</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺&amp;nbsp;</td><td>西格玛</td><td>G8540&amp;nbsp;</td><td>CZB 液体的配制</td></tr><tr><td>M2</td><td>西格玛</td><td>M7167-50ML</td><td>操作液</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>西格玛</td><td>M1880&amp;nbsp;</td><td>CZB 液体的配制</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-EDTA2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>西格玛</td><td>E5134&amp;nbsp;</td><td>CZB 液体的配制</td></tr><tr><td>NaCl&amp;nbsp;</td><td>西格玛</td><td>S5886</td><td>CZB 液体的配制</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>西格玛</td><td>S5761&amp;nbsp;</td><td>CZB 液体的配制</td></tr><tr><td>60% 乳酸钠糖浆，密度 = 1.32 g/L</td><td>西格玛</td><td>L7900&amp;nbsp;</td><td>CZB 液体的配制</td></tr><tr><td>丙酮酸钠&amp;nbsp;</td><td>西格玛</td><td>P4562&amp;nbsp;</td><td>CZB 液体的配制</td></tr><tr><td>压电钻头（ICSI）&amp;nbsp;</td><td>艾本德&amp;nbsp;</td><td>piezoXpert</td><td>压电膜穿孔</td></tr><tr><td>孕马血清促性腺激素（PMSG）</td><td>宁波第二激素厂</td><td>PMSG</td><td>促排卵药物</td></tr><tr><td>PVA&amp;nbsp;</td><td>西格玛</td><td>P8136</td><td>CZB 液体的配制</td></tr></tbody></table>

小鼠圆头精子细胞注射

Mouse Round Spermatid Injection

圆形精子细胞具有单倍体遗传物质，是成熟精子的前体细胞。通过创新的圆形精子细胞注射技术（ROSI），可成功使卵母细胞受精并发育为可存活的胎儿。1995年，科学家首次利用ROSI技术成功诞生了小鼠胎儿，实现了里程碑式的突破。此后，ROSI逐渐成为解析胚胎发育复杂机制的关键工具，并在加速小鼠世代更替、制备基因修饰小鼠等多种应用中展现出重要潜力。1996年，首例通过ROSI技术诞生的人类胎儿成功出生，标志着该技术在人类生殖领域的又一重要进展。然而，该方法在临床应用中的成功率起伏不定，至今尚未在临床实践中得到广泛应用，主要原因在于其出生效率较低，且胎儿安全性尚未得到充分验证。本文系统阐述了在小鼠中实施ROSI技术的精确操作方法，旨在为相关基础研究及其潜在的临床应用提供新的见解。

我们首先通过考察卵母细胞激活（AOA）对胚胎发育能力的影响来开展研究。实验设计的示意图见图1A。在精子注射前，卵母细胞接受AOA处理（A-ICSI）或不进行处理（ICSI）。胚胎发育的详细数据见表1。结果显示，A-ICSI组与ICSI组在卵裂率、囊胚率和出生率方面均无显著差异（P &gt; 0.05；图1B）。这些结果表明，使用10 mM SrCl2处理20分钟的AOA方案未对胚胎的发育潜能产生影响。
先前有报道称，通过流式细胞术（FACS）或在显微镜下直接肉眼观察所筛选的ROSI胚胎，在发育效率上未见明显差异22。本实验采用FACS技术来鉴定圆形精子细胞（RS）（图2A,B）。在显微镜下，小鼠圆形精子细胞直径约为10 µm，中央具有类似突起的核仁结构（图2C）。我们认为，通过FACS进行筛选比在显微镜下直接肉眼观察更为准确。此外，文献也支持通过形态学差异直接鉴定RS。ROSI胚胎通过两种不同方法制备：A-ROSI组，即在圆形精子细胞注射前对卵母细胞进行卵母细胞激活（AOA）；ROSI-A组，即在圆形精子细胞注射后进行AOA。实验设计的示意图见图1C。值得注意的是，A-ROSI组、ROSI-A组与ICSI组之间的卵裂率和囊胚率均无显著差异（P &gt; 0.05；图1D）。A-ROSI组、ROSI-A组和ICSI组的囊胚率均显著高于激活对照组（P &lt; 0.05；图1D）。然而，无论卵母细胞是在注射前还是注射后激活，ROSI组的出生率均低于ICSI组（P &lt; 0.05；图1D）。重要的是，A-ROSI组的出生率略高于ROSI-A组（图1D）。更多关于胚胎发育数据的详细信息见表1。
<img alt="胚胎发育示意图；A-ICSI 和 ROSI 处理；条形图显示效率比率 B, D。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65898/65958fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图 1：与 ICSI 胚胎相比，ROSI 胚胎表现出较低的发育效率。（A）评估激活对 ICSI 胚胎发育影响的实验方案示意图。蓝色 = 卵母细胞未被激活；黄色 = 卵母细胞被激活。（B）来自 A-ICSI 和 ICSI 的胚胎发育效率。（C）生成不同类型胚胎的实验方案示意图。（D）来自 A-ROSI、ROSI-A、A 和 ICSI 的胚胎发育效率。**，P &lt; 0.01。缩写：A = 激活；E = 胚胎发育天数；ROSI = 圆形精子细胞注射；ICSI = 卵胞浆内单精子注射。误差线表示标准差。采用卡方检验进行率的比较。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65898/65958fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术结果；散点图、直方图；颗粒分析；样品细节的显微镜插图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65898/65958fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图2：通过流式细胞分选筛选出圆形精子细胞。（A）用于筛选圆形精子细胞的流式细胞分选示意图。（B）展示圆形精子细胞筛选过程的代表性图像。比例尺：10 µm。缩写：FSC = 前向散射；SSC = 侧向散射；355 为激发波长；460/50 和 670/30 为355波长激光下的两个检测通道。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65898/65958fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">组别</td>
			<td colspan="3">植入前发育</td>
			<td colspan="2">植入后发育</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>重复次数</td>
			<td>卵裂率 (%)</td>
			<td>囊胚率 (%)</td>
			<td>移植的2-细胞胚胎数/受体数量</td>
			<td>出生率 (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-ICSI</td>
			<td>5</td>
			<td>99.33 (149/150)</td>
			<td>75.17 (112/149)</td>
			<td>49/5</td>
			<td>48.98 (24/49)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-ROSI</td>
			<td>5</td>
			<td>99.33 (149/150)</td>
			<td>73.83 (110/149)</td>
			<td>44/5</td>
			<td>18.18 (8/44) **</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROSI-A</td>
			<td>5</td>
			<td>98.00 (147/150)</td>
			<td>64.63 (95/147)</td>
			<td>45/5</td>
			<td>13.33 (6/45) **</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activation</td>
			<td>5</td>
			<td>100.00 (150/150)</td>
			<td>12.00 (18/150) **</td>
			<td>51/5</td>
			<td>0.00 (0/51) **</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICSI</td>
			<td>5</td>
			<td>98.00 (147/150)</td>
			<td>73.47 (108/147)</td>
			<td>46/5</td>
			<td>52.17 (24/46)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 不同组别来源胚胎的发育效率。
补充表 1. 通过流式细胞术分选的不同细胞群体的比例。P3 部分为圆形精子细胞。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65898/Supplementary%20Table%201_RE.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文介绍了一种在小鼠中进行圆头精子细胞注射（ROSI）的方法，该技术具有潜在的临床应用价值，并可用于研究胚胎发育背后的机制。

圆形精子细胞具有单倍体遗传物质，是成熟精子的前体细胞。通过……这一创新技术

圆形精子细胞注射技术可以解决部分非梗阻性无精症患者的生育问题，但其效率非常低。本研究采用小鼠作为模型，探索提高小鼠圆形精子细胞注射后胚胎发育效率的方法。不完全统计显示，全球范围内通过人类圆形精子细胞注射技术诞生的胎儿数量不足200例。2015年，田中（Tanaka）及其同事报道了通过ROSI技术成功诞生14只胎儿，这一成果成为理解ROSI技术潜力的转折点，重新增强了人们对该技术临床应用可行性的信心。目前ROSI研究的重点集中在表观遗传修饰异常和卵母细胞辅助激活异常方面，而准确识别圆形精子数据也是一项挑战。在本实验室，ROSI胚胎在小鼠中的发育效率已经非常高，与其他实验室的结果相似。然而，非啮齿类动物（如人类）的发育效率研究仍处于起步阶段。未来，我们将致力于提高非啮齿类动物的发育效率。首先，在下午5:00，向6至8周龄的雌性小鼠腹腔注射7.5国际单位的孕马血清促性腺激素，48小时后再注射等量的人绒毛膜促性腺激素。注射后确保不与雄性小鼠接触。处死小鼠后，打开其腹腔。用剪刀在靠近卵巢处剪断输卵管，并将其置于预热至37摄氏度的M2缓冲液中。在正置显微镜的10倍物镜下，找到输卵管透明且膨大的部分。然后使用1毫升注射器固定输卵管，剪下膨大部分，并收集卵母细胞冠丘复合体。为去除颗粒细胞，将卵母细胞复合体置于预热的含0.1%透明质酸酶的M2操作液中，用口控移液器轻轻吹打。将卵母细胞依次转移到KSOMaa液滴中，清洗三次，然后置于含5%二氧化碳的37摄氏度培养箱中。首先，取一只8至10周龄的C57BL/6雄性小鼠，实施安乐死后打开其腹腔，用剪刀在靠近睾丸处小心剪下附睾。将含有附睾的培养皿置于直立显微镜的10倍物镜下，并使用1毫升注射器轻轻切碎附睾，使精子流出。用移液管将悬浮液中的精子吸入含有0.5毫升M2缓冲液的离心管底部。对于圆头精子细胞的分离，将解剖后的睾丸转移至M2缓冲液中。使用1毫升注射器在显微镜下轻轻剪开白膜，然后挤出并切除弯曲的生精小管。提取悬液后，用400目筛网过滤，并对滤过的细胞进行离心。弃去上清液，加入200微升Hoechst 33342，在37摄氏度下孵育细胞10分钟。将含有染色细胞的流式管放入流式细胞仪中。调节电压后，根据前向散射和侧向散射选择细胞群体。然后，根据前向散射和触发脉冲宽度去除细胞黏附物。使用355纳米波长激光下的两个检测通道，分选圆形精子细胞并将它们保存在4°C。在显微镜下，小鼠圆形精子细胞直径约为10微米，中央具有类似突起的核仁结构。首先，从小鼠中获取卵母细胞和圆形精子细胞。然后，准备适当直径的持卵针和注射针。将卵母细胞放入含有或不含细胞松弛素B的10微升M2液滴中，以软化并保存配子。然后，将圆形精子细胞的M2液滴放置好，并将操作皿固定在显微操作台上。调整注射位置并固定针头。使用聚乙烯吡咯烷酮（PVP）润湿并清洁注射针。接下来，将圆形精子细胞吸入注射针中。用固定针旋转卵母细胞，使卵母细胞的极体位于12点钟位置。然后，将注射针小心地置于卵母细胞的3点钟位置。使用 PiezoXpert 装置在卵母细胞的透明带中打孔。然后将注射针水平轻柔地推进卵母细胞内，并刺破卵母细胞膜。逐渐将圆形精子细胞注入卵母细胞的细胞质中。拔出注射针，并在开口附近吸取少量卵母细胞膜以封闭开口。进行胞质内精子注射时，将精子置于PVP跑道上。从精子尾部吸入精子，并将其颈部置于注射针口处。使用压电装置将精子头部与尾部分离。然后，如前所述，用直径为9至10微米的注射针将精子注入卵母细胞。为辅助卵母细胞激活，将卵母细胞置于含有六水合氯化锶的无钙无镁CZB培养基液滴（20微升）中。然后，将它们转移至KSOMaa培养基中进行培养。同时，建立一组不注射圆形精子细胞或精子的孤雌激活组，用于胚胎学研究。激活后，转移至KSOMaa培养基中进行培养。与胞质内精子注射的胚胎相比，注射圆形精子细胞的胚胎表现出发育效率降低。

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

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