Name: 离体胎盘外植体流动培养 - 模拟子宫内的动态条件 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-08T14:05:00.000+00:00
Duration: 4 min 17 s
Description: 学习离体胎盘外植体流动培养技术，用于研究生殖健康与先兆子痫病因。该方法通过模拟子宫内动态剪切力环境，利用免疫组织化学染色评估组织完整性，为理解胎盘功能提供重要实验手段。

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作者衷心感谢Bettina Amtmann和Petra Winkler在组织取样方面提供的出色技术支持。本研究由奥地利科学基金FWF（DOC 31-B26）以及奥地利格拉茨医科大学通过“妊娠期炎症性疾病博士培养项目”（DP-iDP）资助。

格拉茨医科大学伦理委员会批准了本研究（31-019 ex 18/19 版本 1.2 和 29-319 ex 16/17）。所有参与研究的受试者均签署了知情同意书。
1. 流动实验的准备工作
注意：实验在带有集成蠕动泵的生物反应器中进行（参见材料表）。生物反应器内的湿度、温度和气体水平可进行调节。
<ol>
	<li>根据生物反应器的操作手册启动生物反应器，并完成所有预先准备（例如泵的校准、预加热、气体条件和湿度设置）。在开始实验前，应将所需的设置参数（温度、气体含量、湿度）稳定数小时或过夜。为此，请启动生物反应器及配套软件，然后在菜单项&#34;Incubator&#34;下点击Change SetPoints。</li>
	<li>将PBS和所需培养基（内皮细胞生长培养基，添加提供的补充剂hEGF-5、HC-500，以及5%无外泌体胎牛血清和1%青霉素/链霉素）（见材料表）预热至37 °C。 
	&#8203;</li>
</ol>
2. 胎盘样本解剖
<ol>
	<li>分娩后立即按照 Kupper 等人3所述方法，从胎盘中区切取三个 2 cm3 的胎盘组织样本。简而言之，将样本保存在 PBS 中。弃去标本中的绒毛膜板、母体蜕膜以及可见梗死区域。</li>
	<li>将剩余的组织标本解剖成横截面直径约 0.5 cm 的绒毛外植体（湿重约 7.5 mg），并转移至含新鲜 PBS 的培养皿中。</li>
	<li>用镊子在液体中轻轻振荡外植体，以 PBS 清洗，去除血渍残留。 
	&#8203;注意：在含 PBS 的培养皿中进行样本解剖，以实现预清洗并防止组织干燥；处理组织时应使用已灭菌/高压灭菌的器械。</li>
</ol>
3. 流动实验
<ol>
	<li>在无菌操作台内，根据流室的使用说明书，使用鲁尔接头将五个腔室与储液瓶串联连接（参见 材料表). 
	注意：所有材料在使用前应根据相应说明书进行灭菌和/或高压灭菌。储液瓶上需使用空气过滤器以实现无菌气体交换。开启和关闭腔室时，应轻轻挤压腔室的凸耳部分。步骤 3.1 也可提前准备。</li>
	<li>将培养室倒置，并通过移除底部将其打开。使用镊子将金属板转移至培养室上部中央位置，确保针脚朝上。</li>
	<li>用预热的培养基（37 °C）向各腔室中加入1 mL，然后在储液器中额外加入20 mL。整个回路总共需要25 mL培养基，包括每个流室、管路和储液瓶中的体积。在流动条件下，充满培养基的腔室内最终体积为2 mL。</li>
	<li>使用镊子将绒毛外植体逐个转移&#160;将金属板上的针插入腔室内的绒毛膜绒毛之间，使针在绒毛间滑动，以避免刺穿组织。将四个外植体转移至一个腔室内。仔细重新安装底部以封闭腔室。一个完整的回路共包含20个外植体。腔室需保持倒置状态。 
	注意：用镊子轻轻夹取外植体，避免挤压。确保小室和回路完全密封，防止泄漏。小室始终倒置使用。每个小室中外植体的数量以及小室本身的数量均可变动。孕早期组织的操作步骤与孕晚期组织相似，仅增加一个小步骤：为固定绒毛，在将组织转移至金属板后，将针头在外植体上方略微弯曲（Brugger 等人，个人通讯）。此操作可固定脆弱的组织，防止样本从金属板上滑脱。</li>
	<li>将流路组件转移至生物反应器中。</li>
	<li>将蠕动泵管连接至生物反应器内蠕动泵的流路系统，并将其固定在4th 阶段（会听到咔嗒声四次）。</li>
	<li>如果需要静态对照，则还需将培养板放入生物反应器中。 
	注意：对于静态培养，将六孔板中的五个孔每孔加入 4 mL 培养基和 4 个绒毛外植体。将加好培养基的孔板同样置于生物反应器中，与灌注培养外植体在相同气氛条件下进行培养。更多细节参见 Kupper 等人的研究。3</li>
	<li>将泵模式设置为 手动 在菜单项下 &#34;泵&#34;然后将泵速设置为 1 mL/min，并通过点击开始将培养基泵入管路中 运行在向回路中加入培养基时，将培养室倾斜放置，以确保其完全充满培养基。 
	注意：参见 补充表1 用于胎盘绒毛血流和静态培养的实验设置。流动和静态系统的具体参数如下所示。 补充表 2. 
	注意：填充时应小心倾斜腔室，以防止样品从针头上滑落。</li>
	<li>填充完成后，&#160;培养室保持倒置状态。确保培养室稳固竖直放置，并关闭生物反应器的两个盖子。 
	注意：充满培养基的流室最终体积为 2 mL。实验所用流室和培养板的实验条件及规格详见 Kupper 等人的研究。3</li>
	<li>将组织置于所需时间进行孵育。 
	注意：无需再次打开生物反应器的盖子，即可在计算机上监测温度、气体水平和流速。</li>
	<li>在组织孵育所需时间后，通过点击停止泵 中止 在菜单项下 &#34;泵&#34;打开生物反应器的两个盖子，然后依次打开一个流室。使用镊子小心地从金属板上取出外植体。</li>
	<li>根据所选的下游分析方法处理组织和上清液。本实验中进行了免疫组织化学染色和电子显微镜检查3。参见 补充表3 有关免疫组织化学和免疫荧光所用抗体的详细信息。 
	注意：取出组织后，通过逆时针旋转泵来排空回路中的培养基。</li>
	<li>根据流动室和管路的制造商说明，拆卸并清洗流路系统。</li>
</ol>

Improving Ex Vivo Placental Explant Culture Using a Flow-Based Approach

<ol><li>Villee, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metabolism+of+human+placenta+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The metabolism of human placenta in vitro.</a> Journal of Biological Chemistry. 205 (1), 113-123 (1953).</li>
<li>Miller, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+placental+explants+in+culture%3A+Approaches+and+assessments%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Human placental explants in culture: Approaches and assessments.</a> Placenta. 26 (6), 439-448 (2005).</li>
<li>Kupper, N., Pritz, E., Siwetz, M., Guettler, J., Huppertz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+villous+explant+culture+2.0%3A+flow+culture+allows+studies+closer+to+the+in+vivo+situation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Placental villous explant culture 2.0: flow culture allows studies closer to the in vivo situation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7464(2021).</li>
<li>Reti, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+high+oxygen+on+placental+function+in+short-term+explant+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of high oxygen on placental function in short-term explant cultures.</a> Cell and Tissue Research. 328 (3), 607-616 (2007).</li>
<li>Simán, C. M., Sibley, C. P., Jones, C. J. P., Turner, M. A., Greenwood, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+regeneration+of+syncytiotrophoblast+in+cultured+explants+of+term+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Regulatory%2C+Integrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">The functional regeneration of syncytiotrophoblast in cultured explants of term placenta.</a> American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 280 (4), R1116-R1122 (2001).</li>
<li>Toro, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+is+an+anti-apoptotic+effector+in+placental+cells+involving+p53+downregulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Leptin is an anti-apoptotic effector in placental cells involving p53 downregulation.</a> PLoS ONE. 9 (6), e99187(2014).</li>
<li>Morley, L. C., Debant, M., Walker, J. J., Beech, D. J., Simpson, N. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+blood+flow+sensing+and+regulation+in+fetal+growth+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Placental blood flow sensing and regulation in fetal growth restriction.</a> Placenta. 113, 23-28 (2021).</li>
<li>Wang, Y. Z. S., Wang, Y., Zhao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+blood+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular+biology+of+the+placenta%22%5BJournal%5D)">Placental blood circulation.</a> Vascular biology of the placenta. Chapter 2, (2010).</li>
<li>Huppertz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anatomy+of+the+normal+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">The anatomy of the normal placenta.</a> Journal of Clinical Pathology. 61 (12), 1296-1302 (2008).</li>
<li>Weiss, G., Sundl, M., Glasner, A., Huppertz, B., Moser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trophoblast+plug+during+early+pregnancy%3A+a+deeper+insight%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The trophoblast plug during early pregnancy: a deeper insight.</a> Histochemistry and Cell Biology. 146 (6), 749-756 (2016).</li>
<li>Burton, G. J., Woods, A. W., Jauniaux, E., Kingdom, J. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheological+and+physiological+consequences+of+conversion+of+the+maternal+spiral+arteries+for+uteroplacental+blood+flow+during+human+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Rheological and physiological consequences of conversion of the maternal spiral arteries for uteroplacental blood flow during human pregnancy.</a> Placenta. 30 (6), 473-482 (2009).</li>
<li>Gude, N. M., Roberts, C. T., Kalionis, B., King, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+function+of+the+normal+human+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Growth and function of the normal human placenta.</a> Thrombosis Research. 114 (5-6), 397-407 (2004).</li>
<li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+biology+of+the+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Colloquium+Series+on+Integrated+Systems+Physiology%3A+From+Molecule+to+Function%22%5BJournal%5D)">Vascular biology of the placenta.</a> Colloquium Series on Integrated Systems Physiology: From Molecule to Function. 2 (1), 1-98 (2010).</li>
<li>Moser, G., Windsperger, K., Pollheimer, J., de Sousa Lopes, S. C., Huppertz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+trophoblast+invasion%3A+new+and+unexpected+routes+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Human trophoblast invasion: new and unexpected routes and functions.</a> Histochemistry and Cell Biology. 150 (4), 361-370 (2018).</li>
<li>Kupper, N., Huppertz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endogenous+exposome+of+the+pregnant+mother%3A+Placental+extracellular+vesicles+and+their+effect+on+the+maternal+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The endogenous exposome of the pregnant mother: Placental extracellular vesicles and their effect on the maternal system.</a> Molecular Aspects of Medicine. 87 (October 2020), 100955(2022).</li>
<li>Huppertz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFPA+award+in+placentology+lecture%3A+biology+of+the+placental+syncytiotrophoblast+-+myths+and+facts%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">IFPA award in placentology lecture: biology of the placental syncytiotrophoblast - myths and facts.</a> Placenta. 31 (SUPPL), S75-S81 (2010).</li>
<li>Gauster, M., Moser, G., Wernitznig, S., Kupper, N., Huppertz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+human+trophoblast+development%3A+from+morphology+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Early human trophoblast development: from morphology to function.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (6), 345(2022).</li>
<li>Lecarpentier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+shear+stress+promotes+placental+growth+factor+upregulation+in+human+syncytiotrophoblast+through+the+cAMP-pKA+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Fluid shear stress promotes placental growth factor upregulation in human syncytiotrophoblast through the cAMP-pKA signaling pathway.</a> Hypertension. 68 (6), 1438-1446 (2016).</li>
<li>Lecarpentier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+fluid+dynamic+simulations+of+maternal+circulation%3A+wall+shear+stress+in+the+human+placenta+and+its+biological+implications%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Computational fluid dynamic simulations of maternal circulation: wall shear stress in the human placenta and its biological implications.</a> PLOS ONE. 11 (1), e0147262(2016).</li>
<li>Miura, S., Sato, K., Kato-Negishi, M., Teshima, T., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+shear+triggers+microvilli+formation+via+mechanosensitive+activation+of+TRPV6%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Fluid shear triggers microvilli formation via mechanosensitive activation of TRPV6.</a> Nature Communications. 6 (1), 8871(2015).</li>
<li>Jauniaux, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onset+of+maternal+arterial+blood+flow+and+placental+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Onset of maternal arterial blood flow and placental oxidative stress.</a> The American Journal of Pathology. 157 (6), 2111-2122 (2000).</li>
<li>Sodha, R. J., Proegler, M., Schneider, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+and+metabolism+of+norepinephrine+studied+from+maternal-to-fetal+and+fetal-to-maternal+sides+in+the+in+vitro+perfused+human+placental+lobe%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Obstetrics+and+Gynecology%22%5BJournal%5D)">Transfer and metabolism of norepinephrine studied from maternal-to-fetal and fetal-to-maternal sides in the in vitro perfused human placental lobe.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 148 (4), 474-481 (1984).</li>
<li>Kupper, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Extracellular+vesicles+from+advanced+placental+explant+flow+culture+and+their+role+in+preeclampsia+%5B%5D%22">Extracellular vesicles from advanced placental explant flow culture and their role in preeclampsia [Dissertation]</a>. , Medical University of Graz, Austria. (2022).</li>
<li>Burton, G. J., Fowden, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+placenta%3A+a+multifaceted%2C+transient+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The placenta: a multifaceted, transient organ.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370 (1663), 20140066(2015).</li>
<li>Arora, N., Sadovsky, Y., Dermody, T. S., Coyne, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+vertical+transmission+during+human+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Microbial vertical transmission during human pregnancy.</a> Cell Host & Microbe. 21 (5), 561-567 (2017).</li>
<li>Cheong, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Positive+feedback+loop+between+glial+cells+missing+1+and+human+chorionic+gonadotropin+%28hCG%29+regulates+placental+hCG%CE%B2+expression+and+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">A Positive feedback loop between glial cells missing 1 and human chorionic gonadotropin (hCG) regulates placental hCGβ expression and cell differentiation.</a> Molecular and Cellular Biology. 36 (1), 197-209 (2016).</li>
<li>Heisenberg, C. P., Bellaïche, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forces+in+tissue+morphogenesis+and+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Forces in tissue morphogenesis and patterning.</a> Cell. 153 (5), 948-962 (2013).</li>
<li>Lee, T. C., Moulvi, A., James, J. L., Clark, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-scale+modelling+of+shear+stress+on+the+syncytiotrophoblast%3A+could+maternal+blood+flow+impact+placental+function+across+gestation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Multi-scale modelling of shear stress on the syncytiotrophoblast: could maternal blood flow impact placental function across gestation.</a> Annals of Biomedical Engineering. 51 (6), 1256-1269 (2023).</li>
<li>Kamkin, A., Kiseleva, I. Mechanosensitivity in Cells and Tissues. Mechanosensitivity in Cells and Tissues. 49 (0), Academia. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21290773 (2005).</li>
<li>Kluge, M. A., Fetterman, J. L., Vita, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+endothelial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and endothelial function.</a> Circulation Research. 112 (8), 1171-1188 (2013).</li>
<li>Boren, J., Brindle, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis-induced+mitochondrial+dysfunction+causes+cytoplasmic+lipid+droplet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Apoptosis-induced mitochondrial dysfunction causes cytoplasmic lipid droplet formation.</a> Cell Death & Differentiation. 19 (9), 1561-1570 (2012).</li>
<li>Chernyavsky, I. L., Jensen, O. E., Leach, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mathematical+model+of+intervillous+blood+flow+in+the+human+placentone%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">A Mathematical model of intervillous blood flow in the human placentone.</a> Placenta. 31 (1), 44-52 (2010).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本研究介绍了一种独特的胎盘外植体灌注培养技术，旨在模拟动态环境 在子宫内 环境3,23研究结果表明，与传统的静态培养方法相比，在流动条件下培养的组织其形态得到了更好的保存。3值得注意的是，尽管静态和流动培养条件均无法实现胎盘血管的灌注，但胎儿-胎盘组织的破坏&#160;绒毛间质内的血管在静态培养中占主导地位，而在灌注培养中，血管的完整性在较长时间内似乎维持得更好3.
这一观察结果的一种可能解释可能与合体滋养层的关键保护和内分泌功能有关，该功能在文献中已有充分记载12,24,25,26。鉴于此，绒毛外层的整体完整性很可能对维持其下方的间质组织（包括血管）起着重要作用。因此，在流动条件下血管细胞完整性的维持可能归因于培养基的持续流动。这种流动有助于外植体的被动运动，促进气体、营养物质和纳米颗粒（如细胞外囊泡）通过胎盘屏障的交换。这反过来可能对血管形态的保持产生积极影响。此外，机械感知现象在多种组织的组织形态发生中均发挥作用27,28。研究表明，机械敏感性在多个层面影响细胞过程，触发一系列生化反应，最终影响组织和器官的功能29。值得注意的是，合体滋养层在整个妊娠期间均表达机械敏感蛋白28。此外，该研究提示组织表面的微绒毛可能也参与了这一过程28。
另一个值得考虑的视角是线粒体在细胞对流体剪切力响应中的潜在作用。例如，在内皮细胞中，线粒体可作为细胞响应环境刺激的信号转导器。30通过透射电子显微镜在静态培养组织中观察到脂滴积累增加3，已发现与线粒体功能障碍引起的细胞凋亡诱导有关31需要进一步研究以揭示其潜在机制和关键因素，并将其与下游信号通路联系起来。这一探索有助于加深我们对组织如何感知和响应剪切应力的理解，从而提高绒毛外植体在培养中的存活率和完整性23.
若干关键实验步骤必须反复强调并谨慎执行。胎盘娩出后，应尽快将组织进行培养。在制备外植体时，必须避开可见梗死区域。使用镊子轻柔操作外植体，避免挤压。建议在整个操作过程中始终保持组织被液体覆盖，并迅速完成操作。
需要指出的是，本研究无法确定所展示流动系统中的确切剪切应力，这一点应在未来的调查中被视为一项局限性。3,23然而，必须认识到，对于特定的胎盘绒毛，精确的血流速度和剪切应力 体内 受到多种参数的影响，例如绒毛间隙的几何特征、绒毛在该间隙内的位置，以及其与母体螺旋动脉和子宫静脉的邻近程度和角度3,19,23,32胎盘几何结构的复杂性因个体而异，也必须予以考虑。23,32. 胎盘绒毛间隙内血流的数学模型估算32 以及对合体滋养层壁面剪切应力的计算19,28已存在。有趣的是，一项研究预测，与妊娠早期相比，妊娠晚期合体滋养层所受的剪切应力较低28，而另一项研究则揭示了合体滋养层上空间异质性的壁面剪切应力19确定特定胎盘绒毛的精确流速和剪切应力仍是一个挑战3,19,23,32此类计算可为未来研究提供剪切应力范围的近似值，但可能需要持续的解剖学调整与优化23此外，未来的研究可能会开发出新的、更精细的灌注培养技术，以考虑绒毛间隙复杂的几何结构，并制定策略以增加每次实验的样本数量3预计该流动系统将持续改进和发展，未来可能采用其他类型的流动室（Brugger 等，未发表数据，2023）。
总之，本研究通过展示一种易于实施的方法，奠定了坚实的基础 离体 一种能够维持培养绒毛外植体结构完整性的灌流培养技术。该技术强调了动态培养方法在胎盘功能生物学研究中的重要性，为灌流培养系统的进一步发展以及新思路和新假说的提出奠定了基础3,23.

自20世纪60年代以来，胎盘外植体在孔板底部的培养已被用于研究母胎界面1,2,3。该方法成熟且简便，除单细胞培养外，还可利用人体组织开展多种研究2,3。随着时间推移，胎盘外植体培养的实验设计已在氧浓度4以及防止组织沉降至孔板底部等方面进行了改进2,5,6。然而，该方法尚未模拟子宫内in vivo的实际条件，特别是缺乏持续流动的环境3。
妊娠的成功取决于母体血液对绒毛间隙充分且持续的灌注，从而形成一个具有连续血液及血液携带物质流入和流出的动态循环7,8,9,10,11,12。胎盘具有&#160;两套独立的血液供应系统，分别供应母体血液和胎儿血液，由此实现母体和胎儿系统的双重灌注13。母体血液在妊娠第一孕期末开始灌注胎盘的绒毛间隙，缓慢地经由扩张的子宫螺旋动脉10,11,14流动&#160;。因此，胎盘绒毛树浸泡在母体血液中，向胎儿输送营养物质和氧气。这些母体血液流经绒毛间隙后，通过子宫胎盘静脉回流至母体循环。在流经绒毛间隙的过程中，氧气和营养物质通过扩散和主动摄取进入胎儿血液，导致母体血液中的氧气和营养物质水平降低12,15。然而，绒毛间隙中的血液每分钟大约被新鲜的富氧血液完全替换两到三次，从而确保营养物质和气体的持续供应13。值得注意的是，合体滋养层作为胎盘屏障的最外层，是胎盘绒毛树中唯一直接暴露于母体血液的组成部分15,16,17。因此，合体滋养层持续受到流动母体血液产生的轻微剪切应力作用3,14。
当前科学知识结合现代技术进步，使得在流动条件下对胎盘外植体进行适应性且接近生理状态的培养成为可能。此外，有证据表明，剪切力会影响合体滋养层细胞的生物学功能18,19,20,21一种考虑血流因素的著名方法是胎盘双叶灌注系统22然而，这些实验需要较高的专业技术，且受时间限制（仅可在数小时内进行），仅适用于孕晚期胎盘样本3,23相比之下，我们开发了一种简单且非侵入性的技术，用于 离体&#160;胎盘绒毛&#160;恒定流条件下的外植体培养&#160;设置，可容纳孕早期和孕晚期的胎盘组织3在此装置中，胎盘外植体被培养于五个串联的流动腔室中。绒毛外植体通过薄金属板上的针状突起固定在腔室底部。构建的流动回路随后被转移至生物反应器中，在其中对氧浓度和流速进行调控。3流动培养结果表明，与通常使用的静态方法相比，组织完整性得以更好地保存3此外，这种动态方法能够为组织外植体培养实现新颖且可调节的实验设计，从而允许 体外 更接近模拟自然环境的实验3.

<table><tbody><tr><td>6孔板</td><td>NUNC, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 山羊抗小鼠抗体</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>A21422</td><td>用PBS稀释，1:200</td></tr><tr><td>抗体稀释液</td><td>Dako, Santa Clara, CA, USA</td><td>S3022</td><td></td></tr><tr><td>抗-&amp;beta;-肌动蛋白抗体（AC-15）</td><td>Abcam, Cambridge, UK</td><td>ab6276</td><td>储存浓度：2.1 mg/mL，用抗体稀释液稀释至1:10,000</td></tr><tr><td>生物反应器TEB500</td><td>TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain</td><td></td><td>序列号：TEB505 / 1000EW/ 117</td></tr><tr><td>CD34 Class II（QBEnd-10）</td><td>Dako, Santa Clara, CA, USA</td><td>M7165</td><td>储存浓度：12 mg/L，用抗体稀释液稀释至1:500</td></tr><tr><td>CPD 030 临界点干燥仪</td><td>Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein)</td><td></td><td>临界点干燥仪</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>D21490</td><td>用PBS稀释，1:1000</td></tr><tr><td>Ebers TEB505系列软件</td><td>TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain</td><td></td><td>&amp;nbsp;系列软件1.4</td></tr><tr><td>内皮细胞生长培养基MV</td><td>PromoCell PC-C-22120, Heidelberg, Germany;&amp;nbsp;</td><td>C-22120</td><td>不添加EGCS/h和FCS使用，也可使用任何其他适用于该组织的培养基</td></tr><tr><td>Excelsior AS 组织处理仪&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>去外泌体胎牛血清</td><td>Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>A2720803</td><td></td></tr><tr><td>Histolab Clear透明剂</td><td>Histolab, Askim, Sweden</td><td>14250-TY</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢阻断剂</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>TA125H202Q</td><td></td></tr><tr><td>Kaiser&amp;rsquo;s甘油明胶</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>1092420100</td><td></td></tr><tr><td>Leica DM 6000 B显微镜</td><td>Leica, Wetzlar, Germany</td><td></td><td>配备Olympus DP 72相机</td></tr><tr><td>Leica UC7超薄切片机</td><td>Leica Microsystems, Vienna, Austria)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>带针金属板</td><td>自行构建</td><td></td><td></td></tr><tr><td>切片机&amp;nbsp;</td><td>Microtome Microm HM 355 S, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微波炉</td><td>Miele, Guetersloh, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus显微镜&amp;nbsp;（BX63）</td><td>Olympus, Hamburg, Germany</td><td></td><td>序列号：1A52421</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>10010015</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素&amp;nbsp;</td><td>Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>2585627</td><td></td></tr><tr><td>一抗增强剂</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>TL-125-PB</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>泵管</td><td>Tygon, Bartelt, Graz, Austria</td><td>6.078 175</td><td>&amp;nbsp;直径1.02 mm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>QV500 流动腔室</td><td>Kirkstall Ltd., Quasi Vivo, North Yorkshire, UK</td><td>QV500&amp;nbsp;</td><td>其他腔室也可使用</td></tr><tr><td>SCD 500 溅射镀膜仪</td><td>Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein</td><td></td><td>溅射镀膜仪</td></tr><tr><td>底物氨基乙基咔唑（AEC底物试剂盒）</td><td>Abcam, Cambridge, UK</td><td>ab64252</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus载玻片&amp;nbsp;</td><td>Menzel-Glaeser, Braunschweig, Germany</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器</td><td>Corning Incorporated, NY, USA</td><td>431219</td><td>0.2 &amp;micro;m孔径SFCA膜，用于储液瓶的空气滤器&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TAAB环氧树脂</td><td>Agar Scientific, Stansted, Essex, UK</td><td>T001</td><td></td></tr><tr><td>UltraVision LP检测系统 HRP聚合物&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>TL-125-HL</td><td></td></tr><tr><td>UltraVision蛋白阻断剂</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>TA125BPQ</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss EM 900透射电子显微镜</td><td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Sigma 500场发射扫描电子显微镜</td><td>Zeiss, Cambridge, UK</td><td></td><td>使用背散射电子探测器，加速电压为5 kV</td></tr></tbody></table>

离体 胎盘外植体流体培养——模拟动态环境条件 子宫内

Ex Vivo Placental Explant Flow Culture - Mimicking the Dynamic Conditions In Utero

现有的ex vivo胎盘外植体培养模型主要基于使用孔板的静态培养系统。然而，这些模型未能充分反映in utero的动态环境，在该环境中，胎盘会因血浆或血液流动而持续受到轻微的剪切应力。为克服这一局限性，已设计出一种流动培养系统，使ex vivo胎盘外植体的培养条件更接近母体体内所经历的in utero流动环境。在此方法中，胎盘外植体被培养在五个相互连接的流动腔室序列中。该体系&#160;维持生理氧浓度和稳定的流速。收集的数据表明，在流动条件下，组织形态的保存效果相较于传统的静态方法有显著改善。这一创新技术为ex vivo胎盘外植体培养提供了一种简便的方法，更真实地再现了动态的in vivo环境。此外，本研究还为探究胎儿-母体界面的功能动态性开辟了新的&#160;可能性。通过采用可行的动态研究方法，有助于更深入地理解胎盘生物学，凸显其在母胎健康中的重要意义。

该出版物的部分内容及其研究成果已发表（参见参考文献3和23）。
实验装置 
图1 展示了一个实验装置示意图。一个复合流动循环系统由五个串联连接的流动室组成（图1A）。在每个流动室中，培养四个组织块，每个组织块的横截面直径约为 0.5 cm（图1 A,C）。对于静态对照实验，组织块被培养在六孔板的各个孔中（图1B）。为防止组织块被冲洗出去，它们被固定在带有细针状突起的金属板上（图1 D,E）。为了使培养基直接流经组织块，流动室被倒置，使入口和出口位于前端位置（图1 F,G）。在生物反应器中，流动循环系统连接至一台蠕动泵。为了比较流动培养组织与传统静态培养组织的组织完整性，将组织块放置在流动循环系统旁边的六孔板中。这可确保在氧气、温度和湿度方面维持一致的培养条件（图1A）3。
形态学分析
β-actin 
采用多种免疫组织化学染色方法，以检测不同培养条件下组织完整性的组织学差异图2）。解剖后立即包埋的外植体作为基线对照。为分析绒毛外植体中的肌动蛋白细胞骨架，进行了β-actin染色（图2A-E）。描述性分析揭示了新鲜组织中细胞骨架具有良好的结构和有序的视觉呈现图 2A随着时间的推移，在培养过程中可观察到微丝的聚集，表明细胞骨架结构发生降解。这一现象在经历静态培养的绒毛外植体中 consistently 被观察到。3 (图 2C，E，以星号标示）。
苏木精-伊红染色（H&amp;E染色） 
H&amp;E染色进一步证实了组织完整性在静态培养过程中逐渐下降的观察结果，而这一趋势在流动培养条件下得到改善（图2F-J）。新鲜组织显示出绒毛外植体结构清晰且具有典型特征的组织学表现，其特点是间质致密且细胞排列紧密（图2F）。此外，合体滋养层牢固地附着于下方的间质组织（图2F）。在流动环境中培养24小时后，绒毛外植体仍呈现相似的形态（图2G）。然而，在流动条件下培养48小时后，部分合体滋养层出现局部脱落现象（图2I，箭头所示），并伴有间质内散在的小型腔隙。组织学分析表明，在静态培养24小时后，组织完整性已未能得到充分维持（图2H）；而在静态培养48小时后，组织完整性进一步显著恶化（图2J）。间质呈现多孔和凹陷的形态，且在较大区域可见合体滋养层与间质组织明显分离（图2J，箭头）3。
CD34II 
采用CD34II染色以显示内皮细胞，从而可视化绒毛外植体中的胎儿-胎盘血管（图2K-O）。解剖后立即包埋的组织显示出内皮细胞结构清晰有序（图2K）。胎儿-胎盘血管的形态完整性在流动培养24小时后仍保持良好，甚至在48小时后仍经常得以维持，尽管在流动条件下偶尔观察到血管塌陷现象（图2 L,N）。然而，在静态培养24小时后，血管出现部分塌陷，表现为形态结构紊乱（图2M，箭头所示）。在静态培养条件下，血管结构的退化随培养时间延长而加剧。综上所述，对绒毛外植体在流动与静态培养后的描述性形态学评估表明，与静态培养相比，流动培养系统更有效地维持了组织的完整性3。
培养组织的超微结构分析
透射电子显微镜 
为了更详细地观察绒毛外植体的形态，进一步采用透射电子显微镜（TEM）进行了超微结构分析（图3A-E）。这些结果与组织学研究的发现相互印证。在制备后立即直接包埋的组织中，形态结构保存得极为完好（图3A）。合体滋养层细胞表面清晰可见微绒毛结构。合体滋养层呈现出其特有的连续层状结构，无侧向细胞边界，并与基底膜直接接触。新鲜组织的间质结构致密，无明显穿孔或破裂。此外，血管的超微结构以及血管内独立存在的红细胞也显示出极佳的保存状态（图3A）。
即使经过24小时的灌注培养，组织样本的整体形态仍保持得相对完好（图3D）。与新鲜组织相比，合体滋养层表面的微绒毛略有减少，但合体滋养层仍主要附着于基底膜上。在合体滋养层内部区域可观察到细胞核和少量小空泡。胎盘绒毛内的间质保存良好，形态与新鲜组织非常相似（图3D）。即使在灌注培养48小时后，间质细胞仍保持相对良好的结构，尽管出现了一些穿孔（图3E）。有趣的是，在组织中检测到了脂滴。尽管合体滋养层出现空泡化及微绒毛数量减少，但在多个区域仍附着于基底膜，且合体细胞和细胞核清晰可见（图3E）。
与流体培养的组织形成鲜明对比的是，静态培养的绒毛组织在24小时时已表现出形态学上的退化图3B）。合体滋养层在多个位点处与基膜分离，并显示出相对明显的穿孔。此外，脂滴在合体滋养层和间质中均常可见。图3B）。经过48小时静态培养后，超微结构的进行性退化已明显可见（图3C）。合体滋养层出现大量穿孔，并在很大程度上从基底膜脱离。间质中的细胞以及构成血管的内皮细胞难以辨认。此外，在静态培养48小时后，绒毛外植体中可见明显的脂滴积聚。图3C综上所述，静态培养条件下组织的超微结构在培养期间呈现进行性退化，而流动培养条件可减轻这一退化趋势。3.
扫描电子显微镜 
通过扫描电子显微镜（SEM）对绒毛外植体表面进行了详细观察（图4A-J）。新鲜包埋的组织在其表面显示出密集分布的微绒毛结构（图4 A,B），部分区域可见囊泡样结构。相比之下，静态培养的组织在24小时后微绒毛显著减少（图4C,D），并在48小时后仍维持该状态（图4E,F）。某些区域可见未释放的囊泡样结构聚集，而其他区域则呈现裸露和侵蚀的形态（图4D,F）。在经历灌注培养的组织中，24小时（图4G,H）和48小时（图4I,J）后表面仍保留有微绒毛，尽管其密度低于新鲜组织。与静态培养相比，灌注培养组织表面的囊泡样结构更少。值得注意的是，这些囊泡样结构明显集中在某些流体流动减缓或缺失的凹陷区域（图4H,J），提示它们可能因培养基流动而从暴露于流场的组织表面被冲刷脱落3。
<img alt="用于3D细胞培养分析的流室与蠕动泵装置；图像详细展示了设备和样品。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65919/65919fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：流动系统的装置示意图。（A）组装好的流动系统，包含储液槽和五个流室，连接至一台蠕动泵。右侧为六孔板，用于组织块的静态培养。（B,C）两种培养方法中，胎盘样本均被分离为约0.5 cm2大小的绒毛组织块，每孔或每室使用四个组织块。在实验设计中，共使用五个流室或孔。（D,E）在流动培养中，使用带有细长针状凸起的金属板固定组织块。（F,G）管道开口位于流室前端，因此装置倒置使用，以确保组织直接暴露于流动液体中。该图引自 Kupper 等人3。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65919/65919fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="组织分析；β-肌动蛋白、苏木精-伊红、CD34 II 染色；组织学、细胞形态、比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65919/65919fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：胎盘绒毛外植体在灌流培养与静态培养条件下的形态学分析。（A-E）通过β-肌动蛋白免疫荧光染色显示外植体在培养后的细胞骨架结构。分析时每张切片随机选取六个视野，图中展示代表性图像。（A）直接在制备后包埋的组织中细胞骨架的可视化结果。比例尺：20 µm。（B-E）代表性图像显示，在灌流培养与静态培养条件下，外植体的肌动蛋白细胞骨架随时间及培养模式发生退化。（C-E）星号表示肌动蛋白微丝积累增加，提示肌动蛋白细胞骨架的降解。（F-J）绒毛外植体的苏木精-伊红染色结果。比例尺：100 µm。（F,G）新鲜包埋组织（F）及灌流培养24小时的外植体（G）显示绒毛外植体形态保存良好。（I）灌流培养48小时后，合体滋养层细胞出现间歇性脱落区域（箭头）。（H,J）静态外植体培养后结构完整性随时间退化，表现为合体滋养层细胞脱落（箭头）及间质穿孔。（K-O）使用CD34 II标记绒毛内皮细胞。比例尺：100 µm。（K,L）新鲜组织（K）及在灌流条件下培养24小时的外植体（L）均呈现特征性的结构有序排列的内皮细胞模式。（N）在灌流培养48小时后，血管完整性出现一定程度下降。（M,O）在静态培养中，血管塌陷在24小时后已可见（M），且随着静态培养时间延长而加剧（O）。本图引自 Kupper 等人3。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65919/65919fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="静态与流动条件下随时间变化的显微镜比较；细胞结构分析，脂质储存。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65919/65919fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：利用透射电子显微镜对绒毛外植体进行培养前和培养后的超微结构检查。 图像分析使用了三个独立实验的组织样本。（A）新鲜包埋组织的代表性图像显示，合体滋养层（ST）表面存在大量微绒毛（MV）。在保存良好的间质（S）中可见结构完整的毛细血管（Ca）。（B）经24小时静态培养后，合体滋养层的结构完整性出现退化，部分区域似乎与基底膜脱离。此外还可观察到明显的脂滴（LD）积聚。（C）静态培养48小时后，观察到严重的超微结构退化。间质及合体滋养层均出现穿孔，脂滴大量积聚，血管几乎无法辨认。（D,E）流动培养条件下，组织的超微结构在培养24小时（D）和48小时（E）后均相对较好地得以保存。比例尺：2 µm。MV：微绒毛，ST：合体滋养层，S：间质，Ca：毛细血管，LD：脂滴。该图引自 Kupper 等人3。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65919/65919fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="静态和流动条件下新鲜、24小时、48小时的矿物生长扫描电镜图像；比例尺可见。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65919/65919fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：利用扫描电子显微镜对绒毛外植体进行培养前后的超微结构观察。（A,C,E,G,I）胎盘绒毛树表面的概览图像及其相应的详细图像（B,D,F,H,J）。（A,B）新鲜包埋的组织显示出密集的微绒毛结构。（B）在某些区域可见类似囊泡的结构。（C-F）静态培养24小时和48小时后，合体滋养层细胞表面的微绒毛数量明显减少。显著特征是外植体表面大量聚集了类似囊泡的颗粒。（F）在静态培养48小时后，这些颗粒似乎出现萎缩。（G-J）与静态培养相比，流动培养条件下组织表面在24小时（G,H）和48小时（I,J）后均表现出更好的保存状态。表面可见微绒毛（H,J），尽管其密度仍不及新鲜组织。（B）在流体流动减少的凹陷区域，可见囊泡样颗粒散在分布。本图引自 Kupper 等人3。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65919/65919fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充表1：胎盘绒毛灌流与静态培养的实验条件。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65919/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表 2：流动系统与静态系统的参数说明。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65919/Supplementary%20Table%202.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表3：本研究中用于免疫组织化学和免疫荧光的抗体。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65919/Supplementary%20Table%203.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

以下是在恒定流动条件下培养胎盘外植体的实验方案。该方法通过模拟动态生理环境，改进了传统的静态绒毛培养系统。

现有的离体胎盘外植体培养模型主要基于使用孔板的静态培养系统。然而，这些模型……

我们正试图揭示为何部分孕妇会发展为子痫前期而另一些则不会。这种妊娠特异性综合征会导致孕妇出现高血压和蛋白尿，并可能造成母婴死亡。通过我们的转化医学研究，希望能确定导致母体症状的胎盘病因。近年来，单细胞RNA测序技术已被用于鉴定健康胎盘与子痫前期胎盘之间的差异。现在是将这些数据与原始组织关联起来的时候了。为此，我们正在利用空间组织学与原位测序技术来识别单细胞水平上的变化。胎盘几何结构的个体复杂性为确定特定胎盘绒毛内的精确流速和剪切应力带来了挑战。通过使用该流动培养系统，可以探讨并研究剪切力对胎盘组织生物学功能的影响。首先，将切除的胎盘样本片段置于磷酸盐缓冲液（PBS）中。弃去标本的绒毛板、母体蜕膜以及任何可见的梗死组织。将剩余的组织标本切成横截面直径约0.5厘米的绒毛外植块。将外植块转移至盛有新鲜PBS的培养皿中。用镊子将每个外植体在 PBS 中轻轻晃动，以去除所有血液。在无菌操作台内，使用鲁尔锁将五个腔室连接到储液瓶上。将腔室倒置，然后取下底部。现在使用镊子将金属板中央放置于腔室上部，使针脚朝上。向腔室中一半加入一毫升预热的培养基。再向储液槽中加入额外的 20 毫升培养基。用镊子小心地将绒毛外植体放置在腔室内金属板的针上。每个腔室放入四个外植体。重新安装腔室底部以封闭腔室。接下来，将泵管连接到泵上，以将流路与生物反应器内的蠕动泵相连。将其固定在第四级。在“泵”菜单下，选择“手动”模式。将泵速调节至每分钟1毫升，然后点击“RUN”开始泵液。填充过程中将腔室保持倾斜角度，以确保完全充满。填充过程结束后，再次翻转腔室。确认腔室已固定，然后关闭生物反应器的两个盖子。组织孵育完成后，单击“ABORT”以停止泵运行。随后，依次打开两个生物反应器盖子和一个流体腔室。使用镊子小心地从金属板上取下外植体，以进行后续分析。免疫组织化学染色的外植体显示，新鲜组织和流动培养组织中的细胞骨架具有结构完整且有序的可视化表现。随着时间推移，静态培养的外植体中微丝聚集现象逐渐增加，表明细胞骨架结构发生退化。通过苏木精和伊红染色证实了培养时间延长导致组织完整性下降。新鲜组织显示出致密且紧密排列的间质结构。在流动培养48小时后，可见部分脱落的合体滋养层碎片。在静态培养条件下，组织完整性在24小时后已出现保存不足的情况，并在48小时后进一步恶化。内皮细胞染色显示新鲜组织中的细胞排列清晰有序。而在灌注培养中，即使经过48小时，组织的形态完整性仍得到较广泛的维持。然而，静态外植体在24小时后即出现部分塌陷，48小时后进一步恶化。

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Research

科研

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