大规模人脑成像中用于光片荧光显微镜的光学透明化与标记技术

人脑是一个跨越不同尺度的复杂器官。要理解其功能，必须构建覆盖全脑的详细共识图谱。我们常规的高通量实验方案能够以微米级分辨率分析人脑体积载体的组织架构，从而实现对其结构的表征。

对人类大脑大范围区域进行容积重建时，面临诸多实验挑战，这些挑战与脑组织样本的巨大尺寸、复杂的生物组成、多变的死后固定与储存条件，以及脂褐素类色素产生的自发荧光信号密切相关。上述因素均可能影响透明化效率及成像质量。与其他透明化技术相比，短时组织转化方法结合实时片层显微成像技术，可用于快速且同步地处理多个人脑切片。

这些步骤可实现亚细胞分辨率的三维脑组织重建。首先，取一个含有磷酸盐缓冲液（PBS）的烧杯，加入琼脂糖以制备4%的琼脂糖溶液。将经甲醛固定的中国台湾人脑组织块包埋于该琼脂糖溶液中。

让其冷却至室温，并在4°C下保存24小时。为实现精确切片，将样品固定于振动切片机的样品盘上，并向切片槽中加入冷的PBS。根据待切组织的类型，调节振动切片机的频率、振幅和切片速度。

切片完成后，将所有切片转移至含有0.01%叠氮化钠的磷酸盐缓冲液（PBS）防腐溶液中。首先将福尔马林固定、石蜡包埋的脑组织切片放入带螺旋盖的培养皿中，加入关闭液（switch off solution），用铝箔包裹，于4°C条件下振荡孵育一天。

第二天，将所有样品转移至新的培养皿中，并按照之前所示方法加入转换开启溶液进行孵育。孵育结束后，将样品放入离心管中，用 PBS 洗涤三次，每次两小时，同时振荡。然后向样品中加入灭活溶液，于37摄氏度水浴中孵育过夜。

进行三次洗涤后，向样品中加入透明溶液，并在55摄氏度水浴中孵育三至七天。孵育结束后，在37摄氏度孵育箱中用PBST洗涤样品三小时。次日，向每个样品中加入10毫升30%过氧化氢，并在室温下振荡洗涤三次，每次10分钟，每次使用PBS洗涤。

接下来，将抗原修复液在水浴中预热至95摄氏度。将样品转移至预热的溶液中，在95摄氏度下孵育10分钟，随后在摇床上室温孵育40分钟。在摇动条件下，用去离子水洗涤样品5分钟。

用 PBS 平衡样品。然后将样品转移至带螺旋盖的培养皿中。在烧杯中为所有样品配制新鲜的一抗溶液后，加入样品中，并在 37 °C 下避光轻柔振荡孵育 1 至 7 天。

然后，将样品放入离心管中，用预热的PBST在37摄氏度的培养箱中洗涤。将样品转移至带螺旋盖的培养皿中，并加入用PBST和0.01%叠氮化钠配制的二抗。再将样品转移至离心管中，用预热的PBST在37摄氏度振荡洗涤三次，每次两小时。

为了实现折射率匹配，将样品放入新的培养皿中，并加入30%的TDE溶液。然后将样品中的30% TDE替换为68%的TDE溶液，并在室温下震荡孵育。经过短暂处理后，灰质和白质的所有组织切片均达到了最佳且均匀的透明效果。

首先，取一张使用短时组织转化技术制备的脑组织切片。然后将钢制垫片放置在载玻片上，并将样本置于载玻片上。小心地将石英盖玻片覆盖在样本上，并固定所有组件。

现在将双组分硅胶按等比例混合。使用1毫升注射器，将双组分硅胶注入垫片与盖玻片之间的空隙中。取下固定组件的夹子。

使用细针缓慢地将68%TDE注入整个封片夹心结构中，并用新配制的封片胶密封夹心结构。成像完成后，用刀片轻轻打开封片夹心，将样本转移至装有螺口盖的新培养皿中，加入30%TDE溶液浸泡3小时。

然后将样品转移至离心管中，用 PBS 在室温下轻轻振荡洗涤三次，每次两小时。将样品置于透明化溶液中，并在 80 摄氏度的水浴中孵育四小时。孵育结束后，按前述方法用 PBS 洗涤样品。

人布罗卡区共标记了 NeuN、生长抑素，显示出两种不同的中间神经元亚群。经过多轮染色和短时处理的脑片通过光片荧光显微镜成像，显示白质和灰质被多种神经元标记物标记。对500微米厚脑片进行最大强度投影成像，展示了三轮连续免疫染色中使用的七种不同抗体的信号。