Name: 通过跨内皮电阻检测对bEnd.3血管内皮细胞进行屏障功能完整性记录 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-29T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 学习使用跨内皮电阻检测技术评估bEnd.3细胞构建的血脑屏障完整性。该方法通过测量TER值监测屏障形成，为中枢神经系统药物筛选提供可靠的体外模型。

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感谢国家自然科学基金（82274207 和 82104533）、宁夏回族自治区重点研发计划（2023BEG02012）以及成都中医药大学杏林学者科研提升项目（XKTD2022013）的经费支持。

注意：将小鼠脑源性内皮细胞系3（bEnd.3）接种至24孔板的培养小室中，以构建一个简单的 体外 在特定培养基条件下建立的血脑屏障模型。使用TEER仪测量正常细胞和缺氧细胞的TEER值。图1 和 图2).
1. 溶液配制
<ol>
	<li>准备含有 FBS（10%，v/v）、100 U/mL 青霉素和 10 mg/mL 链霉素的 DMEM 细胞培养基（参见材料表）。</li>
	<li>将 1.30 mg CoCl2 加入 100 µL DMSO 溶液中，配制 100 mM CoCl2 储存液。 
	注意：上述所有溶液均在 4 °C 条件下保存，使用前根据所需浓度进行稀释。</li>
	<li>将 2 mL 次氯酸钠溶液加入 38 mL 双蒸水中，配制 5% 次氯酸钠溶液（v/v）。</li>
</ol>
2. 细胞培养与细胞活力
<ol>
	<li>将 bEnd.3 细胞以 1 × 106 个细胞/mL 的密度接种于含 DMEM 培养基的培养皿（100 mm）中，总体积为 1 mL，在 37 °C、5% CO2 的湿化环境中培养。每 2 至 3 天更换一次培养基，每周传代 2 次。</li>
	<li>当 bEnd.3 细胞生长至 80% 汇合度时，用 0.25% 胰蛋白酶消化 30 秒。</li>
	<li>使用细胞计数仪在 DMEM 培养基中制备浓度为 7 × 104 个细胞/mL 的 bEnd.3 细胞悬液。随后，将 100 µL 细胞悬液接种至 96 孔板中。</li>
	<li>待细胞贴壁后，用 PBS 清洗细胞，并在相同条件下加入 100 µL 培养基或含不同浓度 CoCl2 的药物培养基（100 µM、200 µM、300 µM、400 µM、500 µM）培养 24 小时。弃去孔内培养基，用 PBS 清洗后，每孔加入 100 µL CCK-8 溶液。 
	注意：加样时避免产生气泡，以免影响光密度（OD）值的测定。</li>
	<li>将 96 孔板置于 37 °C 环境中孵育 1 小时，然后使用酶标仪在 450 nm 波长下测定各孔的吸光度。 
	注意：为避免组内差异，检测前应将孔板冷却至室温。</li>
	<li>根据公式 [OD药物组 - OD空白组] / [OD对照组 - OD空白组] × 100% 计算不同浓度 CoCl2 诱导的细胞活力。选择与对照组相比细胞活力显著降低的 CoCl2 浓度用于后续实验。</li>
</ol>
3. 模型组装
<ol>
	<li>用 PBS 清洗 24 孔板的上室。 
	注意：细胞在 24 孔板上室的底部生长并融合，细胞间逐渐形成紧密连接，发挥屏障作用。如果某些研究中使用的内皮细胞无法在 PET 膜上独立形成完整的屏障，则需在接种细胞前用 IV 型胶原溶液包被膜。</li>
	<li>将 bEnd.3 细胞与 DMEM 培养基混合，使用涡旋混合器制备成密度为 5 × 105 个细胞/mL 的细胞悬液。然后，取 200 µL bEnd.3 细胞悬液接种于 24 孔板上室的 PET 膜上（0.33 cm2，0.4 µm 膜孔径）。 
	注意：本方案的预实验发现，使用传代 5 至 10 代的 bEnd.3 细胞进行实验，结果无显著差异。为确保建模成功率，请参考本方案提供的细胞数量范围。</li>
	<li>向 24 孔板的下室加入 1200 µL 完全培养基，以确保上下室的渗透压趋于稳定。不同类型的板加入的培养基体积可能有所不同；请确保上下室的液面齐平。</li>
	<li>每天定时更换上室和下室的培养基，并同时监测电阻值。
	<ol>
		<li>更换培养基时，人工操作或过度移动可能损伤细胞层的完整性。为避免上述情况，在换液过程中应使用负压移液器从一侧缓慢吸出旧培养基，并沿孔壁缓慢加入新培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 跨上皮电阻（TEER）的测量
<ol>
	<li>实验开始前，将电阻器、5% 次氯酸钠溶液、75% 乙醇和双蒸水溶液置于超净工作台内，开启紫外照射 30 分钟，以消除残留的细菌和病原体。</li>
	<li>将电极置于 5% 次氯酸钠溶液中缓慢振荡 3 至 5 秒，随后浸入 75% 乙醇中 15 分钟。最后转移至 PBS 或双蒸水溶液中，待用。</li>
	<li>打开细胞电阻仪背面的电源开关，根据表 1中的参数点击选择培养板，并选择24 孔板。</li>
	<li>根据操作需求，选择合适的检测序列。本研究中我们选择了A1程序。</li>
	<li>将一个 kΩ 电阻插入右侧插孔以校准仪器。若校准结果为 1000 ± 5 Ω，则认为仪器精度正常。
	<ol>
		<li>若校准结果不为 1000 Ω，点击主界面上的模式单位选择OHMS，然后点击主屏幕上的校准按钮重新校准仪器。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>拔出右侧的 kΩ 电阻，将测量电极更换为连接导线。</li>
	<li>将电极垂直插入未接种细胞的 24 孔板中，并点击仪器主屏幕上的空白处理。未接种细胞的培养板电阻背景值约为 134.4 Ω。</li>
	<li>将两个电极分别插入已接种细胞的培养板的上室和下室，使细胞层位于两者之间，然后轻踩脚踏开关记录电阻值。
	<ol>
		<li>确保电极不接触上室中的细胞以及下室的底部。电极在溶液中的浸泡时间对电阻值无影响，只需确保电极处于正确位置即可。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过将电阻值（欧姆）乘以上室的底面积（cm2），计算得到 TEER 值（Ωcm2），公式如下： 
	TEER (Ωcm2) = 电阻 (Ω) × Sinsert (cm2)</li>
	<li>绘制 TEER-时间（天）折线图。当电阻值随时间（以天计）不再持续上升时，可认为细胞已形成屏障。 
	注意：通过本研究所述参数培养 bEnd.3 细胞约 6 天，可成功构建 bEnd.3 细胞的单层血脑屏障（BBB）模型。在 6 天内，bEnd.3 细胞单层模型的 TEER 值范围为 16.49 ± 2.12 Ωcm2 至 27.59 ± 1.50 Ωcm2（n=8，均值 ± 标准差）。</li>
</ol>
5. 屏障破坏与统计分析
<ol>
	<li>根据TEER-时间曲线，选择具有屏障功能的孔，并将其分为对照组和CoCl₂组。2 组（n = 4）。</li>
	<li>加入培养基以及含有 300 µM CoCl 的培养基2 (200 µL) 加入对照组和 CoCl2 分别置于上室。</li>
	<li>检测对照组和 CoCl₂ 处理组的电阻值2 在37 °C孵育12 h和24 h后，按照步骤4所述方法进行分组。</li>
	<li>使用商业软件绘制细胞屏障在有无 300 µM CoCl 条件下培养时 TEER 值的变化趋势2.</li>
	<li>使用统计分析软件分析CoCl2处理组细胞与正常细胞之间电阻值的差异（n=4，*p<0.05，**p<0.01）。&#60;0.05，**p&#60;0.01，***p&#60;0.001).</li>
</ol>

Transendothelial Resistance Measurement to Assess Cell Barrier Integrity

<ol><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLEC14A+deficiency+exacerbates+neuronal+loss+by+increasing+blood-brain+barrier+permeability+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">CLEC14A deficiency exacerbates neuronal loss by increasing blood-brain barrier permeability and inflammation.</a> J Neuroinflammation. 17 (1), 48(2020).</li>
<li>Bagchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vitro+blood-brain+barrier+models+for+drug+screening+and+permeation+studies%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Des+Devel+Ther%22%5BJournal%5D)">In-vitro blood-brain barrier models for drug screening and permeation studies: an overview.</a> Drug Des Devel Ther. 13, 3591-3605 (2019).</li>
<li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier.</a> Cold Spring Harb perspect Biol. 7 (1), 020412(2015).</li>
<li>Profaci, C. P., Munji, R. N., Pulido, R. S., Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier+in+health+and+disease%3A+Important+unanswered+questions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier in health and disease: Important unanswered questions.</a> J Exp Med. 217 (4), 20190062(2020).</li>
<li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier delivery.</a> Drug Discov Today. 12 (1-2), 54-56 (2007).</li>
<li>Eigenmann, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+four+immortalized+human+brain+capillary+endothelial+cell+lines%2C+hCMEC%2FD3%2C+hBMEC%2C+TY10%2C+and+BB19%2C+and+optimization+of+culture+conditions%2C+for+an+in+vitro+blood-brain+barrier+model+for+drug+permeability+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies.</a> Fluids Barriers CNS. 10 (1), 33(2013).</li>
<li>Gajdács, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+concept+of+an+ideal+antibiotic%3A+Implications+for+drug+design%5BTitle%5D)+AND+%22Molecule%22%5BJournal%5D)">The concept of an ideal antibiotic: Implications for drug design.</a> Molecule. 24 (5), 892(2019).</li>
<li>Stanimirovic, D. B., Bani-Yaghoub, M., Perkins, M., Haqqani, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+models%3A+in+vitro+to+in+vivo+translation+in+preclinical+development+of+CNS-targeting+biotherapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier models: in vitro to in vivo translation in preclinical development of CNS-targeting biotherapeutics.</a> Expert Opin Drug Discov. 10 (2), 141-155 (2015).</li>
<li>Helms, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier%3A+An+overview+of+commonly+used+brain+endothelial+cell+culture+models+and+guidelines+for+their+use%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 36 (5), 862-890 (2016).</li>
<li>Özyurt, M. G., Bayir, E., DoĞan, Ş, ÖztÜrk, Ş, Şendemİr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coculture+model+of+blood-brain+barrier+on+electrospun+nanofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Turk+J+Biol%22%5BJournal%5D)">Coculture model of blood-brain barrier on electrospun nanofibers.</a> Turk J Biol. 44 (4), 121-132 (2020).</li>
<li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+validation+of+the+simplified+in+vitro+3D+Co-culture+based+BBB+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Functional validation of the simplified in vitro 3D Co-culture based BBB model.</a> Biochem Biophys Res Commun. 625, 128-133 (2022).</li>
<li>Aazmi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularizing+the+brain+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Vascularizing the brain in vitro.</a> iScience. 25 (4), 104110(2022).</li>
<li>Burkhart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+brain+capillary+endothelial+cells+in+primary+culture+with+defined+blood-brain+barrier+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Transfection of brain capillary endothelial cells in primary culture with defined blood-brain barrier properties.</a> Fluids Barriers CNS. 12, 19(2015).</li>
<li>Campisi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+self-organized+microvascular+model+of+the+human+blood-brain+barrier+with+endothelial+cells%2C+pericytes+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes.</a> Biomaterials. 180, 117-129 (2018).</li>
<li>Peng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammatory+in+vitro+cell+culture+models+and+the+potential+applications+for+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammatory in vitro cell culture models and the potential applications for neurological disorders.</a> Front Pharmacol. 12, 671734(2021).</li>
<li>Secker, P. F., Schlichenmaier, N., Beilmann, M., Deschl, U., Dietrich, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+transepithelial+transport+measurements+to+detect+nephrotoxicity+in+vitro+using+the+RPTEC%2FTERT1+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Functional transepithelial transport measurements to detect nephrotoxicity in vitro using the RPTEC/TERT1 cell line.</a> Arch Toxicol. 93 (7), 1965-1978 (2019).</li>
<li>Nazari, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+TEER+measurements+of+biological+barriers+in+microphysiological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Advances in TEER measurements of biological barriers in microphysiological systems.</a> Biosens Bioelectron. 234, 115355(2023).</li>
<li>Nicolas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+transepithelial+electrical+resistance+%28TEER%29+measurements+on+perfused+membrane-free+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">High throughput transepithelial electrical resistance (TEER) measurements on perfused membrane-free epithelia.</a> Lab Chip. 21 (9), 1676-1685 (2021).</li>
<li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+alleviates+hypoxia-induced+blood-brain+barrier+injury+via+regulation+of+CLDN5+%28claudin+5%29%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagy alleviates hypoxia-induced blood-brain barrier injury via regulation of CLDN5 (claudin 5).</a> Autophagy. 17 (10), 3048-3067 (2021).</li>
<li>Feng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoA%2FROCK-2+pathway+inhibition+and+tight+junction+protein+upregulation+by+catalpol+suppresses+lipopolysaccaride-induced+disruption+of+blood-brain+barrier+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">RhoA/ROCK-2 pathway inhibition and tight junction protein upregulation by catalpol suppresses lipopolysaccaride-induced disruption of blood-brain barrier permeability.</a> Molecules. 23 (9), (2018).</li>
<li>Sulhan, S., Lyon, K. A., Shapiro, L. A., Huang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation+and+blood-brain+barrier+disruption+following+traumatic+brain+injury%3A+Pathophysiology+and+potential+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation and blood-brain barrier disruption following traumatic brain injury: Pathophysiology and potential therapeutic targets.</a> J Neurosci Res. 98 (1), 19-28 (2020).</li>
<li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notoginsenoside+R1+intervenes+degradation+and+redistribution+of+tight+junctions+to+ameliorate+blood-brain+barrier+permeability+by+Caveolin-1%2FMMP2%2F9+pathway+after+acute+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Notoginsenoside R1 intervenes degradation and redistribution of tight junctions to ameliorate blood-brain barrier permeability by Caveolin-1/MMP2/9 pathway after acute ischemic stroke.</a> Phytomedicine. 90, 153660(2021).</li>
<li>Hou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salidroside+intensifies+mitochondrial+function+of+CoCl2-damaged+HT22+cells+by+stimulating+PI3K-AKT-MAPK+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway.</a> Phytomedicine. 109, 154568(2023).</li>
<li>Muñoz-Sánchez, J., Chánez-Cárdenas, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+cobalt+chloride+as+a+chemical+hypoxia+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Toxicol%22%5BJournal%5D)">The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model.</a> J Appl Toxicol. 39 (4), 556-570 (2019).</li>
<li>Jiang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salidroside+attenuates+high+altitude+hypobaric+hypoxia-induced+brain+injury+in+mice+via+inhibiting+NF-%CE%BAB%2FNLRP3+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Salidroside attenuates high altitude hypobaric hypoxia-induced brain injury in mice via inhibiting NF-κB/NLRP3 pathway.</a> Eur J Pharmacol. 925, 175015(2022).</li>
<li>Xie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodiola+crenulate+alleviates+hypobaric+hypoxia-induced+brain+injury+via+adjusting+NF-%CE%BAB%2FNLRP3-mediated+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Rhodiola crenulate alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury via adjusting NF-κB/NLRP3-mediated inflammation.</a> Phytomedicine. 103, 154240(2022).</li>
<li>Thiebaut de Schotten, M., Forkel, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergent+properties+of+the+connected+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The emergent properties of the connected brain.</a> Science. 378 (6619), 505-510 (2022).</li>
<li>Tu, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimated+burden+of+stroke+in+China+in+2020%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Netw+Open%22%5BJournal%5D)">Estimated burden of stroke in China in 2020.</a> JAMA Netw Open. 6 (3), 231455(2023).</li>
<li>Alzheimers Dement. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease+facts+and+figures%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimers+Dement%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease facts and figures.</a> Alzheimers Dement. 17 (3), 327-406 (2021).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+promote+tPA-induced+brain+hemorrhage+via+cGAS+in+mice+with+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps promote tPA-induced brain hemorrhage via cGAS in mice with stroke.</a> Blood. 138 (1), 91-103 (2021).</li>
<li>Liu, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Cdk5+deficit+leads+to+the+development+of+spontaneous+epilepsy+through+CXCL1%2FCXCR2-mediated+reactive+astrogliosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Endothelial Cdk5 deficit leads to the development of spontaneous epilepsy through CXCL1/CXCR2-mediated reactive astrogliosis.</a> J Exp Med. 217 (1), 20180992(2020).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Sporadic+Alzheimer%27s+Disease+in+Human+Brain+Organoids+under+Serum+Exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci+%28Weinh%29%22%5BJournal%5D)">Modeling Sporadic Alzheimer's Disease in Human Brain Organoids under Serum Exposure.</a> Adv Sci (Weinh). 8 (18), 2101462(2021).</li>
<li>Qi, D., Lin, H., Hu, B., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+on+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier+%28BBB%29+based+on+hCMEC%2FD3+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">A review on in vitro model of the blood-brain barrier (BBB) based on hCMEC/D3 cells.</a> J Control Release. 358, 78-97 (2023).</li>
<li>Artus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt%2Fplanar+cell+polarity+signaling+pathway+contributes+to+the+integrity+of+tight+junctions+in+brain+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).</li>
<li>Sivandzade, F., Cucullo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vitro+blood-brain+barrier+modeling%3A+A+review+of+modern+and+fast-advancing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">In-vitro blood-brain barrier modeling: A review of modern and fast-advancing technologies.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 38 (10), 1667-1681 (2018).</li>
<li>Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocultures+of+primary+porcine+brain+capillary+endothelial+cells%3A+Still+a+functional+in+vitro+model+for+the+blood-brain-barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Monocultures of primary porcine brain capillary endothelial cells: Still a functional in vitro model for the blood-brain-barrier.</a> J Control Release. 285, 172-177 (2018).</li>
<li>Srinivasan, B., Kolli, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial%2Ftransendothelial+electrical+resistance+%28TEER%29+to+measure+the+integrity+of+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Blood-Brain+Barrier%22%5BJournal%5D)">Transepithelial/transendothelial electrical resistance (TEER) to measure the integrity of blood-brain barrier.</a> Blood-Brain Barrier. 142, 99-114 (2019).</li>
<li>Liang, Y., Yoon, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+sensors+for+blood-brain+barrier+%28BBB%29+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Sens+Actuators+Rep%22%5BJournal%5D)">In situ sensors for blood-brain barrier (BBB) on a chip.</a> Sens Actuators Rep. 3, 100031(2021).</li>
<li>Ozgür, B., Helms, H. C. C., Tornabene, E., Brodin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+increases+expression+of+selected+blood-brain+barrier+transporters+GLUT-1%2C+P-gp%2C+SLC7A5+and+TFRC%2C+while+maintaining+barrier+integrity%2C+in+brain+capillary+endothelial+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Hypoxia increases expression of selected blood-brain barrier transporters GLUT-1, P-gp, SLC7A5 and TFRC, while maintaining barrier integrity, in brain capillary endothelial monolayers.</a> Fluids Barriers CNS. 19 (1), (2022).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

大脑是人体最发达的器官之一，控制着一系列复杂的生理过程，包括记忆、认知、听觉、嗅觉和运动27。同时，大脑也是人体最复杂且最容易发生疾病的器官之一。由于空气污染、饮食不规律等因素，中枢神经系统疾病的发病率正逐年上升27,28,29。有趣的是，某些中枢神经系统疾病（如中风、癫痫和阿尔茨海默病（AD））的发生与发展，与血脑屏障（BBB）的发育密切相关30,31,32。因此，针对大多数脑功能障碍相关疾病治疗的一个基本思路，可能是开发新的疗法或药物以维持血脑屏障功能的稳态。然而，由于血脑屏障具有疏水性及其独特的溶质转运机制，大多数药物难以进入脑实质发挥其关键作用14,</s...

血脑屏障（BBB）是血液循环与神经组织之间的一种独特生物界面，由血管内皮细胞、周细胞、星形胶质细胞、神经元及其他细胞结构组成1。该屏障严格调控血液与大脑之间离子、化学物质和细胞的流动，这种稳态保护神经系统组织免受毒素和病原体侵害，同时维持脑神经的正常功能2,3。维持血脑屏障的完整性可有效预防中枢神经系统疾病的发生与发展，例如神经功能障碍、水肿和神经炎症4。然而，血脑屏障独特的生理特性阻止了超过98%的小分子药物和100%的大分子药物进入中枢神经系统5。因此，在中枢神经系统药物研发过程中，提高药物穿越血脑屏障的能力对于实现治疗效果至关重要6,7。尽管通过计算机模拟筛选底物已显著提高了候选药物穿透血脑屏障的可能性，但仍需要可靠且经济的体外（in vitro）和体内（in vivo）血脑屏障模型，以满足科学研究的需求8。
一种快速且经济的高通量药物筛选技术是体外模型9。为了阐明药物对血脑屏障（BBB）功能影响的基本过程及其在疾病发生与进展中的作用，已开发出一系列简化的体外BBB模型。目前常见的体外BBB模型包括单层、共培养、动态和微流控模型10,11,12，这些模型由血管内皮细胞与星形胶质细胞、周细胞或小胶质细胞构建而成13,14。尽管三维细胞培养更符合BBB的生理结构15，但其作为BBB药物筛选手段的应用仍受限于结构复杂和可重复性差的问题。相比之下，单层体外模型是研究BBB最常用的模型，特别适用于测定特定细胞中膜转运蛋白和紧密连接蛋白的表达。
跨膜电阻力（TEER）测量是一种用于评估和监测细胞层电阻，进而评价屏障细胞完整性和通透性的技术。通过将两个电极同时插入单层细胞两侧的培养基或缓冲液中，可测量穿过细胞致密层的交流电流或电学阻抗。16,17为了确定是否 体外 BBB 模型成功构建后，通常采用跨内皮电阻（TEER）的测量作为金标准18另一方面，通过测量药物作用后细胞层电阻的变化，可以准确预测药物对血脑屏障通透性的影响趋势。19例如，Feng 等人发现，梓醇（地黄的主要活性单体）可有效逆转脂多糖诱导的血脑屏障紧密连接蛋白的下调，并提高小鼠脑微血管内皮细胞层的跨内皮电阻（TEER）值。20.
神经炎症反应通常是血脑屏障（BBB）稳态失衡的主要原因21。通过缺氧处理诱导神经炎症损伤是破坏血脑屏障的主要方法，主要包括物理方法和化学试剂方法。前者主要利用三气培养箱调节细胞生长环境中的氧含量以模拟缺氧条件22，而后者则是通过向细胞培养基中人工添加如CoCl2等去氧试剂来实现23。若在血红素中用Fe2+取代Co2+，细胞将处于脱氧状态。若在催化基团中用Fe2+取代Co2+，则会抑制脯氨酸羟化酶和天冬氨酸羟化酶的活性，导致缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）的积累24。在持续缺氧条件下，细胞质中HIF-1α的去磷酸化会触发细胞死亡，并激活血管内皮生长因子，最终增加血管通透性。在以往的研究中25,26，已充分证明缺氧可显著降低内皮紧密连接蛋白的表达，从而增加血脑屏障的通透性。在本研究中，通过测定接种于24孔板中的bEnd.3细胞的跨内皮电阻-时间曲线，建立了一个简便的血脑屏障模型。利用该模型，我们表征了CoCl2干预后细胞TEER的变化，以构建可用于筛选血脑屏障保护药物的细胞模型。

<table><tbody><tr><td>24孔Transwell板</td><td>Corning (Corning 3470, 0.33 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;, 0.4 &amp;micro;m)</td><td>10522023</td><td></td></tr><tr><td>75%乙醇</td><td>成都 chron 化学品有限公司</td><td>2023052901</td><td></td></tr><tr><td>96孔板</td><td>广州捷博过滤科技有限公司</td><td>220412-078-B</td><td></td></tr><tr><td>bEnd.3细胞</td><td>湖南丰晖生物科技有限公司</td><td>CL0049</td><td></td></tr><tr><td>细胞计数试剂盒-8（CCK-8）</td><td>武汉博士德生物工程有限公司</td><td>BG0025</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养皿（100 mm）</td><td>浙江索尔法生命科学研究有限公司</td><td>1192022</td><td></td></tr><tr><td>氯化钴（CoCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma</td><td>15862</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>武汉博士德生物工程有限公司</td><td>PYG0040</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（1×）</td><td>Gibco ThermoFisher Scientific</td><td>8121587</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco ThermoFisher Scientific</td><td>2166090RP</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 软件</td><td>GraphPad Software</td><td>9.0.0(121)</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel（含IV型胶原）</td><td>MedChemexpress</td><td>HY-K6002</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax iD5</td><td></td></tr><tr><td>OriginPro 8 软件</td><td>OriginLab Corporation</td><td>v8.0724(B724)</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（100×）</td><td>武汉博士德生物工程有限公司</td><td>17C18B16</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS, 1×）</td><td>Gibco ThermoFisher Scientific</td><td>8120485</td><td></td></tr><tr><td>次氯酸钠</td><td>成都 chron 化学品有限公司</td><td>2022091501</td><td></td></tr><tr><td>跨膜电阻测量仪</td><td>World Precision Instruments LLC</td><td>VOM3 (verison 1.6)</td><td></td></tr></tbody></table>

bend.3 血管内皮细胞屏障功能完整性记录 通过 跨内皮电阻力检测

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

血脑屏障（BBB）是一种由微血管内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞构成的动态生理结构。通过协调调控有害物质的通透限制、营养物质的吸收以及脑内代谢产物的清除，血脑屏障在维持中枢神经系统稳态中起着至关重要的作用。构建 体外 血脑屏障模型是研究神经系统疾病病理生理机制和开发药理学治疗方法的重要工具。本研究描述了一种构建血脑屏障模型的实验流程。 体外 通过将 bEnd.3 细胞接种至 24 孔板的上室中构建单层血脑屏障细胞模型。为评估细胞屏障功能的完整性，采用常规上皮细胞伏特计记录正常细胞及 CoCl₂ 处理细胞的跨膜电阻。2实时监测缺氧诱导的细胞变化。我们预计上述实验将为创建有效方案提供有益思路 体外 血脑屏障模型及治疗中枢神经系统疾病药物

该方案允许根据跨内皮电阻仪设定的参数记录细胞电阻值的变化。经不同浓度CoCl处理的bEnd.3细胞（活细胞数量）的存活率2 通过CCK-8法进行检测。CoCl引起的细胞损伤更显著。2 细胞活力降低。我们发现 300 µM CoCl的2 具有显著的细胞毒性 体外，该浓度用于后续实验（图3A）。通过监测bEnd.3细胞的生长电阻变化，我们发现细胞的TEER值在第5天开始趋于稳定th 天。通过添加诱导缺氧损伤 300 µM CoCl2 到6孔板的上室th 天，在12小时和24小时时间点，TEER值相较于对照组均显著降低（图3B）。细胞屏障的功能可通过TEER值间接评估，TEER值下降表明细胞屏障的破坏。该细胞屏障的TEER值 300 µM CoCl2 与对照组相比，在孵育24小时后，该组数量下降。图3C</stro...

本方案描述了一种可靠且高效的 体外 血脑屏障模型。该方法采用小鼠脑血管内皮细胞bEnd.3，并测量跨膜电阻力。

bEnd.3 血管内皮细胞屏障功能完整性记录 通过 跨内皮电阻力检测

血脑屏障（BBB）是一种由微血管内皮细胞、星形胶质细胞和周细胞组成的动态生理结构。通过协调……

目前的研究通常采用通透性实验及相关蛋白表达来验证跨内皮电阻（TER）检测的准确性。体外单层细胞构成的血脑屏障模型在药物筛选中的应用效果较差，且使用更多种类的细胞会使其模型构建更加困难。本研究的方案相对简单，且无创操作使得细胞样本在完成TER检测后仍可用于其他实验。通过检测跨内皮电阻（TER）来评估细胞模型的通透性，可加速中枢神经系统疾病治疗和预防药物的筛选，从而提高新药研发的成功率。未来，我们将检测Transwell上室细胞中紧密连接蛋白的表达，以验证TER检测结果能够有效反映血脑屏障（BBB）屏障功能的完整性。首先，配制含有胎牛血清（FBS）、青霉素和链霉素的DMEM细胞培养基。此外，通过将1.30 mg氯化钴加入100 L DMSO中配制100 mM氯化钴储备液。接着，在含有DMEM培养基的100 mL培养皿中接种1 mL bEnd.3细胞，并于37 °C、5%二氧化碳的湿化气氛中培养。每两到三天更换一次培养基，每周传代培养细胞两次。当bEnd.3细胞生长至80%融合度时，用0.25%胰蛋白酶消化30秒。使用细胞计数器计数细胞，并制备浓度为每毫升 7 × 10⁴ 个细胞的细胞悬液。随后将 100 µL 该细胞悬液接种至 96 孔板中，用于细胞贴壁实验。然后用 PBS 洗涤细胞，并加入含有氯化钴的 100 µL 培养基。将细胞培养24小时。孵育结束后，移除培养基，并用PBS洗涤。接着，加入100 µL CCK-8溶液。将培养板在 37 °C 下孵育 1 小时。然后使用酶标仪在 450 nm 处测定吸光度。根据此公式计算氯化钴诱导的细胞活力。选择与对照组相比，细胞活力显著降低的浓度。采用CCK-8法分析不同浓度氯化钴处理的bEnd.3细胞的活力。结果表明，300 M 的氯化钴在体外表现出显著的细胞毒性。首先，用 PBS 清洗 24 孔板的上室。混合 bEnd。使用涡旋混合器将3细胞与DMEM培养基混匀制成悬液。然后取200 µL bEnd.3细胞悬液接种于24孔板上室聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜上。向培养板的下室中加入 1,200 L 完全培养基，以稳定上下室的渗透压。换液时，用负压移液器从一侧缓慢吸出旧培养基，并沿壁加入新培养基。测量 TEER 前，将电阻依次置于 5% 次氯酸钠溶液、75% 乙醇和双蒸水中，在超净台中进行处理。开启紫外照射30分钟，以消除残留的细菌和病原体。将电极置于5%次氯酸钠溶液中，缓慢振荡3至5秒，然后浸入75%乙醇中15分钟。最后，转移至 PBS 或双蒸水中，直至使用。接着打开细胞电阻仪背面的电源开关。点击选择培养板，选择 24 孔板。根据操作要求，选择合适的检测顺序。将一个千欧姆电阻插入右侧插孔以校准仪器。如果校准结果为 1,000 ± 5 欧姆，则认为仪器准确。如果没有，请在主界面点击模式单位，选择欧姆，然后点击校准。接着移除千欧姆电阻，使用连接导线将测量电极替换上去。将电极垂直放入仅含有培养基的24孔板中，然后点击仪器上的空白处理按钮。未接种细胞时，平板电阻的背景值应约为 134.4 欧姆。接下来，将两个电极分别插入接种了细胞的平板的上、下腔室中，使细胞层位于两个电极之间。轻踩脚踏开关，记录电阻值。确保电极不接触上室中的细胞以及下室的底部。通过将电阻值乘以上室的底面积来计算TEER值，计算方法如公式所示。绘制TEER随时间（天）变化的折线图。当电阻值不随时间增加时，表明细胞已形成屏障。bEnd.3细胞的电阻值随时间变化的曲线显示，细胞的TEER值在第5天开始趋于稳定。首先培养 bEnd.3 细胞，然后将培养孔分为对照组和氯化钴组。向对照组的上室中加入 200 µL 培养基，向氯化钴组的上室中加入含有 300 µM 氯化钴的培养基。将培养板在 37 °C 条件下孵育，并在孵育 12 小时和 24 小时时采用 TEER 法检测电阻值。使用商业软件绘制细胞屏障 TEER 值的变化趋势图。采用统计分析软件分析氯化钴处理组细胞与对照组细胞之间电阻值的差异。加入300 M氯化钴后，在12小时和24小时两个时间点，TEER值均较对照组显著下降。24小时后，300 M氯化钴组的TEER值较对照组进一步降低，表明氯化钴诱导的缺氧条件导致了细胞屏障的破坏。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

通过跨内皮电阻检测对bEnd.3血管内皮细胞进行屏障功能完整性记录

一种基于实时电阻抗技术测定癌细胞侵袭内皮细胞单层的方法

本视频展示了一种在体外评估小鼠脑微血管内皮细胞跨内皮电阻（TEER）的方法。较高的TEER值表明内皮细胞连接完整，而加入活化的T细胞后TEER值降低，反映出连接屏障的破坏。...

评估体外血脑屏障模型中的跨内皮细胞电阻

有机电化学晶体管与活细胞集成，用于监测胃肠道上皮屏障的离子流。本研究中，通过添加钙螯合剂EGTA（乙二醇双(β-氨基乙基醚)四乙酸）破坏紧密连接，从而引起离子流增加，并对此进行了测量。...

利用有机电化学晶体管感知屏障组织的破坏

本方案综述了电细胞基底阻抗传感技术，该方法用于记录和分析贴壁细胞的阻抗谱，以定量检测细胞黏附、增殖、运动性以及细胞对药理和毒性刺激的反应。重点强调内皮细胞通透性的检测以及细胞间和细胞-基底相互作用的评估。...

用于定量分析内皮细胞增殖、屏障功能及迁移活性的细胞电阻传感技术

一个 体外 利用阻抗谱技术构建血脑屏障模型：聚焦T细胞与内皮细胞的相互作用

本文介绍了一种集成电极的器官芯片装置的制备方法，用于直接定量跨内皮细胞电阻（TEER）。为验证该方法，利用该微流控装置模拟了血脑屏障，并对其屏障功能进行了监测。所提出的电极集成与直接TEER定量方法具有广泛的适用性。...

集成电极以直接量化跨内皮电阻的器官芯片系统的构建与验证

本文演示了如何搭建一种低成本的可编程输出频率伏安计，该设备可与市售的筷子式电极配合使用，用于跨上皮/内皮电阻的测量。...

一种使用自制可编程输出频率伏安表进行TEER测量的简便方法

本方案演示了一种 体外 内皮细胞转胞吞实验作为一种模型，通过检测人视网膜微血管内皮细胞在小窝介导的跨细胞转运过程中跨细胞运输辣根过氧化物酶的能力，评估内层血-视网膜屏障的通透性。...

内皮细胞转吞作用检测方法作为一种 体外 评估内层血-视网膜屏障通透性的模型

在此，我们演示了使用基于阻抗的生物传感器（ECIS 和 cellZscope）测量脑血管内皮屏障强度的技术。我们详细介绍了制备过程以及向系统中添加各种刺激物的方法和技术。 体外...

利用两种基于阻抗的生物传感器测量癌细胞和细胞因子刺激下脑血管内皮屏障完整性的变化

我们介绍一种从接受有创癫痫监测的患者中采集皮层脑电图信号以用于研究目的的方法。我们展示了如何使用BCI2000软件平台进行数据采集、信号处理和刺激呈现。具体而言，我们演示了SIGFRIED——一种基于BCI2000的实时功能性脑图谱绘制工具。...

记录人类颅内脑电图（ECoG）信号用于神经科学研究与实时功能性皮层定位

学习使用跨内皮电阻检测技术评估bEnd.3细胞构建的血脑屏障完整性。该方法通过测量TER值监测屏障形成，为中枢神经系统药物筛选提供可靠的体外模型。

bEnd.3 血管内皮细胞屏障功能完整性记录通过跨内皮电阻力检测

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