Name: 小鼠肠道中 T4 噬菌体和 大肠杆菌 相互作用:研究体内宿主-噬菌体动力学的原型模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T13:55:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 了解T4噬菌体与大肠杆菌在无菌小鼠肠道中的相互作用机制，探索噬菌体、细菌与哺乳动物免疫系统的三方关系。该标准化方案为研究肠道微生物组动态及疾病相关机制提供了重要工具。

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作者谨此申明，本研究所进行的区域是 xwməθkwəy̓əm（Musqueam）民族的传统、祖传且未经割让的领地。该土地位于历来为 Musqueam 人民的学习之地，千百年来，他们的文化、历史与传统在此地代代相传。我们鼓励各界人士通过 https://native-land.ca 了解更多有关其生活与工作所在原住民土地的信息。作者感谢来自 Natural&#160;加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）加拿大研究生奖学金-硕士（N.P.），BC省迈克尔·史密斯健康研究会培训生奖（RT-2023-3174，授予MH），加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）发现基金项目（RGPIN-2019-04591，授予C.T.；RGPIN-2016-04282，授予LCO），加拿大先进研究所/人类与微生物组项目（FL-001253 Appt 3362，授予C.T.），迈克尔·史密斯健康研究基金会学者奖（18239，授予C.T.），加拿大卫生研究院（PJT-159458，授予LCO）以及加拿大创新基金会（34673，授予LCO；38277，授予CT）。我们感谢不列颠哥伦比亚大学疾病建模中心（UBC Centre for Disease Modelling）和ubcFLOW提供的技术支持，上述机构由不列颠哥伦比亚大学GREx生物韧性倡议（UBC GREx Biological Resilience Initiative）资助, 并向Osborne实验室和Tropini实验室的成员致以感谢，感谢他们对稿件提出的宝贵讨论与评审意见。 图1A 和 图 2A 使用 Biorender.com 创建。

Exploring Gut Phage-Bacteria Dynamics in Murine Models Using T4 Phage

作者无任何利益冲突需要披露。

与细菌相比，微生物组中噬菌体的研究面临重大挑战。具体而言，噬菌体缺乏一种所有噬菌体共有的保守系统发育标记，而这种标记在细菌和真核生物中分别由16S和18S核糖体亚基提供，使得原核和真核物种的测序与鉴定得以简便进行。42然而，随着下一代测序技术的进步，包括读长的增加、通量的提高以及成本的降低，噬菌体基因组数据库正在迅速扩展42,43,44。随着噬菌体发现的基础工作不断推进，噬菌体研究如今比以往更加易于开展。作为肠道微生物组的关键成员以及地球上遗传多样性最丰富的生物体，噬菌体为探究微生物组复杂性的新研究提供了极具吸引力的切入点。本文所述的实验方案聚焦于在定植了目标细菌的小鼠中研究已知的噬菌体种类。需要注意的是，这些方案仅为研究噬菌体提供了指导性框架 体内 并可随着该领域的发展而进一步拓展。
随着20世纪40年代抗生素的问世，噬菌体在治疗细菌感染方面的研究在很大程度上逐渐被弃用。然而，抗生素的过度处方和滥用已加速了多重耐药病原体的出现，成为重大的公共卫生问题3。由于噬菌体具有高度的宿主特异性，它们被视为抗生素的一种颇具吸引力的潜在替代方案3。重要的是，由于噬菌体天然存在于人类肠道微生物组中，因此有必要首先了解噬菌体在这些复杂环境中的作用。尽管已有许多研究在体外（in vitro）探讨了噬菌体与其靶向细菌之间的关系，但同样需要考虑这些关系在胃肠道环境中的实际表现。正如在探索微生物群细菌组分的初步研究中所采用的那样，使用无菌小鼠（GF）和单菌定植小鼠等简化的动物模型，有助于我们分离噬菌体对其靶向菌种的影响，并阐明这种相互作用如何影响宿主的免疫应答。这是实现噬菌体治疗的重要一步，因为某些噬菌体在引入肠道后可能并不会带来益处。例如，Pseudomonas aeruginosa 的噬菌体Pf4通过抑制抗菌免疫反应和角质形成细胞迁移，加重了其宿主引起的疾病，导致伤口愈合受损18,45。本文所述的操作流程旨在标准化将噬菌体作为小鼠肠道微生物群成员进行研究的技术方法。正如早期研究揭示微生物群对多细胞宿主影响的开创性工作一样，在微生物群背景下持续开展噬菌体研究，可能对全面理解多生物组（multibiome）带来令人振奋且重要的进展46。
局限性 
本文所述方案已针对T4噬菌体与其宿主细菌之间的竞争研究进行了优化， E. coli，当通过口服灌胃给予T4噬菌体时 E. coli 单定植小鼠。与细菌类似，不同的噬菌体物种之间也表现出不同的特性，其复制时间、裂解量以及宿主细菌的范围各不相同。47因此，在利用类似的动物模型研究其他噬菌体-细菌配对时，应对各个步骤的实验方案进行优化。例如，复制周期较长和/或裂解量较小的噬菌体，可能需要更长的孵育时间以与其宿主细菌共培养，从而获得高滴度的裂解液。同样，噬菌斑实验中的平板培养时间也可能需要相应延长。相反，复制周期较短和/或裂解量较大的噬菌体则可能需要缩短平板培养时间，因为过夜培养可能导致噬菌斑过度生长。若所关注的特定噬菌体的增殖条件尚不明确，应在开展实验前系统建立确定其生长条件的基础实验。 体内 工作48.
T4噬菌体Hoc衣壳蛋白中的Ig样结构域促进其黏附于肠道黏液11根据所选噬菌体与黏液结合能力的不同，粪便样本中噬菌体-细菌水平的动力学可能与所示结果存在差异 图2B-E例如，在肠道芯片系统中已证明，含有完整Hoc蛋白的噬菌体具有增强的 E. coli 与缺乏 Hoc 的噬菌体相比的杀伤能力11. 虽然有推测认为T4噬菌体是通过黏液结合而被保留 在体11,12,13，不能排除小鼠通过食粪行为重新接种的影响。这些影响可通过使用金属网笼底或频繁更换笼具来降低。由于在单链DNA或RNA噬菌体中尚未鉴定出Ig样结构域49，研究噬菌体用于在肠道黏膜中保持定植的其他策略将十分有趣。
最后，这些探索性研究仅在稳态条件下考察了噬菌体-细菌-宿主之间的相互作用。在人类疾病的动物模型中，尚不清楚肠道屏障完整性的改变（如炎症性肠病中的情况）会如何影响这些相互作用。最近的研究表明，Caudovirales 噬菌体在炎症性肠病患者中的丰富度和多样性有所增加7,8。在小鼠模型中，持续的噬菌体治疗会加重葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的实验性结肠炎8。目前仍需明确噬菌体-细菌-宿主相互作用在炎症环境中的具体表现，以及屏障完整性受损是否会促进噬菌体诱导的炎症反应。
故障排除与替代方法
小鼠模型 
单菌定植小鼠模型可用于研究单一细菌物种对宿主生理的影响16。涉及单菌定植小鼠的研究在阐明微生物群如何影响免疫系统方面发挥了关键作用22。作为一种模型系统，单菌定植小鼠并不能完全再现其具有常规微生物群对应小鼠的生理状态。与无菌（GF）小鼠更为相似，E. coli 单菌定植小鼠表现出黏液分泌减少（与GF小鼠相似50）以及免疫系统发育不成熟23。然而，单菌定植小鼠对于揭示特定微生物对胃肠道和免疫系统发育的个体化作用具有不可估量的价值。一个经典例子是发现分节丝状细菌（SFB）能够强烈诱导小鼠体内CD4+ 辅助性T细胞17（Th17）的生成24。在黏液相关研究方面，不同微生物对黏液相关基因的转录51及黏液层厚度50具有特异性影响。尽管目前应用有限，单菌定植小鼠仍为在受控模型中研究单一噬菌体-细菌配对对哺乳动物宿主的影响提供了机会。重要的是，噬菌体的研究可以在复杂微生物群的背景下进行，也应当如此。截至本文撰写时，极少有研究探讨噬菌体在常规微生物组内对共生细菌物种捕食作用的影响。这是本文所介绍实验方案未来可拓展的应用方向，相关方案可被调整以推动此类研究的开展。
使用适当的溶剂对照 
在任何实验中，适当的对照都是至关重要的。本研究中定义了一种适用于小鼠口服给药的合适溶剂，用于控制T4噬菌体裂解液的多步清洗和纯化过程。一个重要要求是，溶剂对照应含有与噬菌体裂解液相等水平的细菌内毒素，以排除任何由内毒素介导的免疫反应。氯仿和1-辛醇在纯化过程中被添加至裂解液中，随后被去除。为控制这些化学物质在痕量水平下可能引发的潜在免疫反应，可制备无噬菌体的细菌裂解液作为溶剂对照。T4噬菌体裂解液和溶剂对照中的细菌内毒素浓度均非常低，远低于饮用水中允许的限值25&#160;（图1B）。也可使用其他替代性对照，并可根据具体研究问题进行调整。最简单的替代方法是使用含有等量内毒素的噬菌体缓冲液，但该方法无法模拟多步清洗和纯化过程。Gogokhia等人8曾报道使用热灭活噬菌体作为对照，以检验不含DNA的噬菌体蛋白是否足以引发免疫反应。在我们的实验中，热灭活噬菌体的内毒素水平低于T4噬菌体裂解液（图1B），因此未用于本研究中对内毒素水平的对照。然而，我们建议对两种方案均进行测试，以确定哪种方法更适用于特定的实验目的。如果溶剂对照与T4噬菌体裂解液在内毒素含量上存在显著差异，可向内毒素水平较低的裂解液中补充纯化的内毒素。1-辛醇在纯化过程中被加入裂解液，但会干扰显色内毒素定量试剂盒的检测。因此，必须检测样品中可能存在的干扰物质对检测的抑制作用，以确保内毒素测定结果的准确性。若怀疑存在产物抑制，可能是因为样品未充分使用快速真空干燥。若问题持续存在，可采用透析法去除残留的1-辛醇25。
给药途径与剂量 
由于T4噬菌体具有结合黏液的能力，小鼠模型采用单次口服灌胃方式进行接种。此举旨在监测噬菌体与E. coli在胃肠道中共存的时间；然而，已有其他研究方法被用于在体内模型中研究噬菌体。例如，已有研究使用富含噬菌体的饮用水持续向小鼠提供噬菌体8,20。该给药方式的优势在于，即使在缺乏细菌宿主的情况下，噬菌体仍可被持续补充，这一点已被Gogokhia等人证实.8。这种实验设计使得研究人员能够在无细菌存在的情况下评估机体对噬菌体的免疫应答，并在整个实验过程中实现持续的免疫刺激。从生理学角度来看，该方法并不能代表噬菌体感染或在肠道环境中定植的自然过程，但它为反复暴露于噬菌体如何启动免疫系统提供了重要见解。这一发现对于噬菌体疗法的开发具有重要意义，因为噬菌体鸡尾酒疗法可能需要像抗生素治疗方案一样，以连续给药的方式用于治疗肠道细菌感染。在T4噬菌体与E. coli配对的研究背景下，研究发现，降低口服给予单菌定植小鼠的T4噬菌体剂量，并不会改变粪便中噬菌体或细菌的水平（图2D、E）。因此，在此情况下，T4噬菌体的接种剂量对于维持双菌定植小鼠肠道内稳定的T4噬菌体与E. coli共存状态并非关键因素。需指出的是，本研究中最低给药剂量为200 pfu/小鼠，最高剂量为2 × 106 pfu/小鼠（依据Hsu等人）2。因此，本研究未提供支持T4噬菌体与E. coli动力学关系在该剂量范围之外的数据。
噬菌斑点计数与整板噬菌体滴度测定 
为检测粪便和组织中的T4噬菌体水平，本文所述方案依赖于斑点接种法（spot plating），而非整板噬菌斑测定法（whole plate plaque assays），后者可能增加小鼠间噬菌体水平的变异性（图2B）。在整板测定法中，噬菌斑在更大面积上进行计数，从而实现更精确的定量。然而，通常需要通过斑点接种法预先确定每个样本的合适稀释倍数。由于样本在采集当天即进行检测，因此斑点接种法被认为更适合高通量的实验流程。因此，本数据的分辨率最准确地反映为各样本中噬菌体数量级的差异。对于精确的噬菌体定量，还需针对每种噬菌体考虑其他因素。通过整板测定法或对每个样本采用更小的连续稀释梯度，可以获得更准确的测量结果。如果这些方法仍导致噬菌体或目标细菌计数不稳定，则应谨慎评估噬菌体与细菌之间是否存在特异性相互作用，从而导致个体小鼠间的差异；可通过宏基因组测序或其他方法实验性地评估共进化与抗性机制。根据Bonilla等人的研究25，在制备噬菌斑测定用软琼脂时，加入的宿主细菌量应保持一致25。如图3所示，即使细菌培养时间（图3A）和密度（图3B）发生相对较小的变化，也可能影响噬菌斑测定的准确性。这些结果可能因不同的噬菌体-细菌配对而异，在使用新生物体时建议进行类似的实验验证。此外，对于新的噬菌体-细菌配对，应开展探索性实验以确定各自的生长特性。例如，可通过生长曲线实验确定细菌的延滞期、对数生长期、稳定期及生长速率；通过一步生长实验确定噬菌体的潜伏期（裂解时间）和爆发量（单个细菌裂解后释放的噬菌体数量）52,53。
通过qPCR替代测定T4噬菌体 
噬菌体的定量可通过噬斑实验（如上所述）或定量聚合酶链式反应（qPCR）进行。这两种方法有一个重要区别：噬斑实验测定的是能够感染并杀死其细菌宿主的活噬菌体数量，而qPCR测定的是噬菌体特异性遗传物质（作为噬菌体存在数量的替代指标），但无法提供有关噬菌体活力和感染能力的信息。本研究采用Hsu等人2&#160;描述的引物，通过qPCR比较噬菌体基因拷贝数与噬斑实验中形成的噬斑数量（图4）。从T4噬菌体/E. coli 共定植小鼠的盲肠内容物中提取并扩增T4噬菌体DNA。在大多数小鼠中，qPCR与噬斑实验检测到的盲肠内容物中T4噬菌体水平相似（图4A、B）。尽管在对照溶剂接种的小鼠盲肠内容物中也检测到一定程度的扩增，但计算出的基因拷贝数/g低于检测限（LOD）（图4A）。通过凝胶电泳确认这些样本中无可观测的噬菌体。在T4接种小鼠盲肠内容物提取的DNA中可清晰观察到T4噬菌体基因产物（96 bp），而在对照溶剂组中则未检测到（图4C）。
在这些检测中，通过qPCR在一只定植T4噬菌体的小鼠的盲肠内容物中检测到了T4噬菌体基因拷贝数图 4A，箭头所示）尽管在相同样本的噬菌斑实验中无法检测到T4图4B，箭头）。这些结果表明，无法形成蚀斑的病毒颗粒可能产生于 体内，这可能是由于产生了有缺陷的病毒颗粒，或噬菌体和/或细菌的共同进化所致。在硬琼脂培养基上进行细菌涂布培养技术可用于测定粪便细菌对噬菌体的敏感性14我们建议，qPCR介导的检测可能是对现有方法的一个有益补充 体内 噬菌体工作流程，因为它针对的是短而保守的基因，可能对肠道环境中噬菌体的进化更具鲁棒性&#160;序列。宏基因组学等无偏倚方法在研究噬菌体-细菌共进化及相对丰度方面具有重要价值，但最终可能成本更高。
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65906/65906fig04v2.jpg" /> 
图 4T的检测4 通过qPCR检测噬菌体。 (A，BT4噬菌体载量被测定 通过 (A绝对定量qPCR或（B) 在盲肠内容物中的噬菌斑测定 E. coli 接种T4噬菌体或对照溶剂的C57BL/6小鼠在接种后第29天的定植情况。箭头指示来自一只小鼠的结果，该小鼠的盲肠内容物中可检测到T4基因组拷贝，但未检测到可形成噬斑的病毒。C) PCR产物的凝胶电泳结果显示，在T4噬菌体接种的盲肠样本中存在96 bp条带，而在对照溶剂接种样本中未检测到该条带。使用了100 bp DNA标记物。LOD = 检测限。误差线表示均值和标准误。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65906/65906fig04largev2.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
应用 
噬菌体占微生物组中存在的类病毒颗粒的90%以上44然而，噬菌体对肠道微生物组的影响尚不明确。早期研究通过分离特定菌种并探究其对免疫系统成熟的影响，来考察微生物组中的细菌组分。22,24对噬菌体组进行类似的探究是一项艰巨但必要的任务，也是全面理解多生物组所必需的条件46尽管噬菌体疗法的研发重点通常集中在治疗败血性细菌感染上，但了解噬菌体鸡尾酒疗法添加至胃肠道后可能对肠道生态系统造成的影响同样至关重要。此外，应通过建立免疫谱型来评估治疗性噬菌体鸡尾酒的安全性。噬菌体已被研究作为治疗肠道细菌感染的潜在手段，例如 C. difficile5&#160;和 鼠伤寒沙门氏菌 血清型鼠伤寒沙门菌54. 近期研究还表明，FFTs 在治疗早产仔猪坏死性小肠结肠炎方面具有同等或更优的疗效9，提示粪便微生物移植（FMT）中的病毒组分可能在疾病缓解中发挥积极作用。有必要进一步开展研究以探讨噬菌体在微生物组中的作用。&#160;以进一步推动针对肠道病原体的噬菌体疗法的发展，同时也为粪便微生物移植（FMT）作为疾病治疗手段提供更充分的科学依据。通过标准化噬菌体研究的方法 体内，噬菌体研究的透明度和可重复性将得到提高，同时为那些将其研究扩展到小鼠模型的研究人员提供指导。

噬菌体（bacteriophages，简称phages）是一类能够特异性感染并杀死特定物种和菌株细菌的病毒1。在复杂的细菌群落（如肠道微生物群）中，噬菌体发挥着重要作用，已被证实参与调控细菌种群动态并影响细菌的适应性2。在过去十年中，由于耐药性病原微生物的不断出现3，人们对噬菌体研究重新产生了浓厚兴趣，并开始探索将噬菌体疗法作为替代治疗策略的潜力。近年来，裂解性噬菌体混合制剂已通过静脉注射方式在治疗人类严重的抗生素耐药性细菌败血症感染中取得了一定成效3,4。口服噬菌体疗法也被提出作为治疗肠道感染和炎症的潜在抗生素替代方案。此外，研究表明噬菌体可能在粪便滤液移植（fecal filtrate transplants, FFT）中发挥关键作用；FFT 是经过滤去除细菌后的粪便微生物群制剂，已被用于治疗复发性Clostridioides difficile感染（rCDI）5,6&#160;、炎症性肠病（IBD）7,8以及早产仔猪的坏死性小肠结肠炎9。鉴于上述结果，在将新型噬菌体引入已有微生物群落时，必须充分考虑噬菌体与肠道微生物群之间以及噬菌体与哺乳动物宿主之间的相互作用，因为这种引入可能不仅影响其靶向细菌，还可能对整个微生物群落产生间接影响2,10。
噬菌体与其靶向细菌相互作用的研究 体外 已证明对理解肠道中噬菌体与细菌相互作用的机制及影响具有重要意义。在此背景下, 已表明 大肠杆菌-特异性的T4噬菌体，属于目 有尾噬菌体目 需要位于病毒颗粒表面高抗原性外衣壳（Hoc）蛋白中的免疫球蛋白（Ig）样结构域以黏附于肠黏液11此外，Transwell 实验表明，T4 噬菌体能够与上皮细胞培养物相互作用，并通过巨胞饮作用穿过细胞层。12,13这些结果支持了噬菌体能够与其后生动物宿主相互作用的假说，尽管它们无法感染真核细胞。这些模型虽然具有一定的应用价值，但缺乏肠道生态系统中存在的全部复杂相互作用，因而不足以全面探究噬菌体、细菌与后生动物宿主三者之间的相互关系。
小鼠模型是研究复杂环境中噬菌体的重要工具。噬菌体施用的一个理想应用是作为治疗耐药性微生物感染或与慢性炎症性疾病（包括炎症性肠病）相关的病理共生菌的替代策略。然而，新近的文献表明噬菌体行为 体外 不能完全代表 体内 功能。Buttimer 等人14&#160;证明了噬菌体混合制剂能够在简化的人类微生物组共培养物中耗尽靶向细菌 体外，但无法被重复 体内 在定植有相同细菌-噬菌体群落的无菌小鼠中。此外，在常规小鼠肠道微生物组中，T7噬菌体导致其靶向肠道细菌的选择性减少，尽管随着时间推移观察到细菌逐渐恢复，表明靶细菌已进化出抗性15其他研究已证明口服噬菌体与其靶向细菌菌株可在体内共存 体内2,16事实上，除了噬菌体与细菌的共存之外，噬菌体的施用还导致了整体微生物群落组成和功能的广泛变化2,16这一点在疾病背景下具有重要意义，因为多项研究已发现尾病毒目（Caudovirales）相对丰度的增加与炎症性肠病（IBD）之间存在关联。7,8,17&#160;与细菌丰度变化无关7目前尚不清楚这是疾病发病机制的驱动因素还是其结果。
噬菌体研究的历史重点一直集中在噬菌体与其靶向细菌之间的关系上。然而，同样重要的是要考虑噬菌体与后生动物宿主的黏膜、上皮以及免疫系统之间可能存在的相互作用。这些相互作用在宿主对肠道噬菌体感染的整体反应中均发挥着重要作用。为说明这一点，已有研究利用无菌（GF）小鼠模型来探究噬菌体对免疫系统的影响，从而排除微生物群的干扰8。在此系统中，吞噬性免疫细胞（巨噬细胞和树突状细胞）内体中的Toll样受体（TLRs）可检测到噬菌体核酸，进而激活下游信号通路，并刺激T细胞依赖性的干扰素（IFN）-γ8&#160;或I型IFN18的产生。此外，Fluckiger等19&#160;发现记忆性CD8+ T细胞能够识别噬菌体编码的（前噬菌体）抗原，导致T细胞与肿瘤抗原发生交叉反应，从而减轻肿瘤负荷。最后，在小鼠研究中已记录到噬菌体特异性抗体的产生，这些研究通过饮水持续给予动物模型噬菌体8,20，或通过连续数月重复口服灌胃的方式给予噬菌体20，表明噬菌体蛋白具有诱导体液免疫反应的能力。尽管这些噬菌体接种方式有利于免疫系统的最佳且持续的致敏，但它们可能并不能代表噬菌体与肠道环境之间自然发生的相互作用，也无法反映口服噬菌体治疗的动力学特征。迄今为止，仅有少数研究探讨了噬菌体在单菌定植小鼠模型中与单一细菌物种的相互作用21。然而，单菌定植小鼠模型已被证明对于解析单个微生物物种对胃肠道（GI）道及免疫系统发育的特异性影响至关重要22,23,24，未来该模型可能在阐明噬菌体、其靶向细菌与后生动物宿主三者之间相互作用方面继续发挥重要作用。
令人振奋的是，关于肠道噬菌体与肠道共生细菌之间的相互作用，以及后生动物宿主与其体内定植的噬菌体之间的相互作用，仍有许多未知有待探索。本实验方案提供了一套利用无菌小鼠模型研究分离的T4噬菌体及其&#160;细菌对应物E. coli（K-12，BW25113）的操作流程。这些标准化的操作步骤也为优化其他噬菌体-细菌组合提供了基础，只需根据目标组合调整相应的培养参数即可。本文所述方法包括：（1）制备用于小鼠灌胃的T4噬菌体及对照溶剂裂解液；（2）对单一定植E. coli的无菌小鼠进行T4噬菌体口服给药；（3）随时间动态监测小鼠粪便及组织中T4噬菌体的水平。
此处展示的代表性结果所用的纯化T4噬菌体裂解液，源自Rohwer实验室保藏的噬菌体库菌种。T4噬菌体的扩增采用了改良的Phage-on-Tap方法25，如本方案中所提及。该方法可在三天内获得高滴度、低内毒素的噬菌体储备液。采用此方法，可从10 mL培养物中获得≥1010&#160;噬菌体T4的斑块形成单位（pfu）/mL &#60; 0.5 内毒素单位（EU）/mL&#160;常规收集。小鼠口服或静脉注射时推荐的内毒素水平分别为 ≤ 20 EU/mL 和 ≤ 5 EU/kg/h（或对20 g小鼠在1 h内给予0.1 EU），因此该噬菌体制备方法适用于 体内 接种。所有噬菌体储备液均保存在4 °C的盐水镁（SM）噬菌体缓冲液中（配方见步骤1.1.5.1）。 E. coli 在LB培养基中培养。对于不同的噬菌体-细菌配对，可从本方案中调整多种培养基和培养条件。噬菌体也可来源于环境样本，如废水、海水、土壤和肠道内容物，并可根据Sambrook和Russell的方法进行分离和纯化。26&#160;在使用每种噬菌体-宿主组合对应的适宜生长和扩增条件进行制备之前25或者，噬菌体可从商业来源获得（参见 材料表）或从噬菌体文库中获取。

<table><tbody><tr><td>1-辛醇（99%）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>CAAAA15977-AP</td><td></td></tr><tr><td>50 ml PES Steriflip 无菌一次性真空滤器单元</td><td>Millipore Sigma&amp;nbsp;</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖（低电渗/多用途/分子生物学级）</td><td>Fisher BioReagents&amp;nbsp;</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>Amicon&amp;reg; 100 kDa Ultra-15 离心过滤装置，Ultracel-100</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC910008</td><td></td></tr><tr><td>BD Microtainer&amp;reg; SST 管</td><td>BD 医疗</td><td>365967</td><td></td></tr><tr><td>生物排阻气密笼具（ISO笼具）&amp;nbsp;</td><td>Techiplast</td><td>1245ISOCAGE</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch&amp;trade; 带有96孔快速反应模块的热循环仪</td><td>BioRad</td><td>1851196</td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙（白色晶体至粉末）</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP510-500</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管盖帽，100 个/包</td><td>安德温科学公司&amp;nbsp;</td><td>16812612</td><td></td></tr><tr><td>氯仿（乙醇作为防腐剂/符合美国化学会标准）</td><td>Fisher</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>铜包钢珠（4.5 mm）</td><td>Crosman Corporation</td><td>0767</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy 血液 &amp;amp; 组织试剂盒（50）</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）二钠盐溶液，分子生物学用，0.5 M 水溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents&amp;trade; 琼脂，粉末/薄片，Fisher BioReagents&amp;trade;&amp;nbsp;</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents&amp;trade; 微生物培养基：LB肉汤（粉末）- Lennox&amp;nbsp;</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp DNA Ladder</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>SM0241</td><td></td></tr><tr><td>Green FastMix&amp;reg; qPCR 混合液，1250 次反应</td><td>QuantaBio</td><td>95072-012</td><td></td></tr><tr><td>用于隔离笼盖的高效过滤器，可高压灭菌 H14 级过滤器，适用于 IsoLine - 经辐照处理</td><td>Techiplast</td><td>UISOHEPAXTBOX-300</td><td></td></tr><tr><td>七水硫酸镁</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 6000 恒温摇床</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>8354-30-0009</td><td></td></tr><tr><td>微生物学培养基：LB 肉汤（粉末）- Lennox</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr><tr><td>带锁定扣盖的微量离心管，2 ml</td><td>Fisher</td><td>14-666-315</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 密封膜</td><td>贝米斯</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>噬菌体储备液</td><td>卡罗来纳生物供应公司&amp;nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>PicoLab&amp;reg; 小鼠饮食20 EXT</td><td>LabDiet</td><td>5R58</td><td></td></tr><tr><td>皮尔斯&amp;trade; 显色法内毒素定量试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>A39552S</td><td></td></tr><tr><td>RNase A（17,500 U）</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>无RNase的DNase试剂盒</td><td>Qiagen&amp;nbsp;</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠（细白色粉末）</td><td>Fisher Chemical</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（结晶/美国化学会认证）</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>超声波破碎仪（探头型号 CL-18；电源型号 FB50）</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>无菌柔性薄膜隔离器&amp;nbsp;</td><td>生物洁净等级&amp;nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>SYBR&amp;trade; 安全型DNA凝胶染料</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>T100热循环仪&amp;nbsp;</td><td>伯乐（BioRad）</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>T4噬菌体引物，正向（CCACACATAGCGCGAGTATAA）</td><td>IDT</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>T4噬菌体引物，正向（GAAACTCGGTCAGGCTATCAA）</td><td>IDT</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser II&amp;nbsp;</td><td>Qiagen&amp;nbsp;</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl，1 M 溶液，pH 8.0，分子生物学级，超纯</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>AAJ22638AE</td><td></td></tr><tr><td>水（无DNASE、RNASE）</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP2484100</td><td></td></tr></tbody></table>

t4 噬菌体与小鼠肠道内e. coli的相互作用：研究宿主-噬菌体体内动态关系的典型模型

T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo

噬菌体（phages）是一类特异性感染细菌的病毒，其宿主范围可精确到物种和菌株水平，是目前已知所有生态系统中数量最丰富的生物实体。在细菌群落（如肠道微生物群）中，噬菌体参与调控微生物群的种群动态，并驱动细菌的进化过程。过去十年间，随着溶菌性噬菌体因其对特定宿主的杀伤能力而展现出对抗日益严峻的抗菌药物耐药性细菌的潜力，噬菌体研究重新受到广泛关注。此外，近期研究表明，噬菌体可黏附于肠黏膜，提示其可能在防止细菌侵入下方上皮组织方面发挥保护作用。尤为重要的是，类似于细菌微生物组，噬菌体组的失衡也已被证实与炎症性肠病等疾病的恶化预后相关。先前的研究已证明，通过粪便滤液移植，噬菌体能够调节动物和人类的微生物组，从而有益于宿主健康。随着这一轮研究热潮的到来，建立并标准化在肠道微生物组背景下研究噬菌体的实验方案变得尤为必要。. 本方案提供了一套用于研究分离的T4噬菌体及其细菌宿主的实验步骤， 大肠杆菌,&#160;在小鼠胃肠道的背景下。本文所述方法概述了&#160;如何从噬菌体裂解液开始，将其施用于小鼠，并评估其对细菌宿主和噬菌体水平的影响。&#160;该方案可经修改后应用于其他噬菌体-细菌组合，为研究宿主-噬菌体相互作用动态提供了起点 体内

为研究T4噬菌体与E. coli在小鼠肠道内的相互作用，制备、清洗并纯化了T4噬菌体及对照溶剂裂解液（图1A）。通过噬斑实验测定T4噬菌体裂解液的滴度，并用SM缓冲液稀释至2 × 107 pfu/mL（每只小鼠2 × 106 pfu）。同时对对照溶剂裂解液进行滴度测定以确认无活性噬菌体存在，并用与T4噬菌体裂解液相同体积的SM缓冲液稀释。使用显色法内毒素定量试剂盒测定稀释后裂解液中的内毒素水平。T4噬菌体、热灭活噬菌体及对照溶剂裂解液的内毒素水平均低于饮用水可接受限值（&#60;20 EU/mL）25&#160;（图1B）。由于对照溶剂裂解液的内毒素含量与T4噬菌体裂解液相近，因此被认为适合作为对照。热灭活噬菌体裂解液（热处理前为2 × 107&#160; pfu/mL）的内毒素水平低于对照溶剂和T4噬菌体裂解液。根据试剂盒说明书，对经1-辛醇处理的样品，通过向对照溶剂裂解液中添加内毒素标准品（加标对照溶剂）以检测是否存在检测抑制，终浓度为0.5 EU/mL。加标对照溶剂测得的内毒素水平减去原始对照溶剂的内毒素水平为0.5 EU/mL ±25%，符合制造商建议（图1B）。这表明1-辛醇已成功去除，且裂解液未引起检测抑制，不会干扰检测结果。
在无菌柔性薄膜乙烯基隔离器内，将单一定植 E. coli K-12 (BW25113) 的 C57BL/6 小鼠于已知菌群条件下进行繁育（图 2A）。F0 代小鼠通过将其接种至环境中并进行共饲养的方式实现 E. coli 定植。实验仅使用从出生起即通过垂直传播和共饲养获得 E. coli 定植的后代（F1 和 F2 代）。该策略可排除因细菌接种所引起的免疫系统、黏液分泌及胃肠道发育变化的干扰，从而能够特异性地检测仅由噬菌体引入所导致的变化22,37。小鼠成熟后转移至无菌独立笼具中，并在 6–8 周龄时通过口服灌胃给予每只 2 × 106 pfu 的 T4 噬菌体或等体积的溶剂裂解物。通过采集粪便颗粒并在 0.5%（软）琼脂或 1.5% 琼脂上进行点样培养，分别在四周内监测 T4 噬菌体和 E. coli 的丰度。在此实验过程中，T4 噬菌体与 E. coli 可共存，且任一种群数量均未出现耗竭（图 2B、C）。以较低剂量（每只小鼠 2 × 102 和 2 × 104 pfu）口服给予 T4 噬菌体时，其在肠道中定植的能力与 2 × 106 pfu 剂量相比未见降低（图 2D）。同样，T4 噬菌体接种对 E. coli 水平的影响未表现出剂量依赖性效应（图 2E）。
重要的是，样品间接种的一致性被发现对噬菌斑计数至关重要。例如，在将细菌加入软琼脂时，细菌的密度被确定为显著影响实验结果。添加 E. coli 培养1小时、1.5小时或2小时后继代的样本，其空斑计数低于添加 E. coli 继代培养2.8小时或更长时间后，噬斑定量结果稳定在约1 x 109 pfu/mL&#160;当 E. coli 继代培养2.8小时至16小时（过夜），相较于1小时继代培养计算所得值增加了约5倍（~2 x 108 pfu/ml) (图3A）。而不是&#160;传代培养时，可将过夜培养物中的目标细菌接种至软琼脂中。此处，16 h（过夜）培养物的体积 E. coli 接种至软琼脂中的培养物影响了噬菌斑计数图3B。这些结果表明，密度 E. coli 琼脂内的物质可能产生影响&#160;噬菌体斑块测定计数。在这两种方法中，噬菌体定量结果均达到相同的平台值（109 pfu/ml），这表明软琼脂中的目标细菌必须达到足够高的密度，才能确保噬菌斑计数的准确性。
综上所述，这些结果凸显了通过研究噬菌体-细菌动力学来深入理解其相互作用的重要性 体外 和 体内 在进行实验操作之前开展预实验。
<img alt="图 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65906/65906fig01v2.jpg" /> 
图 1：噬菌体裂解液的制备。 （A）从高滴度噬菌体储备液开始制备噬菌体裂解液的工作流程。裂解液经过扩增、纯化、浓缩，并去除内毒素。通过真空离心去除残留的1-辛醇。 （B）使用显色法内毒素定量试剂盒对噬菌体裂解液及对照溶剂裂解液中的内毒素进行定量。虚线蓝线表示产物抑制对照中排除产物抑制效应的上下限（0.5 EU/mL ± 25%）。每个数据点代表两个技术重复中的一次。柱高表示重复样本的平均值。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65906/65906fig01largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65906/65906fig02v2.jpg" /> 
图2：单菌定植小鼠的制备及粪便颗粒中噬菌体与细菌水平的监测。 （A）将无菌小鼠定植单一细菌物种并建立F1和F2代单菌定植小鼠的工作流程。（B-E）对出生时即单菌定植大肠杆菌（E. coli）并在6-8周龄时接种T4噬菌体的C57BL/6小鼠，检测其粪便颗粒中T4噬菌体和E. coli的水平。在定植前第0天及定植后指定时间点，采用单层琼脂法通过点种平板和噬斑实验测定T4噬菌体水平；通过点种于1.5% LB琼脂平板测定E. coli水平。（B, C）接种2 × 106&#160;pfu T4噬菌体或对照溶剂裂解物（按体积和内毒素水平标准化）后，回收粪便颗粒中（B）T4噬菌体和（C）E. coli水平的动力学变化。（D,&#160;E）接种2 × 102 pfu、2 × 104 pfu或2 × 106 pfu T4噬菌体后，回收粪便颗粒中（D）T4噬菌体和（E）E. coli的水平。误差条表示均值及标准误（SEM）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65906/65906fig02largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65906/65906fig03v2.jpg" /> 
图3：噬斑实验中准确性的故障排查。 （A）使用 E. coli 过夜培养物或传代培养物制备软琼脂（0.5% 琼脂，LB）测定 T4 噬菌体裂解液滴度。传代培养通过将过夜 E. coli 培养物以 1:50 比例稀释至新鲜 LB 培养基中获得。在 5 mL 软琼脂中接种 100 µL E. coli 和 20 µL T4 噬菌体。本实验未向软琼脂中添加 CaCl2&#160;和 MgSO4，但可根据需要添加。当 E. coli 传代培养时间少于 2.8 小时时，测得的噬菌体滴度偏低。（B）使用不同 E. coli 密度制备软琼脂对 T4 噬菌体裂解液滴度的影响。将过夜培养（未经传代，如图 A 所示）的 E. coli 以不同体积加入软琼脂，导致测得的噬菌体滴度出现差异。误差棒表示计算得到的噬菌体滴度不确定性。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65906/65906fig03largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>

噬菌体（phages）是一类感染细菌的病毒，是肠道微生物组的重要组成部分。尽管这些共生微生物影响着细菌的适应性和种群动态，但其对肠道稳态及疾病的影响机制仍知之甚少。本实验方案采用小鼠模型研究分离的T4噬菌体，该方法可适用于其他噬菌体-细菌组合的研究。

T4 噬菌体与小鼠肠道内E. coli的相互作用：研究宿主-噬菌体体内动态关系的典型模型

噬菌体（phages）是一类特异性感染细菌的病毒，其宿主范围可精确到物种和菌株水平，是地球上数量最多的生物实体，广泛分布于……

本研究旨在了解噬菌体、细菌与哺乳动物免疫系统在肠道环境，特别是无菌小鼠肠道内的三者相互作用。我们希望通过研究健康与疾病状态下的这些相互作用，深入理解肠道微生物组的重要性。近期研究进展发现，哺乳动物免疫系统能够识别噬菌体。有研究表明，人类肠道噬菌体组在炎症性肠病等疾病状态下可能出现失调，而噬菌体引发的免疫刺激可能加剧疾病的表型。我们的目标是为他人提供一种标准化的实验方案，用于制备T4噬菌体裂解液，以便在无菌小鼠模型中进行接种和定量。这些方案可作为基础，并可根据需要修改后用于其他噬菌体-细菌组合的研究。首先，在无菌的聚苯乙烯或玻璃培养管中，将大肠杆菌（Escherichia coli）接种于5毫升LB（Luria-Bertani）培养基中进行培养。将试管在37摄氏度、200转/分钟振荡条件下过夜培养。将过夜培养的菌液按1:50的比例接种于100毫升LB培养基中，在锥形瓶中进行传代培养。在37摄氏度、200转/分钟条件下继续培养约1.5小时。接下来，向大肠杆菌培养物中加入100微升高滴度T4噬菌体储备液，在37摄氏度下振荡培养3小时。待T4噬菌体裂解液变澄清后，将其收集至50毫升锥形管中。将裂解液在4,000 G离心20分钟，以沉淀残留的细菌和细胞碎片。使用0.22微米尼龙滤器对所得上清液进行过滤除菌，并将滤液收集至新的50毫升离心管中。向过滤后的T4噬菌体裂解液中加入0.1倍体积的氯仿，以杀灭残留的细菌并防止细菌生长。短暂涡旋混匀，然后将裂解液在室温下孵育10分钟。将裂解液在 4,000 G 离心 5 分钟，以分离氯仿与裂解液。使用血清移液管，小心地将上层裂解液转移至新的 50 毫升离心管中。向 100 千道尔顿离心过滤装置的上层储液室中加入 13 毫升噬菌体裂解液。在 4,000 G 条件下离心 5 分钟，或直至大部分裂解液通过滤膜。使用 P200 或 P1000 移液器，轻轻吹打上层储液室中剩余的 2 毫升裂解液，以疏通滤膜。将下层储液室中的滤液弃入废液容器中。重复浓缩操作，保留约2毫升浓缩噬菌体于上层储液室中。最后一次离心后，用移液器轻轻吹打上层储液室中剩余的裂解液。为洗涤噬菌体裂解液，向上层储液室中加入12毫升氯化钠-镁溶液（SM缓冲液），并在4,000 ×g下离心10分钟。第二次洗涤后，将剩余的2毫升裂解液用SM缓冲液重悬，最终体积为10毫升。将裂解液转移至50毫升离心管中，并于4摄氏度保存。为去除污染的内毒素，向裂解液总体积中加入0.4倍体积的1-辛醇。用封口膜密封管盖，在120 RPM条件下振荡1小时，随后在4摄氏度下静置孵育1.5小时。离心以分离内毒素清除后的裂解液与1-辛醇。使用P1000移液器小心尽可能移除全部1-辛醇，并将其弃入适当的废液容器中。使用18号针头和10毫升注射器，收集位于剩余1-辛醇层下方的噬菌体裂解液。将T4噬菌体裂解液1毫升等分转移至无菌的1.5毫升微量离心管中。将管盖打开，以4,000 G的转速离心浓缩，使裂解液中残留的1-辛醇挥发。将噬菌体裂解液进行10倍系列稀释。然后取每个稀释度的5 µL点样于LB琼脂平板上，于37°C过夜培养。次日计数噬菌斑，以计算噬菌斑形成单位（plaque forming units，PFU）。用SM缓冲液将所得裂解液稀释至所需浓度，并重新测定滴度以确认。将浓缩的裂解液于4摄氏度保存，直至使用。首先，收集接种了T4噬菌体的单菌群化小鼠的粪便颗粒，放入无菌的预先称重的微量离心管中。记录离心管的最终重量，并通过减去离心管初始重量来计算样品重量。向离心管中加入1毫升无菌SM缓冲液，涡旋振荡至最大速度以充分混匀粪便颗粒。记录每个样品中加入的SM缓冲液体积，用于后续每克样品中菌落形成单位（CFU）或噬斑形成单位（PFU）的计算。将每个样本取20微升，在180微升SM缓冲液中进行八倍系列稀释。取每种稀释液5微升点样于含有大肠杆菌的LB琼脂平板或仅含LB琼脂的平板上，以测定T4噬菌体和大肠杆菌的浓度。待每点完全干燥后，将平板倒置并在37摄氏度下过夜培养。第二天，选择每个点有 3–30 个可计数噬斑的稀释度。计数并记录噬斑数量及所用稀释倍数。将噬斑数除以每个点接种的体积，得到每微升的噬斑形成单位（PFU）。将此数值乘以稀释倍数以及添加到每个样品中的 SM 缓冲液体积，得到每份样品的 PFU。最后，除以样品重量，得到每克样品的 PFU。在注射了 2 × 10⁶ PFU 的 T4 噬菌体或载体裂解物的小鼠中检测到的 T4 噬菌体和大肠杆菌（E.coli）水平表明，在四周内 T4 噬菌体与大肠杆菌共存，且任一群体均未出现减少。与 2 × 10⁶ PFU 相比，较低剂量的 T4 噬菌体对定植无显著影响，且未观察到大肠杆菌水平的剂量依赖性效应。

t4-bacteriophage-e-coli-interaction-murine-intestine-prototypical

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

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