Name: 光片荧光显微镜在大规模人脑成像中的光学透明化和标记 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: 了解光片荧光显微镜结合SHORT组织透明化技术用于人脑切片三维成像的方法。该技术实现多轮免疫标记和亚细胞分辨率重建，为神经科学研究提供高通量脑结构分析方案。

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感谢马萨诸塞州总医院A.A. Martinos生物医学成像中心放射科的Bruce Fischl提供了本研究中分析的人脑标本。本项目获得了欧盟“地平线2020”研究与创新框架计划资助协议编号654148（Laserlab-Europe）、欧盟“地平线2020”研究与创新框架计划特定资助协议编号785907（人脑计划SGA2）和编号945539（人脑计划SGA3）、美国国立卫生研究院下属综合医院中心资助号U01 MH117023，以及意大利教育部门在Euro-Bioimaging意大利节点（ESFRI研究基础设施）框架内的资助。最后，本研究还得到了&#34;Fondazione CR Firenze.&#34;的支持。本研究内容的全部责任由作者承担，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。图1使用BioRender.com制作。

福尔马林固定的人体组织样本由美国马萨诸塞州波士顿市麻省总医院（MGH）尸检服务部神经病理学系提供。在死亡前，已从健康参与者处获得书面知情同意，该组织采集方案经合作伙伴机构生物安全委员会（PIBC，方案编号2003P001937）批准的机构审查委员会（IRB）审核通过。授权文件保存于美国马萨诸塞州波士顿市麻省总医院尸检服务部，可根据要求提供。
1. 琼脂糖包埋与样品切片
<ol>
	<li>在烧杯中用 1× 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）配制 4% w/v 琼脂糖溶液，并将组织块包埋其中。待其冷却至室温（RT）后，于 4 °C 保存 24 小时。</li>
	<li>为获得高精度切片，将样品粘附至振动切片机的样品盘上，并在切片槽中加入冷的 1× PBS（pH 7.4）。根据待切组织类型调整振动切片机的参数，如频率、振幅和速度（本实验所用参数：频率 = 5（50 Hz）；振幅 = 0.4；速度 = 3（0.15 mm/s））。 
	注意：应根据样品体积选择不同的振动切片机。对于最大体积为 70 × 40 × 15 mm 的样品，可使用振动切片机（例如 Leica VT1000 S）；对于更大体积的样品，可使用压缩切片机（例如 VF-900-0Z Microtome18）或定制装置21。本文所展示的切片厚度为 400 µm 或 500 µm。</li>
	<li>切片完成后，将所有切片置于保存液中，保存液成分为含 0.01% w/v 叠氮化钠（NaN3）的 1× PBS（pH 7.4），并于 4 °C 保存。 
	&#8203;注意：在包埋前，需等待琼脂糖溶液冷却至 37 °C。温度过高可能损伤组织样本。建议固定时间不超过 48 小时，因长时间固定可能破坏抗原并增强组织自发荧光，从而干扰标记过程。对于人源组织的长期保存，使用含 NaN3 的 PBS 可防止微生物污染。由于叠氮化钠（NaN3）具有毒性，应在化学通风橱内配制保存液。</li>
</ol>
2. 组织固定
注意：以下方案中使用的所有溶液均需大量配制，足以处理同一组织块的所有切片，以尽量减少技术差异并缩短各步骤所需时间。
<ol>
	<li>配制关闭溶液：含50% v/v 1× PBS（pH 3）、25% v/v 0.1 M 盐酸（HCl）、25% v/v 0.1 M 邻苯二甲酸氢钾（KHP）以及新鲜的4% v/v 戊二醛。将所有样品置于带螺口盖的培养皿（70 × 23 mm）中，加入关闭溶液，在4 °C条件下避光（用铝箔包裹）轻轻振荡孵育1天。</li>
	<li>配制开启溶液：含1× PBS（pH 7.4）和新鲜的1% v/v 戊二醛。将所有样品转移至新的培养皿中，加入开启溶液，在4 °C条件下避光（用铝箔包裹）轻轻振荡孵育1天。 
	&#8203;注意：由于戊二醛具有高毒性和光敏感性，关闭溶液和开启溶液必须现配现用，并置于冰上、在通风橱内保存。每次均应向培养皿中加入20 mL溶液，并用封口膜密封。</li>
</ol>
3. 灭活与透明化
注意：必须通过孵育灭活溶液来灭活样品中具有反应活性的戊二醛，灭活溶液组成为 1× PBS（pH 7.4）、4%（w/v）乙酰胺、4%（w/v）甘氨酸，pH 9.0。该溶液可在 4 °C 下保存长达 3 个月。为去除脂质并使组织透明，我们使用透明溶液，其组成为 200 mM 十二烷基硫酸钠（SDS）、20 mM 亚硫酸钠（Na2SO3）和 20 mM 硼酸（H3BO3），pH 9.0。该溶液必须在室温下保存，因为 SDS 在 4 °C 时会发生沉淀。后续所有步骤均在装有该溶液的离心管中进行。
<ol>
	<li>将样品从培养皿转移至离心管中，用 1× PBS（pH 7.4）在室温下轻轻振荡洗涤，每次 2 小时，共洗涤 3 次。 
	注意：步骤 3.1 必须在通风橱内操作，因为戊二醛具有毒性。乙酰胺、SDS 和硼酸也属于有毒试剂，均需在通风橱中操作。每次务必用 50 mL 溶液充满离心管。</li>
	<li>将样品置于灭活溶液中，在 37 °C 水浴中孵育过夜（o/n）。</li>
	<li>用 1× PBS（pH 7.4）在室温下轻轻振荡洗涤，每次 2 小时，共洗涤 3 次。</li>
	<li>将样品置于透明化溶液中，在 55 °C 水浴中孵育 3–7 天。每 2 天更换一次溶液（表 1）。</li>
</ol>
4. 免疫标记
注意：在标记步骤之前，必须去除残留的十二烷基硫酸钠（SDS），降低自发荧光，并使用抗原修复液（含10 mM Tris碱、1 mM EDTA和0.05% v/v Tween 20，pH 9）进行表位暴露。pH 9的条件可优化抗原修复效率；Tris碱作为缓冲剂，维持稳定的pH环境；EDTA是一种螯合剂，可增强抗原的可及性；非离子型去垢剂Tween 20有助于提高组织通透性。该溶液可在4 °C保存。需要注意的是，过氧化氢与抗原修复步骤联用时，可通过分解或修饰内源性荧光物质（如脂褐素）来降低自发荧光信号，从而在减少非特异性背景信号方面产生协同效应。
<ol>
	<li>配制含0.1% v/v Triton X-100的1×PBS（PBST），预热至37 °C，在培养箱中于37 °C轻柔振荡条件下，每日分3次、每次3小时清洗样本。最后一次清洗过夜。 
	注意：PBST储存液应保存于4 °C。必须彻底去除组织中的SDS，因其在低温下可能形成不溶性沉淀，干扰后续成像过程。</li>
	<li>次日，向每个样本中加入10 mL 30% v/v过氧化氢（H2O2），在室温下轻柔振荡孵育45分钟。</li>
	<li>用1×PBS（pH 7.4）在室温下轻柔振荡清洗3次，每次10分钟。</li>
	<li>将抗原修复液在95 °C水浴中预热；将样本转移至预热的修复液中，在95 °C下孵育10分钟。</li>
	<li>在轻柔振荡条件下，使样本在修复液中自然冷却至室温，约40分钟。</li>
	<li>用去离子水在轻柔振荡条件下清洗3次，每次5分钟。</li>
	<li>将样本在4 °C的PBS中平衡15分钟。</li>
	<li>现配含0.01% w/v NaN3的PBST抗体稀释液（参见步骤1.3的注意项&#160;），加入一抗。将样本置于带螺旋盖的培养皿中，于37 °C孵育箱内轻柔振荡、避光孵育n天（1–7天）（表2）。 
	注意：孵育时间取决于样本大小和厚度（表1和表2）。</li>
	<li>孵育n天后，将样本转移至离心管中，在孵育箱内用预热的PBST于37 °C轻柔振荡清洗3次，每次2小时。</li>
	<li>在含0.01% w/v NaN3的PBST中加入二抗，将样本转移至新的带螺旋盖培养皿中，于37 °C孵育箱内轻柔振荡、避光孵育n天（1–6天）（表1和表2）。</li>
	<li>孵育n天后，将样本转移至离心管中，在37 °C孵育箱内用预热的PBST轻柔振荡清洗3次，每次3小时，当日完成；最后一次清洗过夜。 
	&#8203;注意：由于Triton X-100和Tween 20具有黏性，移液时应缓慢操作，确保吸头充分充满。每次均需向离心管中加入50 mL溶液。每个样本使用10 mL抗体溶液，并用封口膜密封培养皿以防止溶液蒸发。由于抗体溶液含有NaN3，可在4 °C保存，并在2周内重复用于新样本的标记。</li>
</ol>
5. 折射率匹配
注意：为了实现高透明度，有必要使组织的折射率均一化。此处我们使用溶于1× PBS中的2,2'-二乙硫醇（TDE）。TDE溶液必须在室温下保存。
<ol>
	<li>将样品转移至新的培养皿中，加入30% v/v TDE，在室温下轻轻振荡孵育4小时。</li>
	<li>去除30% v/v TDE溶液，向样品中加入68% v/v TDE，在室温下轻轻振荡孵育。 
	&#8203;注意：由于TDE具有黏性，移液时应缓慢操作，以确保吸头充分充满。吸入TDE蒸气或雾滴可能刺激呼吸道，因此建议在通风良好的环境中操作，或使用通风橱以减少暴露风险。TDE溶液应于室温下保存。每个样品使用10 mL TDE溶液。</li>
</ol>
6. 样品安装
注意：为了便于样品安装和光片显微镜成像，我们使用一种自制的密封样品 holder（称为“&#34;三明治&#34;”），它由三个部分组成：载玻片、间隔垫片和盖玻片。
<ol>
	<li>将钢制垫片（56 × 56 × 0.5 mm3）置于显微镜载玻片（60 × 60 × 1 mm3）上，并将样品放置在载玻片上。</li>
	<li>小心地盖上石英盖玻片（60 × 60 × 0.5 mm3），用夹具固定所有组件，并按1:1比例配制双组分硅胶。使用石英盖玻片可匹配折射率，减少成像过程中的光学像差。</li>
	<li>使用1 mL注射器将双组分硅胶注入垫片与盖玻片之间的空隙中，静置干燥10分钟。</li>
	<li>取下夹具，用细针缓慢将68%（v/v）TDE注入整个样品夹心结构中。</li>
	<li>重新配制新鲜胶液并密封夹心结构。 
	&#8203;注意：如果在步骤6.1中TDE意外接触垫片，胶体将无法固化。确保在步骤6.2中不产生气泡。</li>
</ol>
7. 剥离
注意：SHORT 技术在保持组织结构完整的同时增强了表位的可及性，因此可通过去除抗体并用其他标记物对样本重新染色，实现切片的多轮标记。
<ol>
	<li>用刀片打开三明治结构，将样本放入带有螺旋盖的新培养皿中，加入30% v/v TDE溶液，室温孵育3小时。</li>
	<li>将样本转移至离心管中，用1× PBS（pH 7.4）在室温下轻轻振荡清洗3次，每次2小时，最后一次清洗过夜。</li>
	<li>将样本置于水浴中，80 °C条件下在透明化溶液中孵育4小时。</li>
	<li>用1× PBST（pH 7.4）在37 °C下轻轻振荡清洗3次，每次2小时，最后一次清洗过夜。此时样本已准备好，可从步骤4.8开始重新进行标记。 
	注意：每次操作均需向离心管中加入50 mL相应溶液。每份样本使用10 mL TDE溶液。</li>
</ol>

High-Resolution 3D Reconstruction of Human Brain with SHORT and LSFM

<ol><li>Costantini, I., Cicchi, R., Silvestri, L., Vanzi, F., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+and+ex-vivo+optical+clearing+methods+for+biological+tissues%3A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">In-vivo and ex-vivo optical clearing methods for biological tissues: review.</a> Biomedical Optics Express. 10 (10), 5251(2019).</li>
<li>Richardson, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing.</a> Nature Reviews Methods Primers. 1 (1), 84(2021).</li>
<li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li>
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<li>Lee, H., Park, J. -H., Seo, I., Park, S. -H., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+application+of+the+electrophoretic+tissue+clearing+technology%2C+CLARITY%2C+to+intact+solid+organs+including+brain%2C+pancreas%2C+liver%2C+kidney%2C+lung%2C+and+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine.</a> BMC Developmental Biology. 14 (1), 48(2014).</li>
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<li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+profiling+of+cells+and+circuits+in+mammals+by+tissue+clearing+and+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy.</a> Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).</li>
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<li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+clearing+agent+for+multi-modal+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging.</a> Scientific Reports. 5 (1), 9808(2015).</li>
</ol>

作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

对大面积人脑组织进行高分辨率成像和三维重建，需要先进行机械切片，随后对单个切片进行光学透明化处理和免疫标记。本文所述方案介绍了如何利用SHORT组织转化方法，快速、同步地处理多个人脑厚切片，以实现亚细胞分辨率的全脑三维重建，适用于光片显微镜（LSFM）成像。
与其他方法不同，SHORT 方法的透明化和多重标记步骤无需复杂的定制设备。大量样本可同时处理，从而缩短大尺寸人脑组织块的处理时间，并最大限度地减少技术变异性。
在处理陈旧的甲醛固定人体组织时，脱色和表位暴露处理至关重要。过氧化氢和碱性抗原修复溶液还可与其他透明化方法联合使用，例如 iDISCO6,28、CLARITY、SWITCH 和 SHIELD24。
为了确保表位信息的完整保留并实现灰质和白质的均匀透明化，有必要将样本转化为一种耐热且耐化学试剂的凝胶/组织杂合体。选择戊二醛是因为其具有优异的交联能力，并且在低pH（pH = 3）条件下能够有效渗透组织切片。戊二醛的浓度是决定组织强度和透明度的关键因素。较高浓度有助于更好地保存组织结构，但也会延长透明所需的时间。这一选择可在表位保留和均一透明之间实现理想的平衡。在关闭溶液（方案步骤2.1）的情况下，戊二醛的浓度经过精心选择和优化，以在有效交联与快速透明之间取得平衡18,25。SHORT方法特别适用于处理来自布罗卡区、海马体和大脑皮层的福尔马林固定人脑切片18,23,25。然而，在使用其他生物模型或不同脑区时，由于灰质和白质组成存在差异，可能需要进行一些调整。
本方案中的一个关键任务是优化透明化处理（方案步骤 3.4）以及抗体溶液（方案步骤 4.8 和 4.10）的孵育时间，这主要取决于样本尺寸和组织的生物学组成。我们估计，500 µm 是实现白质和灰质均达到最佳透明度，并在多种抗体染色中实现贯穿组织深度均匀标记的组织厚度上限（表 2）。有关这些过程的详细描述可参见 Pesce 等人18 和 Scardigli 等人24 的研究。不同脑区的脂质和蛋白质组成可能存在差异，而衰老的大脑会积累大量脂褐素类色素和神经黑色素，从而产生强烈的自发荧光信号，并影响探针在组织中的扩散。例如，来自人类布洛卡区、面积为 16 cm2、厚度为 400 µm 的脑片需要 7 天的透明化溶液处理，才能实现充分的去脂化；为确保在整个组织深度内染色均匀，其与一抗和二抗溶液的孵育时间分别需要 7 天和 6 天（图 3）。因此，在应用本方案所述的高通量流程之前，必须对透明化和标记步骤进行精细优化。
SHORT 技术能够将样本保存在定制的成像支架中，因为已证实其荧光信号至少可稳定保存一年。因此，研究人员可以预先制备所有的样本夹心结构，并将其储存，后续再进行成像操作。值得注意的是，用于制备夹心结构的显微镜载玻片、间隔片以及盖玻片，均可根据样本的尺寸进行定制。
采用本文所述SHORT方案处理的样本，使用定制的倒置LSFM18,23进行分析。该系统包含两个臂，每个臂配备12倍定制物镜，并带有折射率（RI）校正环。每个物镜同时作为照明和检测通道，能够在0.16 cm3/h的体积速度下同步采集两个通道的图像。由于样本 holder 可同时容纳两个样本夹心结构，我们可在10小时内连续对两个切片中的四个通道进行成像。由于TDE蒸气对呼吸系统具有轻微毒性，且为避免球面像差，样本 holder 中填充了91% v/v的甘油/水溶液，其折射率（1.46）与石英盖玻片和TDE溶液均相匹配。91% v/v的甘油/水溶液需每3天更换一次，以防止灰尘污染。因此，我们的LSFM可在后处理后以3.6 µm的各向同性分辨率实现低光漂白的快速样本成像18,23,29。所产生的大量数据通过自定义流程进行处理，使用自主研发的软件ZetaStitcher（https://github.com/lens-biophotonics/ZetaStitcher）对图像堆栈进行重切片和拼接23,29。
尽管我们结合了光片荧光显微镜使用SHORT方法，但根据实验室条件和具体应用需求，也可采用其他类型的荧光成像技术进行图像采集。例如，共聚焦显微镜25或双光子显微镜14可用于分析透明化样本。这类方法适用于体积相对较小的样本，因为它们属于扫描式系统，对大面积组织成像所需时间非常长30。光片荧光显微镜通过实现更快的成像速度，并将横向分辨率与轴向分辨率解耦，因此是成像大体积透明化样本的首选方法3,4,18,31,32,33。
综上所述，我们描述了一种快速、高通量的方案，可同时实现数十个死后人类脑切片的透明化、均一的共标记以及三维体积重建。通过将 SHORT 方法与光片荧光显微成像（LSFM）及计算分析相结合，能够获得用于全面开展人类脑细胞普查和蛋白质组学分析的三维数据。

分析人脑大体积样本的三维分子结构和细胞架构需要实现组织的光学透明，这通常通过耗时较长的处理流程来完成。光学透明化技术旨在最大限度地减少组织内部折射率（RI）的不均匀性，从而降低光散射，提高光穿透深度，以实现高分辨率成像1,2,3,4,5。近年来在透明化和深层组织标记方法上的进展，结合前沿显微成像技术，已可对完整的啮齿类动物器官和胚胎进行三维成像6,7,8,9,10,11,12。
然而，与模式生物相比，对死后人脑大范围区域进行容积式三维重建仍是一项具有挑战性的任务。复杂的生物组成以及多变的死后固定和储存条件可能会影响组织透明化效率、抗体渗透深度以及表位识别13,14,15,16,17,18,19。此外，为了实现对人大脑大范围区域的有效透明化和均匀标记，仍需进行机械切片，并对每一片组织进行后续的透明化和标记处理，这导致处理时间较长，并需要复杂的定制设备&#160;，相比之下，模式生物则无需如此15,20,21,22。
的 SWITCH - H2O2 抗原 R检索 -TDE（短时）组织转化技术已专门开发用于分析大量的人脑组织18,23该方法采用 SWITCH 试剂盒的组织结构保存技术11 并利用高浓度的过氧化氢降低组织自发荧光，结合表位修复技术。该方法可实现对人脑切片中不同神经元亚型、胶质细胞、血管以及髓鞘纤维标记物的均匀染色。18,24其结果适用于低密度和高密度蛋白质的分析。. 由此产生的高透明度和均匀标记可实现厚切片的荧光显微镜三维重建，特别是可使用快速成像的光片显微装置进行数据采集18,24,25,26,27.
在本研究中，我们描述了如何利用 SHORT 组织转化技术，对数十片福尔马林固定的成人脑组织切片进行同步透明化和多轮标记。可同时使用四种不同的荧光标记物，从而鉴定不同的细胞亚群。透明化后，可通过荧光显微镜进行高分辨率的三维成像。本文中我们使用了一台定制的倒置 LSFM18,24,25,26,27，该系统能够实现样本的快速光学切片，并行快速获取多个通道的图像。通过这一常规高通量实验流程，可对人脑大范围区域进行亚细胞分辨率水平的全面细胞与结构表征，此前已在全布罗卡区的图谱绘制中得到验证23。

<table><tbody><tr><td>2,2'-硫代二乙醇</td><td>Merck Life Science S.R.L.</td><td>166782</td><td></td></tr><tr><td>乙酰胺 &gt;= 99.0% (GC)</td><td>Merck Life Science S.R.L.</td><td>160</td><td></td></tr><tr><td>高电渗流琼脂糖</td><td>Merck Life Science S.R.L.</td><td>A9793</td><td></td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Merck Life Science S.R.L.</td><td>B7901</td><td></td></tr><tr><td>Compressome VF-900-0Z 切片机</td><td>Precisionary</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>LaserOptex</td><td>/</td><td>定制</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠盐二水合物</td><td>Merck Life Science S.R.L.</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>Merck Life Science S.R.L.</td><td>G7651</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC_29096</td><td></td></tr><tr><td>30% 过氧化氢</td><td>Merck Life Science S.R.L.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养箱 ISS-4075</td><td>Lab companion&amp;nbsp;</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>光片荧光显微镜 (LSFM)</td><td>/</td><td>/</td><td>自制</td></tr><tr><td>Loctite Attak</td><td>Henkel Italia srl</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Laborchimica</td><td>/</td><td>定制</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液片剂</td><td>Merck Life Science S.R.L.</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Picodent Twinsil</td><td>Picodent</td><td>13005002</td><td>已停产</td></tr><tr><td>邻苯二甲酸氢钾</td><td>Merck Life Science S.R.L.</td><td>P1088</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Merck Life Science S.R.L.</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Merck Life Science S.R.L.</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>亚硫酸钠</td><td>Merck Life Science S.R.L.</td><td>S0505</td><td></td></tr><tr><td>间隔片</td><td>Microlaser srl</td><td></td><td>定制</td></tr><tr><td>痰液收集容器（带螺旋盖的培养皿）</td><td>Paul Boettger GmbH &amp;amp; Co. KG</td><td>07.061.2000</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>PanReac AppliChem (ITW reagents)</td><td>A4577,0500</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck Life Science S.R.L.</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>离心管</td><td>Sarstedt</td><td>62 547254</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Merck Life Science S.R.L.</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>振动切片机 VT1000S</td><td>Leica Biosystem</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅&amp;nbsp;</td><td>Memmert</td><td>WNB 7-45</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;抗体与染料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure 羊驼抗兔 IgG (H+L)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>611-545-215</td><td>使用稀释度 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure 牛抗山羊 IgG (H+L)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>805-545-180</td><td>使用稀释度 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 AffiniPure 羊驼抗兔 IgG (H+L)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>611-605-215</td><td>使用稀释度 1:200</td></tr><tr><td>抗 NeuN 抗体</td><td>Merck Life Science S.R.L.</td><td>ABN91</td><td>使用稀释度 1:100</td></tr><tr><td>抗钙结合蛋白抗体 (PV)</td><td>Abcam</td><td>ab32895</td><td>使用稀释度 1:200</td></tr><tr><td>抗波形蛋白抗体 [V9] - 细胞骨架标记物 (VIM)</td><td>Abcam</td><td>ab8069</td><td>使用稀释度 1:200</td></tr><tr><td>钙视网膜蛋白多克隆抗体</td><td>ProteinTech</td><td>12278_1_AP</td><td>使用稀释度 1:200</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>D3571</td><td>使用稀释度 1:100</td></tr><tr><td>驴抗小鼠 IgG H&amp;amp;L (Alexa Fluor 568)</td><td>Abcam</td><td>ab175700</td><td>使用稀释度 1:200</td></tr><tr><td>驴抗小鼠 IgG H&amp;amp;L (Alexa Fluor 647)</td><td>Abcam</td><td>ab150107</td><td>使用稀释度 1:200</td></tr><tr><td>驴抗兔 IgG H&amp;amp;L (Alexa Fluor 568)</td><td>Abcam</td><td>ab175470</td><td>使用稀释度 1:200</td></tr><tr><td>驴抗大鼠 IgG H&amp;amp;L (Alexa Fluor 568) 预吸附</td><td>Abcam</td><td>ab175475</td><td>使用稀释度 1:200</td></tr><tr><td>山羊抗鸡 IgY H&amp;amp;L (Alexa Fluor 488)</td><td>Abcam</td><td>ab150169</td><td>使用稀释度 1:500</td></tr><tr><td>山羊抗鸡 IgY H&amp;amp;L (Alexa Fluor 568)</td><td>Abcam</td><td>ab175711</td><td>使用稀释度 1:500</td></tr><tr><td>山羊抗鸡 IgY H&amp;amp;L (Alexa Fluor 647)</td><td>Abcam</td><td>ab150171</td><td>使用稀释度 1:500</td></tr><tr><td>山羊抗兔 IgG H&amp;amp;L (Alexa Fluor 488)</td><td>Abcam</td><td>ab150077</td><td>使用稀释度 1:200</td></tr><tr><td>重组 Alexa Fluor 488 抗 GFAP 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab194324</td><td>使用稀释度 1:200</td></tr><tr><td>生长抑素抗体 YC7</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-47706</td><td>使用稀释度 1:200</td></tr><tr><td>血管活性肠肽 (VIP)</td><td>ProteinTech</td><td>16233-1-AP</td><td>使用稀释度 1:200</td></tr></tbody></table>

大规模人脑成像中用于光片荧光显微镜的光学透明化与标记技术

Optical Clearing and Labeling for Light-sheet Fluorescence Microscopy in Large-scale Human Brain Imaging

尽管过去十年中出现了多种组织透明化技术，但由于人脑的体积和结构复杂性，对死后人脑进行处理仍是一项具有挑战性的任务，这使得微米级分辨率的成像尤为困难。本文介绍了一种通过同时处理数十个脑片来重建人脑体积区域的方案，该方案采用SHORT（SWITCH - H2O2 - 抗原 R2,2'-硫代二乙醇的提取TDE]) 组织转化方案，可实现样本的透明化、标记及使用光片荧光显微镜（LSFM）进行连续成像。SHORT 方法可快速透明化厚切片并实现多种神经元标记物的均一多标，从而在白质和灰质中均可识别不同的神经元亚群。透明化后，切片可通过 LSFM 以微米级分辨率进行多通道同步成像，实现快速三维重建。将 SHORT 与 LSFM 分析结合于常规高通量流程中，可在短时间内实现大体积区域的高分辨率三维细胞构筑重建，从而实现对人脑结构的全面表征。

本方案采用SHORT方法，可同时处理厚度在100 µm至500 µm范围内的多个脑片，显著缩短了整个实验流程的处理时间。本文全面描述了同时处理多张死后人脑厚切片的完整流程（图1），并展示了同时处理24张切片的实验操作（图2A）。根据样本的大小和厚度，透明化与共标记所需时间在11至30天之间（表1），此时间不包括成像及成像后处理。在TDE中完成脱脂和折射率匹配后，所有组织切片的灰质和白质均达到理想且均匀的透明效果（图2B）。
图像采集可使用多种先进的荧光显微镜完成，包括共聚焦显微镜25和双光子显微镜14。本研究中采用了一台定制的倒置光片荧光显微镜（LSFM）18,23，配备405 nm、488 nm、561 nm和638 nm四条激发激光线，能够同时获取由荧光染料偶联抗体标记的四种不同生物学特征。图3A展示了来自人类布罗卡区400 µm厚切片的代表性图像，该样本共标记了神经元全标记物NeuN、两种不同中间神经元亚群标记物——生长抑素（SST）和钙视网膜蛋白（CR），以及细胞核标记物DAPI（图3A,B）。在400 µm厚的组织块中，我们观察到沿Z轴方向的荧光信号不仅局限于表面，而且在整个组织深度中几乎均匀分布，尽管信号强度在中间区域略有减弱（图3C）。
为了对人脑组织进行更全面的细胞表征，可以通过去除抗体并重新标记样本，对同一标本进行多轮染色，如 SHORT 原始论文中所示。图4（改编自 Pesce 等人18）展示了在一块经 SHORT 处理的 500 µm 厚组织切片上，连续三轮免疫染色中应用七种不同抗体的潜在效果。所使用的抗体包括 NeuN、SST、CR、Parvalbumin（PV）和血管活性肠肽（VIP），作为抑制性神经元标记物；胶质纤维酸性蛋白（GFAP）用于标记胶质细胞；波形蛋白（VIM）用于标记血管系统（表2）。结果表明，SHORT 方法在经历多次脱标处理后仍能有效保持组织信息，显著降低自发荧光信号，并实现高效的组织透明化。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65960/65960fig01.jpg" /> 
Figure 1: Timeline of SHORT. 示意图展示了使用SHORT方案处理样本所需的步骤。每个步骤中，数十个人脑组织切片被一同处理。包埋于琼脂糖并切片后，样本分别置于Switch-on和Switch-off溶液中各1天；灭活步骤过夜完成，而通过孵育于透明溶液中进行脱脂则需要3-7天。随后，样本与一抗和二抗溶液分别孵育最多7天和6天。折射率匹配后，样本被装载到样品夹（三明治结构）中，用于光片荧光显微镜成像和储存。在三明治结构组装完成后的任何时间，样本均可进行洗脱和重新标记，以检测不同标志物。缩写：TDE = 2,2'-硫代二乙醇；SHORT = 开关-过氧化氢-抗原修复-TDE；o/n = 过夜；RI = 折射率；LSFM = 光片荧光显微镜。&#39;-thiodiethanol; SHORT = SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval -TDE; o/n = overnight; RI = refractive index; LSFM = light-sheet fluorescence microscopy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65960/65960fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65960/65960fig02.jpg" /> 
图2来自布罗卡区组织块的同期处理人脑切片 (A布罗卡区连续24个切片，尺寸为4 × 4 × 0.04 cm3 在使用 SHORT 方法处理前，用 PBS 清洗。B)&#160;相同的样本在 A 经 SHORT 处理后显示。比例尺 = 1 cm。缩写：TDE = 2,2'-硫代双乙醇；SHORT = SWITCH - H2O2 - 抗原 R检索 -TDE；PBS = 磷酸盐缓冲液。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65960/65960fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65960/65960fig03.jpg" /> 
图3代表性光片显微镜图像，显示经四种不同标记物标记的透明化组织切片。 (A最大强度投影图像（分辨率为 3.3 x 3.3 x 3.3 &#181;m3) 显示了布罗卡区经 SHORT 处理的切片在 NeuN、生长抑素、钙视网膜蛋白以及核标记物 DAPI 染色后的介观重建图像。右侧为合并图像（NeuN-SST-CR-DAPI）。比例尺 = 0.5 cm。B) 合成图像中放大插图 A比例尺 = 100 &#181;m.&#160;(C) 高分辨率（0.55 × 0.55 × 3.3 &#181;m来自 (B) 的 yz 图像。比例尺 = 100 &#181;m缩写：TDE = 2,2'-硫代双乙醇；SHORT = SWITCH - H2O2 - 抗原 R检索 -TDE；LSFM = 光片荧光显微镜；NeuN = 神经元核抗原；SST = 生长抑素；CR = 钙视网膜蛋白；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65960/65960fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65960/65960fig04.jpg" /> 
图4：SHORT处理切片中多轮染色的代表性光片显微镜图像。 (A) 人脑切片在 PBS 中预清除及多轮标记并进行折射率匹配（68% TDE）后的图像。比例尺 = 1 cm。B)&#160;多轮连续成像中各通道的合并结果。该图像显示了使用血管活性肠肽、生长抑素、甲状旁腺素、钙视网膜蛋白、神经元核抗原、胶质纤维酸性蛋白和波形蛋白标记的白质和灰质。高分辨率（分辨率为 0.55 x 0.55 x 3.3 &#181;m），单通道图像显示在图像右侧及下方。比例尺 = 100 &#181;m 所有图像均适用，星形胶质纤维酸性蛋白（GFAP）除外（比例尺 10 = &#181;m). (C最大强度投影图像 500 &#181;m-厚切片显示了三轮连续免疫染色中使用的七种不同抗体的信号。第一轮：PV-SST-VIP；第二轮：CR-SST-NeuN；第三轮：VIM-SST-GFAP。比例尺 = 1 mm。该图改编自 Pesce 等人。18缩写：TDE = 2,2'-硫代双乙醇；SHORT = SWITCH - H2O2 - 抗原 R检索 -TDE；LSFM = 光片荧光显微镜；NeuN = 神经元核抗原；SST = 生长抑素；CR = 钙视网膜蛋白；PV = 甲状旁腺素相关蛋白；GFAP = 胶质纤维酸性蛋白；VIM = 波形蛋白；VIP = 血管活性肠肽 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65960/65960fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
表1：不同面积和厚度样本的SHORT处理代表性时长。 不同面积和厚度的样本在透明化和抗体溶液中所需的孵育时间各不相同，导致整个SHORT流程的总时长存在差异。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65960/65960_Table 1 (1).xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表2：适用于SHORT的抗体。 本表格列出了所有在400-500 µm厚的人脑组织样本中经SHORT方案测试并显示出特异性染色的抗体。P/M列表示多克隆和单克隆抗体。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65960/65960_Table 2.xls" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

本方案提供了一种结合（的逐步操作流程，用于对数十个死后人类脑切片进行快速且同步的光学透明化、多轮标记及三维体积重建SWITCH - H2O2 - 抗原 R2,2'-硫代二乙醇的提取TDE]) 短时组织转化技术结合光片荧光显微成像的常规高通量实验方案

尽管在过去十年中出现了 numerous 透明化技术，由于其……，处理死后人类大脑仍然是一项具有挑战性的任务。

人脑是一个跨越不同尺度的复杂器官。要理解其功能，必须构建覆盖全脑的详细共识图谱。我们常规的高通量实验方案能够以微米级分辨率分析人脑体积载体的组织架构，从而实现对其结构的表征。对人类大脑大范围区域进行容积重建时，面临诸多实验挑战，这些挑战与脑组织样本的巨大尺寸、复杂的生物组成、多变的死后固定与储存条件，以及脂褐素类色素产生的自发荧光信号密切相关。上述因素均可能影响透明化效率及成像质量。与其他透明化技术相比，短时组织转化方法结合实时片层显微成像技术，可用于快速且同步地处理多个人脑切片。这些步骤可实现亚细胞分辨率的三维脑组织重建。首先，取一个含有磷酸盐缓冲液（PBS）的烧杯，加入琼脂糖以制备4%的琼脂糖溶液。将经甲醛固定的中国台湾人脑组织块包埋于该琼脂糖溶液中。让其冷却至室温，并在4°C下保存24小时。为实现精确切片，将样品固定于振动切片机的样品盘上，并向切片槽中加入冷的PBS。根据待切组织的类型，调节振动切片机的频率、振幅和切片速度。切片完成后，将所有切片转移至含有0.01%叠氮化钠的磷酸盐缓冲液（PBS）防腐溶液中。首先将福尔马林固定、石蜡包埋的脑组织切片放入带螺旋盖的培养皿中，加入关闭液（switch off solution），用铝箔包裹，于4°C条件下振荡孵育一天。第二天，将所有样品转移至新的培养皿中，并按照之前所示方法加入转换开启溶液进行孵育。孵育结束后，将样品放入离心管中，用 PBS 洗涤三次，每次两小时，同时振荡。然后向样品中加入灭活溶液，于37摄氏度水浴中孵育过夜。进行三次洗涤后，向样品中加入透明溶液，并在55摄氏度水浴中孵育三至七天。孵育结束后，在37摄氏度孵育箱中用PBST洗涤样品三小时。次日，向每个样品中加入10毫升30%过氧化氢，并在室温下振荡洗涤三次，每次10分钟，每次使用PBS洗涤。接下来，将抗原修复液在水浴中预热至95摄氏度。将样品转移至预热的溶液中，在95摄氏度下孵育10分钟，随后在摇床上室温孵育40分钟。在摇动条件下，用去离子水洗涤样品5分钟。用 PBS 平衡样品。然后将样品转移至带螺旋盖的培养皿中。在烧杯中为所有样品配制新鲜的一抗溶液后，加入样品中，并在 37 °C 下避光轻柔振荡孵育 1 至 7 天。然后，将样品放入离心管中，用预热的PBST在37摄氏度的培养箱中洗涤。将样品转移至带螺旋盖的培养皿中，并加入用PBST和0.01%叠氮化钠配制的二抗。再将样品转移至离心管中，用预热的PBST在37摄氏度振荡洗涤三次，每次两小时。为了实现折射率匹配，将样品放入新的培养皿中，并加入30%的TDE溶液。然后将样品中的30% TDE替换为68%的TDE溶液，并在室温下震荡孵育。经过短暂处理后，灰质和白质的所有组织切片均达到了最佳且均匀的透明效果。首先，取一张使用短时组织转化技术制备的脑组织切片。然后将钢制垫片放置在载玻片上，并将样本置于载玻片上。小心地将石英盖玻片覆盖在样本上，并固定所有组件。现在将双组分硅胶按等比例混合。使用1毫升注射器，将双组分硅胶注入垫片与盖玻片之间的空隙中。取下固定组件的夹子。使用细针缓慢地将68%TDE注入整个封片夹心结构中，并用新配制的封片胶密封夹心结构。成像完成后，用刀片轻轻打开封片夹心，将样本转移至装有螺口盖的新培养皿中，加入30%TDE溶液浸泡3小时。然后将样品转移至离心管中，用 PBS 在室温下轻轻振荡洗涤三次，每次两小时。将样品置于透明化溶液中，并在 80 摄氏度的水浴中孵育四小时。孵育结束后，按前述方法用 PBS 洗涤样品。人布罗卡区共标记了 NeuN、生长抑素，显示出两种不同的中间神经元亚群。经过多轮染色和短时处理的脑片通过光片荧光显微镜成像，显示白质和灰质被多种神经元标记物标记。对500微米厚脑片进行最大强度投影成像，展示了三轮连续免疫染色中使用的七种不同抗体的信号。

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神经科学

光片荧光显微镜在大规模人脑成像中的光学透明化和标记

本文介绍一种快速、简便的方法，用于在半厚脑切片中对荧光标记的细胞进行成像。通过固定、切片并进行光学透明化处理脑组织，我们描述了如何利用标准的落射荧光或共聚焦成像技术，在完整的神经组织中观察单个细胞及神经元网络。...

一种用于半厚脑切片高分辨率荧光成像的快速方法

通过在成像前对器官进行光学透明化处理，可实现对整只小鼠器官的多光子显微成像，但并非所有方案都能保留荧光蛋白的荧光信号。我们采用基于乙醇脱水和苯甲醇：苯甲酸苄酯透明化的光学透明方法，展示了表达黄色荧光蛋白（YFP）的整只小鼠脑组织的高分辨率多光子图像。...

表达黄色荧光蛋白的小鼠脑组织透明化后的多光子显微成像

来源： Pekarek, B. T., et. al., 通过CLARITY组织透明化技术对完整神经元树突进行成像与定量分析。J. Vis. Exp.

完整小鼠脑组织中树突分支及树突棘形态的共聚焦显微成像

本文中，我们详细描述了以高分辨率重建荧光标记小鼠大脑精细脑解剖结构的完整实验流程。所述方案包括样本制备与透明化处理、成像用样本的装载、数据后处理以及多尺度可视化。...

利用共聚焦光片显微镜对整只小鼠大脑进行微米级分辨率光学断层成像

光学透明化技术正在彻底改变组织成像的方式。在本报告中，我们描述了对原始的“清除脂质-丙烯酰胺杂交的刚性成像兼容组织水凝胶”（CLARITY）方案所进行的改进，这些改进可获得更一致且成本更低的结果。...

小鼠中枢神经系统的被动CLARITY光学透明化处理

ACT-PRESTO（活性透明技术——基于压力的高效稳定大分子递送至器官）能够实现快速、高效且低成本的组织透明化，并通过被动扩散或压力辅助递送方式，促进抗体快速渗透入透明化组织。利用该方法，可对多种组织进行透明化处理，使用多种抗体进行免疫标记，并实现整体体积成像。...

ACT-PRESTO：用于大体积成像的生物组织透明化与免疫标记方法

神经元树突的形态通常与其功能相关。事实上，许多影响神经元发育的疾病过程均表现为形态学表型。本方案描述了一种简单而强大的方法，用于分析完整的树突分支及其相关的树突棘。...

通过CLARITY组织透明技术对完整神经元树突进行成像与定量分析

本方案提供了一种利用组织透明化方法ScaleSF对脑切片进行神经元成像的详细操作流程。该方案包括脑组织制备、组织透明化处理、透明化切片的操作以及从介观到微观水平对神经元结构进行共聚焦激光扫描显微镜成像。...

一种用于从介观到微观尺度神经元成像的组织透明化方法

利用可诱导的转基因谱系示踪小鼠品系，通过荧光蛋白对干细胞及其子代进行永久性标记，可实现对干细胞的活化、增殖、迁移和/或分化进行空间和时间上的分析 体内谱系示踪可揭示有关谱系定向、对干预措施的响应以及多能性方面的 novel...

成年小鼠大脑中可诱导荧光标记干细胞的谱系示踪

本方案描述了使用iDISCO+对完整小鼠脑组织进行磁共振成像、透明化处理和免疫标记的方法，随后详细介绍了利用光片显微镜进行成像，以及使用NuMorph进行后续分析的步骤。...

利用MRI、组织透明化和光片显微镜对完整新生小鼠脑进行全脑单细胞成像与分析

我们介绍了一种名为光学多层干涉断层成像（Optical Multilayer Interference Tomography,...

一种与扫描电子显微镜兼容的光学成像方法用于介观全细胞脑图谱绘制

了解光片荧光显微镜结合SHORT组织透明化技术用于人脑切片三维成像的方法。该技术实现多轮免疫标记和亚细胞分辨率重建，为神经科学研究提供高通量脑结构分析方案。

大规模人脑成像中用于光片荧光显微镜的光学透明化与标记技术

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