Name: 体内 大鼠三叉神经节感觉神经元的钙成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-09T13:35:00.000+00:00
Duration: 4 min 39 s
Description: 学习利用基因编码钙指示剂对大鼠三叉神经节感觉神经元进行在体钙成像技术，用于表征神经损伤后的感觉编码变化并识别参与神经病理性疼痛的传入神经亚群。该方法有助于深入理解外周疼痛机制并探索潜在治疗靶点。

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我们感谢Kathy Albers博士和Brian Davis博士提供Leica显微镜及Metamorph软件的使用，感谢Charles Warwick协助构建我们的热电Peltier装置，以及感谢Raymond Sekula博士在手术准备过程中的故障排查协助。本研究得到了美国国立卫生研究院资助：F31NS125993（JYG）、T32NS073548（JYG）和R01NS122784（MSG和RS）。

所有涉及动物实验的研究均遵循美国国立卫生研究院和国际疼痛研究协会制定的标准，并经匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会批准（方案编号 #22051100）。每次实验结束后，大鼠通过冰冻磷酸盐缓冲液（PBS）心脏灌流放血处死，该方法已获美国兽医协会和匹兹堡大学IACUC批准。
1. GCaMP 诱导
<ol>
	<li>订购妊娠时间明确的Sprague Dawley大鼠，以便在幼崽出生后的适当时间进行注射。</li>
	<li>在接触每只幼鼠前，用70%乙醇喷洒手套。这可以防止母鼠吞食幼崽。</li>
	<li>用70%乙醇擦拭幼鼠（P1-2），并在冰上麻醉3分钟。</li>
	<li>使用25 µL无菌、气密的Hamilton注射器，将15 µL AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40（Addgene）经腹腔注射。</li>
</ol>
2. 三叉神经节暴露手术
<ol>
	<li>根据体重，对6-8周龄大鼠（约150-200 g）腹腔注射麻醉混合液（55 mg/kg 氯胺酮，5.5 mg/kg 赛拉嗪，1 mg/kg 乙酰丙嗪）。 
	注意：通常这足以维持手术所需的麻醉深度，可通过后肢足垫施加有害性夹捏后无回缩反射来评估。然而，若动物麻醉变浅，需通过鼻罩补充异氟烷。</li>
	<li>待大鼠完全麻醉后，剃除头部和面部的毛发及胡须。</li>
	<li>将大鼠固定于立体定位仪上，使用耳杆固定，并在下方放置加热垫（约37 oC），以维持体温。</li>
	<li>使用小鼠血氧仪或同类设备监测生命体征（心率、呼吸频率、血氧饱和度）。 
	注意：通过直肠探头监测体温，并将大鼠置于由反馈控制的循环水毯上以维持体温。</li>
	<li>将浸有冰生理盐水的纱布置于头部，以收缩血管、减少出血。使用15号手术刀在颅骨上方沿中线切开皮肤和肌肉。</li>
	<li>钝性分离皮肤和肌肉组织，暴露颅骨。</li>
	<li>使用¼圆钻头小心钻穿颅骨，暴露前脑。然后使用咬骨钳（2.5 mm杯）小心切除颅骨。</li>
	<li>使用15号手术刀在脑部（前囟：-3.80）和嗅球处进行切开。 
	注意：若切口位置更偏尾侧，则会导致大鼠死亡</li>
	<li>使用解剖铲小心分离硬脑膜与颅骨，并轻轻抬起已切断的脑组织，以暴露三叉神经节（TG）和颅底。 
	注意：在整个取出过程中持续使用冰生理盐水灌注，有助于减少出血并优化后续解剖视野。</li>
	<li>使用电凝笔止住取材过程中出现的出血。 
	&#8203;注意：切开硬脑膜将不可避免地引起出血。最好预先准备好冰冻人工脑脊液（aCSF，含119 mM NaCl、26.2 mM NaHCO3、2.5 mM KCl、1 mM NaH2PO4、1.3 mM MgCl2、10 mM 葡萄糖、2.5 mM CaCl2），用于灌洗颅腔，以帮助收缩血管并同时维持神经元活性。</li>
</ol>
3. GCaMP6s 成像
注意：由于这些神经元的尺寸和密度，所使用的成像和数据采集系统（物镜、显微镜、光源、相机）将决定可观察到的 GECI+ 细胞数量。光源、物镜和相机还将决定图像采集的参数，包括曝光时间和图像采集速率。虽然根据实验参数可以选择双光子或共聚焦成像技术，但落射荧光显微镜可能已足以分辨大量细胞。可使用任何图像采集软件包。理想情况下，刺激施加应与图像采集软件包实现时间同步。
<ol>
	<li>将颅腔置于物镜下方，使用可见光将TG调至焦点。</li>
	<li>GCaMP6s 的激发波长为 496 nm，发射波长为 513 nm；因此，请使用合适的二向色镜和滤光片组来定位 GCaMP+ 细胞。调节焦距以定位并清晰观察神经元对目标感受野所受刺激产生反应的神经节区域。</li>
	<li>使用10倍物镜以实现对三叉神经节中大多数神经元的可视化，这些神经元对施加于1 cm区域的机械刺激有反应2 面部区域16使用工作距离较长（10.8 mm）的20倍干镜物镜以提高分辨率。</li>
	<li>使用采集软件（例如 Metamorph）随时间采集荧光数据，并记录对刺激应用的响应。
	<ol>
		<li>为尽量减少神经元的光漂白，应使用尽可能短的曝光时间来检测荧光的基础水平及刺激诱导的荧光增强。在本研究中采用20倍、0.40 NA的空气物镜、120 W汞卤素光源以及互补金属氧化物半导体（CMOS）相机，设置曝光时间为300 ms，图像采集速率为3 Hz，可获得稳定的基线记录 &#62;90 分钟 
		注意：1）这些图像采集参数必须通过实验经验确定。2）可在感受野上施加机械性（刷子、点状、振动、夹捏）、温度性（热和冷）以及化学性（辣椒素、薄荷醇、炎症介质）刺激。一种相对廉价的主观方法是手动施加刺激，但建议采用更客观且可重复的方法，例如使用反馈控制的驱动装置以已知力度进行重复刺激。虽然反馈控制的帕尔帖（Peltier）装置适用于精确的加热和冷却，但并不适合对曲面（如面部）进行热刺激。反馈控制的红外光源可作为加热的替代方案，而冷喷雾则是冷却效果较差的替代方法。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

In Vivo Visualization of the Rat Trigeminal Ganglion With Calcium Indicators

<ol><li>Gold, M. S., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptor+sensitization+in+pain+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Nociceptor sensitization in pain pathogenesis.</a> Nat Med. 16 (11), 1248-1257 (2010).</li>
<li>Gold, M. S., Caterina, M. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGold%2C+MS+%22The+Senses%3A+A+Comprehensive+Reference%22">The Senses: A Comprehensive Reference</a>. , Academic Press. (2008).</li>
<li>Lawson, S. N., Fang, X., Djouhri, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptor+subtypes+and+their+incidence+in+rat+lumbar+dorsal+root+ganglia+%28DRGs%29%3A+focussing+on+C-polymodal+nociceptors%2C+A%CE%B2-nociceptors%2C+moderate+pressure+receptors+and+their+receptive+field+depths%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Physiol%22%5BJournal%5D)">Nociceptor subtypes and their incidence in rat lumbar dorsal root ganglia (DRGs): focussing on C-polymodal nociceptors, Aβ-nociceptors, moderate pressure receptors and their receptive field depths.</a> Curr Opin Physiol. 11, 125-146 (2019).</li>
<li>Handler, A., Ginty, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanosensory+neurons+of+touch+and+their+mechanisms+of+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The mechanosensory neurons of touch and their mechanisms of activation.</a> Nat Rev Neurosci. 22 (9), 521-537 (2021).</li>
<li>Jankowski, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+neurturin+overexpression+alters+mechanical%2C+thermal%2C+and+cold+responsiveness+in+physiologically+identified+primary+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Cutaneous neurturin overexpression alters mechanical, thermal, and cold responsiveness in physiologically identified primary afferents.</a> J Neurophysiol. 117 (3), 1258-1265 (2017).</li>
<li>Shannonhouse, J., Gomez, R., Son, H., Zhang, Y., Kim, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+calcium+imaging+of+neuronal+ensembles+in+networks+of+primary+sensory+neurons+in+intact+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia.</a> J Vis Exp. 192, 64826(2023).</li>
<li>Anderson, M., Zheng, Q., Dong, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+pain+mechanisms+by+calcium+imaging+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Bull%22%5BJournal%5D)">Investigation of pain mechanisms by calcium imaging approaches.</a> Neurosci Bull. 34 (1), 194-199 (2018).</li>
<li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li>
<li>Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+for+analgesic+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Pain%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging for analgesic drug discovery.</a> Neurobiol Pain. 11, 100083(2022).</li>
<li>Tada, M., Takeuchi, A., Hashizume, M., Kitamura, K., Kano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+sensitive+fluorescent+indicator+dye+for+calcium+imaging+of+neural+activity+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A highly sensitive fluorescent indicator dye for calcium imaging of neural activity in vitro and in vivo.</a> Eur J Neurosci. 39 (11), 1720-1728 (2014).</li>
<li>Lu, S. G., Zhang, X., Gold, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+regulation+among+subpopulations+of+rat+dorsal+root+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium regulation among subpopulations of rat dorsal root ganglion neurons.</a> J Physiol. 577 (Pt 1), 169-190 (2006).</li>
<li>Warwick, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+calcium+imaging+of+central+sensitization+in+mouse+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific calcium imaging of central sensitization in mouse dorsal horn.</a> Nat Commun. 13 (1), 5199(2022).</li>
<li>Scheff, N. N., Yilmaz, E., Gold, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+properties%2C+distribution+and+function+of+Na%28%2B%29-Ca%282%2B%29+exchanger+isoforms+in+rat+cutaneous+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The properties, distribution and function of Na(+)-Ca(2+) exchanger isoforms in rat cutaneous sensory neurons.</a> J Physiol. 592 (Pt 22), 4969-4993 (2014).</li>
<li>Scheff, N. N., Gold, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+na%2B%2Fca2%2B+exchanger+to+the+site+of+persistent+inflammation+in+nociceptive+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Trafficking of na+/ca2+ exchanger to the site of persistent inflammation in nociceptive afferents.</a> J Neurosci. 35 (22), 8423-8432 (2015).</li>
<li>Hartung, J. E., Gold, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GCaMP+as+an+indirect+measure+of+electrical+activity+in+rat+trigeminal+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons.</a> Cell Calcium. 89, 102225(2020).</li>
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<li>Hu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+trigeminal+ganglion+neuronal+activities+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+.Biol%22%5BJournal%5D)">Visualization of trigeminal ganglion neuronal activities in mice.</a> Curr Protoc Cell .Biol. 83 (1), e84(2019).</li>
<li>von Buchholtz, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+cellular+mechanisms+for+mechanosensory+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Decoding cellular mechanisms for mechanosensory discrimination.</a> Neuron. 109 (2), 285-298 (2021).</li>
<li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaImAn+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22elife%22%5BJournal%5D)">CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> elife. 8, e38173(2019).</li>
</ol>

Gold 博士在本实验方案开发期间获得了格兰泰公司的资助。格兰泰公司的研究项目与本文所述实验方案的研究重点并无重叠。其余两位作者均无其他潜在利益冲突需要披露。

在此，我们展示了一种快速、无创的方法，用于生成可用于TG成像的GECI大鼠。我们选用CAG启动子来驱动并维持高水平的基因表达。尽管先前的研究表明其他AAV血清型可能在DRG神经元中高效驱动基因表达39，但我们的结果与最近一项关于新生大鼠腹腔注射AAV的研究一致32，表明AAV9血清型在感染新生大鼠感觉神经元方面具有很高的效率。
在对该技术进行故障排查时，需注意一些可能影响最佳感染效果的潜在问题。首要考虑的变量是仔鼠的年龄。大鼠神经系统在出生后的前7天内发育迅速40。我们曾尝试在较晚的时间点（例如出生后第4至7天）进行感染，结果感染效率不稳定且较低。而在较早的时间点（出生后第1至4天）进行操作可获得更强且更一致的感染效率，其中以出生后第1至2天的感染率最高。第二个变量是注射体积。无论年龄如何，使用滴度为2.5 × 1014时，至少需要15 µL的注射量才能在三叉神经节（TG）或背根神经节（DRG）中实现超过70%的感染效率。我们发现，即使在出生后第2天，腹腔注射低于10 µL的病毒量也会导致成年期几乎无表达。或许通过更低体积但更局部化的注射方式（即直接注射到目标感受野区域）也能达到类似效果。然而，这种方法需要仔鼠完全麻醉，并可能对目标组织造成损伤。最后，使用更高滴度的病毒可能允许减少注射体积。
既往已在小鼠中实施过暴露三叉神经节（TG）以进行基因编码钙离子指示剂（GECI）成像的操作16。然而，将该方法应用于大鼠时暴露出若干值得注意的问题。首先，大鼠颅骨和硬脑膜的厚度明显大于小鼠，因此移除颅骨骨瓣可能更具挑战性。我们发现，使用小型钻头有效穿透颅骨骨瓣后，可用咬骨钳将其移除。第二个问题是脑组织移除后可能出现出血。若不加以控制，出血不仅可能影响制备样本的存活时间，还可能影响成像清晰度，甚至影响神经元本身的特性。将浸有冰冻脑脊液（CSF）的纱布敷于暴露的脑表面，有助于闭合主要动脉。使用小型电灼笔也可能有效阻止进一步出血。此外，在成像窗对侧放置明胶海绵（Gelfoam）也有助于防止血液和脑脊液干扰成像。第三个需考虑的因素是需移除脑组织的范围。我们发现，若移除位于约前囟后方 -3.80 mm 以远的脑组织，动物会在移除后一小时内死亡。因此，应分小块逐步移除脑组织，在尽可能充分暴露三叉神经节的同时，最大限度保留脑组织。
如引言中所述，[Ca2+]i 是神经元活动的间接指标，因此，[Ca2+]i 的升高并不一定意味着神经活动的增加。因此，对照实验至关重要，用以确认所观察到的活动确实是真正的神经活动。例如，电刺激诱发的反应应产生与自然刺激相似幅度的时间锁定性 [Ca2+]i 升高。重要的是，这种活动应能被神经阻断（例如使用 TTX）所消除。然而也需注意，尽管有这些重要的对照措施，部分看似由刺激诱发的 [Ca2+]i 升高仍有可能源于神经节内部的信号传递，例如由于神经节内递质释放41，而非由外周引发并传入胞体的动作电位所致。
尽管我们的结果证实了先前研究者16,42,43的发现，即GCaMP荧光在感觉神经元胞体中变化所对应的信噪比足以满足标准落射荧光显微镜的使用要求，但诸如本研究中所采用的神经损伤等操作，可能引起神经元活动和Ca2+信号传导的显著变化34，导致整个神经节范围内出现明显的表观背景升高，从而可能人为地削弱单个神经元的响应信号。尽管已有图像处理方法被开发出来以帮助缓解这一局限性44，但共聚焦或双光子成像可能是更有效地解决该问题的必要手段。
综上所述，该技术为在群体水平上研究大鼠三叉神经节（TG）神经元的刺激-反应特性提供了一种方法。我们对眶下神经（ION）进行慢性压迫损伤（CCI）的结果证实了检测这些刺激-反应特性变化的可行性。尽管本研究仅使用了机械和热刺激，但该实验体系应同样适用于化学刺激的应用，以全面界定TG神经元的刺激-反应特性。类似地，尽管我们重点关注了皮肤传入纤维的刺激-反应特性，但由于皮肤神经创伤后会出现动态机械性异常性疼痛等现象，因此也有望检测支配其他颅面结构（如颞下颌关节（对无害与有害下颌运动的反应）、角膜或舌）的传入纤维特性的改变。外周注射AAV9血清型病毒可实现神经元特异性且外周神经系统（PNS）特异性的GCaMP诱导表达。该策略的一个主要优势在于，病毒标记可在终末分化细胞（即神经元）中实现强效且持久的表达，而在分裂细胞（如上皮细胞）中则不表达。此外，初步对不同外周神经系统组织的筛选结果表明，该病毒策略还可用于研究交感/副交感神经节、背根神经节（DRG）以及肠神经系统（数据未显示）。
这种体内制备方法还为探索当前文献中尚缺乏的多种比较研究提供了基础。体内群体研究，如大鼠三叉神经节（TG）与背根神经节（DRG）之间的比较、大鼠与小鼠三叉神经节（TG）之间的比较，尚未开展。本文展示的数据说明了开展这些重要实验的新可行性。

躯体感觉是指机械、热和化学刺激作用于皮肤或其他身体结构（包括肌肉、骨骼和内脏）时，由支配这些结构的初级传入神经元活动所引发的神经编码过程1。基于单个神经元的电生理学方法已为参与该过程的传入神经元亚型及其刺激-反应特性随时间变化的规律提供了大量信息1,2,3。然而，尽管支持“标记线理论”（即特定感觉模式由特定神经元亚群传递）的证据仍然充分，但许多神经元亚群能够对相同类型的机械、热和化学刺激产生反应的事实表明，大多数躯体感觉刺激是由多个神经元亚群共同编码的4,5。因此，只有具备同时研究数十个甚至数百个神经元活动的能力，才能更深入地理解躯体感觉机制。
随着共聚焦显微技术的出现，以及随后多光子成像和数字成像技术的发展，光学方法取得了显著进步，使得对神经元活动进行相对无创的群体水平分析成为可能6,7。该技术应用中的最后一个挑战之一，是开发出可用于光学检测神经活动的工具。鉴于动作电位的发生和结束可在不到一毫秒内完成，能够以动作电位的速度追踪膜电位变化的电压敏感性染料，将是实现这一目标的理想工具。尽管该领域已取得巨大进展7,8,9,10，但这些染料中的许多信号噪声比仍不够高，尚无法在单细胞水平上对数百个神经元进行群体分析。作为一种替代方法，研究人员转而监测细胞内Ca2+浓度（[Ca2+]i）的变化。这一策略的局限性从一开始就十分明确，包括：[Ca2+]i升高是神经活动的间接指标11；[Ca2+]i升高可能独立于电压门控Ca2+通道（VGCCs）激活所引起的Ca2+内流而发生12,13；Ca2+瞬变的幅度和持续时间可能受控于与VGCC活性无关的其他过程11,12,14；以及Ca2+瞬变的时间进程远长于动作电位15。然而，使用Ca2+作为神经活动间接测量指标仍具有若干显著优势。其中尤为突出的是大多数Ca2+指示剂所具有的较高信号噪声比，这既反映了细胞内Ca2+变化的幅度，也得益于信号来源于细胞质的三维空间，而非细胞膜的二维空间。此外，随着基因编码Ca2+指示剂（GECI's）的发展，现在可以利用基因策略驱动Ca2+指示剂在特定细胞亚群中的表达，从而促进在完整组织样本中进行群体水平的分析（例如见16）。
鉴于目前可用于小鼠的遗传工具数量众多，GECI 在该物种中的应用最为广泛也就不足为奇了。现已开发出在感觉神经元亚群中组成型表达 GECI 的小鼠品系。7,16,17随着表达重组酶的特定小鼠品系的发展，现在可以采用更为复杂精密的策略来控制GECI的表达15然而，尽管这些工具正变得越来越强大，仍有一些原因使得其他物种（如大鼠）在某些实验问题上可能更为合适。这包括大鼠体型更大，便于进行许多在体型较小的小鼠中难以甚至无法实施的实验操作；大鼠在相对复杂的行为学任务中更容易训练；并且至少有一些证据表明，大鼠感觉神经元中多种离子通道的生物物理特性及其表达模式，相较于小鼠，更接近于人类感觉神经元中所观察到的情况&#160;小鼠中相对于人类的相同通道18.
虽然躯体感觉刺激的转导通常发生在初级传入神经元的外周末梢，但从外周引发的动作电位必须经过初级传入神经元胞体所在的结构——即背根神经节（DRG）或三叉神经节（TG）——才能传入中枢神经系统19。尽管有证据表明，并非每一个沿初级传入轴突传导的动作电位都会侵入胞体20——这可能是由于初级传入神经元胞体通过T型分支与主传入轴突相连所致19——但大多数在外周引发的动作电位似乎仍会侵入胞体21。这一特性在使用基因编码钙指示剂（GECIs）评估初级传入神经元群体编码时提供了三个实验优势：相对于轴突而言较大的胞体尺寸，在利用细胞内钙离子浓度[Ca2+]i作为传入活动间接指标时可进一步提高信噪比；DRG通常易于接近；并且在空间上远离传入末梢的部位评估活动，可最大限度地减少暴露神经节所需的手术对传入末梢刺激-反应特性可能造成的影响。然而，由于TG位于脑下方（或腭部上方），其可及性远低于DRG。此外，尽管DRG与TG神经元之间存在诸多相似之处，但两者之间的差异也日益显现，包括TG神经元大致呈躯体定位式的排列方式22、所支配的独特结构、不同的中枢末梢终止模式23,24,25,26，以及越来越多发现的基因表达27,28和功能型受体表达方面的差异29。此外，由于我们关注的是疼痛外周机制的识别，而临床上存在大量似乎仅局限于三叉神经系统的疼痛综合征（例如偏头痛、三叉神经痛、灼口综合征），这些疾病被认为涉及初级传入神经元的异常活动30,31,32，因此有必要对TG进行直接研究。
因此，尽管已利用基因编码的钙离子指示剂（GECIs）在小鼠中研究了三叉神经节（TG）神经元的刺激-反应特性16，但由于上述原因表明大鼠可能是回答多种实验问题的更合适物种，本研究的目的是建立一种在大鼠中使用GECIs研究TG神经元的方法。为实现这一目标，我们采用病毒介导的方法在周围神经系统中驱动GECI GCaMP6s的表达。随后去除前脑，以暴露并获取对TG的通路。最后，在对面部施加机械和热刺激的同时，通过荧光显微镜评估神经元的反应。这些数据共同支持利用大鼠研究多种状态下TG变化的作用，从而扩展了对三叉神经系统感觉编码感兴趣的科研人员可用的技术工具。

<table><tbody><tr><td>AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>100844-AAV9</td><td>AAV9-GCaMP6s 病毒</td></tr><tr><td>马来酸乙酰丙嗪</td><td>Covetrus</td><td>11695-0095-5</td><td>10 mg/mL</td></tr><tr><td>镇痛灵（赛拉嗪）注射液</td><td>AKORN Animal Health</td><td>23076-35-9</td><td>20 mg/mL</td></tr><tr><td>CTR5500 电子控制箱</td><td>Leica</td><td>11 888 820</td><td>电源供应器</td></tr><tr><td>Cutwell 钻头</td><td>Ransom &amp;amp; Randolph</td><td></td><td>&amp;frac14; 圆形</td></tr><tr><td>DM 6000 FS</td><td>Leica</td><td>11 888 928</td><td>底座支架</td></tr><tr><td>EL6000</td><td>Leica</td><td>EL6000</td><td>带120 W汞灯的光源</td></tr><tr><td>镊子</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td>Dumont No. 05</td></tr><tr><td>弗里德曼咬骨钳</td><td>FST</td><td>16000-14</td><td>2.5 mm 杯口尺寸</td></tr><tr><td>弗里德曼-皮尔逊咬骨钳</td><td>FST</td><td>16021-14</td><td>1 mm 杯口尺寸</td></tr><tr><td>加热垫（温度治疗垫）</td><td>STRYKER</td><td>8002-062-022</td><td></td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮</td><td>Covetrus</td><td>1695-0703-1</td><td>100 mg/mL</td></tr><tr><td>Plan Fluor 20x/0.40</td><td>Leica</td><td>MRH00105</td><td>20倍物镜，数值孔径0.4，工作距离10.8 mm</td></tr><tr><td>高温电灼笔电源手柄</td><td>Bovie</td><td>HIT1</td><td>手持式可更换笔头电灼笔</td></tr><tr><td>Prime 95B</td><td>Photometrics</td><td>Prime 95B</td><td>CMOS 相机</td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>菲舍尔科技</td><td>NC0291799</td><td>0.9% 无菌生理盐水</td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>菲舍尔科技</td><td>22-079-701</td><td>15号一次性刀片</td></tr><tr><td>刮勺</td><td>BRI</td><td>48-1460</td><td>脑用刮勺</td></tr><tr><td>弹簧剪</td><td>FST</td><td>91500-09</td><td>学生用Vannas剪，5 mm剪切刃</td></tr><tr><td>弹簧剪</td><td>FST</td><td>15012-12</td><td>Noyes剪，14 mm剪切刃</td></tr><tr><td>STP6000 智能触摸面板</td><td>Leica</td><td>11 501 255</td><td>控制面板</td></tr><tr><td>注射器</td><td>Hamilton</td><td>80201</td><td>25 &amp;mu;L Model 1702 鲁尔接头注射器</td></tr><tr><td>水加热器</td><td>Adroit</td><td>HTP-1500</td><td></td></tr></tbody></table>

体内大鼠三叉神经节感觉神经元的钙成像

In-Vivo Calcium Imaging of Sensory Neurons in the Rat Trigeminal Ganglion

基因编码的钙离子指示剂（GECIs）可实现对特定细胞群体中细胞内钙离子变化的成像监测。由于其具有较高的信噪比，GECIs 成为检测感觉神经元中刺激诱发活动的有力工具。GECIs 能够促进对刺激编码的群体水平分析，使可同时研究的神经元数量显著增加。这种群体编码分析最适合在 在体背根神经节（DRG）含有支配颈部以下躯体和内脏结构的感觉神经元胞体，被最广泛地用于 体内 成像，因为这些结构相对容易获取。最近，该技术被用于小鼠以研究支配口腔和颅面结构的三叉神经节（TG）中的感觉神经元。除了背根神经节（DRG）之外，研究TG的原因众多，其中包括一系列特发于口腔和颅面结构的疼痛综合征，这些综合征似乎反映了感觉神经元活动的变化，例如三叉神经痛。由于遗传工具的可及性，小鼠被最广泛地用于DRG和TG神经元的研究。然而，考虑到大小、操作便利性以及潜在的重要物种差异，也有必要对大鼠而非小鼠的TG神经元进行研究。因此，我们建立了一种用于成像大鼠TG神经元的方法 体内我们通过腹腔注射的方式向新生幼鼠（p2）注射了编码GCaMP6s的腺相关病毒（AAV），结果导致 &gt;三叉神经节（TG）和背根神经节（DRG）神经元的感染率达到90%。通过开颅和去皮质手术在成年动物中观察三叉神经节（TG），并在刺激面部下颌支和上颌支区域后监测TG神经元中GCaMP6s荧光信号的变化。我们通过外周神经阻断证实荧光增强是由刺激诱发的。尽管该方法具有多种潜在应用，目前我们正利用它来表征外周神经损伤后发生变化的TG神经元亚群。

由于我们先前使用 AAV9 血清型感染大鼠感觉神经元已取得成功15，因此本研究采用该血清型在大鼠三叉神经节（TG）神经元中表达 GCaMP6s。我们首先评估了将 AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40（AAV9-GCaMP）病毒注射至新生大鼠后对感觉神经元的感染效率20。该病毒采用 CAG 启动子，可驱动并维持高水平的基因表达。此外，已有研究表明，AAV9 在注射至新生大鼠时能高效感染感觉神经元33。初次注射采用 5 µL 病毒量，注射于出生后第 5 天（p5）的幼鼠，感染效率约为 51.66% ± 14.33%（图 1A）。为提高感染率，后续实验改用更小日龄（p2）的大鼠，并增加病毒注射体积至 15 µL，同时保持病毒滴度为 2.4 × 1014 不变。该策略使神经元感染率达到 91.84% ± 3.18%（n = 8）（图 1B）。
为了观察支配须垫的三叉神经节（TG）神经元，我们接下来开发了一种外科手术策略以暴露TG 体内大约60%的前脑可被切除而不会影响主要的呼吸中枢，这对应于前囟（Bregma）-3.80前方的脑组织。左侧显示暴露的三叉神经节（TG）示意图，右侧显示眶下神经（ION）的支配区域示意图。 图2通过在20倍镜下监测荧光变化，同时对须垫施加轻度机械刺激（刷子），确定三叉神经节（TG）中支配须垫的区域。正如预期，支配面部上颌分支的TG的V2区域是唯一被激活的区域。即在未进行系统研究的情况下，当所研究的神经元可被施加于须垫的刺激激活时，施加于V1（前额皮肤）或V3（下颌皮肤）区域的刺激并未引起荧光信号的变化。随后监测了基线状态及对须垫施加刺激后的荧光变化。感兴趣区域（V2）在图中已标出 图 3A. 与先前关于感觉神经元静息活动水平相对较低的报道一致34，大多数神经元的静息荧光相对较低，且几乎未见荧光的自发性升高图3B). 用于识别外周神经元中刺激诱发活动的标准6,16,21 和中枢神经系统12,35,36 是一个不断发展的领域，已有多个复杂的流程软件包被免费提供37,38. 本文并非旨在全面讨论所采用的各种方法的优缺点，相关内容已超出本论文的范畴。由于该问题并非本研究的重点，我们采用了相对随意且主观的标准，即依据在神经节中无明显可检测神经元（根据能否观察到细胞核判断）的区域所记录到的峰值反应来判定。若神经元的荧光信号增强与刺激施加在时间上具有锁时关系（在刺激施加后1秒内检测到荧光增强，此标准基于如下假设：动作电位在最慢传导的轴突（0.2 m/s）中，若起始位置距离胞体不超过3 cm，则应在1秒内传导至胞体），则认为该神经元对刺激有反应，且其反应 &gt;6 倍峰响应（ΔF/F）的标准差用于检测对照位点图3C）。接着，我们表征了这些神经元对自然刺激的反应特性：刷毛、点状、热和冷刺激。每种刺激反应的示例如下所示 图4值得注意的是，在疼痛相关研究中最常使用的点状刺激，其反应最为显著（图4B，F).
开发该技术的目标是能够评估三叉神经节（TG）神经元中群体编码的变化。因此，我们采用了先前已使用过的眶下神经慢性压迫损伤模型（CCI-ION）29，以研究神经损伤后2周的大鼠。在模型建立后，我们暴露三叉神经节，并检测了损伤同侧与对侧TG的静息状态活动及诱发活动。有趣的是，与对侧施加相同刺激时的峰值反应相比，损伤侧对刷毛刺激的峰值诱发反应幅度增加了约2倍（图5A-C）。此外，当以10秒的刺激间间隔连续施加两次刷毛刺激时，仅在损伤侧而非未损伤侧，第二次刺激的反应幅度出现显著增强（图5D）。
最后，作为初步的对照实验，为了确认刺激诱发的荧光增强是由于外周引发的动作电位所致，我们评估了河豚毒素（tetrodotoxin,1 µM)对刺激诱发反应的影响。注射河豚毒素（TTX）的体积为 200 µL 经皮穿刺，操作步骤如前所述28 以靶向眶下神经。如图所示 图6，诱发活动几乎完全消失。综上所述，这些结果表明利用AAV9-GCaMP研究三叉神经节群体反应的有效性 体内.
<img alt="神经元的荧光显微镜图像，AAV9 GCaMP6s 和 NeuN 标记物，GCaMP6s+ 百分比图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65978/65978fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：通过新生期 AAV 注射在三叉神经节神经元中实现 GCaMP6s 高效感染。（A）对出生后第5天（P5）的大鼠幼崽腹腔注射 5 µL 的 pAAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-Sv40 病毒（滴度：2.4 × 1014），在三叉神经节（TG）神经元中检测到 51.7 ± 14.3% 表达 GCaMP6s（每只动物 n = 3 个切片，共 7 只大鼠）。（B）在更年轻的动物（P2）中将注射体积增加至 15 µL 可提高感染效率：在 TG 神经元中检测到 91.8 ± 3.2% 表达 GCaMP6s（每只动物 n = 3 个切片，共 8 只大鼠）。左侧图板显示 GCaMP6s 染色结果，中间图板显示神经元特异性标志物 NeuN 的染色结果，右侧图板为 GCaMP6s 与 NeuN 图像的合并结果。第一张图中的比例尺适用于后续所有图板。右侧图表显示每只动物每个切片中表达 GCaMP6s 的神经元百分比（均值 ± 标准误），其中单个数据点代表每只动物的数据。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65978/65978fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="三叉神经节（TG）示意图；小鼠头部、刺激区域、眶下神经突出显示。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65978/65978fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：三叉神经节（TG）、眶下神经（ION）及面部受刺激区域（须垫）的位置。 （A）去除前脑以暴露三叉神经节（TG）。 （B）施加自然刺激的面部区域，相对于眶下神经（ION）和三叉神经节（TG）的位置。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65978/65978fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="视觉皮层反应，钙成像分析，基础状态与刷毛刺激对比，荧光变化图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65978/65978fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3刺激诱发的 GCaMP6s 荧光增强 (A) 20倍放大下的全视野。图中标示出三叉神经节的眼支（V1）和上颌支（V2）。B,C方框内的区域在各图中显示 B 和 C，分别为刺激大鼠触须垫前后拍摄的荧光图像。白色圆圈为对照兴趣区域。根据文中所述，在对照兴趣区域内观察到的荧光信号峰值变化，判断神经元是否对刺激有反应。第一张图中的比例尺适用于两幅图像。D) 对面部施加刷毛刺激后，B 和 C 中所示神经元荧光的代表性变化。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65978/65978fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="基线与刺激显微图像及响应曲线；感觉神经元活性分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65978/65978fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：基于面部施加刺激后神经元反应的神经元分类。 三叉神经节（TG）神经元在对同一面部区域施加1 cm驼毛刷（A — 刷拭）、1 cm2单丝阵列（B — 点状刺激）、加热（C — 热刺激）和冷却（D — 冷刺激）前（上排图像 — 基线）和刺激后（中排图像 — 刺激响应）的代表性图像。第一幅图像中的比例尺适用于后续所有图像。橙色圆圈表示有反应的神经元示例，白色圆圈为对照兴趣区域。（E–H）每种刺激对应的代表性响应曲线。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65978/65978fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="神经元反应图和柱状图；ΔF/F分析；对侧与同侧；数据比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65978/65978fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：神经损伤会增强三叉神经节（TG）神经元对刷毛刺激的反应。 三叉神经节神经元对大鼠面部施加两次刷毛刺激的典型反应，刺激部位位于眶下神经慢性缩窄性损伤的对侧（A，对侧）或同侧（B，同侧）。（C）对六只大鼠中具有反应的神经元进行数据汇总分析（数据按每只大鼠绘制）证实，对侧与同侧在首次刷毛刺激反应幅度上的差异具有统计学显著性（配对t检验）。（D）当将第二次与第一次刺激的峰值反应比值（R2/R1）进行分析时，汇总数据分析进一步证实，在神经损伤侧，反应比值的增加具有统计学显著性。** p &lt; 0.01 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65978/65978fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图A中随时间变化的荧光强度（ΔF/F）；图B中峰值反应的比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65978/65978fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 6"> 
图6：河豚毒素（TTX）对三叉神经节（TG）神经元诱发活动的阻断作用。（A）在眶下神经旁注射TTX（200 µL，1 µM）后，接受刷毛刺激（蓝色条）时，同侧神经损伤的TG神经元的荧光数据。(B) 来自三只大鼠的峰值反应数据汇总。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65978/65978fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

基因编码的钙离子指示剂（GECI）可实现对感觉神经元信号传导的稳健且群体水平的分析。本文中，我们开发了一种新方法，可实现 体内 大鼠三叉神经节神经元活动的GECI可视化

基因编码的钙离子指示剂（GECIs）可使成像技术用于监测特定细胞群体中细胞内钙离子浓度的变化。

我们实验室的总体目标是研究疼痛的外周机制。而我的项目则具体探讨三叉神经损伤相关的疼痛。我今天展示的实验方法使我们能够表征感觉编码的变化，并鉴定参与神经病理性疼痛的传入神经亚群。因此，我们已证明三叉神经传入纤维与躯体传入纤维在神经损伤后的反应存在差异。Nav 1.1 在三叉神经中特异性地上调，提示选择性阻断 Nav 1.1 的药物可用于识别参与神经病理性疼痛的不同传入纤维亚群。目前，转基因小鼠最广泛地与多种成像技术和基于组学的策略联合使用。将小鼠实验产生的数据外推至其他物种（甚至人类）存在困难。小鼠体型非常小，难以进行训练，且小鼠、大鼠与人类之间存在越来越多已知的差异。因此，使用大鼠可能有助于解决其中多项挑战。颅面部结构（即颈部以上结构）的疼痛机制及潜在治疗靶点，与身体其他体表和内脏结构（即颈部以下结构）存在差异。本实验结果表明，神经病理性疼痛可能不仅反映中枢神经系统的变化，实际上也可能反映周围神经系统的变化，而过去认为这种疼痛仅与中枢神经系统改变相关。首先，使用25微升Hamilton注射器向麻醉后的大鼠幼崽腹腔内注射15微升agene。接着，剃除6至8周龄麻醉幼鼠的头部毛发和胡须，将大鼠固定在立体定位仪上并插入耳杆，并在下方放置加热垫以维持动物体温。然后，将浸有冰生理盐水的纱布覆盖在大鼠头部，以尽量减少出血。使用15号手术刀，在颅骨上方的皮肤和肌肉正中线上做一切口。牵开皮肤和肌肉以暴露颅骨，用1×4圆形钻头小心地钻穿颅骨，暴露前脑。然后使用咬骨钳剪开颅骨。使用15号手术刀在脑组织和嗅球上做切口。用解剖铲小心地将硬脑膜与颅骨分离。然后轻轻抬起切断的脑组织，以暴露三叉神经节和颅底。使用电灼笔灼烧止血。为成像GCaMP6s，将颅腔置于显微镜物镜下方，然后调节至终末神经节清晰对焦。接下来，对脸部一平方厘米的区域施加机械刺激。使用20倍物镜观察三叉神经节中对刺激有反应的神经元。为了通过采集软件随时间收集荧光信号，点击“采集”菜单下的连续采集按钮，然后将帧数设置为300，采集时间设置为90秒。设置相机参数以帧率采集图像。获得持续三分钟的稳定基线记录。病毒滴度体积越大，导致幼鼠神经元感染程度增加。轻度机械模拟仅激活三叉神经节的V2区。大多数神经元的静息荧光相对较低，且自发性升高较少。自然刺激，特别是点状刺激，引发的神经元反应最为强烈。在慢性缩窄性损伤模型中，与对侧相比，损伤侧对刷毛刺激的峰值反应幅度增加了一倍。当连续施加两个刺激时，对第二个刺激的反应显著增强。

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体内 大鼠三叉神经节感觉神经元的钙成像

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小鼠膝状神经节神经元对味觉刺激反应的活体钙成像

本方案描述了背根神经节（DRG）的手术暴露过程，随后在对同侧后爪施加多种刺激的同时，利用Pirt-GCaMP3小鼠对神经元集合进行GCaMP3（基因编码的Ca2+指示剂；绿色荧光蛋白-钙调蛋白-M13蛋白3）Ca2+成像。...

体内完整背根神经节初级感觉神经元网络中神经元集群的钙成像

本方案概述了 体内 利用钙成像技术测量腰段6背根神经节（L6...

体内背根神经节神经元对躯体和内脏刺激反应的钙成像

本方案描述了 体内 完整三叉神经节（TG）神经元的GCaMP钙成像。该描述包括TG暴露手术， 体内 共聚焦显微镜成像三叉神经节神经元、在三叉神经节神经元显微成像期间施加体感刺激，以及分析 体内 GCaMP...

体内完整三叉神经节初级感觉神经元网络中神经元集群的钙成像

本文介绍了利用荧光电压敏感染料对蟹类口胃神经节神经元的详细活动进行快速、高分辨率成像的方法。...

使用电压敏感性染料对蟹类口胃神经节中神经元进行光学成像

我们展示了一种 体内 电穿孔转染方案，用于在多种出生后年龄段的小鼠中转染单个或少量成簇的视网膜神经节细胞（RGCs）及其他视网膜细胞类型。该方法实现了对出生后RGCs的标记与遗传操作 体内...

小鼠视网膜神经节细胞的转染 体内 电穿孔

我们介绍一种利用慢病毒技术对单个嗅觉感觉神经元轴突及其终末分支进行遗传操作和可视化的方法 体内.

慢病毒介导的嗅觉感觉神经元遗传操作与可视化 体内

凭借其微小透明的身体、详尽记录的神经解剖结构，以及一系列适用的遗传学技术和试剂， 秀丽隐杆线虫 是理想的模式生物 体内...

体内 神经元钙成像在 C. elegans 中的应用

本文描述了一种利用高分辨率谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）对小鼠视网膜进行活体成像的实验方案。重点针对视乳头周围区域的视网膜神经节细胞（RGC），介绍了多种扫描与定量分析方法。...

光学相干断层扫描：活体成像小鼠视网膜神经节细胞 In Vivo

学习利用基因编码钙指示剂对大鼠三叉神经节感觉神经元进行在体钙成像技术，用于表征神经损伤后的感觉编码变化并识别参与神经病理性疼痛的传入神经亚群。该方法有助于深入理解外周疼痛机制并探索潜在治疗靶点。

体内大鼠三叉神经节感觉神经元的钙成像

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