Name: 噬菌体和机器人辅助的近乎连续进化的实用指南 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T13:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 8 s
Description: 了解PRANCE技术如何通过机器人自动化和实时反馈控制实现蛋白质快速进化。该方法利用并行实验和动态进化严格性，帮助研究人员在实验室时间尺度上预测和优化蛋白质工程过程。

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感谢 Emma Chory 和 Kevin Esvelt 在硬件和软件设置方面提供的帮助与建议。Samir Aoudjane、Osaid Ather 和 Erika DeBenedictis 获得了 Steel Perlot 早期研究者奖助金的支持。&#160;本研究由弗朗西斯·克里克研究所资助，该研究所的核心资金来自英国癌症研究署（CC2239）、英国医学研究理事会（CC2239）和惠康信托基金会（CC2239）。

1. 硬件设置
注意：有关 PRANCE 系统硬件组件的概述，请参见图2；有关这些组件实际组装后的照片，请参见图3。
<ol>
	<li>获取 PRANCE 系统的主要硬件，包括液体处理仪器、酶标仪和辅助泵。 
	注意：迄今为止所有 PRANCE 系统均基于中型至大型液体处理仪器构建，配备8通道独立寻址移液臂、单活塞96通道移液臂、用于移动微孔板的机械臂夹持器、集成式移液头清洗站以及可进行吸光度和发光检测的集成酶标仪。</li>
	<li>根据液体处理机器人的型号和功能配置加热策略。可使用加热板载具或通过加热器实现机器人环境温控。</li>
	<li>建立移液头清洗站，以实现移液头的重复使用。 
	注意：迄今为止，PRANCE 系统均采用现成的清洗站，但原则上该组件也可使用低成本部件轻松构建。</li>
	<li>通过设置一个在 37 °C 下运行的实时生物反应器作为恒化器/恒浊器，维持处于对数生长期的细菌培养物。或者，将预先在 37 °C 下培养至对数生长期（OD600 在 0.25 至 0.45 之间）且体积不少于 1 L 的细菌培养物置于附近冰箱中于 4 °C 下保存。确保无论培养物处于冷藏或常温状态，均需使用摇床或磁力搅拌器定期搅拌，以防止沉淀。</li>
	<li>配置适合与机器人集成的泵，并安装必要的软件和驱动程序。通过软件设置使泵能够精确输送 10–100 mL 量级的液体。 
	注意：参见材料表中本实验所用泵的型号，以及制造商网站上用于操作这些泵的软件及其配置说明。本文所述 PRANCE 系统所用泵的控制软件已在以下 GitHub 仓库中开源提供&#160;https://github.com/dgretton/std-96-pace PRANCE 至少需要一个三泵歧管系统，能够独立控制三个独立通道（向细菌储液池输送细菌、向细菌储液池输送次氯酸钠溶液、将细菌储液池废液排至废液容器），每个泵的流速需经过校准并可独立调控。过去曾使用过鱼缸泵和水培泵阵列，但原则上任何可通过 Python 控制的蠕动泵均可使用。关键功能包括：能够使用机器人夹持器将微孔板移入或移出酶标仪、启动酶标仪检测，并获取检测数据。</li>
	<li>使用 3D 打印技术制备 PRANCE 系统所需的定制化平台组件，至少包括细菌储液/分配歧管（&#34;华夫格&#34;结构），设计文件见补充文件 1（https://drive.google.com/file/d/16ELcvfFPzBzNSto0xUrBe-shi23J9Na7/view?usp=share_link）。将这些容器固定在平台指定位置，并使用标准液体处理机器人软件校准其坐标位置。将储液池与泵阵列连接。 
	注意：校准方法请参考机器人制造商的技术文档，因具体操作依赖于设备型号。建议使用基于树脂的 3D 打印机；打印机类型示例见材料表；打印时使用标准透明树脂及默认打印参数。</li>
	<li>为系统配备符合当地生物安全规范的废液排放装置。</li>
	<li>按照图 4所示示例，将实验耗材放置于液体处理机器人的平台上。</li>
	<li>遵循标准安全操作规程，包括穿戴标准实验室个人防护装备（即实验服、手套和眼部防护装置）。</li>
</ol>
2. 软件准备
<ol>
	<li>安装用于通过 Python 控制液体处理机器人的开源软件11，该软件来自开源的 PyHamilton 代码仓库。&#160;https://github.com/dgretton/pyhamilton</li>
	<li>修改并校准液体处理机器人软件中的甲板布局文件，以准确反映机器人甲板上实验耗材的位置，如&#160;图4所示。 
	注意：此处使用的设置基于液体处理机器人制造商提供的软件，并遵循其提供的文档说明。</li>
	<li>以模拟模式运行 PRANCE 机器人方法程序。
	<ol>
		<li>使用以下命令在命令行中打开程序（在 Windows 操作系统中），如 图5 所示。 
		Windows 键 + R 
		&#8203;输入：cmd</li>
		<li>将父目录更改为机器人方法程序所在的目录。根据正确的路径输入如下命令，如 图5 所示。 
		&#8203;CD c:\Robot_methods_directory\PRANCE</li>
		<li>使用 Python 调用机器人方法程序，并添加模拟模式标志，如 图5 所示。 
		py robot_method.py --simulate</li>
		<li>在程序执行后弹出的机器人运行控制窗口左上角，点击PLAY按钮（图5）。 
		注意：在继续下一步之前，请确保 PRANCE 方法能够在模拟模式下无错误运行。若脚本可在不触发系统错误处理机制的情况下完成多个主程序循环，则表明其在模拟模式下运行正常，否则主程序循环将被终止。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在禁用模拟模式的情况下运行 PRANCE 机器人方法程序。
	<ol>
		<li>在相应目录中打开命令行（图5）。 
		Windows 键 + R 
		输入：cmd 
		&#8203;CD c:\Robot_methods_directory\PRANCE</li>
		<li>使用 Python 调用机器人方法程序，不添加任何标志： 
		py robot_method.py</li>
		<li>在程序执行后弹出的机器人运行控制窗口左上角，点击PLAY按钮。</li>
		<li>确认 PyHamilton 能够控制仪器并使其完成初始化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>建立实时数据同步。 
	注意：截至目前，PRANCE 系统采用联网计算机，用户可通过远程文件共享软件或远程桌面方式监控日志文件及实时微孔板读数仪的测量图表。</li>
	<li>关闭自动更新功能。</li>
</ol>
3. 预运行准备
<ol>
	<li>确保为计划运行所需的所有培养物提供处于对数生长期的细菌培养源，并持续搅拌以防止沉淀。可使用活跃的恒化器/恒浊器，或使用预培养后冷藏的生长停滞培养物。</li>
	<li>在控制器清单文件中更新每个程序周期内将泵入96孔培养池各孔的细菌培养物体积（范围为0–500 µL）的详细信息。这可实现对培养池有效稀释率的精确控制。参见图6。
	<ol>
		<li>使用提供的DilutionCalculator.xlsx电子表格（见补充文件2）计算培养池的稀释率，如图7所示。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在robot_method.py文件中更新目标培养池高度。为遵循本方案，程序中变量fixed_lagoon_height的默认值应设为14（单位为毫米）。这对应系统中550 µL的培养池体积，但具体数值可能因所用特定的96深孔板而异。</li>
	<li>将洁净的带滤芯移液吸头按指定位置放置于机器人工作台，并用胶带将吸头架固定在吸头架托上，以确保运行期间的稳定性。</li>
	<li>将洁净的96深孔板按指定位置放置于机器人工作台。</li>
	<li>将洁净的96孔读板仪用板按指定位置放置于机器人工作台。</li>
	<li>确保读板仪托盘未被已有板占用。</li>
	<li>确保泵已连接至计算机，并分配至正确的地址。</li>
	<li>通过启动泵泵入次氯酸钠溶液，随后泵入水，以清洗泵管路。</li>
	<li>将泵管路连接至相应的源端和输出端，特别注意确保正确的管路连接至相应的细菌培养物。</li>
	<li>补充用于细菌储液和移液吸头清洗的次氯酸钠溶液/水储罐/容器。</li>
	<li>确保所有工作台上的组件，特别是可移动部件，均稳定固定在指定位置。</li>
	<li>根据本地设置启动加热器，以达到目标温度（即&#160;37 °C；图8）。</li>
	<li>运行紫外线灭菌程序文件10分钟，以启动制造商提供的液体处理机器人内置紫外线灭菌灯（图9）。
	<ol>
		<li>程序执行后打开的机器人运行控制窗口左上角，点击播放按钮。</li>
		<li>以参数化选项600 s运行该文件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确保机器人运行控制软件已关闭。 
	注意：若运行控制软件已有实例在运行中，机器人方法程序将崩溃。</li>
</ol>
4. 硬件与软件集成
<ol>
	<li>进行一次“水运行”，即用纯水替代所有培养物和湿性试剂，整夜运行 PRANCE 机器人方法程序。 
	注意：该测试可在室温下进行。
	<ol>
		<li>按照上述说明完成运行前准备，设置 controller_manifest 和 robot_method，使有效泻湖稀释速率为1 体积/小时，如图 5 和 图 6 所示。</li>
		<li>将“细菌输入”管路连接至盛有水的容器，以在水运行中替代对数期细菌。 
		注意：可在水源中加入食用色素，以便追踪液体在实验过程中的流动情况。</li>
		<li>在相应目录中打开命令行界面。</li>
		<li>使用 Python 调用机器人方法程序，并添加新运行标志（py robot_method.py --new），输入所需参数，包括日志文件名（TestRun）、泻湖孔数量（16）、循环持续时间（30）、每次读板测量的循环次数（4）以及诱导剂体积（本次测试运行中诱导剂体积为0 µL；在通过阿拉伯糖诱导突变的进化实验中，该值可能为 10 µL），如图 5 所示。</li>
		<li>在程序执行并输入参数后，会弹出机器人运行控制窗口，点击其左上角的播放按钮。 
		注意：PRANCE 方法可使用空的泻湖板启动，泻湖中的液体体积将在前六个循环内逐渐达到最终平衡体积。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行一次“仅细菌运行”，即在目标温度下整夜运行 PRANCE 协议，仅使用细菌培养物，不加入噬菌体。
	<ol>
		<li>按照上述说明完成运行前准备，设置 controller_manifest 和 robot_method，使有效泻湖稀释速率为1 体积/小时，如图 5 和 图 6 所示。确保加热器已开启，目标温度设为37 °C。</li>
		<li>将“细菌输入”管路连接至选定的对数期细菌来源。</li>
		<li>在相应目录中打开命令行界面。</li>
		<li>使用 Python 调用机器人方法程序，并添加新运行标志（py robot_method.py --new），输入此前第 4.1.4 节所述的参数。</li>
		<li>在程序执行并输入参数后，会弹出“机器人运行控制”窗口，点击其左上角的播放按钮。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>运行一次“感染测试”，即使用携带进化蛋白的噬菌体挑战依赖该蛋白的细菌，以检测其增殖能力。 
	注意：需提前确定哪些泻湖将接种噬菌体，哪些泻湖不接种，作为无噬菌体对照泻湖，用于检测交叉污染。
	<ol>
		<li>按照上述说明完成运行前准备，设置 controller_manifest 和 robot_method，使有效稀释速率为1 体积/小时，如图 5 和 图 6 所示。确保加热器已开启，目标温度设为37 °C。</li>
		<li>将“细菌输入”管路连接至选定的对数期细菌来源。</li>
		<li>在相应目录中打开命令行界面。</li>
		<li>使用 Python 调用机器人方法程序，并添加新运行标志（py robot_method.py --new），输入此前第 4.1.4 节所述的参数。</li>
		<li>在程序执行并输入参数后，会弹出机器人运行控制窗口，点击其左上角的播放按钮。</li>
		<li>在添加噬菌体之前，先运行方法程序 2–3 小时，使泻湖板中的液体体积和细菌 OD 值达到平衡。</li>
		<li>在程序休眠期间（即一个运行周期结束时），向接种噬菌体的泻湖中加入 106 pfu/mL 的噬菌体（例如，向 550 µL 泻湖中加入 5.5 µL 浓度为 108 pfu/mL 的噬菌体分装液，具体浓度由噬斑测定或 qPCR 确定）。</li>
		<li>整夜运行程序，随后通过噬斑测定或 qPCR 检测泻湖孔中的噬菌体滴度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Setting Up PRANCE: A Comprehensive Guide for Robotics-Accelerated Evolution

<ol><li>Esvelt, K. M., Carlson, J. C., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+the+continuous+directed+evolution+of+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A system for the continuous directed evolution of biomolecules.</a> Nature. 472, 499-503 (2011).</li>
<li>Pu, J., Zinkus-Boltz, J., Dickinson, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+a+split+RNA+polymerase+as+a+versatile+biosensor+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolution of a split RNA polymerase as a versatile biosensor platform.</a> Nat Chem Biol. 13 (4), 432-438 (2017).</li>
<li>Pu, J., Disare, M., Dickinson, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+C-terminal+modification+tolerance+in+full-length+and+split+T7+RNA+polymerase+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Evolution of C-terminal modification tolerance in full-length and split T7 RNA polymerase biosensors.</a> Chembiochem. 20 (12), 1547-1553 (2019).</li>
<li>Xie, V. C., Styles, M. J., Dickinson, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+directed+evolution+of+biomolecular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Methods for the directed evolution of biomolecular interactions.</a> Trends Biochem Sci. 47 (5), 403-416 (2022).</li>
<li>Popa, S. C., Inamoto, I., Thuronyi, B. W., Shin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage-assisted+continuous+evolution+%28PACE%29%3A+A+guide+focused+on+evolving+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">Phage-assisted continuous evolution (PACE): A guide focused on evolving protein-DNA interactions.</a> ACS Omega. 5 (42), 26957-26966 (2020).</li>
<li>Wang, T., Badran, A. H., Huang, T. P., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+directed+evolution+of+proteins+with+improved+soluble+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Continuous directed evolution of proteins with improved soluble expression.</a> Nat Chem Biol. 14 (10), 972-980 (2018).</li>
<li>Miller, S. M., Wang, T., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage-assisted+continuous+and+non-continuous+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Phage-assisted continuous and non-continuous evolution.</a> Nat Protoc. 15 (12), 4101-4127 (2020).</li>
<li>DeBenedictis, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+molecular+evolution+enables+robust+biomolecule+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Systematic molecular evolution enables robust biomolecule discovery.</a> Nat Methods. 19 (1), 55-64 (2022).</li>
<li>Zhong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+continuous+evolution+of+proteins+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated continuous evolution of proteins in vivo.</a> ACS Synth Biol. 9 (6), 1270-1276 (2020).</li>
<li>Roth, T. B., Woolston, B. M., Stephanopoulos, G., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage-assisted+evolution+of+Bacillus+methanolicus+methanol+dehydrogenase+2%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Phage-assisted evolution of Bacillus methanolicus methanol dehydrogenase 2.</a> ACS Synth Biol. 8 (4), 796-806 (2019).</li>
<li>Chory, E. J., Gretton, D. W., DeBenedictis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enabling+high-throughput+biology+with+flexible+open-source+automation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Enabling high-throughput biology with flexible open-source automation.</a> Mol Syst Biol. 17 (3), 9942(2021).</li>
<li>Novotny, C. P., Lavin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+effects+of+temperature+on+the+growth+of+F+pili%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Some effects of temperature on the growth of F pili.</a> J Bacteriol. 107 (3), 671-682 (1971).</li>
<li>Carlson, J. C., Badran, A. H., Guggiana-Nilo, D. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+selection+and+stringency+modulation+in+phage-assisted+continuous+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Negative selection and stringency modulation in phage-assisted continuous evolution.</a> Nat Chem Biol. 10 (3), 216-222 (2014).</li>
<li>Steel, H., Habgood, R., Kelly, C., Papachristodoulou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+characterization+and+manipulation+of+biological+systems+with+Chi.Bio%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ characterization and manipulation of biological systems with Chi.Bio.</a> PLOS Biology. 18 (7), e3000794(2020).</li>
<li>Wong, B. G., Mancuso, C. P., Kiriakov, S., Bashor, C. J., Khalil, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise%2C+automated+control+of+conditions+for+high-throughput+growth+of+yeast+and+bacteria+with+eVOLVER%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Precise, automated control of conditions for high-throughput growth of yeast and bacteria with eVOLVER.</a> Nat Biotechnol. 36 (7), 614-623 (2018).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

尽管已努力实现设备标准化，但在实际操作中，由于设备供应、硬件和软件版本的差异，每套PRANCE系统都各不相同。因此，每套PRANCE系统的搭建都会面临独特的配置挑战，需要充分理解各个组件的功能，才能有效地进行模块化故障排查。
本方法详细阐述了建立和测试已有的PRANCE系统的逐步操作流程。我们首先聚焦于硬件和软件的关键组成部分，然后详细介绍准备和实施一系列测试运行所必需的步骤，以确认系统已具备进行PRANCE实验的条件。
硬件的一个关键特性是经过优化，以降低在使用噬菌体进行多重实验时发生样本交叉污染的风险。建议专门使用带滤芯的吸头，并采用与吸头重复使用兼容的机器人吸头技术，该技术通过避免强制卡合式吸头，被认为可最大限度减少吸头弹出过程中产生的气溶胶。根据本方案进行充分的吸头清洗可实现吸头重复使用，但其有效性必须在每套系统上通过感染测试进行验证。自动灭菌功能还依赖于系统持续供应的水和次氯酸钠溶液。这些液体储存在水箱或桶中，一旦耗尽，将导致自动灭菌功能受损并迅速引发交叉污染。可在程序运行前后对水箱或桶拍照，以评估在特定泵配置下清洗设备消耗水和次氯酸钠溶液的速率。
该系统的另一个关键要素是细菌生长阶段和温度的维持。PRANCE 实验使用 S2060 E. coli 菌株（Addgene：#105064）。这是一种源自 K12、含有 F 质粒的菌株，经过优化以减少生物膜形成7。此外，该菌株中的 F 质粒经过改造，插入了四环素抗性盒以维持质粒稳定性，同时引入 luxCDE 和 luxR 基因以补足 luxAB 介导的发光检测功能，并在噬菌体休克启动子控制下携带 lacZ 基因，从而实现噬菌斑的比色可视化。F 质粒编码的 F 菌毛对于 M13 噬菌体感染至关重要。因此，用于 PACE 的细菌必须在 37 °C 条件下培养，并处于对数生长中期，此时 F 菌毛12 表达，M13 噬菌体的感染、增殖与进化才可能发生。为实现稳定的温度控制，可采用现成的加热板载具。另一种方法是使用廉价加热器加热进入 HEPA 过滤器的空气，但不推荐此方法，因其可能导致设备加速老化。此外，该方法还会加快甲板上辅助液体（如次氯酸钠/水桶和诱导剂）的蒸发速度。
软件包的校准对于系统的正常运行也至关重要。软件操作台布局与实际机器人操作台之间的偏差是系统运行过程中最常见的故障原因。根据蠕动泵的使用情况，定期校准用于供应细菌培养物、次氯酸钠以及排出系统液体的辅助泵至关重要，因为蠕动泵的使用可能导致管路磨损和液体体积变化。
水运行测试将快速揭示多种常见的设置问题，包括不正确的液体处理设置、流体泄漏/连接故障以及软件不稳定。一次成功的水运行测试应无任何意外液体泄漏，并能整夜稳定运行且不出现错误。在水运行过程中可能出现若干常见问题，例如无法执行某些液体处理步骤、移液管滴漏以及程序在运行中途停止。若无法执行某些液体处理步骤，请确认所有液体类型均已正确安装。这些液体类型列出了相应的黏度和移液速度，并需在制造商提供的机器人控制软件中进行调整。如果出现移液管滴漏，必须确保机器人移液臂的设置正确，以实现干净的移液操作并避免噬菌体交叉污染。成功的机器人移液不仅需要正确的液体类型，还需要准确的实验耗材在工作台上的布局高度，以及在PRANCE机器人方法程序中指定的适当移液高度偏移量。这些高度偏移量可能需要直接调整。如果程序在运行中途停止，通常是由多种错误引起的，表明工作台布局文件可能与实际的工作台配置不匹配。
仅使用细菌的运行测试将揭示酶标仪设置和实时数据可视化方面的问题、次氯酸钠浓度过高或冲洗不充分的问题，以及温度稳定性问题。一次成功的仅使用细菌的运行应表现为前三个循环中潟湖吸光度达到平衡，随后在整个运行过程中保持稳定的吸光度。此外，该测试还可能揭示若干常见问题。这是首次对酶标仪生成的数据进行绘图的步骤。酶标仪数据库中的数据可能未被正确保存或正确绘制。如果细菌的吸光度未能达到平衡，这可能表明次氯酸钠浓度过高。次氯酸钠过量或洗涤不充分可能会使整个实验被灭菌，而不仅仅是实验器具部分。若怀疑存在此情况，可使用次氯酸钠检测试纸条检测潟湖液体。可通过红外测温枪检查培养物温度的稳定性。
成功的感染测试表明系统已准备好进行 PRANCE 运行。可通过接种含有细菌培养物的部分潟湖来执行感染测试。当合适的噬菌体（缺乏 pIII 基因的 ΔgIII 噬菌体）感染这些细菌时，细菌将表达 pIII，从而允许噬菌体增殖。一种可能的测试组合是：使用携带在噬菌体休克启动子驱动下表达 pIII 的质粒的 S2060 细菌，与任意一种 ΔgIII 噬菌体联用。我们推荐使用携带野生型 T7 RNA 聚合酶的 ΔgIII 噬菌体，并与经辅助质粒转化的 S2060 细菌联用，该辅助质粒中 pIII 和 luxAB 由 T7 启动子驱动（质粒 pJC173b13），如图 1所示。这种方法还可在测试过程中通过酶标仪监测感染情况。感染测试成功且无交叉污染的确凿证据来自对测试组和对照组潟湖的噬菌体滴度测定。当使用荧光素酶报告基因&#160;时，仅在测试孔中观察到发光信号增强（如图 3所示），也是噬菌体成功感染与增殖的指标。噬菌体滴度定量的金标准是噬斑测定法7。此外也有通过 qPCR 定量 M13 的方案7，该方法可能更快，但无法区分具有感染性与非感染性的噬菌体颗粒，因此可能高估滴度。
主程序引用一个清单文件，这是一个纯文本数据库文件，用于规定每次传代培养的稀释体积，以及选择任意数量的潜在细菌培养物进料来源，这些进料来源在选择严格性上可能有所不同。通过这种方式，清单文件定义了PRANCE运行的多个参数。需要注意的是，该文件可在运行过程中由操作人员或系统进行编辑，这意味着可以实现手动或自动的反馈控制。
功能完整的PRANCE系统的实用性在于其能够在经过严密监控和控制的环境中快速进化大量种群。基于微孔板的格式使PRANCE区别于其他技术，例如使用现成的小型基于浊度恒定仪的系统14,15。基于微孔板的设置不仅便于与额外的机器人处理步骤轻松整合，还能够兼容离心机等其他实验室仪器。此外，能够在多个实验实例中同时进行加速进化的特性为实验增添了新的维度，提高了获得多样化且可靠结果的可能性。PRANCE所具备的精细控制与反馈系统进一步增强了实验的可预测性和可靠性，标志着定向进化技术领域的一项重大进展。然而，该技术在可并行开展的实验数量方面存在局限性。根据具体配置，PRANCE系统的通量通常受限于机器人移液速度或可用的平台空间。
用于PRANCE的相同硬件和软件也可应用于不涉及噬菌体的进化方法。正如多通道浊度计方法11所展示的那样，该仪器可完全与细菌结合使用，从而实现全基因组适应性进化实验。这种适应性拓宽了该仪器的应用范围，为机器人加速进化的新形式铺平了道路。

PRANCE 是两种强大的定向进化技术的结合。第一种是 PACE1，这是一种分子技术，将基因多样化和筛选的循环过程与 M13 噬菌体的快速生命周期相偶联，从而能够在液态噬菌体培养物中持续、快速地进行多轮进化。该筛选过程依赖于一种质粒编码的基因回路，该回路将进化中蛋白质的功能与 pIII（M13 噬菌体的尾部衣壳蛋白）的表达相偶联，而 pIII 是噬菌体增殖所必需的，&#160;如图 1所示。在实验层面，通过对液态噬菌体培养物进行持续稀释，可实现连续筛选。因此，筛选的严格性既可通过基因回路的设计进行调节，也可通过控制噬菌体培养物的稀释速率在实验层面上进行调控。因此，只要存在能够在大肠杆菌（E. coli）中检测目标活性并诱导 pIII 表达的分子传感器，PACE 就可应用于任何生物分子工程挑战。其应用包括蛋白质-蛋白质结合2,3,4、蛋白质-DNA 结合5、蛋白质溶解度6以及多种特定酶功能的进化7。第二种技术是机器人加速进化8,9，它利用反馈控制器消除定向进化中两种常见的失败模式：灭绝（当环境过于严苛时发生）和缺乏进化（当环境过于宽松时发生）。与 PANCE（噬菌体辅助非连续进化）中采用的连续传代方式不同7,10，机器人加速的&#34;近连续&#34;进化通过快速移液操作使培养物维持在对数中期，从而使种群能够经历持续的感染和增殖循环。当这两种技术结合使用时，被称为 PRANCE（Phage and Robotics-assisted Near-continuous Evolution，噬菌体与机器人辅助的近连续进化）8，可实现稳健、多重化且快速的连续进化。PRANCE 已被用于进化聚合酶、tRNA 和氨酰-tRNA 合成酶，并在这些进化过程中实施反馈控制，以提高其速度和可靠性8。
PRANCE 的硬件和软件设置中有若干细节，使得能够在液体处理机器人上使用噬菌体。我们并未使用机器人制造商提供的默认软件，而是采用了一种基于 Python 的开源软件包11，该软件可实现快速、并发的执行，从而能够将半连续生物反应器维持在对数生长期的中期。通过使多个甲板上组件定期自动灭菌，可将研究人员的非干预时间延长至数天，这一过程通过自动控制泵来实现，泵可对这些组件进行漂白和冲洗。通过使用不采用压合式吸头的液体处理机器人，并仔细调整液体处理参数，可消除噬菌体交叉污染。

<table><tbody><tr><td>3D打印细菌储存器“华夫格”结构&quot;waffle&quot;</td><td>-</td><td>-</td><td>https://drive.google.com/file/d/16ELcvfFPzBzNSto0xUrBe-shi23J9Na7/view; 用于机器人工作台</td></tr><tr><td>3D打印机</td><td>FormLabs</td><td>Form 3B+</td><td>3D打印机组件</td></tr><tr><td>3D打印机树脂（透明）</td><td>FormLabs</td><td>RS-F2-GPCL-04</td><td>3D打印机耗材</td></tr><tr><td>8-1,000 &amp;micro;L移液头</td><td>Hamilton</td><td>10140943</td><td>用于液体处理机器人</td></tr><tr><td>96-1,000 &amp;micro;L移液头</td><td>Hamilton</td><td>10120001</td><td>用于液体处理机器人</td></tr><tr><td>黑色聚苯乙烯板读数微孔板</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS3603</td><td>用于机器人工作台</td></tr><tr><td>BMG Labtech Spectrostar FLuorstar Omega</td><td>BMG Labtech</td><td>10086700</td><td>用于液体处理机器人</td></tr><tr><td>清洗液</td><td>Fluorochem Limited</td><td>F545154-1L</td><td>用于清洗机器人的液体处理部件</td></tr><tr><td>深孔板</td><td>Appleton Woods</td><td>ACP006</td><td>用于在机器人工作台上盛放正在进化的细菌</td></tr><tr><td>腔体加热器</td><td>Stego</td><td>13060.0-01</td><td>加热机器人腔体内部</td></tr><tr><td>Hamilton STAR</td><td>Hamilton</td><td>870101</td><td>用于液体处理机器人</td></tr><tr><td>加热器</td><td>Erbauer</td><td>BGP2108-25</td><td>用于液体处理机器人</td></tr><tr><td>HIG Bionex离心机</td><td>Hamilton</td><td>10086700</td><td>用于液体处理机器人</td></tr><tr><td>iSWAP板夹持器</td><td>Hamilton</td><td>190220</td><td>用于液体处理机器人</td></tr><tr><td>实验室管路</td><td>Merck</td><td>Z280356</td><td>用于构建液体处理歧管</td></tr><tr><td>鲁尔接头转卡套接头</td><td>AIEX</td><td>B13193/B13246</td><td>用于连接管路</td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>Camlab</td><td>SKU - 1189930</td><td>用于辅助冰箱</td></tr><tr><td>分子移液臂</td><td>Hamilton</td><td>173051</td><td>用于液体处理机器人</td></tr><tr><td>Omega</td><td>BMG labtech</td><td>5.7</td><td>微孔板读数仪控制软件</td></tr><tr><td>单向止回阀</td><td>Masterflex</td><td>MFLX30505-91</td><td>用于液体处理歧管的单向部分</td></tr><tr><td>pyhamilton</td><td>MIT/开源</td><td>https://github.com/dgretton/std-96-pace%20PRANCE</td><td>开源Python机器人控制软件</td></tr><tr><td>pymodbus</td><td>开源</td><td>3.5.2</td><td>Python泵控制软件接口</td></tr><tr><td>冰箱</td><td>Tefcold</td><td>FSC175H</td><td>允许使用冷却的细菌替代浊度恒定培养系统（turbidostat）</td></tr><tr><td>S2060细菌菌株</td><td>Addgene</td><td>Addgene: #105064</td><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>温度控制器</td><td>Digiten</td><td>DTC102UK</td><td>用于恒温控制加热器</td></tr><tr><td>温控开关控制器</td><td>WILLHI</td><td>WH1436A</td><td>WILLHI WH1436A 10 A 温度控制器 110 V 数字温控开关 水浴控制器 NTC 10K 传感器 改进版；用于液体处理机器人</td></tr><tr><td>Venus</td><td>Hamilton</td><td>4.6</td><td>专有的机器人控制软件</td></tr><tr><td>MPH 96/384清洗站</td><td>Hamilton</td><td>190248</td><td>用于液体处理机器人</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;推荐的泵制造商&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;文档&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Agrowtek</td><td>AD6i Hexa Pump</td><td></td><td>https://www.agrowtek.com/doc/im/IM_ADi.pdf</td></tr><tr><td>Amazon</td><td>INTLLAB 12V DC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07522-3</td><td>Masterflex L/S 数字驱动器，100 RPM，115/230 VAC</td><td>https://pim-resources.coleparmer.com/instruction-manual/a-1299-1127b-en.pdf</td></tr><tr><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07554-80</td><td>Masterflex L/S 经济型可调速驱动器，7 至 200 rpm，115 VAC</td><td>https://pim-resources.coleparmer.com/instruction-manual/a-1299-1127b-en.pdf</td></tr></tbody></table>

噬菌体与机器人辅助近连续进化的实用指南

A Practical Guide to Phage- and Robotics-Assisted Near-Continuous Evolution

机器人加速进化技术利用反馈控制提高进化的可靠性和速度，从而改善蛋白质和生物体进化实验的结果。本文介绍了一套用于建立噬菌体与机器人辅助近连续进化（PRANCE）系统所需的硬件和软件配置指南。PRANCE 技术结合了基于噬菌体的快速分子进化方法，能够同时运行数百个独立且受反馈控制的进化实验。本文将详细说明 PRANCE 系统的硬件需求与搭建流程，包括液体处理仪器、微孔板读板仪、辅助泵、加热装置以及3D打印容器。我们还将描述如何配置液体处理机器人，使其与基于 Python 的开源软件兼容。最后，本文为新构建的 PRANCE 系统提供了前两个实验的建议方案，用以充分测试系统的功能并验证其是否已具备开展多重进化实验的能力。本指南旨在作为开展机器人加速进化研究时应对复杂设备搭建工作的实用手册。

感染测试结果 
该测试将揭示细菌培养、噬菌体克隆与滴度、设备温度稳定性、液体处理设置以及酶标仪整合方面可能存在的问题。成功的噬菌体感染测试将在接种噬菌体的培养池中观察到清晰且快速的噬菌体感染信号，而在未接种噬菌体的培养池中则无信号。图10展示了噬菌体感染测试的一些代表性结果。实验结果还可根据所采用的是“热PRANCE”（由活菌浊度恒定培养系统供料）还是“冷PRANCE”（由冷却的对数中期培养物供料）配置，与本PRANCE论文8中的图1d和图1c进行比较。该测试可能揭示若干常见问题。细菌培养制备不当通常会导致感染微弱或完全缺失。M13噬菌体仅在细菌处于对数生长中期且温度为37 °C时才能实现最佳感染。在其他温度或生长阶段，细菌的菌毛表达较弱，因而对噬菌体感染的敏感性降低12。使用滴度偏低或含有载体突变的噬菌体接种，可能导致信号延迟或缺失。荧光或发光检测时酶标仪增益设置不当的问题也将通过本测试显现。
<img alt="T7 RNAP、pIII蛋白、大肠杆菌感染及发光结果的噬菌体扩增示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65974/65974fig01v4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：PRANCE装置感染测试运行期间遗传回路的示意图。 当编码于噬菌体基因组上的T7 RNA聚合酶感染大肠杆菌（Escherichia coli）宿主后，该酶被转录并结合至T7启动子上的辅助质粒（AP），从而启动噬菌体pIII蛋白和luxAB蛋白的转录，进而促进噬菌体的扩增及发光信号的产生。缩写：PRANCE = 噬菌体与机器人辅助近连续进化；AP = 辅助质粒。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65974/65974fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="PRANCE 系统硬件示意图；用于细菌培养的冰箱、泵和液体处理机器人" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65974/65974fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2PRANCE 系统物理组件的示意图。 冰箱用于储存搅拌后的培养物，随后通过一组泵将其转移至机器人平台上的细菌储存器，即"华夫板"。液体处理机器人利用移液头将细菌培养物从"华夫板"转移至预热至培养温度的暂存孔板，再转移至发生主要培养过程的培养池。暂存孔板与培养池均采用标准的2毫升深孔板。机器人将样品分装至一次性检测板，随后检测板被移送至酶标仪进行测量。缩写：PRANCE = 噬菌体与机器人辅助的近连续进化。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65974/65974fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="实验室设置中的高通量色谱自动化液体处理系统；蛋白质纯化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65974/65974fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：PRANCE机器人装置。（A）PRANCE系统设置。（I）HEPA过滤器和外部加热器。（II）培养冰箱。（III）主机器人外壳。（IV）酶标仪。（V）泵和储液罐。（B）机器人外壳内部。（VI）主培养泵。（VII）水、废液和次氯酸钠储液罐。（VIII）清洗泵。（C）机器人外壳内部。（IX）机器人移液臂和抓手。（X）移液吸头。（XI）用于将培养物分配到机器人上的3D打印组件（“华夫格”）。（XII）用于在酶标仪中取样的微孔板。（XIII）吸头清洗桶。（XIV）“泻湖”：进行连续进化培养的培养容器。缩写：PRANCE = 噬菌体与机器人辅助近连续进化（Phage- and Robotics-assisted Near-continuous Evolution）；HEPA = 高效微粒空气过滤器（high-efficiency particulate air）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65974/65974fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="自动移液工作站示意图和照片；96孔板；检测用液体处理装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65974/65974fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：工作台布局。（A）机器人控制软件中工作台布局的三维示意图。（B）工作台组件的照片。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65974/65974fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="用于自动化实验室实验的Python脚本设置，带有空闲状态和控制选项的图形用户界面。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65974/65974fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5：命令行界面示例参数（上方）与运行控制软件（下方）的截图。 播放按钮位于左上角，可根据本地实现情况通过鼠标点击或触摸屏操作。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65974/65974fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="微生物实验结果表格、孔板、稀释体积、感染状态分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65974/65974fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 6"> 
图6：测试运行所配置的控制器清单文件。 培养物#0所在的培养池位于96孔深孔板的第1列和第3列，其余列为未使用孔。96深孔板中的A、B、D和E行在右侧列中标记为噬菌体感染组（1），其余行（0）为无噬菌体对照组。该控制器清单文件的设置将使程序在每个循环中用210 µL培养物对培养池进行稀释。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65974/65974fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="泻湖稀释率与体积的关系；图表显示数据计算；有效稀释方法分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65974/65974fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图7"> 
图7：使用稀释计算器电子表格计算有效泻湖稀释率。 详见补充文件2中的DilutionCalculator Spreadsheet。如本图所示，一个550 µL的泻湖每30分钟循环加入210 µL新鲜培养液，并且每四个循环取150 µL样品用于读板仪检测，其对应的平均有效稀释率为1.0泻湖体积/小时（每经过1小时，该小时开始时原始泻湖液体的50%将被保留）<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65974/65974fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="实验室封闭环境中带有发射分析的光谱学装置；可见光学设备。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65974/65974fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图8"> 
图8：机器人加热系统。 如红圈所示，插入电源后即可启动加热器。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65974/65974fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="紫外去污染装置；COM端口选择、时间持续、移液范围输入；方法示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65974/65974fig09.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图9"> 
图9：紫外去污染程序的设置。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65974/65974fig09large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="感染测试图；发光强度随时间变化，噬菌体阴性/阳性分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65974/65974fig10.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 10"> 
图 10：在 PRANCE 系统上进行的感染测试测量结果。 在运行过程中采集样品，并对发光强度和吸光度进行测量。对于每个微池，将发光强度测量值除以相应的吸光度测量值，并以时间为横坐标作图。被噬菌体感染的微池以绿色表示，未感染的对照微池以黑色表示。缩写：PRANCE = 噬菌体与机器人辅助近连续进化系统。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65974/65974fig10large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充文件 1：PRANCE 系统所需定制化平台组件的 3D 打印 STL 文件，至少包括细菌储存/分配歧管（“华夫格”）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65974/waffle_mini%20(1).zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 2：稀释计算器电子表格。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65974/65974_SI%20DilutionCalculator.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

噬菌体与机器人辅助的近连续进化（PRANCE）是一种用于快速、高效蛋白质进化的技术。机器人系统可实现实验的并行化、实时监测以及反馈控制。

机器人加速进化技术通过反馈控制提高进化的可靠性和速度，改善蛋白质及其他分子的进化结果。

我们正试图使神秘的进化过程变得足够可预测，以便用于工程化应用。PRANCE 使我们能够通过并行化手段将进化过程带入实验室的时间尺度，从而更深入地理解它。实验室自动化正在引入更广泛的软件工程概念，包括将人工智能应用于控制代码的开发。人们还将机械臂和多向传送系统集成到液体处理平台中。总体而言，自动化正融合更多先进的仪器设备和工作流程。反馈控制通过防止灭绝等常见失败模式，提高了连续进化的成功率。在多重进化过程中，分子的起始活性各不相同，动态调控进化严格性对于获得理想结果至关重要。新的科学问题包括探索不同条件如何影响进化过程，以及分析这些条件对噬菌体扩增和进化回路效率的作用。借助这些改进的蛋白质工程工具，我们致力于设计出功能更复杂、对环境敏感且具有动态功能的蛋白质。

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噬菌体和机器人辅助的近乎连续进化的实用指南

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通过逐步噬菌体筛选组合式单域抗体文库创建高特异性化学诱导蛋白二聚化系统

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利用噬菌体展示技术开发针对E3泛素连接酶的泛素变体调节剂

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利用NgTET辅助的CRISPR-Cas系统实现精确的噬菌体诱变

了解PRANCE技术如何通过机器人自动化和实时反馈控制实现蛋白质快速进化。该方法利用并行实验和动态进化严格性，帮助研究人员在实验室时间尺度上预测和优化蛋白质工程过程。

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