跨空间尺度捕捉小鼠卵母细胞核由细胞骨架介导的扰动

本实验室旨在利用小鼠卵母细胞模型系统，深入理解雌性配子数量获得过程中所涉及的机制，这对于有性生殖物种的繁殖至关重要。近期，我们发现了一种新的机械转导过程，该过程可促进细胞核及其内容物的扰动，从而实现对小鼠卵母细胞中母源RNA的精细调控。本实验方案中介绍的成像与图像分析流程，使我们能够揭示细胞骨架力量的传递如何作为一个连续过程，从细胞质跨尺度传递至细胞核及其内部结构，包括小鼠卵母细胞中的核内RNA加工小体。

本方案提供了简单的工具，使我们首次能够在单一流程中研究跨越多个细胞尺度的初始信号传递。结合生物物理建模，该方案构成了一种非侵入性技术，可用于研究细胞核力学性质的变化以及能量在细胞不同区室间的耗散。首先，在工作平台上准备好实验所需的所有材料。

从小鼠体内取出卵巢后，将其放入预热的含1微摩尔米力农的M2+牛血清白蛋白培养基中。用外科针头刺破卵巢卵泡，使生长中的卵母细胞从窦状卵泡中释放出来。使用微量移液器收集实验所需大小的卵母细胞，然后将其转移至含有新鲜培养基的培养皿中。

使用显微移液管将卵母细胞从一滴转移至另一滴，以实现卵母细胞与窦状卵泡细胞的机械分离。在37摄氏度下将卵母细胞稳定孵育一小时。

将YFP-Rango和SSF2 GFP的cRNA等分试样进行离心。使用显微注射器，在含有牛血清白蛋白并补充了米力农的温热M2培养基中，将cRNA注射到卵母细胞的细胞质内。将卵母细胞在37摄氏度的培养基中孵育两小时，以进行cRNA翻译。

接下来，将卵母细胞移入置于35毫米组织培养皿中的培养液滴内，该培养皿底部为盖玻片腔室，并以矿物油覆盖。首先，启动成像软件。打开采集窗口，将曝光时间设置为500毫秒，相机区域设为全芯片，二分之一合并（Binning）设为1。

然后为所需通道设置照明。进行细胞质搅拌时，使用透射光聚焦于卵母细胞的核仁；进行核斑点实验时，聚焦于SRSF2 GFP液滴。

在“特殊”选项卡中，为优化采集速度，将相机快门设置为“曝光时打开”，清除模式设置为“序列前清除”。接着，打开实时采集窗口。在“已采集”选项卡中，将采集模式设置为“流式传输至内存”，帧数设置为 480。

设置相机参数以按帧率采集图像，并将跳过帧数设为 0。在数字相机控制器参数选项卡中，将相机状态设为 HALT，快门模式设为 OPEN NEVER，清除模式设为 CLEAR PRE SEQUENCE，平均帧数设为 1。接下来，调整围绕目标物体的兴趣区域。

在“流采集”窗口中，单击“采集”以启动视频采集。采集完成后，将视频保存为 tiff 文件。进行图像分析时，请打开 ImageJ 或 Fiji。

在插件中，点击 CIRB 并打开 Verlhac 菜单，然后选择卵母细胞核形态。在对话框中，选择包含待分析视频的文件夹。然后选择 Theta 角度以及用于裁剪的边距。

现在选择 XY 校准和时间间隔，然后点击“确定”。要绘制随时间变化的平均形状，可在电子表格中针对每个定义的 theta 角度，计算所有时间点 T 上的平均半径 R。对于每个 T 和 theta，从半径 r 中减去该时间上的平均半径 R。

最后，针对每种条件下的每个细胞核以及所有细胞核，计算所有时间点 T 和所有角度 theta 的波动均值。在对照组卵母细胞中，细胞核表现出显著的周边波动，这可通过核探针 YFP-Rango 观察到；相比之下，在细胞骨架作用力被破坏的卵母细胞中，细胞核随时间保持稳定。

细胞核中心到其边缘距离的方差在对照组卵母细胞中比细胞骨架受力被破坏的卵母细胞高出六倍。对照组卵母细胞中的核斑在液滴表面表现出比细胞质受力被破坏时更大的波动。