Name: 使用组织切碎器培养离体患者来源的神经胶质瘤类器官 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T13:35:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: 了解使用组织切碎器培养离体患者来源的神经胶质瘤类器官的方法。该技术可将制备时间缩短近70%，同时保持原始肿瘤特征，为药物和免疫治疗筛选提供更高效的模型。

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本研究由维尔茨堡大学跨学科临床研究中心（IZKF，项目编号 B-450）、巴伐利亚癌症研究中心（BZKF）资助，出版费用由维尔茨堡大学开放获取出版基金支持。我们感谢维尔茨堡大学医院神经外科系实验神经外科部门的 Dagmar Hemmerich 和 Siglinde Kühnel 提供的技术支持。图1使用&#160;www.biorender.com 制作。

所有患者均在中国台湾大学医院维尔茨堡分院神经外科接受治疗，并在符合《赫尔辛基宣言》要求且经维尔茨堡大学机构审查委员会批准（编号：#22/20-me）的前提下签署书面知情同意书。本研究获取了四名胶质母细胞瘤（GBM）患者和一名异柠檬酸脱氢酶突变型星形细胞瘤（CNS WHO 2级）患者（低级别胶质瘤，LGG）的肿瘤组织样本（表1），组织样本来自手术切除材料，并按照以下方案进行处理。使用组织切片机自动制备类器官的过程称为“切片法”（C），而在显微镜下通过两把手术刀手动切割组织的过程称为“手工法”（M）。从每个肿瘤样本中分离出六个大小相等的组织块（1–2 cm3），每个组织块再被均分为两半，并分别采用上述两种方法进行均质化处理。由于肿瘤内部存在前述的异质性，每位患者针对每种方法各制备一块6孔板，每孔中的类器官均来源于原发肿瘤的不同区域。两种操作均在层流洁净台内进行，所有使用器械均在使用前经过灭菌处理。该实验流程的总体示意图见图1。
1. 制备琼脂糖凝胶块（仅适用于C法，可选）
<ol>
	<li>向烧杯中加入 50 mL 磷酸盐缓冲液（PBS），放入一片琼脂糖（见材料表），充分混匀至悬浮。</li>
	<li>将混合物放入微波炉加热 30–40 秒，避免沸腾。随后冷却至 47 °C。</li>
	<li>将琼脂糖混合物倒入密封的圆柱形制模中，避免产生气泡。立即使用预冷（-20 °C）的夹具或将其置于干冰上 30 分钟进行冷却定型。</li>
</ol>
2. 肿瘤样本的处理
<ol>
	<li>准备一盒冰，以便在肿瘤组织从手术室转运至实验室的过程中保持其低温。</li>
	<li>将肿瘤组织（4-5 cm³）转移至含有25 mL Hibernate A（见材料表）的无菌50 mL离心管中，确保液体完全覆盖肿瘤组织，并将离心管放入冰盒中。</li>
	<li>在超净工作台内，将肿瘤组织连同Hibernate A一起转移至已灭菌的玻璃培养皿中。</li>
	<li>在显微镜观察下，使用手术刀和组织镊子仔细去除坏死组织并分离血管。坏死组织可通过出血区域呈现的棕褐色，或与邻近存活组织相比颜色更浅或更白的外观来识别。注意避免挤压或破坏组织。</li>
	<li>将肿瘤组织切成六块，每块大小约为1-2 cm3。将组织块分别放入预先加入3 mL H-GPSA培养基的塑料培养皿中（n = 6）（表2）22。将培养皿置于冰上。</li>
</ol>
3. 设置组织切片机
<ol>
	<li>按照制造商手册中所述方式放置刀片23。</li>
	<li>将切片厚度调整为 0.45–0.50 mm。将刀片力度设为中等。将载物台释放旋钮固定在 &#34;开始&#34; 模式。</li>
</ol>
4. 肿瘤组织块的处理
<ol>
	<li>使用切碎器处理肿瘤组织（C法）
	<ol>
		<li>将琼脂糖块切成 2 cm 长的圆柱体，并使用组织胶（histoacryl glue）将其中一个圆柱体粘接到切片器的圆形塑料皿上（参见 材料表).</li>
		<li>使用解剖刀在琼脂糖圆柱体上挖出一个凹陷，然后将第一孔中的肿瘤组织（步骤 2.5）嵌入该凹陷中。 
		注意：应小心处理肿瘤组织，避免挤压或将其推入缝隙中。缝隙应足够大，以便肿瘤组织能轻松放入，但又需足够小，以确保在切割过程中肿瘤组织保持稳定。步骤 4.1.1 和 4.1.2 为可选步骤。</li>
		<li>将塑料圆盘放置在切割台的安装圆盘上（参见 材料表).</li>
		<li>切换斩波器 在 并按下 重置 按钮。切片机现在开始切割（第一轮）。当载物台到达末端时，机器会自动停止，琼脂糖和肿瘤组织均被切成设定的直径。</li>
		<li>将安装盘旋转90°，然后调节释放台旋钮至起始模式。</li>
		<li>按压 重置 按钮，让机器再次切割组织，形成矩形组织（第二轮）。</li>
		<li>移除带有处理后材料的塑料圆盘，使用组织铲小心地仅将肿瘤组织旋转90°。</li>
		<li>将塑料圆盘放置在切割台上，然后调节释放台旋钮至起始模式并按下 重置 用于最终切割轮次（第三轮）的按钮</li>
		<li>切换斩波器 关闭 并移除塑料圆盘。清洁切碎器及其刀片。</li>
		<li>使用5 mL单通道移液器，将处理后的材料连同培养基吸入移液器中，再将悬液重新排入培养皿内。</li>
		<li>重复上一步骤 2–3 次，以充分分离组织。</li>
		<li>将培养皿放回冰上，并对每种肿瘤的其余5个培养皿重复步骤（4.1.1–4.1.12）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手动处理肿瘤组织（M法）
	<ol>
		<li>将肿瘤组织连同3 mL H-GPSA培养基从第一个塑料培养皿（步骤2.5）转移表2) 转移至玻璃培养皿中。在显微镜下用两把手术刀将组织段手动解剖成0.5 mm的片段。</li>
		<li>使用2 mL移液器将解剖后的组织转移回其塑料培养皿中。</li>
		<li>对其他五个培养皿中的肿瘤切片（步骤 2.5）重复步骤 (4.2.1–4.2.3)。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 肿瘤组织的洗涤
<ol>
	<li>将每个培养皿向上倾斜至45°，静置30秒，直至肿瘤组织块沉降至培养皿底部。</li>
	<li>使用1 mL移液器小心吸取2.5 mL H-GPSA培养基（表2），注意避免吸入任何肿瘤组织。</li>
	<li>向每个样品中加入2 mL红细胞裂解缓冲液（见材料表），确保处理后的肿瘤组织完全被裂解缓冲液覆盖。</li>
	<li>将6个培养皿置于实验室轨道摇床上，以低速振荡10分钟。</li>
	<li>小心吸除2 mL裂解缓冲液，避免吸入任何肿瘤组织。</li>
	<li>重复之前的洗涤步骤（步骤5.1–5.5）两次，每次使用2 mL H-GPSA培养基（表2）代替裂解缓冲液。</li>
</ol>
6. 肿瘤组织的培养
<ol>
	<li>从每个培养皿中吸出 H-GPSA 培养基（表 2），并替换为 4 mL PDO 培养基（表 2）。</li>
	<li>将每个培养皿中的组织块转移至一个相应的超低吸附 6 孔板（见材料表）的孔中。</li>
	<li>将该 6 孔板置于培养箱内的轨道摇床上，于 37 °C、5% CO2、150 rpm 条件下培养 2–4 周。</li>
	<li>每两天进行一次半量换液：从每个孔中吸出 2 mL 培养基，并加入 2 mL 预热至 37 °C 的新鲜 PDO 培养基（表 2）。</li>
	<li>在显微镜下观察组织（形态、生长情况、培养基颜色），并切割正在生长的类器官（&#62;0.7 mm）或粘附性组织，以防止组织缺氧。
	<ol>
		<li>操作时，将类器官从超低吸附孔转移至无菌玻璃培养皿中，使用手术刀进行切割。或者，可通过 1 mL 移液器吸取来解离粘附的类器官。注意不要挤压类器官，操作应轻柔。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过每两天计数类器官并仔细检查其是否具有理想的圆形形态（图 2）来评估类器官的形成情况。</li>
</ol>
7. 类器官的固定与包埋
<ol>
	<li>培养6周后，用4%甲醛固定每位患者每孔中的两个PDO，固定时间为24小时。</li>
	<li>将固定的PDO浸入中性缓冲（磷酸钠）甲醛溶液中，直至包埋。</li>
	<li>将每个PDO放入包埋盒中（见材料表），以进行后续处理。</li>
	<li>按照以下溶液顺序浸入包埋盒，启动脱水过程（参见下方注释）： 
	注：50%乙醇20分钟，70%乙醇20分钟，80%乙醇20分钟，96%乙醇20分钟，100%乙醇20分钟，100%乙醇30分钟，100%乙醇+氯仿（1:1比例）30分钟，100%乙醇+氯仿（1:1比例）30分钟，纯氯仿30分钟，纯氯仿30分钟，石蜡30分钟，石蜡30分钟，使用STP 120仪器进行。</li>
	<li>将脱水后的PDO在58–60 °C的石蜡中包埋。</li>
	<li>将包埋的PDO切成2.5 µm厚度的切片，并贴附于载玻片上用于染色。</li>
</ol>
8. 免疫荧光染色
<ol>
	<li>培养6周后对PDO进行切片。</li>
	<li>随后对胶质纤维酸性蛋白（GFAP，稀释比例：1:100）和增殖标志物Ki67（稀释比例：1:1000）进行双重染色（参见材料表），方法如先前报道22。</li>
	<li>同样地，通过GFAP与抗caspase-3（CC3，稀释比例：1:400）的双重染色评估PDO的凋亡情况（参见材料表）。</li>
	<li>使用荧光显微镜在40倍放大倍数下采集PDO的图像。</li>
	<li>分析图像中GFAP阳性、Ki67阳性及CC3阳性的细胞，以及GFAP/Ki67双阳性细胞和GFAP/CC3双阳性细胞。</li>
	<li>使用开源软件Fiji（ImageJ-win 32）进行图像分析。</li>
</ol>
9. 评估与数据分析
<ol>
	<li>在培养的第一周内，使用标准设置和 5 倍放大倍数，每日拍摄显微镜明场图像。</li>
	<li>观察形态学变化，并在手动和自动处理方法中追踪类器官成熟过程。</li>
	<li>使用显微镜在标准明场模式下进行形态学分析。</li>
	<li>在来自全部五名患者的类器官培养的前 4 周内，评估类器官数量及其形态。</li>
	<li>对每名患者的每个类器官计数进行三次读数，以计算平均值和平均值的标准误（SEM）。</li>
	<li>对三名患者的类器官进行增殖和凋亡研究。</li>
	<li>使用 commercially available 的统计分析软件包进行数据分析（参见 材料表）。</li>
	<li>采用 Student's T 检验和 Mann-Whitney U 检验，分析手动与自动类器官生成在类器官数量、增殖和凋亡方面的差异。</li>
</ol>

Derivation of 3D Glioma Organoids from Chopper-Processed Patient Tumors

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作者无任何利益冲突需要披露。

本研究介绍了一种快速高效的类器官（PDO）生成方法。胶质母细胞瘤（GBM）仍是一种治疗极具挑战性的肿瘤，常表现为复发和高疾病负荷3,6。迫切需要创新的治疗策略，因为在体外（in vitro）观察到的有前景的结果，往往在I期临床试验的体内（in vivo）研究中无法显示出疗效。造成这种差异的原因之一，可能是来源于患者的永生化细胞系在单层培养条件下，难以真实反映原发肿瘤复杂的细胞间相互作用及其遗传特性。鉴于GBM具有高度的瘤间和瘤内异质性8,9，个体化靶向治疗更受青睐，并可能在未来应用中展现出潜力。与二维贴壁培养的细胞系相比，类器官能够更好地保留原发组织的特性21，但肿瘤与正常脑组织之间复杂的细胞间相互作用至关重要，而此类模型可能忽略这些相互作用。然而，人工生成PDO的过程耗时较长，且在切割过程中使用手术刀挤压组织可能造成组织损伤，从而阻碍PDO的成功生长。因此，本研究优化了一种利用组织切片机的自动化方法，以更短的时间和更少的操作投入生成更多数量的PDO。此外，我们证实了两种方法在总体增殖率和凋亡率方面并无差异。
C法简单直接，易于实施，并能够生成更多的PDO（图3）。在第二轮和第三轮切碎之间旋转组织被确定为该方案中的关键步骤。在此阶段，组织已失去完整性，容易解体，导致产生较大的组织块，需要进一步切割或在显微镜下进行手动解剖。尽管自动切碎法可更精确地预设切割尺寸，但手动方法在确定PDO大小方面缺乏精度，导致生成的PDO形状和大小不均，这对比较性药物筛选是一个不利因素（图2）。然而，采用所提出的方法仍未能实现每个PDO中细胞数量的标准化，这可能对标准化药物筛选方案构成局限。不同类器官生成技术的优缺点18,19,20,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36, 
37,38,39,40,41,42及其应用总结于表3中。
GBM 组织的质地可能差异较大，从坚韧（浸润区）到柔软（坏死核心）不等，这可能对自动化切片方法带来挑战。如果组织过于坚韧，切片机可能会挤压并损伤组织；而过于柔软的组织则可能被压碎。所选取的组织具有明显的特征，包括中等硬度，偶尔呈现粉灰色，而非褐色或黄色变色。具有海绵状且易于碎裂质地的组织在琼脂糖块中表现出更佳的保存状态，而极度脆弱或液化的肿瘤组织则被排除在取样过程之外。然而，即使组织质地并非理想，切片法仍比手动方法成功产生了更多的 PDO。关键在于与实施肿瘤切除的外科医生保持密切沟通，以便处理来自肿瘤不同区域的组织。在组织质地不理想的情况下，切片后在显微镜下进行手动修整是有益的补充步骤。为考虑肿瘤异质性，肿瘤组织最初被分为六个部分，每个部分再进一步分为两半，分别用于 C 法或 M 法。在这六个不同区段中，预期存在显著的异质性。此外，即使在同一区段或同一孔中的 PDO 内部，也可能存在不同的亚群。
作为概念验证，本文报告了两名胶质母细胞瘤（GBM）患者和一名低级别胶质瘤（LGG）患者的增殖与凋亡数据，结果显示两种方法之间无显著差异。类器官（PDOs）的生成不仅限于高度恶性的脑肿瘤，也可应用于低级别胶质瘤（LGG）。本研究强调，低级别胶质瘤在二维培养中很少表现出生长能力，因此建立用于研究此类肿瘤的准确模型具有重要价值。本实验方案旨在展示该方法在快速、高效地从胶质母细胞瘤（GBM）和低级别胶质瘤（LGG）中生成类器官（PDOs）方面的广泛适用性。
总体而言，类器官（PDO）未来可被用于恶性脑肿瘤靶向治疗的患者导向型治疗前检测。提供一种快速高效的个体化药物筛选方法至关重要，因为肿瘤进展迅速，迫切需要挽救性治疗方案。下一步，可采用多种免疫治疗策略对PDO模型进行评估，以更好地模拟实际治疗反应。未来，可利用PDO得出关于在临床环境中进一步探索和评估治疗方案必要性的深入结论。

低级别胶质瘤（LGGs）是一组相对罕见的脑肿瘤，与胶质母细胞瘤等高级别胶质瘤相比，通常表现为生长缓慢且侵袭性较低。LGGs 可发生于成人和儿童，其中成人发病率略高。其确切患病率因地区和人群而异，但约占所有原发性脑肿瘤的 15%–20%1。LGGs 的治疗策略通常包括手术、放射治疗和化学治疗的联合应用，旨在最大限度切除肿瘤的同时保留神经功能。LGGs 的管理较为复杂，治疗方案的选择可能取决于肿瘤位置和分子特征等因素2。随着对 LGGs 遗传和分子基础的深入理解，靶向治疗不断发展，当前研究仍在持续优化治疗策略。
胶质母细胞瘤（IDH野生型，中枢神经系统WHO 4级，GBM）则是成人中最常见的原发性脑肿瘤，其发病率为每10万人年3.19–4.17例3。GBM可引起头痛、癫痫、局灶性神经功能缺损、性格改变以及颅内压增高等症状。GBM的标准治疗方案包括在可行的情况下进行肿瘤减容手术，随后联合放疗与替莫唑胺治疗4。此外，对于O6-甲基鸟嘌呤-甲基转移酶（MGMT）启动子甲基化的患者，联合使用替莫唑胺与洛莫司汀可能提高中位总生存率5。然而，尽管已有这些最新的治疗手段，GBM仍是一种无法治愈的疾病，预后极差；在加用肿瘤治疗电场（TTFields）后，患者的中位总生存期也仅为16个月至20.9个月3,6。尽管已针对GBM开展了多种免疫治疗策略的研究，但在体内（in vivo）显示出的疗效仍十分有限。此外，临床与临床前研究中的诸多限制因素也阻碍了治疗上的突破7。由于GBM存在显著的肿瘤间8和肿瘤内9异质性，建立一种合适且贴近实际的离体（ex vivo）模型一直面临挑战。
传统的二维（2D）患者细胞系代表了同质的细胞群体，适用于高通量药物筛选。然而，由于多次传代后在培养条件、基因型和表型特征方面存在差异，患者来源的和永生化细胞系均无法充分模拟胶质母细胞瘤（GBM）的实际情况10,11,12。
另一方面，三维类器官模型近年来已成为能够模拟器官及多种癌症类型表型和分子异质性的有前景的体系13,14,15,16,17,18。在胶质母细胞瘤（GBM）研究中，脑类器官已被通过基因改造以模拟肿瘤样特征16,17，或与胶质瘤干细胞（GSCs）或球状体共培养以诱导肿瘤细胞浸润18,19。尽管来源于患者的GBM类器官在Matrigel及EGF/bFGF条件下培养时可表现出干细胞异质性和缺氧等GBM典型特征20，但该模型在多大程度上能够代表患者肿瘤的关键分子特性仍不明确。
源自患者的胶质母细胞瘤类器官（PDO）是一种极具前景的模型，能够保留其对应原发肿瘤的主要特征，包括组织学特性、细胞多样性、基因表达和突变谱型。此外，将这类类器官植入成年啮齿类动物脑内后可迅速发生浸润，为药物筛选和个体化治疗提供了高度仿真的研究模型21。然而，通过手工解剖肿瘤组织来制备PDO耗时且成本高昂。因此，亟需一种能够快速大量生成PDO的方法，以支持对多种治疗策略进行全面评估，推动个体化药物测试的发展。本研究介绍了一种利用自动组织切片机直接从新鲜解剖的肿瘤组织中制备PDO的新方法。此外，还从PDO数量、形态学特征、肿瘤细胞凋亡及增殖等方面，对本方法生成的PDO与同一患者来源的手工解剖PDO进行了比较。

<table><tbody><tr><td>2-巯基乙醇（1000倍稀释）</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>30% 无甲醇甲醛</td><td>Carl Roth</td><td>4235.1</td><td>使用浓度为4%</td></tr><tr><td>70% 乙醇溶液</td><td></td><td></td><td>用于消毒&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>琼脂糖片剂 0.5 g</td><td>Carl Roth</td><td>HP67.7</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素B 250 &amp;micro;g/mL</td><td>Gibco</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>解剖镊</td><td>&amp;nbsp;Hartstein</td><td>&amp;nbsp;N/A</td><td></td></tr><tr><td>解剖刮匙</td><td>&amp;nbsp;Hartstein</td><td>&amp;nbsp;N/A</td><td></td></tr><tr><td>B-27 添加剂（不含维生素A，50倍稀释）</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>带盖活检盒</td><td>Resolab</td><td>37001-b</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain 组织切片机刀片</td><td>Campden Instruments</td><td>型号 TC752-1</td><td></td></tr><tr><td>CC3 抗体（Asp 175）</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9661</td><td></td></tr><tr><td>一次性手术刀</td><td>&amp;nbsp;Feather</td><td>&amp;nbsp;0200130015</td><td></td></tr><tr><td>蒸馏水</td><td>Gibco</td><td>15230089</td><td>用于稀释甲醛</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）F-12（1:1）（1倍稀释）</td><td>Gibco</td><td>11330032</td><td>含L-谷氨酰胺和15 mM HEPES</td></tr><tr><td>杜尔贝科磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>D8537-500ML</td><td>改良型，不含钙、氯化物和氯化镁，液体，经无菌过滤，适用于细胞培养</td></tr><tr><td>eBioscience 1倍红细胞裂解缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>433357</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 管 50 ml Cellstar</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>GFAP 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc33673</td><td></td></tr><tr><td>玻璃烧杯</td><td>&amp;nbsp;N/A</td><td>&amp;nbsp;N/A</td><td></td></tr><tr><td>玻璃培养皿</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX（100倍稀释）</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 240i CO2 培养箱</td><td>Thermo Scientific</td><td>51032875</td><td></td></tr><tr><td>Herasafe 2025 生物安全柜</td><td>Thermo Scientific</td><td>5016643</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate-A</td><td>Gibco</td><td>A1247501</td><td></td></tr><tr><td>Histoacryl 胶水</td><td>B. Braun Surgical</td><td>1050052</td><td></td></tr><tr><td>人胰岛素溶液</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-360248</td><td></td></tr><tr><td>冰盒</td><td>&amp;nbsp;N/A</td><td>&amp;nbsp;N/A</td><td></td></tr><tr><td>Ki67 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab16667</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain 组织切片机</td><td>Cavey Laboratory Engineering</td><td>51350V</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI 3000B、DMI 4000B、DMI 6000B 倒置显微镜</td><td>Leica</td><td>DMI6000B</td><td>用于明场和免疫荧光成像</td></tr><tr><td>S9D 体视变焦显微镜</td><td>Leica</td><td>W841832</td><td>用于手动切割和类器官观察</td></tr><tr><td>微波炉</td><td>Bosch</td><td>N/A</td><td>用于加热琼脂糖溶液</td></tr><tr><td>塑料固定盘</td><td>Cavey Laboratory Engineering</td><td>51354</td><td></td></tr><tr><td>N-2 添加剂（100倍稀释）</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NEM 非必需氨基酸（NEAA）（100倍稀释）</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal（1倍稀释）</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Rotamax120 轨道摇床</td><td>Heidolph</td><td>10304491</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>塑料培养皿 Cellstar</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td>n = 12</td></tr><tr><td>单通道移液器 1000 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>4924000010</td><td></td></tr><tr><td>单通道移液器 5000 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>EP3123000276</td><td></td></tr><tr><td>社会科学统计软件包（SPSS）第23.0版</td><td>IBM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surgipath Paraplast 包埋介质</td><td>Leica</td><td>39601006</td><td>包埋介质</td></tr><tr><td>超低吸附 Nucleon Sphera 6孔板</td><td>Thermo Scientific</td><td>174932</td><td></td></tr></tbody></table>

使用组织切片机体外培养患者来源的胶质瘤类器官

Cultivating Ex Vivo Patient-Derived Glioma Organoids Using a Tissue Chopper

胶质母细胞瘤，IDH野生型，中枢神经系统WHO 4级（GBM），是一种原发性脑肿瘤，尽管采取积极治疗，患者生存率仍然较低。开发真实的 离体 模型的构建仍然具有挑战性。源自患者的三维类器官（PDO）模型提供了一种创新平台，能够捕捉胶质母细胞瘤（GBM）的表型和分子异质性，同时保留原始肿瘤的关键特征。然而，人工解剖制备PDO耗时较长、成本高昂，且可能产生大量形状不规则、大小不一的类器官。本研究提出一种利用自动化组织切片机进行PDO制备的创新方法。来自4例胶质母细胞瘤及1例异柠檬酸脱氢酶突变型星形细胞瘤（CNS WHO 2级）患者的肿瘤样本分别采用人工方法和组织切片机进行处理。在人工操作中，肿瘤组织在显微镜控制下使用手术刀进行解剖；而组织切片机则在三种不同角度下进行操作。处理后的组织在37 °C条件下于摇床中培养，通过明场显微镜观察形态学变化，并在培养6周后通过免疫荧光染色评估增殖（Ki67）和凋亡（CC3）情况。与人工处理相比，组织切片机方法使制备时间减少了近70%，且自第二周起显著提高了PDO的平均数量（第2周：801） 与. 601, P = 0.018；第3周：1105 与. 771, P = 0.032；第4周：1195 与. 784, P &lt; 0.01）。质量评估显示，两种制备方法在肿瘤细胞凋亡和增殖率方面相似。因此，自动化组织切片法在时间和PDO得率方面更具效率。该方法在胶质母细胞瘤患者药物或免疫治疗筛选中具有应用前景。

经经验丰富的神经病理学家（CMM）病理学确诊后，纳入了4名胶质母细胞瘤（GBM）患者和1名低级别胶质瘤（LGG）患者。大多数患者存在未甲基化的MGMT启动子，所有GBM患者均为IDH1和IDH2野生型（表1）。在C法中，平均制造过程耗时88.8分钟（±6.3分钟），而在M法中为322分钟（±17.2分钟）。经过4周培养后，手动法的总体成功率为87%，切碎法为93%（n = 5）。此外，C组来源的PDO在1周内即达到预期的圆形形态，并已成熟到可用于后续实验的程度 体外 实验中，M组的PDOs大多仍保持清晰的边缘且未发生明显变化（图2）。采用C方法处理的肿瘤组织在培养第一周后共获得281个PDO（每位患者平均为56 ± 43个），而采用M方法处理则获得250个PDO（每位患者平均为50 ± 41个）。在第二周培养期间，所有五位患者的组织在采用C方法时生成的PDO数量更高（共801个；每位患者平均为130 ± 38个），相比之下，M方法共获得601个PDO（每位患者平均为76 ± 44个）； P = 0.018）。在培养的第三周，C方法从所有患者中总共获得了1105个PDO（每位患者的平均数为221 ± 32），而M方法获得了771个PDO（每位患者的平均数为155 ± 34）。P = 0.032）。此外，采用C方法培养四周后共形成1195个PDO（每位患者平均为239 ± 50个），而采用M方法则形成784个（每位患者平均为157 ± 36个）（P &lt; 0.01）。因此，从第二周开始，C方法的PDOs计数显著更高（图3此外，通过评估PDO计数的相对波动情况，探讨了连续几周之间的动态变化趋势。分析结果显示，在C方法中，从第一周到第二周初期PDO计数显著上升（265%），表明进展迅速；随后在第三周增长幅度降低（75%），反映出短暂的调整期。相比之下，M方法在第二周和第三周的PDO计数均呈现稳定增长（分别为92%和67%），并在第四周表现出显著的计数稳定性。PDO计数持续上升的趋势凸显了C方法在整个观察期间的可靠性和抗干扰能力。
纳入两名胶质母细胞瘤（GBM）患者和一名低级别胶质瘤（LGG）患者，用于分析类器官（PDO）中星形胶质细胞数量（GFAP）、PDO细胞增殖（Ki67）以及细胞凋亡（CC3）。测定的星形胶质细胞比例显示，两种处理方法之间无显著差异，C法平均为43%，M法为45%（图4 和 图5，补充图1 和 补充图2）。同样，PDO内的增殖率在C法（3%）与M法（1%）之间也具有可比性。仅来自5号患者的C法生成的PDO显示出26%的增殖率，而M法仅为1%（P = 0.001；图4C）。总体而言，采用C法处理的PDO中检测到的凋亡率较低（3%），而M法为2%，但两者之间无显著差异（图5C）。此外，两种方法在经历凋亡的星形胶质细胞数量方面亦无显著差异（图5D）。
<img alt="脑组织处理工作流程；切碎机、显微镜；细胞培养；实验示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65952/65952fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：使用自动切碎仪与手动方法制备患者来源类器官（PDO）的流程图解概览。 图示展示了所涉及的各个步骤，包括（A）样本采集，（B）肿瘤组织解剖，（C）洗涤，以及（D）孵育。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65952/65952fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="脑组织显微镜图像，GBM与LGG，切碎/手动方法，细胞结构比较分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65952/65952fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：类器官在培养第一周内的形态学特征。 比较使用自动切碎仪和手动方法解剖后类器官的形成情况。比例尺 = 1000 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65952/65952fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="PDO 计数增长比较图；统计分析，切碎法与手动法，显示 p 值。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65952/65952fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图 3：培养前四周内 PDO 的数量变化。 横轴表示时间（周，W），纵轴表示 C 法（蓝色）和 M 法（红色）的 PDO 数量（n = 5）。每个数据点代表平均计数，误差线表示平均值的标准误。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65952/65952fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="组织样本分析，GFAP和Ki67标志物图示，胶质母细胞瘤，切碎法与手工法对比。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65952/65952fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图 4：类器官（PDOs）中的细胞增殖率。（A）来自患者3、4和5（表 1）的类器官中GFAP阳性细胞（绿色）、Ki67阳性细胞（红色）及DAPI（蓝色）的代表性免疫荧光图像（n = 3）。所有类器官均采用切碎法（C）和手工法（M）进行处理。比例尺 = 100 µm。（B）两种方法在GFAP阳性细胞相对数量上的比较，（C）Ki67阳性细胞，以及（D）Ki67/GFAP双阳性细胞的比较。无显著性差异的结果以“ns”表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65952/65952fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="胶质瘤患者组织分析；荧光显微镜图像和柱状图；GFAP、CC3标志物。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65952/65952fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5：类器官（PDOs）中的凋亡率。（A）来自患者3、4和5（表1）的类器官中GFAP阳性细胞（绿色）、CC3阳性细胞（红色）及DAPI（蓝色）的代表性免疫荧光图像（n = 3）。所有类器官均采用切碎法（C）和手动法（M）进行处理。比例尺 = 100 µm。（B）两种方法在GFAP阳性细胞相对数量上的比较，（C）CC3阳性细胞，以及（D）CC3/GFAP双阳性细胞的比较。无显著性差异的结果以“ns”表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65952/65952fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
表1：患者特征和临床参数。 GBM = 胶质母细胞瘤，IDH野生型，CNS WHO 4级；LGG = 低级别胶质瘤；KPS = 卡诺夫斯基体能状态评分；MGMT = O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶；IDH1 = 异柠檬酸脱氢酶1，IDH2 = 异柠檬酸脱氢酶2，ATRX = α-地中海贫血/智力障碍综合征X连锁基因；M = 形态学；CC = 细胞计数；p = 增殖；A = 凋亡。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65952/65952_Table%201.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表2：培养基配方。 H-GPSA = Hibernate A-Glutamax 青霉素-链霉素-两性霉素B。PDO = 患者来源类器官；DMEM：杜氏改良伊格尔培养基。NEAA：非必需氨基酸。Pen Strep：青霉素/链霉素 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65952/65952_Table%202_updated.zip" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表3：用于构建细胞培养模型的技术概述。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65952/Table%203_updated.zip" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充图1：类器官增殖染色的单通道图像。（A）DAPI（蓝色），（B）GFAP阳性细胞（绿色），（C）Ki67阳性细胞（红色）以及（D）来自患者3、4和5的类器官的叠加通道图像。比例尺 = 100 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65952/Supplementary%20figure1.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图2：类器官凋亡染色的单通道图像。（A）DAPI（蓝色），（B）GFAP阳性细胞（绿色），（C）CC3阳性细胞（红色）以及（D）来自患者3、4和5的类器官的叠加通道图像。比例尺 = 100 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65952/Supplementary%20figure2.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本研究介绍了一种利用组织切片机自动生成患者来源的胶质母细胞瘤三维类器官的自动化方法。该方法为获得此类类器官用于治疗测试提供了一种合适且有效的途径。

胶质母细胞瘤，IDH野生型，中枢神经系统WHO 4级（GBM），是一种原发性脑肿瘤，尽管采取积极治疗，患者生存率仍然很低。开发……

因此，我们的研究重点是改进胶质母细胞瘤患者来源类器官的制备方法。我们的核心问题包括：该方法能否高效地生成更多类器官，缩短制备时间，同时保持原始肿瘤的特性。我们将利用这些类器官对胶质母细胞瘤患者进行有效的药物和免疫治疗筛选。近期，胶质母细胞瘤领域的研究进展包括在基因和分子层面理解的深入，推动了新靶点的识别。此外，人们越来越重视使用三维类器官，以更好地模拟肿瘤的复杂性，并实现药物测试。目前，手工解剖、酶解离、器官芯片和生物打印等技术正被广泛用于类器官的制备。另一方面，机械切碎法在多项研究中可提供代谢活性良好的脑切片，但缺乏用于类器官制备的代谢研究。我们的研究引入了一种创新方法，利用自动化切碎仪生成患者来源的三维类器官。与手动解剖相比，该方法使制备时间减少了近70%，且获得的类器官数量显著更多。为胶质母细胞瘤患者的药物和免疫治疗筛选提供更高效的方法。本研究的进展显著加快了类器官的制备过程，同时能够保持原始肿瘤的主要特征。通过减少类器官生成所需的时间和资源，该方法提高了对胶质母细胞瘤患者进行大规模药物和免疫治疗筛选的可行性。首先，在超净工作台中将浸没于25毫升Hibernate A溶液中的肿瘤组织转移至无菌玻璃培养皿内。借助显微镜仔细去除所有坏死组织，然后使用解剖刀和组织镊分离血管。将肿瘤组织切成1至2立方厘米大小的组织块。将它们转移至含有 3 mL H-GPSA 培养基的塑料培养皿中，并将培养皿置于冰上。为手动处理肿瘤组织，将肿瘤组织块转移至一个新的玻璃培养皿中。使用两把手术刀，在显微镜下将组织切分成 0.5 mL 的小段。为了对肿瘤进行机械处理，首先正确安放刀片，然后将切片厚度调整为0.45至0.50毫米，并将切片台释放旋钮固定在启动位置。将Angros包埋块切成一个长约2厘米的圆柱体，并将其粘附在切片机的圆形塑料皿上。使用手术刀在Angros圆柱体上挖出一个小凹坑，然后将肿瘤组织放入该凹坑中。然后将塑料圆盘放置在切削台的安装圆盘上，按下复位按钮以启动切碎过程。第一轮完成后，将安装圆盘旋转90度，重复操作一次，以将组织切成矩形小块。取下塑料圆盘，然后使用组织刮匙仅将肿瘤组织旋转90度。将塑料圆片放回切割台，按下复位按钮以继续切割。然后使用5 mL移液器将处理后的材料连同培养基一起转移至培养皿中。立即将培养皿置于冰上。首先，从患者体内获取肿瘤组织，并使用组织切碎器进行处理。将含有切碎肿瘤的培养皿倾斜向上45度，小心移除2.5毫升H-GPSA培养基。为清洗肿瘤组织块，加入2毫升红细胞裂解缓冲液，并在摇床中低速孵育。然后，彻底弃去裂解缓冲液。接着，向组织碎片中加入 4 mL 患者来源类器官培养基，并将组织块转移至超低吸附六孔板中。将培养板置于摇床中孵育 2 至 4 周。每两天将用过的培养基更换一半，换为预热的新鲜患者来源类器官培养基。为防止组织缺氧，将患者来源类器官转移至无菌玻璃培养皿中，在显微镜下观察组织形态。然后使用手术刀切割粘连的组织。采用切碎器方法获得的患者来源类器官，相较于手工切碎方法，可在一周内达到理想的圆形形态，且形成的类器官数量显著更高。

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Cancer Research

癌症研究

使用组织切碎器培养离体患者来源的神经胶质瘤类器官

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人胶质母细胞瘤类器官切片培养模型用于研究肿瘤细胞迁移及抗侵袭药物的个体化效应

本研究介绍并描述了两种特定人源神经类器官的培养方案 ，作为研究以下两个方面的相关且精确的模型：1）仅在人源神经类器官内研究人脑胶质母细胞瘤的发展；2）生成三维类器官以诱导多巴胺能神经元分化。...

人脑类器官在脑癌与神经退行性疾病研究中的应用

在此，我们描述了一种从原代患者样本或患者来源的细胞培养物中生成胶质母细胞瘤（GBM）类器官并将其培养至成熟的方法。这些GBM类器官包含表型多样化的细胞群体，并可重建肿瘤微环境 离体.

维持人胶质母细胞瘤的细胞多样性 离体 使用三维类器官培养

鸡胚被用于研究人类胶质母细胞瘤（GBM）脑肿瘤 在卵内 以及在 离体 脑片共培养。通过延时显微成像可记录胶质母细胞瘤细胞的行为， 离体 共培养，且两种制备物均可在实验终点通过详细的三维共聚焦分析进行检测。...

利用鸡胚脑作为模型 在体 内 和 离体 人类胶质母细胞瘤细胞行为分析

携带IDH1突变的弥漫性低级别胶质瘤是一种罕见肿瘤，难以进行培养。我们介绍一种简单的非酶解组织块培养法，可维持IDH1突变蛋白的表达，并使培养物持续存活数月。重要的是，该技术适用于冻存肿瘤组织，为胶质瘤研究提供了宝贵的资源。...

IDH1突变型弥漫性低级别胶质瘤的组织块培养方案

本文概述了一种全面的实验方案，用于生成和利用实验室工程化胶质母细胞瘤类器官（LEGO），以研究基因型与表型之间的依赖关系，并筛选潜在的胶质母细胞瘤治疗药物。...

实验室构建的胶质母细胞瘤类器官培养与药物筛选

了解使用组织切碎器培养离体患者来源的神经胶质瘤类器官的方法。该技术可将制备时间缩短近70%，同时保持原始肿瘤特征，为药物和免疫治疗筛选提供更高效的模型。

使用组织切片机体外培养患者来源的胶质瘤类器官

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