Name: 使用 Harwell 的结晶设施和 Beamline VMXi（金刚石光源）进行结晶和 原位 室温数据收集 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-08T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: 了解利用Harwell结晶设施和VMXi同步辐射光源进行蛋白质结晶与原位室温X射线数据收集的完整流程。该方法无需低温冷却即可在20摄氏度下直接分析晶体结构，为药物开发和结构生物学研究提供高通量解决方案。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢众多来自Diamond Light Source的科学家和支持团队成员，他们为VMXi光束线的设计、建造和运行做出了贡献。我们感谢光束线用户，他们提出的想法后来推动了结晶和数据采集流程的开发。哈威尔结晶设施由Diamond Light Source有限公司、罗莎琳德·富兰克林研究所和医学研究理事会提供支持。

Automated Protein Crystallization and Real-Time Data Collection

<ol><li>Lynch, M. L., Snell, M. E., Potter, S. A., Snell, E. H., Bowman, S. E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((20+years+of+crystal+hits%3A+Progress+and+promise+in+ultrahigh-throughput+crystallization+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">20 years of crystal hits: Progress and promise in ultrahigh-throughput crystallization screening.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 79 (Pt 3), 198-205 (2023).</li>
<li>Fischer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+room+temperature+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Macromolecular room temperature crystallography.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 54, 1(2021).</li>
<li>Helliwell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+structural+chemistry+of+the+living+organism+at+its+temperature+and+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">What is the structural chemistry of the living organism at its temperature and pressure.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 76 (Pt 2), 87-93 (2020).</li>
<li>Thorne, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+biomolecular+structures+near+room+temperature+using+x-ray+crystallography%3A+Concepts%2C+methods+and+future+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Determining biomolecular structures near room temperature using x-ray crystallography: Concepts, methods and future optimization.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 79 (Pt 1), 78-94 (2023).</li>
<li>Keedy, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+cryocooling+distorts+conformational+heterogeneity+in+a+model+michaelis+complex+of+dhfr%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Crystal cryocooling distorts conformational heterogeneity in a model michaelis complex of dhfr.</a> Structure. 22 (6), 899-910 (2014).</li>
<li>Huang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+ligand+binding+of+endothiapepsin+by+%27temperature-resolved%27+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Probing ligand binding of endothiapepsin by 'temperature-resolved' macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 78 (Pt 8), 964-974 (2022).</li>
<li>Sanchez-Weatherby, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vmxi%3A+A+fully+automated%2C+fully+remote%2C+high-flux+in+situ+macromolecular+crystallography+beamline%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Synchrotron+Radiation%22%5BJournal%5D)">Vmxi: A fully automated, fully remote, high-flux in situ macromolecular crystallography beamline.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 26 (Pt 1), 291-301 (2019).</li>
<li>Jacquamet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+vapor+diffusion+crystallization+drops+with+an+x-ray+beam%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of vapor diffusion crystallization drops with an x-ray beam.</a> Structure. 12 (7), 1219-1225 (2004).</li>
<li>Mikolajek, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-to-structure+pipeline+for+ambient-temperature+in+situ+crystallography+at+vmxi%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Protein-to-structure pipeline for ambient-temperature in situ crystallography at vmxi.</a> IUCrJ. 10, 420-429 (2023).</li>
<li>Douangamath, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Achieving+efficient+fragment+screening+at+xchem+facility+at+diamond+light+source%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualised+Experiments%22%5BJournal%5D)">Achieving efficient fragment screening at xchem facility at diamond light source.</a> Journal of Visualised Experiments. (171), (2021).</li>
<li>Delageniere, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ispyb%3A+An+information+management+system+for+synchrotron+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Ispyb: An information management system for synchrotron macromolecular crystallography.</a> Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).</li>
<li>Fisher, S. J., Levik, K. E., Williams, M. A., Ashton, A. W., Mcauley, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchweb%3A+A+modern+interface+for+ispyb%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Synchweb: A modern interface for ispyb.</a> Journal of Applied Crystallography. 48 (Pt 3), 927-932 (2015).</li>
<li>Jenkins, J., Cook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito%C2%AE%3A+An+accurate+nanoliter+dispensing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22JALA%3A+Journal+of+the+Association+for+Laboratory+Automation%22%5BJournal%5D)">Mosquito®: An accurate nanoliter dispensing technology.</a> JALA: Journal of the Association for Laboratory Automation. 9 (4), 257-261 (2016).</li>
<li>Gildea, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xia2.Multiplex%3A+A+multi-crystal+data-analysis+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Xia2.Multiplex: A multi-crystal data-analysis pipeline.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 78 (Pt 6), 752-769 (2022).</li>
<li>Winter, G., Mcauley, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+data+collection+for+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Automated data collection for macromolecular crystallography.</a> Methods. 55 (1), 81-93 (2011).</li>
<li>Jumper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+accurate+protein+structure+prediction+with+alphafold%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Highly accurate protein structure prediction with alphafold.</a> Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).</li>
<li>Winter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dials+as+a+toolkit%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Dials as a toolkit.</a> Protein Science. 31 (1), 232-250 (2022).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

我们已描述了从蛋白质样品送至中心实验室（CF）到用户下载最终数据以用于后续应用的完整流程。关键步骤包括制备高质量的蛋白质样品，以及采用商业化的稀疏矩阵筛选试剂盒或基于已有条件的优化筛选试剂盒进行适当的晶体筛选。该过程可在中心实验室内完成，用户也可在各自实验室中进行结晶实验，并将合适的结晶板送至同步辐射光束线。对于某些样品，特别是存在辐射损伤风险的样品，确定合适的数据收集参数可能至关重要。在大多数情况下，自动化数据处理已足以回答科学问题，但用户仍可使用光束线工具对数据重新处理，例如当空间群不明确，或仅使用收集数据的初始部分以最小化辐射损伤效应时。
如果初始结晶实验未能获得合适的晶体，可尝试改变蛋白质浓度、纯度或结晶筛选条件，也可采用晶体接种方法。若晶体在光束线上无法衍射至可用分辨率，可使用未衰减的光束进行网格扫描，以评估晶体的本征衍射极限和晶胞参数，从而指导后续优化工作。对于在板内过小而无法进行数据收集的晶体（例如，&#60;10 µm），可考虑用于串行晶体学或纳米聚焦实验（例如，在Diamond同步辐射光源的VMXm光束线）。利用VMXi数据通过分子置换法求解结构通常较为直接，特别是随着AlphaFold16的出现，能够提供高效的搜索模型。若分子置换不成功，可将晶体从板中取出并进行冷冻处理，以开展常规的单波长反常散射、多波长反常散射或长波长相位实验。
该方法的优势包括能够直接从结晶板中快速获取高质量的数据集和反馈，而无需将晶体从其生长环境中取出。结构生物学领域所谓的“室温复兴”高度重视在非冷冻条件下获得的结构，以探索更具生理相关性的蛋白质动态2。通常，与优化后的冷冻晶体相比，分辨率略低，但这仅在已建立合适的冷冻条件，且晶体对机械操作及结晶液滴的开启具有足够稳定性时才成立3。该技术流程非常适用于一个即将广泛应用的场景：在药物发现中，对蛋白质-配体复合物或片段化合物在室温下进行大规模筛选。配体或片段分子可通过共结晶方式引入，也可在室温数据收集前通过移液器或声波液滴喷射技术添加。另一个应用是高效地对数百甚至数千个晶体快速采集数据，然后利用 DIALS17 multiplex14 软件提取等形态簇，这些簇可能代表不同的生物实体，或用于确定经不同处理或暴露于不同配体或信号的晶体群体之间的统计学显著差异。

X射线晶体学仍是理解蛋白质结构与功能的关键工具，可提供蛋白质或其与底物、药物候选分子等复合物的高分辨率结构。然而，在许多情况下，获得具有理想特性的晶体——即高衍射分辨率、适合浸泡实验且无孪晶等晶体缺陷的晶型——仍然是一个显著的技术瓶颈1。由于通常无法预测获得蛋白质晶体的合适化学条件，因此常规做法是开展涵盖数千种潜在化学混合物的结晶筛选实验，通常借助自动化或机器人系统设置筛选条件，并利用晶体保存库对结晶液滴图像进行监测，且常常通过远程方式记录和观察。
当晶体出现后，通常需要用尼龙环或卡普顿环从结晶环境中取出，然后转移到含有冷冻保护剂的液滴中（冷冻保护剂的筛选是另一个变量），再浸入液氮中进行快速冷冻。从结晶到X射线数据收集之间的这些额外步骤可能会导致结晶液滴在密封环境被破坏后发生脱水，晶体在操作过程中受到机械应力，以及冷冻保护剂对晶格造成损伤（通常表现为镶嵌度增加）等因素的影响2。此外，晶体 harvesting 耗时且劳动密集，可能导致样品间的不均一性，尤其是在 harvesting 过程中液滴表面形成“皮肤”时更为明显。VMXi 光束线使得即使晶体粘附在培养板上，也能获得可用的数据，而这些晶体在常规情况下通常会被弃用而无法用于数据收集。
绝大多数X射线晶体结构均采用上述方法在100 K条件下测定，这使得晶体的运输和操作更为简便，并使晶体在X射线束中的寿命延长数个数量级。然而，目前人们日益关注在非低温条件下测定结构，即更接近与蛋白质功能相关的生理条件2,3,4。这种方法能够更准确地反映蛋白质的动态结构，避免氨基酸构象或环区被冻结在无功能意义的状态5，并可在更接近蛋白质在细胞及生物体内自然环境的条件下研究配体结合过程6。
一种在多功能大分子晶体学中实施的替代方法 原位 位于英国 Diamond Light Source 同步辐射装置的 (VMXi) 光束线，旨在在常温常压条件下，无需扰动晶体，直接在晶体生长环境（即结晶板内）中测量其衍射数据7,8这使得结晶筛选和优化能够快速提供反馈，指导用户获得满足其需求的最佳晶体形态。同时，该方法还能以自动化方式获得高质量的室温晶体结构。9.
本方案假设用户已准备好高纯度的蛋白质样品用于结晶。我们将介绍用户在哈威尔结晶设施进行蛋白质结晶，并利用VMXi光束线收集数据的全过程（图1）。
哈威尔结晶设施
位于哈威尔研究中心（RCaH）内的哈威尔结晶设施（CF）毗邻钻石光源（Diamond Light Source）。该设施为用户提供一个高通量的自动化大分子结晶实验室，利用机器人技术进行结晶筛选、晶体优化、晶体成像和表征。通过与高度自动化的 VMXi 光束线紧密整合，室温结构解析的速度已显著加快，能够在非低温条件下实现对新型蛋白质结构、蛋白质-配体和DNA-配体复合物的表征，以及自动化的片段筛选（图1）。
结晶筛选（CF）平台是一套集成了多种仪器的系统，包括纳升级结晶机器人9，用于可溶性蛋白和膜蛋白的结晶；液体处理机器人，用于制备商业化结晶筛选试剂盒以及复杂的定制优化筛选体系；以及四台成像仪器（其中一台位于4 °C，三台位于20 °C，用于结晶板的成像，参见材料表）。其中一台成像仪可用于脂质立方相（LCP）玻片的成像，另一台成像仪配备多通道荧光光学系统（均位于20 °C）。
目前，该设施已被广泛的学术和工业用户广泛使用，包括膜蛋白实验室（MPL；https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/MPL.html）、XChem 片段筛选平台10、MX 光束线、XFEL 中心以及罗莎琳德·富兰克林研究所（RFI）。这一成熟且经过优化的流程使得结晶实验能够应用于广泛的结构生物学项目中。本文描述了旨在用于 VMXi 进行数据收集的晶体处理流程，尽管晶体也可被收获后进行低温冷冻，或送入 XChem 流程。
用户通过 Diamond MX 提案系统（https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Synchrotron-Access.html）申请使用权限，工业用户可获得 Diamond 工业联络组的支持。所有用户均可携带样品或样品板前往现场，样品板可手动运输。不建议通过快递寄送样品板，因为根据我们的经验，液滴可能会偏离其原始点样位置，或因结晶储液池的影响而受损。 Alternatively，经事先安排，用户也可将蛋白样品寄送至 CF，由工作人员代为设置结晶实验。用户可通过远程方式监控实验进展：对于 CF 实验，用户可登录 Rock Maker Web；对于 VMXi 实验，则可通过 ISPyB 系统进行监控。用户可根据在 Diamond 收集到的 X 射线衍射结果，以迭代方式申请 CF 的后续使用权限。
英国钻石光源的 VMXi 光束线
光束线VMXi（下文简称&#34;该光束线&#34;）是一种独特且新近开发的仪器，专用于室温下高度自动化的X射线晶体学研究，重点在于从适合的结晶板中的晶体采集数据。该光束线提供微聚焦（10 × 10 µm）、粉红光束（带宽 &#60;5 × 10-2ΔE/E），并在16 keV时具有约2 × 1013 光子/秒的高通量7。这种高通量光束结合快速探测器，可实现极高的样品通量，并能采集尺寸大于10 µm的样品的数据。
结晶板通过存储在样品存储系统中进入光束线，并根据用户提供的日程安排进行成像，同时通过ISPyB11界面SynchWeb12对板进行注册。通常建议用户选择斐波那契序列的时间点进行成像（从板进入系统开始计时：0、12、24、36、60……7,320小时）。当某块板完成成像后，用户将收到电子邮件通知。用户可根据需求选择可见光或紫外光成像。样品存储系统拍摄的图像由机器学习算法进行分析，该算法可自动识别并定义类似晶体的物体的兴趣点，并将这些兴趣点注册，供用户添加至数据采集队列。用户也可手动点击可见光图像以注册兴趣点，或通过点击并拖拽选定区域，由光栅扫描方式进行分析。这些兴趣点将与自动识别的兴趣点一同提供给用户，供其添加至队列中。
当所有样品均具备合适的数据采集参数后，该样品板将进入队列。当样品板排到队列首位时，会自动被送入光束线。结晶板由机器人手臂从晶体储存库自动装载至光束线，随后通过图像匹配，根据用户自定义的指令，对每个选定的晶体采集最多60°旋转范围的晶体学数据集。样品板中的所有液滴均可用于光束线上的这些实验。系统会自动合并来自多个晶体的数据，生成同晶型且经过最优合并的数据集7,9。当所有队列中的数据集采集完成后，用户将收到一封电子邮件，其中包含一个链接，可点击查看ISPyB系统中的数据集，方式与其他Diamond MX光束线相同11。用户也可访问光束线网页（https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/VMXi.html）获取更多信息。&#160;

<table><tbody><tr><td>配方器</td><td>Formulatrix</td><td>按需提供</td><td>液体处理机器人</td></tr><tr><td>Formulatrix 成像仪</td><td>Formulatrix</td><td>按需提供</td><td>结晶板成像仪</td></tr><tr><td>Greiner CrystalQuick X&amp;nbsp;</td><td>Greiner</td><td>Z617644</td><td>结晶板</td></tr><tr><td>Gryphon&amp;nbsp;</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>620-1000-10&amp;nbsp;</td><td>结晶机器人</td></tr><tr><td>MiTeGen Insitu-1</td><td>Mitegen</td><td>InSitu-01CL-40</td><td>结晶板</td></tr><tr><td>Mosquito LCP&amp;nbsp;</td><td>(SPT Labtech)</td><td>按需提供</td><td>结晶机器人</td></tr><tr><td>Rock Imager &amp; Maker</td><td>Formulatrix</td><td>按需提供</td><td> 成像仪软件&lt;br/&gt; [1] https://formulatrix.com/protein-crystallization-systems/rock-maker-crystallization-software/ </td></tr><tr><td>Scorpion</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>640-1000-10&amp;nbsp;</td><td> 液体处理机器人&lt;br/&gt; https://www.artrobbins.com/scorpion </td></tr></tbody></table>

结晶与 原位 使用哈威尔结晶设施和钻石光源 vmxi 光束线在室温下收集数据

Crystallization and In Situ Room Temperature Data Collection Using the Crystallization Facility at Harwell and Beamline VMXi, Diamond Light Source

使用哈威尔结晶设施进行机器人蛋白质结晶的实验方案 原位 在钻石光源VMXi光束线上从结晶板中进行室温数据采集的方法被描述。该方法能够以简便的方式从多个晶体中测定高质量的室温晶体结构，为结晶实验结果提供快速反馈，并支持序列晶体学研究。室温结构在解析蛋白质结构、配体结合及动力学行为方面的价值正日益受到结构生物学领域的重视。该实验流程向全球用户开放，并提供多种访问模式。所设置的结晶实验可通过远程成像并在线查看，晶体由机器学习工具自动识别。数据采集采用基于队列的系统，对用户选定的晶体进行最多60°旋转的数据收集。特定孔或样品组内所有晶体的数据由xia2.multiplex自动合并，结果可通过网页浏览器界面直接访问。

结晶设施与 VMXi 光束线已被用于多种类型的科研项目和应用场景。以下列举少量实例，用以说明用户可能希望开展的研究方向。
案例研究 1：标准数据采集
该光束线能够在结晶板中仅使用少量晶体快速测定室温下的晶体结构。所需晶体的最小数量取决于空间群和晶体取向，通常为1至4颗，但通过合并数十颗晶体的数据可获得更高质量的衍射数据。最近的一个实例是光束线标准样品之一——甜蛋白（thaumatin）。如图8A所示，多颗晶体按照方案第2.3节所述手动标记用于数据采集。这些晶体按照方案第2.4节所述添加至采集队列，并从下拉列表中选择实验参数。应用实验参数后，将整块板加入数据采集队列。数据集的采集、自动缩放与合并均按照方案第3节所述，通过xia2.multiplex流程完成。SynchWeb的示例输出结果如图8A中部所示。五个合并后的数据集最终获得分辨率为1.66 Å的数据。对于每个孔中约五颗晶体的标准数据采集，数据采集过程可在2.5分钟内完成。
案例研究 2：配体结合——使用 Mac1 蛋白的片段实验
利用该光束线可在室温下直接获得蛋白质-配体复合物的结构。配体可通过手动方式或声波液滴注入法加入结晶板上的液滴中，并在适当的孵育时间后采集数据。在本文所述示例中，一系列片段化合物被分配至含有SARS-CoV-2病毒蛋白nsp3的第一个宏结构域（Mac-1）晶体的结晶板孔中。根据实验方案第2.5步所述，将两个含有相同片段的孔设为一组。按照实验方案第2.3和2.4步的描述，共标记了42个晶体用于数据采集，并使用标准参数（60°旋转，0.1°步长，0.00178秒曝光时间，5%透光率，每晶体16 keV）采集数据集（图8B）。来自两个孔的数据集通过xia2.dials流程自动处理，随后启动xia2.multiplex流程，自动合并其中22个数据集。接着对这些流程的输出结果运行DIMPLE程序，获得的电子密度图清晰显示了片段结合的证据。片段模型被构建到未占据的电子密度中，并进一步精修（图8B右侧）。通过这一系列步骤可便捷地测定室温下配体结合的结构，从而为基于结构的药物设计提供宝贵的信息与反馈。此次共对多个孔中的42个晶体进行数据采集，整个过程在10分钟内完成。
案例研究3：低对称性空间群与择优取向下的结构解析 通过细胞色素c型气体结合蛋白的结晶实验，获得了具有片状形貌的多晶堆叠样品（图8C）。通过选择堆叠边缘多个仅有一个晶体处于X射线束中的位置，成功合并了四颗晶体的衍射数据，获得了分辨率达1.75 Å的高质量数据集，尽管其空间群为单斜晶系（C2）。该方法使项目得以快速推进，无需进一步优化结晶条件。此结果此前已有报道9。在此四颗晶体的单孔数据收集中，数据采集在2分钟内完成。
案例研究 4：利用串行晶体学技术从平板中的微晶获取信息及室温结构
当液滴中出现微晶，或用户希望在同步辐射或XFEL光源上进行序列晶体学实验之前，以批量方式优化微结晶方案时，使用最少的样品快速获得不同实验条件下晶体的衍射特性和晶胞参数信息非常有帮助。在此应用场景中，将批量培养的溶菌酶微晶用移液器转移至结晶板中（每滴体积为200 nL），并通过步长为10 µm的网格扫描方式对八滴样品进行数据采集（图9）。共收集到25,906张静态图像，采用序列晶体学软件进行处理，其中9,891张衍射图样被成功索引并合并，最终获得分辨率为2.0 Å的数据集，该数据集与已发表的室温结构（使用PDB 8A9D进行比对，Rwork = 19.6%，Rfree = 23.6%）拟合良好（表1）。该结果实现了对晶胞分布的详细分析，并完成了微晶在室温下的结构测定，可为包括时间分辨研究在内的复杂序列晶体学实验提供支持。整个实验所需的微晶悬液总体积仅为1.6 µL。通过在八个孔中采用网格扫描方式进行数据采集，全部数据集在40分钟内完成收集。
<img alt="晶体学工作流程图；包括结晶、成像和数据收集流程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65964/65964fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：整合了结晶筛选、在结晶设施中进行优化、在 VMXi 无需取样进行室温自动化数据采集与处理、XChem 片段筛选以及在其他 MX 光束线进行数据采集的“从蛋白质到结构”流程示意图。 用户可通过提供样品或将培养板送至 VMXi 光束线来启动该流程。缩写：Versatile Macromolecular Crystallography in situ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65964/65964fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="微量滴定板数据分析工作流程；六面板设置过程示意图；酶活性分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65964/65964fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：用于设置结晶板的 Mosquito SPT Labtech 界面。（A）(1) MiTeGen In Situ-1 设置界面。通过选择 (2) 96孔板 类型并选择 (3) MiTeGen 2滴标准板 来设定 MiTeGen 2滴标准板。为更改液滴1和液滴2的定义参数（VMXi 所需），点击 (4) 编辑 图标。这将打开一个新窗口（B），其中 (5) 需按图示修改X 和 Y 偏移量。选择（B）子孔 2 和（C）子孔 3，并相应地更改数值。（D）CrystalQuickX 设置界面。通过选择 96孔板 类型并选择 MiTeGen 2滴标准板，设定 CrystalQuickX 2滴标准板。为更改液滴1和液滴2的定义参数（VMXi 所需），点击与上述相同的 编辑 图标。这将打开一个新窗口，其中（E, F）需按图示修改X 和 Y 偏移量。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65964/65964fig2v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="实验室库存管理系统流程图；包括货物运输跟踪、容器设置、用户列表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65964/65964fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：SynchWeb 界面展示如何创建 VMXi 货运、注册样品板以及核对联系人信息。 图中展示了将信息上传至 SynchWeb 界面各个阶段的截图，分别为（A）下拉菜单，（B,C）注册新货运，（D）注册新容器，（E）输入样品板信息，（F）核对联系人信息，以及（G）某项提案内已注册容器的列表。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65964/65964fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的高清版本。</a>
<img alt="晶体学图像分析；蛋白质结晶过程；示意图；数据采集系统。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65964/65964fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：使用 SynchWeb 选择和准备用于数据采集的样品。 一系列截图展示了使用 SynchWeb 界面准备数据采集样品的各个阶段。（A）从液滴概览中选择目标点和感兴趣区域。该面板的下部为此液滴的一系列按时间顺序排列的照片。（B）一个微孔板的 CHiMP 分析结果示例，突出显示“晶体”类别的结果。（C）从选定的点和区域列表中将样品添加到队列中，以及（D）从光束线预设的实验条件下拉列表中，为已入队的样品应用数据采集参数。注意未设置实验参数的样品（红色）与已正确应用参数的样品（顶部和底部）之间的区别。该面板底部为 Queue Container 按钮，用于将该微孔板加入光束线数据采集队列。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65964/65964fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="实验室数据分析；多样本网格，实验设置管理的结果图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65964/65964fig5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图5：在SynchWeb中创建样本组。 一系列截图展示了创建样本组的各个阶段。（A）从相关货件中选择包含样本的板；（B）选择板内的液滴，可选择单个液滴，也可按行和/或列进行选择。（C）已创建的样本组列表。（D）列出最近三次多重处理任务的输出结果，可选择以显示处理流程中的统计信息。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65964/65964fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="晶体学分析；数据处理结果图像；衍射数据；多重处理。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65964/65964fig6.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：数据处理与数据约简。（A）ISPyB11中已处理数据集的截图。用于访问再处理功能的按钮已高亮显示。左上角显示样品编号和实验参数，中间为衍射图像查看器。点击该图像将打开一个交互式窗口以检查不同图像。右侧显示晶体图像查看器，点击该图像也将打开一个交互式窗口，用于比较光束线和Formulatrix存储的图像。最右侧显示每帧图像的分析图，点击该图像将打开此输出的放大版本。点击自动处理标签可显示自动处理结果，并便于比较不同处理流程的结果。点击标签可在不同处理流程之间切换，并查看所选流程的详细输出。用于数据下载的日志与文件按钮已高亮显示。点击下游处理标签将展开并提供适当情况下通过数据约简后流程运行的任何数据集的结果。（B）来自样品组管理界面的截图。用户定义的组名称位于顶部，下方为所包含孔位的可视化描述。绿色孔位表示从该液滴测量的所有晶体都将被纳入该组。可查看在该组上执行的不同多重处理任务的摘要，其下方为多重处理的详细输出。用于查看所含实验的数据集按钮已高亮显示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65964/65964fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="信号分析的实验数据图表；数据集趋势与响应的图形比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65964/65964fig7.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 7"> 
图7：数据重新处理窗口。（A）单晶数据集和（B）多晶数据集。图中显示了两个单晶数据集，其中已选择特定的数据区域。勾选单独处理复选框后，点击积分按钮即可对所选衍射图像进行单独处理。点击多晶按钮将打开各个数据集的显示界面。如需对来自多个数据集的衍射图像进行重新处理，可如图所示选择图像区域，并通过点击高亮显示的积分按钮启动重新处理过程。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65964/65964fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质晶体学分析；展示结晶结果和结构图谱的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65964/65964fig8.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图8"> 
图8：VMXi流程的代表性结果。（A）甜蛋白（thaumatin）在结晶液滴中的标记晶体（左图）、数据处理结果（中图）以及电子密度图（右图）。（B）对多个晶体进行数据收集，以确定片段与SARS-CoV-2宏结构域（Macro domain）的结合情况。在欧盟开放筛选平台（EU-OPENSCREEN）片段筛选获得的片段存在条件下，使用标准实验设置对多个晶体进行了数据集采集。本图节选自SynchWeb，展示了部分数据采集示例。该片段被构建入相应的电子密度中，并进一步优化，最右侧图示展示了该结果。（C）来自一个具有挑战性的结晶命中结果的堆叠单斜晶系晶体标记图，用于数据收集。绿色十字和红色数字标示了使用10 µm光束和60°旋转进行数据测量的位置。四个采集的楔形数据合并后生成了分辨率为1.75 Å的数据集。右侧展示了血红素（Heme）基团周围的电子密度图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65964/65964fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="蛋白质晶体学分析；示意图、显微镜图像、衍射图样、电子密度图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65964/65964fig9.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图9"> 
图9：在结晶板中进行的序列晶体学实验。（A）结晶液滴的光学图像，白色框表示感兴趣区域。（B）网格扫描点的定义。（C）显示衍射信号的热图。（D）由超过9,000张静态衍射图谱组成的序列晶体学数据集所生成的电子密度图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65964/65964fig9large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>分辨率 (Å)</td>
			<td>完整性 (%)</td>
			<td>多重性</td>
			<td>I/σ(I)</td>
			<td>Rsplit</td>
			<td>CC1/2</td>
			<td>唯一观测值</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总体</td>
			<td>100</td>
			<td>95.5</td>
			<td>20.8</td>
			<td>0.063</td>
			<td>0.998</td>
			<td>8422</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>低分辨率 (55.55 - 5.43)</td>
			<td>100</td>
			<td>147.1</td>
			<td>81.7</td>
			<td>0.028</td>
			<td>0.999</td>
			<td>488</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>高分辨率 (2.03 - 2.00)</td>
			<td>100</td>
			<td>75.3</td>
			<td>1.2</td>
			<td>1.092</td>
			<td>0.410</td>
			<td>411</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：VMXi RT串行数据集的数据统计。缩写说明：I = 标定观测值的平均强度；Rsplit = 测量强度差异性的度量；CC 1/2 = 数据集两个随机半集之间的相关系数。

我们介绍一种利用哈韦尔研究复合体（Research Complex at Harwell）中的结晶设施进行蛋白质结晶的实验方案，以及后续的 原位 在钻石光源同步辐射装置的多功能大分子晶体学线站对晶体板中的晶体进行X射线晶体学数据收集 原位 (VMXi) 光束线。我们介绍了样品要求、结晶方案以及数据收集指南。

结晶与 原位 使用哈威尔结晶设施和钻石光源 VMXi 光束线在室温下收集数据

使用哈威尔结晶设施进行机器人蛋白质结晶的方案及在室温下原位收集数据的方案

了解蛋白质的三维结构是药物设计、生物技术以及理解多种疾病的基础。VMXi 能在无需低温冷冻的条件下测定蛋白质结构，使其更接近天然温度状态。VMXi 还可在蛋白质晶体仍处于结晶板中时直接测量其衍射数据，从而避免因机械操作带来的损伤。未来，我们希望充分利用 VMXi 极高的通量，对大量晶体样本进行分析，以识别出多种不同的结构状态，而不仅仅局限于目前人们常获得的单一结构。我们还希望推进药物开发，直接在结晶板内开展片段筛选与优化，这一新方法展现出巨大的应用前景。首先，在 NC2 板中培养晶体。然后使用提供的 Diamond Fed ID 登录 ISPyB 系统，并选择“提案”（Proposals）。通过滚动列表或在搜索栏中输入提案编号来查找目标提案。找到提案后，在提案编号下方的下拉菜单中选择“运输”（Shipment）。货件窗口将打开，显示与该提案相关的所有货件。要创建新货件，请点击屏幕右上角的“添加货件”按钮，并为该货件提供一个名称。然后选择“自动/成像仪”选项，并点击屏幕左下角的“添加货件”按钮以确认创建货件。进入货件窗口，点击“添加容器”，此时将弹出添加容器页面。随后，在容器类型下拉菜单中选择合适的板类型。根据光束线工作人员的指示，为实验用板输入条形码和容器名称。从“请求成像仪”下拉菜单中选择 VMXi 20 摄氏度成像仪，然后从“成像时间表”下拉菜单中选择斐波那契成像时间表。从“结晶筛选”下拉菜单中选择相应的结晶筛选条件，然后从“所有者”下拉菜单中选择正确的用户名。点击“查看”并在电子邮件输入框中填写准确的联系地址。在注释框中输入关于该孔板的详细信息。从“蛋白质”下拉菜单中选择相应的样品，并使用在UAS中注册且经Diamond在实验提案中批准的缩写名称。将相同的名称输入样品名称框中，其余框保持空白。单击“板”图标，将样本复制到整块板上，并用绿色方块填充整个容器。单击页面底部的“添加容器”以注册该板。将该板转移至相应的成像仪中进行储存和成像。当容器存入成像仪时，系统将生成一次访问记录，用户会收到一封包含该孔板及其图像链接的电子邮件。要查看成像结果，请导航至相关提案，点击提案编号下方的下拉菜单中的“容器”选项，查看可用容器列表。如果存在其他类型的样品 holder，请选择“孔板”滤镜。为了缩小搜索范围，使用“我的容器”选项，仅显示与当前用户 ID 相关的容器。将光标悬停在目标行上，单击鼠标左键以选择所需的容器。随后将弹出一个新窗口，显示该培养板的概览。在培养板示意图的左侧选择一个液滴，以查看其最近的图像。使用箭头键在液滴之间切换，或使用鼠标或光标单独选择液滴。如需手动添加数据采集点，请按下“标记点”按钮，然后将光标定位到目标位置。进行选择并等待红色叉号出现。当所有点均被标记后，单击“完成”按钮。单击“标记区域”按钮，以通过网格扫描为数据采集添加区域。单击左上角的点，向下并向右拖动以创建将在光束线上扫描的区域。当所有目标区域都设定完毕后，单击“完成”按钮。在液滴图像上查找蓝色十字标记，这些标记代表由 CHiMP 自动识别出的晶体样品。要查看结晶液滴的 CHiMP 评估结果，请勾选“显示自动评分”并在类别下拉菜单中选择“crystal”。当所有液滴中的点和区域均已标注后，点击页面底部的“准备数据采集”按钮。查看系统预选或自动识别的样品列表。如需添加单个点或区域，请点击按钮，或点击“将当前页面添加到队列”按钮以添加所有显示的样本。然后点击点筛选器并勾选“全选”复选框，以对当前队列中所有样本应用相同的参数。可使用点、区域、手动和自动的筛选功能。对于区域扫描，选择“网格扫描 DMM，步长10微米，透射率100%”。对于其他点实验，从下拉菜单中选择相应的选项。对于振荡数据采集，选择“Omega扫描 DMM，10度，透射率10%”，以最大化数据采集效率。在为所有样品选择正确的实验参数后，点击“队列容器”按钮。一旦该板升至队列顶部，将被送至光束线进行数据采集，随后返回样品存储区。之后请查收包含访问相关数据链接的电子邮件。在项目编号下方的下拉菜单中选择“样本组管理”，查看其他用户是否已创建了组列表。如需创建新组，请点击“创建样本组”按钮。在“创建样本组”页面的下拉菜单中选择一个运输批次，以查看样本浏览界面。单击某个容器后，查找显示板图概览的图形。单击单个液滴或相应的行字母或列编号。选择与单个组关联的所有孔后，在“样本组名称”框中输入该组的名称，然后单击“保存样本组”按钮。点击此页面上的“查看样本组”按钮，返回与该方案关联的已生成样本组列表，并继续进行数据处理。

crystallization-situ-room-temperature-data-collection-using

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

使用 Harwell 的结晶设施和 Beamline VMXi（金刚石光源）进行结晶和 原位 室温数据收集

本文介绍了如何利用某些同步辐射光束线提供的自动化筛选和数据采集选项。科研人员将低温冷冻的样品送至同步辐射装置，随后对样品的衍射特性进行筛选，自动采集并处理数据集，在条件允许的情况下完成结构解析——整个过程无需人工干预。...

完全自主的生物大分子晶体表征与数据采集

本文介绍了在Diamond光源I24线站进行序列同步辐射晶体学实验的固定靶样品制备、数据收集和数据处理的综合指南。...

在钻石光源进行固定靶连续数据采集

本实验方案展示了如何利用冷冻结构光照明显微镜对生物冷冻保存样品进行成像。我们通过成像U2OS细胞的细胞骨架来演示该方法。...

冷冻保存细胞的冷冻结构光照显微镜数据采集

数据的信噪比是进行微晶X射线衍射测量时最重要的考虑因素之一。VMXm光束线为此类实验提供了低噪声环境和微束条件。本文介绍了适用于VMXm及其他微聚焦大分子晶体学光束线的微晶样品制备、安装与冷却方法。...

用于VMXm光束线微晶样品制备的工作流程

本文介绍了一种用于在 Diamond Light Source 的 I23 光束线上进行长波长大分子 X...

样品制备与转移方案：在 Diamond Light Source 同步辐射光源 I23 光束线上进行真空内长波长晶体学实验

本文介绍了如何在欧洲分子生物学实验室格勒诺布尔分站（EMBL...

格勒诺布尔 EMBL HTX 设施中的自动化晶体学流程

本文介绍了如何在晶上晶装置上设置蛋白质结晶，以及如何利用芯片结晶平台在室温下进行自动化的序列数据收集。...

片上结晶与室温大规模连续衍射

本文描述了如何筛选热稳定突变体、纯化人源5-羟色胺转运蛋白、制备高亲和力抗体，以及对结合抗抑郁药物...

人5-羟色胺转运蛋白与配体结合的热稳定化、表达、纯化及结晶 S西酞普兰

本文描述并讨论了用于常规制备大量筛选板及纳升级结晶液滴以进行蒸汽扩散实验的自动化系统与方案。...

MRC分子生物学实验室大分子结晶的自动化方案

本文介绍了一种简化方案，用于对来自肺炎链球菌（Streptococcus...

SP0092 碳水化合物转运底物结合蛋白的生化与结构表征

了解利用Harwell结晶设施和VMXi同步辐射光源进行蛋白质结晶与原位室温X射线数据收集的完整流程。该方法无需低温冷却即可在20摄氏度下直接分析晶体结构，为药物开发和结构生物学研究提供高通量解决方案。

结晶与原位使用哈威尔结晶设施和钻石光源 VMXi 光束线在室温下收集数据

探索更多视频

结晶与 原位 使用哈威尔结晶设施和钻石光源 VMXi 光束线在室温下收集数据

探索更多视频

结晶与原位使用哈威尔结晶设施和钻石光源 VMXi 光束线在室温下收集数据