血脑屏障的重建 体外 用于建模及治疗性靶向神经系统疾病

我们的目标是确定介导阿尔茨海默病发病机制的分子和细胞机制，以发现潜在的治疗和诊断机会。目前，参与阿尔茨海默病发生与发展的分子通路和机制仍不清楚。这主要是因为小鼠模型及其他体外阿尔茨海默病模型无法重现对疾病发展至关重要的独特人类生物学特征。

我们开发了一种体外血脑屏障模型，可用于研究与阿尔茨海默病、痴呆及其他神经退行性疾病相关的脑血管病理。该模型已被用于证明，阿尔茨海默病最强的风险因子 APOE4 通过部分寄生虫特异性通路，增加致病性淀粉样蛋白的累积。利用诱导性多能干细胞，我们可以在体外构建人类脑组织，用于疾病病理机制的研究以及药物筛选。

这种体外血脑屏障模型可实现个性化的治疗和诊断方法。我们的三维体外血脑屏障模型能够展示具有生理相关性的相互作用，包括血管管腔的形成以及星形胶质细胞终足与脉管系统的定位关系。该模型还能够模拟与疾病相关的表型，包括淀粉样蛋白病理变化。

最后，利用患者来源的诱导性多能干细胞可以研究任何特定的遗传背景。通过体外血脑屏障模型，我们发现了介导病理性脑血管淀粉样蛋白积累的通路。这促使我们探索能够在老年 APOE4 小鼠中逆转该病理变化的治疗策略，目前我们正在对此进行后续研究。

首先准备用于构建诱导性血脑屏障（iBBB）模型的已分化内皮细胞、寄生虫和星形胶质细胞。吸除已分化内皮细胞的培养基后，用PBS洗涤细胞一次，然后向洗涤后的细胞中加入蛋白酶胶原酶混合液，在37摄氏度条件下消化5分钟。将含有解离细胞的蛋白酶胶原酶混合液转移至含有hECSR的锥形管中，保持混合液与hECSR的体积比为1:3。

然后在300 G条件下离心细胞3分钟，吸除上清液，再将所得细胞沉淀重悬于hECSR中。在37摄氏度下用蛋白酶胶原酶混合液消化分化后的寄生虫5分钟。在锥形管中加入适量N2B27，将含有消化后细胞的蛋白酶胶原酶混合液转移至其中，保持混合液与N2B27的体积比为1:3。

在300 ×g条件下离心细胞3分钟。吸除上清液后，将细胞沉淀重悬于N2B27培养基中。使用蛋白酶胶原酶混合液在37°C条件下消化分化后的星形胶质细胞5分钟。

将蛋白酶胶原酶混合液中解离的细胞转移至含有完全星形胶质细胞培养基的锥形管中，混合液与培养基的体积比为1:3。在300 G条件下离心3分钟后，吸除上清液，并用完全星形胶质细胞培养基重悬细胞沉淀。此时细胞已准备好用于构建iBBB。

使用解离的人多能干细胞来源的内皮细胞、寄生虫和星形胶质细胞组装人多能干细胞来源的血脑屏障（iBBB）。将这三种细胞在锥形管中混合，细胞数量应比计算值多出10%，以补偿移液误差。以300 ×g离心3分钟，沉淀细胞混合物。

吸弃上清液，保留含有约50微升培养基的细胞沉淀。使用P200移液器，用残留的培养基轻柔重悬细胞沉淀，制成单细胞悬液。将含有细胞悬液的离心管置于冰上，并根据所需iBBB的数量加入适量的还原型GF基底膜基质。

将细胞均匀混合，同时避免引入任何气泡。用移液器将50微升终末的细胞基质混合物加入48孔或96孔玻璃底培养皿的孔中，并使其均匀分布于皿底。将培养皿置于37摄氏度孵育30至40分钟，使基质聚合并包埋细胞。

最后，向孔中加入 500 微升添加了补充物的星形胶质细胞培养基，并将诱导型血脑屏障（iBBB）维持在培养状态。对于 96 孔板，向每孔加入 100 至 150 微升培养基，直至其充分发育可用于后续检测，通常需要两周时间。在明场显微镜下，结构正常的诱导型血脑屏障呈现为一个固化的单片状半透明圆盘。

24小时后，观察到均匀分布的单个细胞。两周后，出现了更为明显的结构，尽管仍难以界定。