Name: 体外血脑屏障重建，模拟和治疗神经系统疾病 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: 了解利用诱导多能干细胞构建三维体外血脑屏障模型的方法，用于研究阿尔茨海默病相关的脑血管病理机制。该模型可模拟人类血脑屏障功能，支持个性化治疗策略的开发。

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本研究由美国国立卫生研究院（NIH）3-UG3-NS115064-01、R01NS14239、治愈阿尔茨海默病基金会（Cure Alzheimer's Fund）、美国国家航空航天局（NASA）80ARCO22CA004、陈-扎克伯格倡议（Chan-Zuckerberg Initiative）、迈克尔·J·福克斯基金会/加速帕金森研究联盟（MJFF/ASAP Foundation）以及美国脑损伤协会（Brain Injury Association of America）资助。C.G. 获美国国立卫生研究院 F31NS130909 项目支持。图1A 使用 BioRender.com 制作。

1. 将iPSCs分化为iBBB细胞
注意：这些分化方案此前已在 Mesentier-Louro 等人的研究中描述过34。
<ol>
	<li>包被细胞培养板
	<ol>
		<li>在 4 °C 下过夜解冻低生长因子（GF）基底膜基质。将 500 µL 基底膜基质加入 49.5 mL DMEM 中稀释。保持该溶液低温，以防止包被液过早聚合。</li>
		<li>向 6 孔组织培养处理板的每孔中加入 1–2 mL。在 37 °C 下孵育至少 20 分钟后，更换为预热的适当培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将人诱导多能干细胞（iPSCs）分化为 ETV2 诱导型内皮细胞 
	耗时：8 天 
	注：本方案改编自 Blanchard 等人24 和 Qian 等人35。我们采用 Wang 等人36 所述的强力霉素诱导转录因子 ETV2 表达，以提高产量。ETV2 通过 PiggyBac 质粒导入，并对细胞进行转染。
	<ol>
		<li>在低生长因子基底膜基质包被的培养板上，使用无饲养层的多能干细胞培养基培养 iPSCs，直至细胞汇合度达到约 70%。 
		注：建议对诱导型 iPSCs 维持 PiggyBac 质粒的筛选（例如，使用嘌呤霉素）</li>
		<li>第 0 天：使用蛋白酶-胶原酶混合液消化细胞 5 分钟。将消化后的细胞以 1:3 的比例转移至含蛋白酶-胶原酶混合液与干细胞培养基的锥形管中。在 300 × g 条件下离心 3 分钟。用干细胞培养基重悬细胞沉淀，并以 20,800 个细胞/cm2 的密度接种于低生长因子基底膜基质包被的培养板中，培养基中添加 10 µM Y27632。</li>
		<li>第 1 天：更换为 DeSR1 培养基 [DMEM/F12 + 谷氨酰胺补充剂，1× 最小必需培养基非必需氨基酸（MEM-NEAA），1% 青霉素-链霉素（P/S）]，并补充 10 ng/mL BMP4、6 µM CHIR99021 和 5 µg/mL 多西环素。</li>
		<li>第 3 天：更换为 DeSR2 培养基 [DMEM/F12 + 谷氨酰胺补充剂，1× MEM-NEAA，1× N-2，1× B-27，1% P/S]，并补充 5 µg/mL 多西环素。</li>
		<li>第 5 天：更换为 hECSR 培养基 [人内皮细胞无血清培养基，1× MEM-NEAA，1× B-27，1% P/S]，并补充 50 ng/mL VEGF-A、2 µM 福司柯林和 5 µg/mL 多西环素。</li>
		<li>第 7 天：更换为 hECSR 培养基，补充 50 ng/mL VEGF-A、2 µM 福司柯林和 5 µg/mL 多西环素。</li>
		<li>第 8 天：使用蛋白酶-胶原酶混合液以 1:3 比例传代内皮细胞（ECs），并重新接种于新鲜的低生长因子基底膜基质包被的培养板中，培养基为含 50 ng/mL VEGF-A 和 5 µg/mL 多西环素的 hECSR。 
		注：此为将内皮细胞包封入 iBBB 以形成均一血管结构的最佳时间点。</li>
		<li>第 10 天及以后：每隔 2–3 天使用含 50 ng/mL VEGF-A 和 5 µg/mL 多西环素的 hECSR 培养基换液。当培养板细胞汇合时，使用蛋白酶-胶原酶混合液以 1:3 比例传代。 
		注：自第 8 天起，iPSC 来源的内皮细胞可在任意时间点冻存。按传代方式收获细胞，用内皮细胞冻存液 [60% KnockOut 血清替代物（KSR），30% hECSR，10% DMSO，&#160;50 ng/mL VEGF-A，&#160;和 10 µM Y27632] 重悬细胞沉淀，按 1:3 比例分装，使用冻存盒于 -80 °C 冻存。复苏时接种于含&#160;50 ng/mL VEGF-A 和 5 µg/mL 多西环素的 hECSR 培养基中的低生长因子基底膜基质包被板上。</li>
		<li>通过免疫细胞化学染色，使用抗 CD31/PECAM1 或 VE-钙黏蛋白抗体确认脑微血管内皮细胞的分化（图 2A）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将人诱导多能干细胞（iPSCs）分化为周细胞 
	耗时：6 天 
	注：本方案改编自 Patsch 等人36。
	<ol>
		<li>在低生长因子基底膜基质包被的培养板上，于无饲养层条件下使用干细胞培养基培养 iPSCs，直至细胞汇合度达到约 70%。</li>
		<li>第 0 天：使用蛋白酶-胶原酶混合液消化细胞 5 分钟。将消化后的细胞以 1:3 的比例转移至含蛋白酶-胶原酶混合液与干细胞培养基的锥形管中。在 300 × g 条件下离心 3 分钟。用干细胞培养基重悬细胞沉淀，并以 37,000–40,000 个细胞/cm2（根据细胞系而定）的密度接种于低生长因子基底膜基质包被的培养板中，培养基中添加 10 µM Y27632。</li>
		<li>第 1 天：更换为 N2B27 培养基 [50% DMEM/F12 + 谷氨酰胺补充剂，50% Neurobasal，1× MEM-NEAA，0.5× 谷氨酰胺补充剂，1× N-2，1× B-27，1% P/S]，并补充 25 ng/mL BMP4 和 8 µM CHIR99021。</li>
		<li>第 3–4 天：更换为 N2B27 培养基，补充 2 ng/mL Activin A 和 10 ng/mL PDGF-BB，每日换液。</li>
		<li>第 5 天：使用蛋白酶-胶原酶混合液传代周细胞（PCs），并以 35,000 个细胞/cm2 的密度接种于 0.1% 明胶包被的培养板中，培养基为含 10 ng/mL PDGF-BB 的 N2B27。 
		注：仅在细胞完全汇合后进行传代。某些细胞系可能需要更长时间才能达到传代条件；在此期间应继续每日更换培养基，直至细胞汇合。</li>
		<li>在含 10 ng/mL PDGF-BB 的 N2B27 培养基中扩增周细胞，每 2–3 天更换一次培养基。当细胞再次达到汇合状态并完成第二次传代后，从培养基中去除 PDGF-BB。 
		注：周细胞在第二次传代后即可用于 iBBB 构建。扩增后的周细胞可进行冻存。按传代方式收获细胞，用冻存液 [90% KSR 和 10% DMSO] 重悬细胞沉淀，使用冻存盒于 -80 °C 冻存。复苏时以 35,000 个细胞/cm2 的密度接种于 0.1% 明胶包被的培养板中，使用 N2B27 培养基培养。</li>
		<li>通过免疫细胞化学染色，使用抗 PDGFRB 和 NG2 抗体确认周细胞的分化（图 2B）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将人诱导多能干细胞（iPSCs）分化为神经前体细胞（NPCs）和星形胶质细胞 
	总耗时：45 天（NPCs 分化 15 天，随后星形胶质细胞分化 30 天） 
	&#8203;注：NPC 分化方案改编自 Chambers 等人38，星形胶质细胞分化方案参考 TCW 等人39。
	<ol>
		<li>在低生长因子基底膜基质包被的培养板上，于无饲养层条件下使用干细胞培养基培养 iPSCs，直至细胞汇合度达到约 70%。</li>
		<li>使用蛋白酶-胶原酶混合液消化细胞 5 分钟。将消化后的细胞以 1:3 的比例转移至含蛋白酶-胶原酶混合液与干细胞培养基的锥形管中。在 300 × g 条件下离心 3 分钟。用干细胞培养基重悬细胞沉淀，并以 100,000 个细胞/cm2 的密度接种于低生长因子基底膜基质包被的培养板中，培养基中添加 10 µM Y27632。</li>
		<li>次日更换干细胞培养基。每隔一天换液一次，直至细胞汇合度达到&#62;95%（根据细胞系不同，需 3–4 天）。</li>
		<li>NPC 第 0 天：更换为 N2B27 培养基 [50% DMEM/F12 + 谷氨酰胺补充剂，50% Neurobasal，1× MEM-NEAA，0.5× 谷氨酰胺补充剂，1× N-2，1× B-27，1% P/S]，并补充 10 µM SB43152 和 100 nM LDN193189。</li>
		<li>NPC 第 1–9 天：每日使用含 10 µM SB43152 和 100 nM LDN193189 的 N2B27 培养基换液。</li>
		<li>NPC 第 10 天：使用蛋白酶-胶原酶混合液以 1:3 比例传代 NPCs，并接种于新鲜的低生长因子基底膜基质包被的培养板中，使用含 20 ng/mL 基础 FGF 和 10 µM Y27632 的 N2B27 培养基。</li>
		<li>NPC 第 11–13 天：每日使用含 20 ng/mL 基础 FGF 的 N2B27 培养基换液。</li>
		<li>NPC 第 14 天：使用蛋白酶-胶原酶混合液以 1:3 比例传代 NPCs，并重新接种于新鲜的低生长因子基底膜基质包被的培养板中，使用含 20 ng/mL 基础 FGF 和 10 µM Y27632 的 N2B27 培养基。</li>
		<li>NPC 第 15 天/星形胶质细胞第 0 天：此为星形胶质细胞分化的第 0 天。使用完全星形胶质细胞培养基（AM）喂养细胞。 
		注：NPCs 可在含 20 ng/mL 基础 FGF 的 N2B27 培养基中维持培养，并在汇合时传代。如需冻存 NPCs，将细胞沉淀用冻存液 [90% KSR 和 10% DMSO] 重悬，按 1:3 比例分装，使用冻存盒于 -80 °C 冻存。复苏时接种于含 20 ng/mL bFGF 和 10 µM Y27632 的 N2B27 培养基中的低生长因子基底膜基质包被板上。</li>
		<li>星形胶质细胞第 1–30 天：每隔 2–3 天使用 AM 培养基换液。当细胞汇合度&#62;90% 时，使用蛋白酶-胶原酶混合液传代，并以 15,000 个细胞/cm2 的密度接种于新鲜的低生长因子基底膜基质包被的培养板中，使用 AM 培养基培养。 
		注：星形胶质细胞应在 30 天内完成完全分化。星形胶质细胞可用冻存液 [90% KSR 和 10% DMSO] 在冻存盒中于 -80 °C 冻存。复苏时接种于 AM 培养基中的低生长因子基底膜基质包被板上，密度为 25,000–35,000 个细胞/cm2。</li>
		<li>通过免疫细胞化学染色，使用抗 Nestin 和 SOX2 抗体确认 NPC 的分化。通过免疫细胞化学染色，使用抗 S100B 和 CD44 抗体确认星形胶质细胞的分化（图 2C）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 组装 iBBB
<ol>
	<li>在 4 °C 下过夜解冻低生长因子（GF）基底膜基质。不要将该基质用 DMEM 稀释，因为 iBBB 被包埋在 100% 的低生长因子基底膜基质中。每个 iBBB 需要 50 µL 基质。</li>
	<li>使用蛋白酶-胶原酶混合液在 37 °C 下消化分化后的内皮细胞（ECs）5 分钟。将消化后的细胞转移至锥形管中，加入蛋白酶-胶原酶混合液与 hECSR（人内皮细胞无血清培养基，1x MEM-NEAA，1x B-27，1% P/S）按 1:3 比例的培养基。在 300 × g 下离心 3 分钟。将细胞沉淀重悬于 hECSR 中。 
	注意：使用足够大的锥形管（15 mL 或 50 mL），以容纳解离细胞和培养基的总体积。细胞也可分装至多个管中，重悬后再合并。</li>
	<li>使用蛋白酶-胶原酶混合液在 37 °C 下消化分化后的周细胞（PCs）5 分钟。将消化后的细胞转移至锥形管中，加入蛋白酶-胶原酶混合液与 N2B27（50% DMEM/F12 + 谷氨酰胺补充剂，50% Neurobasal，1x MEM-NEAA，0.5x 谷氨酰胺补充剂，1x N-2，1x B-27，1% 青霉素-链霉素 [P/S]）按 1:3 比例的培养基。在 300 × g 下离心 3 分钟。将细胞沉淀重悬于 N2B27 中。</li>
	<li>使用蛋白酶-胶原酶混合液在 37 °C 下消化分化后的星形胶质细胞 5 分钟。将消化后的细胞转移至锥形管中，加入蛋白酶-胶原酶混合液与完全星形胶质细胞培养基（AM）按 1:3 比例的培养基。在 300 × g 下离心 3 分钟。将细胞沉淀重悬于 AM 中。</li>
	<li>使用血细胞计数板对每种细胞进行计数。将每种细胞悬液用相应的培养基稀释至终浓度为 1 × 106 个细胞/mL。</li>
	<li>在锥形管中混合计算好的每种细胞数量：每个 50 µL 的 iBBB 需要 2.5 × 105 个 ECs、5 × 104 个 PCs 和 5 × 104 个星形胶质细胞。额外加入 10% 的细胞数量以补偿移液误差。在 300 × g 下离心细胞混合物 3 分钟。 
	注意：强烈建议将每种细胞类型的剩余细胞以二维单层培养的方式接种，用于固定和染色，以进行输入细胞的质量控制。将每种细胞以 35,000 个细胞/cm2 的密度接种于预先包被低生长因子基底膜基质的培养板上，3–4 天后固定。细胞类型特异性抗体见表 1。</li>
	<li>吸除细胞沉淀上的培养基，保留约 50 µL 上清液在细胞沉淀上方。使用 P200 移液器轻轻将细胞沉淀重悬于残留培养基中，形成单细胞悬液。</li>
	<li>将细胞悬液与足量的低生长因子基底膜基质混合，每 iBBB 加入 50 µL 基质，并补充 10 ng/mL VEGF-A，注意均匀混匀细胞，避免引入气泡。 
	注意：此步骤中必须将细胞和低生长因子基底膜基质置于冰上，以防止基质过早聚合。</li>
	<li>将 50 µL 低生长因子基底膜基质混合物移入 48 孔玻璃底培养皿的孔中。将液体均匀分布于皿底（图 1C）。</li>
	<li>将 iBBB 在 37 °C 下孵育 30–40 分钟，使低生长因子基底膜基质聚合，从而将细胞包埋于基质中。</li>
	<li>加入 500 µL 含 10 ng/mL VEGF-A、5 µg/mL 多西环素和 10 µM Y27632 的 AM 培养基。</li>
	<li>次日更换为含 10 ng/mL VEGF-A 的 AM 培养基。此后每 2–3 天更换一次培养基。两周后停止添加 VEGF-A；iBBB 在培养两周后即可用于后续检测。</li>
</ol>
3. 使用 Aβ 纤维诱导脑淀粉样血管病（CAA）
<ol>
	<li>在 PBS 中配制 200 µM 的淀粉样蛋白-β1-40 和淀粉样蛋白-β1-42 储存液。</li>
	<li>将 Aβ 加入培养 2 周的 iBBB 模型的培养基中，使其终浓度为 20 nM。在含 Aβ 的培养基中孵育细胞 96 小时（4 天）。</li>
	<li>96 小时后，移除培养基，并继续进行固定操作（第 4 部分）。</li>
</ol>
4. iBBB 的固定与染色
<ol>
	<li>为固定iBBB，移除培养基，用1 mL PBS洗涤，然后在4 °C下用500 µL 4%多聚甲醛溶液孵育过夜。</li>
	<li>移除4%多聚甲醛溶液，用1 mL PBS重复漂洗至少4次，每次15分钟。</li>
	<li>在室温下用0.3% PBST（含0.3% Triton X-100的PBS）对样品进行通透处理，轻轻振荡孵育1小时。</li>
	<li>将培养物置于封闭缓冲液（含5%正常血清的0.3% PBST）中，在室温下轻轻振荡孵育至少1小时。 
	注意：所用血清的类型取决于二抗的宿主物种。例如，若二抗的宿主物种为&#160;山羊，则使用正常山羊血清；若宿主物种为&#160;驴，则使用正常驴血清。此步骤也可在4 °C下轻轻振荡孵育过夜完成。</li>
	<li>用封闭缓冲液将一抗稀释至推荐或已确定的浓度。</li>
	<li>用一抗稀释液替换封闭液。确保iBBB完全浸没在抗体溶液中以实现均匀孵育；在48孔玻璃底培养皿中，100–150 µL足以覆盖50 µL的iBBB。在4 °C下轻轻振荡孵育过夜。</li>
	<li>移除一抗溶液，用0.3%&#160;PBS对iBBB进行3次洗涤，每次10–20分钟。</li>
	<li>用封闭缓冲液将二抗稀释至推荐或已确定的浓度。此外，向二抗溶液中加入推荐或已确定浓度的核染料（如Hoechst）。</li>
	<li>用二抗稀释液替换最后一次PBS洗涤液。确保iBBB完全浸没在抗体溶液中以实现均匀孵育；在48孔玻璃底培养皿中，100–150 µL足以覆盖50 µL的iBBB。在室温下轻轻振荡孵育2小时。 
	注意：此步骤也可在4 °C下轻轻振荡孵育过夜完成。</li>
	<li>用&#160;PBS对iBBB进行4–5次洗涤，每次至少1小时。之后将样品保存于PBS或抗荧光淬灭封片剂中，置于4 °C直至成像。</li>
	<li>若在倒置显微镜下成像，应将iBBB保留在玻璃底培养板或培养皿中。在玻璃孔上方加盖盖玻片以固定iBBB位置（图1D）。</li>
</ol>

A 3D Blood-Brain Barrier Model Derived from Human Pluripotent Stem-Cells

<ol><li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412(2015).</li>
<li>Segarra, M., Aburto, M. R., Acker-Palmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+dynamics+to+maintain+brain+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier dynamics to maintain brain homeostasis.</a> Trends in Neurosciences. 44 (5), 393-405 (2021).</li>
<li>Campos-Bedolla, P., Walter, F. R., Veszelka, S., Deli, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+blood-brain+barrier+in+the+nutrition+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Medical+Research%22%5BJournal%5D)">Role of the blood-brain barrier in the nutrition of the central nervous system.</a> Archives of Medical Research. 45 (8), 610-638 (2014).</li>
<li>Hladky, S. B., Barrand, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+and+ion+transfer+across+the+blood-brain+and+blood-cerebrospinal+fluid+barriers%3B+a+comparative+account+of+mechanisms+and+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">Fluid and ion transfer across the blood-brain and blood-cerebrospinal fluid barriers; a comparative account of mechanisms and roles.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 13 (1), 19(2016).</li>
<li>Kaur, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waste+clearance+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Waste clearance in the brain.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 15, 665803(2021).</li>
<li>Verheggen, I. C. M., Van Boxtel, M. P. J., Verhey, F. R. J., Jansen, J. F. A., Backes, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+blood-brain+barrier+and+glymphatic+system+in+solute+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+and+Biobehavioral+Reviews%22%5BJournal%5D)">Interaction between blood-brain barrier and glymphatic system in solute clearance.</a> Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 90, 26-33 (2018).</li>
<li>Weiss, N., Miller, F., Cazaubon, S., Couraud, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier+in+brain+homeostasis+and+neurological+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1788 (4), 842-857 (2009).</li>
<li>Prinz, M., Priller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+peripheral+immune+cells+in+the+cns+in+steady+state+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of peripheral immune cells in the cns in steady state and disease.</a> Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).</li>
<li>Weksler, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).</li>
<li>Liu, W. Y., Wang, Z. B., Zhang, L. C., Wei, X., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junction+in+blood-brain+barrier%3A+An+overview+of+structure%2C+regulation%2C+and+regulator+substances%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Neuroscience+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Tight junction in blood-brain barrier: An overview of structure, regulation, and regulator substances.</a> CNS Neuroscience & Therapeutics. 18 (8), 609-615 (2012).</li>
<li>Siegenthaler, J. A., Sohet, F., Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sealing+off+the+cns%27%3A+Cellular+and+molecular+regulation+of+blood-brain+barriergenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Sealing off the cns': Cellular and molecular regulation of blood-brain barriergenesis.</a> Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 1057-1064 (2013).</li>
<li>Brightman, M. W., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctions+between+intimately+apposed+cell+membranes+in+the+vertebrate+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain.</a> Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).</li>
<li>Reese, T. S., Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+structural+localization+of+a+blood-brain+barrier+to+exogenous+peroxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fine structural localization of a blood-brain barrier to exogenous peroxidase.</a> Journal of Cell Biology. 34 (1), 207-217 (1967).</li>
<li>Mahringer, A., Fricker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abc+transporters+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Metabolism+%26+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Abc transporters at the blood-brain barrier.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 12 (5), 499-508 (2016).</li>
<li>Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes%3A+Developmental%2C+physiological%2C+and+pathological+perspectives%2C+problems%2C+and+promises%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Pericytes: Developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises.</a> Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).</li>
<li>Armulik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+regulate+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pericytes regulate the blood-brain barrier.</a> Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).</li>
<li>Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+are+required+for+blood-brain+barrier+integrity+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis.</a> Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).</li>
<li>Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).</li>
<li>Heithoff, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+are+necessary+for+blood-brain+barrier+maintenance+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain.</a> Glia. 69 (2), 436-472 (2021).</li>
<li>Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin+water+channels+and+endothelial+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Aquaporin water channels and endothelial cell function.</a> Journal of Anatomy. 200 (6), 617-627 (2002).</li>
<li>Wolburg, H., Lippoldt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junctions+of+the+blood-brain+barrier%3A+Development%2C+composition+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Tight junctions of the blood-brain barrier: Development, composition and regulation.</a> Vascular Pharmacology. 38 (6), 323-337 (2002).</li>
<li>Sagare, A. P., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurovascular+dysfunction+and+faulty+amyloid+beta-peptide+clearance+in+alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neurovascular dysfunction and faulty amyloid beta-peptide clearance in alzheimer disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (10), a011452(2012).</li>
<li>Kapasi, A., Schneider, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+contributions+to+cognitive+impairment%2C+clinical+alzheimer%27s+disease%2C+and+dementia+in+older+persons%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Vascular contributions to cognitive impairment, clinical alzheimer's disease, and dementia in older persons.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (5), 878-886 (2016).</li>
<li>Blanchard, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+the+human+blood-brain+barrier+in+vitro+reveals+a+pathogenic+mechanism+of+apoe4+in+pericytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of the human blood-brain barrier in vitro reveals a pathogenic mechanism of apoe4 in pericytes.</a> Nature Medicine. 26 (6), 952-963 (2020).</li>
<li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+integrity+in+the+pathogenesis+of+alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier integrity in the pathogenesis of alzheimer's disease.</a> Frontiers in Neuroendocrinology. 59, 100857(2020).</li>
<li>Morgan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+dephosphorylation+of+the+tight+junction+protein+occludin+in+an+experimental+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Inflammation and dephosphorylation of the tight junction protein occludin in an experimental model of multiple sclerosis.</a> Neuroscience. 147 (3), 664-673 (2007).</li>
<li>Kirk, J., Plumb, J., Mirakhur, M., Mcquaid, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junctional+abnormality+in+multiple+sclerosis+white+matter+affects+all+calibres+of+vessel+and+is+associated+with+blood-brain+barrier+leakage+and+active+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Tight junctional abnormality in multiple sclerosis white matter affects all calibres of vessel and is associated with blood-brain barrier leakage and active demyelination.</a> Journal of Pathology. 201 (2), 319-327 (2003).</li>
<li>Balasa, R., Barcutean, L., Mosora, O., Manu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reviewing+the+significance+of+blood-brain+barrier+disruption+in+multiple+sclerosis+pathology+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Reviewing the significance of blood-brain barrier disruption in multiple sclerosis pathology and treatment.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8370(2021).</li>
<li>Marchi, N., Granata, T., Ghosh, C., Janigro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+dysfunction+and+epilepsy%3A+Pathophysiologic+role+and+therapeutic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier dysfunction and epilepsy: Pathophysiologic role and therapeutic approaches.</a> Epilepsia. 53 (11), 1877-1886 (2012).</li>
<li>Kiani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+disruption+following+seizures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neurology%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier disruption following seizures.</a> Nature Reviews. Neurology. 19 (4), 2023(2023).</li>
<li>Knowland, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+recruitment+of+transcellular+and+paracellular+pathways+underlies+blood-brain+barrier+breakdown+in+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke.</a> Neuron. 82 (3), 603-617 (2014).</li>
<li>Okada, T., Suzuki, H., Travis, Z. D., Zhang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stroke-induced+blood-brain+barrier+disruption%3A+Current+progress+of+inspection+technique%2C+mechanism%2C+and+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">The stroke-induced blood-brain barrier disruption: Current progress of inspection technique, mechanism, and therapeutic target.</a> Current Neuropharmacology. 18 (12), 1187-1212 (2020).</li>
<li>Gireud-Goss, M., Mack, A. F., Mccullough, L. D., Urayama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+amyloid+angiopathy+and+blood-brain+barrier+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Cerebral amyloid angiopathy and blood-brain barrier dysfunction.</a> Neuroscientist. 27 (6), 668-684 (2021).</li>
<li>Mesentier-Louro, L. A., Suhy, N., Broekaart, D., Bula, M., Pereira, A. C., Blanchard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+blood-brain+barrier+using+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Modeling the blood-brain barrier using human-induced pluripotent stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 2683, 135-151 (2023).</li>
<li>Qian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+blood-brain+barrier+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells.</a> Science Advances. 3 (11), e1701679(2017).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+endothelial+cells+via+temporal+modulation+of+etv2+with+modified+mrna%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Robust differentiation of human pluripotent stem cells into endothelial cells via temporal modulation of etv2 with modified mrna.</a> Science Advances. 6 (30), eaba7606(2020).</li>
<li>Patsch, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+vascular+endothelial+and+smooth+muscle+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+es+and+ips+cells+by+dual+inhibition+of+smad+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human es and ips cells by dual inhibition of smad signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li>
<li>Tcw, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+platform+for+astrocyte+differentiation+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">An efficient platform for astrocyte differentiation from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 9 (2), 600-614 (2017).</li>
<li>Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier+in+health+and+chronic+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders.</a> Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).</li>
<li>Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier in health and disease.</a> Annals of Neurology. 72 (5), 648-672 (2012).</li>
<li>Cecchelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+of+the+blood-brain+barrier+in+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 6 (8), 650-661 (2007).</li>
<li>Helms, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier%3A+An+overview+of+commonly+used+brain+endothelial+cell+culture+models+and+guidelines+for+their+use%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).</li>
<li>Erickson, M. A., Wilson, M. L., Banks, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+modeling+of+blood-brain+barrier+and+interface+functions+in+neuroimmune+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">In vitro modeling of blood-brain barrier and interface functions in neuroimmune communication.</a> Fluids Barriers CNS. 17 (1), 26(2020).</li>
<li>Musafargani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+brain+barrier%3A+A+tissue+engineered+microfluidic+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Blood brain barrier: A tissue engineered microfluidic chip.</a> Journal of Neuroscience Methods. 331, 108525(2020).</li>
<li>Hajal, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+human+blood-brain+barrier+microfluidic+model+for+vascular+permeability+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Engineered human blood-brain barrier microfluidic model for vascular permeability analyses.</a> Nature Protocols. 17 (1), 95-128 (2022).</li>
<li>Oddo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+microfluidic+blood-brain+barrier+%28bbb%29+models%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advances in microfluidic blood-brain barrier (bbb) models.</a> Trends in Biotechnology. 37 (12), 1295-1314 (2019).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

血脑屏障功能障碍是多种神经系统疾病的共病因素，且可能作为病因或加重因素7,40,41然而，几乎不可能在患有神经血管疾病的人类中研究血脑屏障功能障碍和破坏背后的分子与细胞生物学机制。本方案中介绍的可诱导血脑屏障（iBBB）提供了一种 体外 可重现血脑屏障（BBB）关键细胞相互作用的系统，包括血管管腔形成以及星形胶质细胞终足与血管系统的定位。该体外血脑屏障模型（iBBB）可用于研究BBB功能障碍各个阶段所涉及的分子通路，并可模拟神经血管疾病的表型，如脑淀粉样血管病中出现的淀粉样-β蛋白聚集。
iBBB 的构建过程较为直接，但 iBBB 的质量在很大程度上取决于所用 iPSC 分化细胞的质量。尽管 iBBB 可提供一种多细胞微环境，促进各组分细胞的成熟，但在包封前每种细胞类型都必须经过正确的定向分化。对每种分化细胞进行质量检测至关重要，应通过对单细胞培养物进行细胞类型特异性标志物的免疫...

血脑屏障（BBB）是一个关键的微血管网络，将中枢神经系统（CNS）与外周系统分隔开来，以维持神经元正常功能所需的理想环境。它在调控物质向中枢神经系统的流入和流出方面发挥着关键作用，包括维持代谢稳态1,2,3,4、清除代谢废物4,5,6，以及保护大脑免受病原体和毒素侵害7,8。
血脑屏障（BBB）的主要细胞类型是内皮细胞（EC）。内皮细胞起源于中胚层谱系，构成血管系统的管壁1,9。微血管内皮细胞之间形成紧密连接，显著降低其膜的通透性10,11,12,13,14，同时表达多种转运蛋白，以促进营养物质在中枢神经系统（CNS）内外的运输1,4,12,14。微血管内皮细胞周围环绕着周细胞（PCs）——一类调控微血管功能和稳态的壁细胞，在调节血脑屏障对分子和免疫细胞的通透性方面具有关键作用15,16,17。星形胶质细胞作为主要的胶质细胞类型，是构成血脑屏障的第三种细胞类型。星形胶质细胞的终足包裹在内皮-周细胞构成的血管管壁周围，而其胞体则延伸至脑实质中，从而在神经元与血管系统之间建立连接1。星形胶质细胞&#160;终足上定位于特定溶质和底物转运蛋白（例如水通道蛋白4 [AQP-4]），这些蛋白在血脑屏障功能中发挥关键作用18,19,20,21。
血脑屏障（BBB）对维持正常的大脑健康功能至关重要，BBB功能障碍已在多种神经系统疾病中被报道，包括阿尔茨海默病（AD）22,23,24,25、多发性硬化7,26,27,28、癫痫29,30和脑卒中31,32。人们日益认识到，脑血管异常在神经退行性病变中起着核心作用，会增加缺血性和出血性事件的易感性。例如，超过90%的AD患者伴有脑淀粉样血管病（CAA），其特征是淀粉样蛋白β（Aβ）在脑血管壁沉积。CAA会增加BBB通透性并降低BBB功能，使中枢神经系统（CNS）易受缺血、出血事件以及加速认知衰退的影响33。
我们最近开发了一种 体外 人源血脑屏障模型，源自&#160;患者来源的诱导多能干细胞，包含包裹在三维基质中的内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞（图1A）。iBBB 模型重现了生理相关的相互作用，包括血管管腔形成以及星形胶质细胞终足与血管系统的定位关系24我们应用iBBB模型来研究由APOE4介导的脑淀粉样血管病（CAA）的易感性（图1B。这使我们能够确定 APOE4 促进脑淀粉样血管病（CAA）的因果性细胞与分子机制，并利用这些发现开发出可减轻 CAA 病理并改善学习与记忆功能的治疗策略 体内 在 APOE4 小鼠中24在此，我们提供了一种利用人iPSCs重建血脑屏障（BBB）并建立CAA模型的详细实验方案及视频教程 体外.

<table><tbody><tr><td>6e10 淀粉样蛋白-&amp;beta; 抗体</td><td>Biolegend</td><td>SIG-39320</td><td>使用稀释比例为 1:1000</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>Peprotech</td><td>20-14E</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488、555、647 二抗</td><td>Invitrogen</td><td>Various</td><td>使用稀释比例为 1:1000</td></tr><tr><td>淀粉样蛋白-β 40 纤维</td><td>AnaSpec</td><td>AS-24235</td><td></td></tr><tr><td>淀粉样蛋白-β 42 纤维</td><td>AnaSpec</td><td>AS-20276</td><td></td></tr><tr><td>Aquaporin-4 抗体</td><td>Invitrogen</td><td>PA5-53234</td><td>使用稀释比例为 1:300</td></tr><tr><td>星形胶质细胞基础培养基及添加剂</td><td>ScienCell</td><td>1801</td><td></td></tr><tr><td>B-27 无血清添加剂</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BMP4</td><td>Peprotech</td><td>120-05ET</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cyamn Chemical</td><td>13112</td><td></td></tr><tr><td>含 GlutaMAX 的 DMEM/F12 培养基</td><td>Gibco</td><td>10565018</td><td></td></tr><tr><td>多西环素</td><td>Millipore-Sigma</td><td>D3072-1ML</td><td></td></tr><tr><td>碱性 FGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G 封片剂</td><td>VWR</td><td>100502-406</td><td></td></tr><tr><td>佛司可林</td><td>R&amp;D Systems</td><td>1099/10</td><td></td></tr><tr><td>GeltrexTM LDEV-Free hESC-合格低生长因子基底膜基质&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>A1413302</td><td></td></tr><tr><td>玻璃底 48 孔培养皿</td><td>Mattek Corporation</td><td>P48G-1.5-6-F</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 添加剂</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>人内皮细胞无血清培养基</td><td>Gibco</td><td>11111044</td><td></td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Tocris</td><td>6053</td><td></td></tr><tr><td>最低必需培养基非必需氨基酸溶液（MEM-NEAA）&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>N-2 添加剂</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>正常驴血清</td><td>Millipore-Sigma</td><td>S30-100mL</td><td>使用与二抗宿主匹配的血清</td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-BB</td><td>Peprotech</td><td>100-14B</td><td></td></tr><tr><td>PDGFRB（血小板源性生长因子受体β）抗体</td><td>R&amp;D Systems</td><td>AF385</td><td>使用稀释比例为 1:500</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Pecam1（血小板内皮细胞黏附分子1）抗体</td><td>R&amp;D Systems</td><td>AF806</td><td>使用稀释比例为 1:500</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PiggyBac 质粒（PB_iETV2_P2A_GFP_Puro）</td><td>AddGene</td><td>&amp;nbsp;目录号 #168805</td><td></td></tr><tr><td>S100B 抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2532-100uL</td><td>使用稀释比例为 1:500</td></tr><tr><td>SB43152</td><td>Reprocell</td><td>04-0010</td><td></td></tr><tr><td>硫黄素 T</td><td>Chem Impex</td><td>22870</td><td>使用浓度为 25 µM</td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-250mL</td><td></td></tr><tr><td>VE-钙黏蛋白（CD144）抗体</td><td>R&amp;D systems</td><td>AF938</td><td>使用稀释比例为 1:500</td></tr><tr><td>VEGF-A</td><td>Peprotech</td><td>100-20</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>R&amp;D Systems</td><td>1254/10</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1</td><td>Invitrogen</td><td>MA3-39100-A488</td><td>稀释比例 = 1:500</td></tr></tbody></table>

血脑屏障的重建 体外 用于建模及治疗性靶向神经系统疾病

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

血脑屏障（BBB）是中枢神经系统（CNS）的关键生理结构，负责维持营养物质、清除代谢废物并保护大脑免受病原体侵袭。BBB固有的屏障特性为治疗神经系统疾病的药物向CNS递送带来了挑战。BBB功能受损与多种神经系统疾病相关。脑淀粉样血管病（CAA）表现为淀粉样物质在脑血管系统的沉积，导致BBB功能受损，大多数阿尔茨海默病（AD）病例中均伴有CAA，提示BBB功能障碍或破坏可能参与了神经退行性病变的发生。由于难以获取人源BBB组织，目前对维持BBB正常功能及导致其退变的机制仍不明确。为克服这些局限，我们开发了一种源自人多能干细胞的BBB模型（iBBB），该模型在三维基质中整合了内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞。iBBB可自发组装，重现BBB的解剖结构和细胞间相互作用。在iBBB中接种淀粉样蛋白可模拟CAA的关键特征。此外，iBBB提供了一个灵活的平台，可用于调控与脑血管疾病和神经退行性病变相关的遗传与环境因素，从而研究遗传背景和生活方式如何影响疾病风险。最后，iBBB可用于药物筛选和药物化学研究，以优化治疗策略。&#160;递送至中枢神经系统。在本方案中，我们描述了由人多能干细胞分化而来的三种细胞类型（内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞）的分化方法，如何将这些分化后的细胞组装成诱导型血脑屏障（iBBB），以及如何建立淀粉样蛋白血管病（CAA）模型 体外 使用外源性淀粉样蛋白。该模型克服了研究活体人脑组织的难题，提供了一个兼具生物学保真度和实验灵活性的系统，能够探究人血脑屏障（BBB）及其在神经退行性变中的作用。

形态正常的iBBB会凝固成一个半透明的圆盘状结构（图3A）。iBBB在培养数天后从最初接种的表面脱落是正常现象，虽无法避免，但只要在更换培养基时小心操作，避免意外吸走iBBB，便不会对其正常形成造成严重影响。接种24小时后，可在明场显微镜下观察到分布均匀的单个细胞（图3B）。培养两周后，可能观察到更明显的结构，但其细节仍难以清晰分辨（图3C）。
iBBB的质量高度依赖于输入细胞分化质量。我们强烈建议将部分剩余细胞接种于二维单层培养体系中，进行固定并染色检测细胞类型特异性标志物。由超过70%表达PECAM1或VE-cadherin的内皮细胞（图2A）、超过95%表达PDGFRB的周细胞（图2B）以及超过95%表达S100B和CD44的星形胶质细胞（...

血脑屏障（BBB）在维持稳定且健康的脑环境方面起着至关重要的作用。BBB功能障碍与多种神经系统疾病相关。我们开发了一种源自干细胞的三维血脑屏障模型，用于研究脑血管病理、血脑屏障完整性，以及遗传因素和疾病如何改变血脑屏障。

血脑屏障（BBB）是中枢神经系统（CNS）的关键生理结构，负责维持营养物质、清除代谢废物并提供保护……

我们的目标是确定介导阿尔茨海默病发病机制的分子和细胞机制，以发现潜在的治疗和诊断机会。目前，参与阿尔茨海默病发生与发展的分子通路和机制仍不清楚。这主要是因为小鼠模型及其他体外阿尔茨海默病模型无法重现对疾病发展至关重要的独特人类生物学特征。我们开发了一种体外血脑屏障模型，可用于研究与阿尔茨海默病、痴呆及其他神经退行性疾病相关的脑血管病理。该模型已被用于证明，阿尔茨海默病最强的风险因子 APOE4 通过部分寄生虫特异性通路，增加致病性淀粉样蛋白的累积。利用诱导性多能干细胞，我们可以在体外构建人类脑组织，用于疾病病理机制的研究以及药物筛选。这种体外血脑屏障模型可实现个性化的治疗和诊断方法。我们的三维体外血脑屏障模型能够展示具有生理相关性的相互作用，包括血管管腔的形成以及星形胶质细胞终足与脉管系统的定位关系。该模型还能够模拟与疾病相关的表型，包括淀粉样蛋白病理变化。最后，利用患者来源的诱导性多能干细胞可以研究任何特定的遗传背景。通过体外血脑屏障模型，我们发现了介导病理性脑血管淀粉样蛋白积累的通路。这促使我们探索能够在老年 APOE4 小鼠中逆转该病理变化的治疗策略，目前我们正在对此进行后续研究。首先准备用于构建诱导性血脑屏障（iBBB）模型的已分化内皮细胞、寄生虫和星形胶质细胞。吸除已分化内皮细胞的培养基后，用PBS洗涤细胞一次，然后向洗涤后的细胞中加入蛋白酶胶原酶混合液，在37摄氏度条件下消化5分钟。将含有解离细胞的蛋白酶胶原酶混合液转移至含有hECSR的锥形管中，保持混合液与hECSR的体积比为1:3。然后在300 G条件下离心细胞3分钟，吸除上清液，再将所得细胞沉淀重悬于hECSR中。在37摄氏度下用蛋白酶胶原酶混合液消化分化后的寄生虫5分钟。在锥形管中加入适量N2B27，将含有消化后细胞的蛋白酶胶原酶混合液转移至其中，保持混合液与N2B27的体积比为1:3。在300 ×g条件下离心细胞3分钟。吸除上清液后，将细胞沉淀重悬于N2B27培养基中。使用蛋白酶胶原酶混合液在37°C条件下消化分化后的星形胶质细胞5分钟。将蛋白酶胶原酶混合液中解离的细胞转移至含有完全星形胶质细胞培养基的锥形管中，混合液与培养基的体积比为1:3。在300 G条件下离心3分钟后，吸除上清液，并用完全星形胶质细胞培养基重悬细胞沉淀。此时细胞已准备好用于构建iBBB。使用解离的人多能干细胞来源的内皮细胞、寄生虫和星形胶质细胞组装人多能干细胞来源的血脑屏障（iBBB）。将这三种细胞在锥形管中混合，细胞数量应比计算值多出10%，以补偿移液误差。以300 ×g离心3分钟，沉淀细胞混合物。吸弃上清液，保留含有约50微升培养基的细胞沉淀。使用P200移液器，用残留的培养基轻柔重悬细胞沉淀，制成单细胞悬液。将含有细胞悬液的离心管置于冰上，并根据所需iBBB的数量加入适量的还原型GF基底膜基质。将细胞均匀混合，同时避免引入任何气泡。用移液器将50微升终末的细胞基质混合物加入48孔或96孔玻璃底培养皿的孔中，并使其均匀分布于皿底。将培养皿置于37摄氏度孵育30至40分钟，使基质聚合并包埋细胞。最后，向孔中加入 500 微升添加了补充物的星形胶质细胞培养基，并将诱导型血脑屏障（iBBB）维持在培养状态。对于 96 孔板，向每孔加入 100 至 150 微升培养基，直至其充分发育可用于后续检测，通常需要两周时间。在明场显微镜下，结构正常的诱导型血脑屏障呈现为一个固化的单片状半透明圆盘。24小时后，观察到均匀分布的单个细胞。两周后，出现了更为明显的结构，尽管仍难以界定。

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科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

体外血脑屏障重建，模拟和治疗神经系统疾病

本方法描述了如何从小鼠脑组织中分离并永生化微血管内皮细胞。我们介绍了一套从脑组织匀浆、消化处理、细胞接种到细胞永生化的逐步实验方案。通常需要约五周时间获得均一的、可永生化的微血管内皮细胞系。...

建立永生化的小鼠脑微血管内皮细胞系作为 体外 血脑屏障模型

血脑屏障的破坏有助于某些药物向脑部的递送。通过动脉内给予甘露醇可使血管周围细胞收缩，从而在物理上破坏该屏障。...

血脑屏障破坏的大鼠模型以实现靶向性神经血管治疗

建立人源血脑屏障（BBB）模型有助于研究与BBB功能障碍相关脑部疾病。本文介绍一种改良的接触式BBB模型制备技术，可在多孔膜的两侧分别共培养人源星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞。...

改进的人源细胞接触共培养血脑屏障模型的制备方法

本研究的目的是验证一种方法的可重复性 体外...

建立一个 体外 大鼠血脑屏障（BBB）模型：重点关注BBB的不可渗透性与受体介导的转运

维持血脑屏障的完整性对于中枢神经系统的稳态至关重要。本方案描述了 体外...

体外 检测血脑屏障网状血管形成与破坏的实验方法

本方案的目的是提供一种优化的流程，用于建立一个 体外 基于原代猪脑微血管内皮细胞（pBECs）的血脑屏障（BBB）模型。该模型具有高度可重复性和紧密性，适用于药物发现中的转运及细胞内 trafficking 研究。...

改进的建立方法 体外 基于猪脑内皮细胞的血脑屏障模型

本文介绍了一种在细胞内构建血脑屏障-微型脑聚酯多孔膜培养插入系统的方法，用于评估生物分子或感染性物质穿过人血脑屏障的转运过程及其对邻近脑细胞的生理影响。...

一种用于研究病原体或药物穿越血脑屏障及其与大脑相互作用的人源性血脑界面模型

药物靶向中枢神经系统肿瘤是一项重大挑战。本文介绍了一种利用小鼠和/或人类细胞构建体外血脑肿瘤屏障模型的实验方案，并探讨了该模型在预测体内中枢神经系统肿瘤靶向性方面的相关性。...

利用培养皿中的血-脑肿瘤屏障预测体内载荷递送效果

血脑屏障（BBB）是一种多细胞构成的神经血管功能单元，可严格调控大脑内环境的稳态。通过结合人诱导多能干细胞（iPSCs）与器官芯片技术，我们构建了一种可用于疾病建模及中枢神经系统药物穿透能力预测的个体化血脑屏障芯片。本文详细描述了该血脑屏障芯片的制备与操作流程。...

人源iPSC衍生的血脑屏障芯片的制备

本方案描述了一种建立人血脑屏障（BBB）的方法 体外...

一种模拟人类血脑屏障的三重共培养细胞系统

此处，我们描述一种基于原代人脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞的三细胞共培养血脑屏障模型的建立方法。该多细胞模型适用于研究缺血性脑卒中期间神经血管单元的功能障碍 体外...

用于研究缺血性中风的人源三重原代细胞共培养血脑屏障模型 体外

了解利用诱导多能干细胞构建三维体外血脑屏障模型的方法，用于研究阿尔茨海默病相关的脑血管病理机制。该模型可模拟人类血脑屏障功能，支持个性化治疗策略的开发。

血脑屏障的重建体外用于建模及治疗性靶向神经系统疾病

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