体内大鼠三叉神经节感觉神经元的钙成像
2024年2月9日
基因编码的钙离子指示剂（GECI）可实现对感觉神经元信号传导的稳健且群体水平的分析。本文中，我们开发了一种新方法，可实现 体内 大鼠三叉神经节神经元活动的GECI可视化
我们实验室的总体目标是研究疼痛的外周机制。而我的项目则具体探讨三叉神经损伤相关的疼痛。我今天展示的实验方法使我们能够表征感觉编码的变化，并鉴定参与神经病理性疼痛的传入神经亚群。
因此，我们已证明三叉神经传入纤维与躯体传入纤维在神经损伤后的反应存在差异。Nav 1.1 在三叉神经中特异性地上调，提示选择性阻断 Nav 1.1 的药物可用于识别参与神经病理性疼痛的不同传入纤维亚群。目前，转基因小鼠最广泛地与多种成像技术和基于组学的策略联合使用。
将小鼠实验产生的数据外推至其他物种（甚至人类）存在困难。小鼠体型非常小，难以进行训练，且小鼠、大鼠与人类之间存在越来越多已知的差异。因此，使用大鼠可能有助于解决其中多项挑战。
颅面部结构（即颈部以上结构）的疼痛机制及潜在治疗靶点，与身体其他体表和内脏结构（即颈部以下结构）存在差异。本实验结果表明，神经病理性疼痛可能不仅反映中枢神经系统的变化，实际上也可能反映周围神经系统的变化，而过去认为这种疼痛仅与中枢神经系统改变相关。
首先，使用25微升Hamilton注射器向麻醉后的大鼠幼崽腹腔内注射15微升agene。接着，剃除6至8周龄麻醉幼鼠的头部毛发和胡须，将大鼠固定在立体定位仪上并插入耳杆，并在下方放置加热垫以维持动物体温。然后，将浸有冰生理盐水的纱布覆盖在大鼠头部，以尽量减少出血。
使用15号手术刀，在颅骨上方的皮肤和肌肉正中线上做一切口。牵开皮肤和肌肉以暴露颅骨，用1×4圆形钻头小心地钻穿颅骨，暴露前脑。然后使用咬骨钳剪开颅骨。
使用15号手术刀在脑组织和嗅球上做切口。用解剖铲小心地将硬脑膜与颅骨分离。然后轻轻抬起切断的脑组织，以暴露三叉神经节和颅底。
使用电灼笔灼烧止血。为成像GCaMP6s，将颅腔置于显微镜物镜下方，然后调节至终末神经节清晰对焦。
接下来，对脸部一平方厘米的区域施加机械刺激。使用20倍物镜观察三叉神经节中对刺激有反应的神经元。为了通过采集软件随时间收集荧光信号，点击“采集”菜单下的连续采集按钮，然后将帧数设置为300，采集时间设置为90秒。
设置相机参数以帧率采集图像。获得持续三分钟的稳定基线记录。病毒滴度体积越大，导致幼鼠神经元感染程度增加。
轻度机械模拟仅激活三叉神经节的V2区。大多数神经元的静息荧光相对较低，且自发性升高较少。自然刺激，特别是点状刺激，引发的神经元反应最为强烈。
在慢性缩窄性损伤模型中，与对侧相比，损伤侧对刷毛刺激的峰值反应幅度增加了一倍。当连续施加两个刺激时，对第二个刺激的反应显著增强。
概述
本研究采用一种新颖的方法，对遗传编码的钙指示剂（GECI）进行活体可视化，以分析大鼠三叉神经节中感觉神经元的信号传导。该研究重点表征三叉神经损伤后神经病理性疼痛相关的感觉编码变化及传入神经元亚群的改变。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 疼痛生物学
- 神经病理性疼痛
背景
- 了解疼痛的外周机制对于开发更有效的治疗策略至关重要。
- 三叉神经损伤的研究揭示了三叉神经传入纤维与躯体传入纤维在反应上的差异。
- 以往关于神经病理性疼痛的假设主要集中于中枢神经系统的变化。
- 外周神经系统可能发挥的作用仍需进一步研究。
研究目的
- 表征三叉神经损伤大鼠模型中感觉神经元的反应。
- 鉴定参与神经病理性疼痛的特定传入神经亚群。
- 探索疼痛管理的潜在治疗靶点。
使用的方法
- 利用基因编码的钙离子指示剂（GECI）在大鼠三叉神经节中进行活体成像。
- 对大鼠进行麻醉，并实施特定手术操作以暴露三叉神经节。
- 施加机械刺激以评估成像过程中神经元的反应。
- 在设定的时间点对神经元活动进行荧光成像。
- 该研究强调了基于损伤类型和刺激类型的不同反应模式。
主要结果
- 神经损伤后，三叉神经与躯体传入神经反应存在显著差异。
- 三叉神经中 Nav 1.1 的上调表明其在神经病理性疼痛中的重要性。
- 特定刺激引发不同的神经元反应，凸显了外周机制在神经病理性疼痛中的潜在作用。
- 成像结果显示，根据刺激施加情况，神经元兴奋性及反应幅度发生显著变化。
结论
- 本研究展示了基因编码钙指示剂（GECI）在分析周围神经系统神经元活动和疼痛机制中的应用价值。
- 研究强调了神经病理性疼痛的复杂性，提示有必要进一步探究周围神经系统在其中的作用。
- 这些发现可能为理解和治疗人类神经病理性疼痛提供更优的策略依据。
常见问题
行业重要性概述
在活体大鼠三叉神经节神经元中进行群体水平的钙成像，可直接量化感觉神经元对特定刺激的反应活性，从而支持疼痛靶点发现过程中的机制性风险评估。该方法在神经病理性疼痛通路的靶点验证中提供了可预测的可信度，尤其适用于可能因物种差异而影响转化连续性的情形。通过实现对与颅面疼痛综合征相关的传入神经元亚群的功能表征，该技术增强了早期发现阶段的关键转折点。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够对神经性疼痛中涉及的感觉神经元亚群进行功能研究。
- 通过区分三叉神经与躯体传入神经对损伤的反应，支持生物学层面的风险评估。
- 有助于识别可用于选择性调控的离子通道靶点，例如 Nav 1.1。
- 在体内提供关于靶点结合及通路相关性的定量证据。
筛选与检测方法开发
- 建立了一种经过验证的体内系统，用于测量刺激诱发的神经元活动。
- 提供可重复的定量荧光读数，用于实验标准化。
- 可在可扩展的条件下评估靶向感觉神经元兴奋性的药理学干预措施。
- 支持在具有疾病相关性的背景下对候选调节剂进行高效筛选。
转化与临床前研究
- 将临床前模型与人类相关的颅面疼痛机制相匹配。
- 在小鼠与大鼠之间架起发现成果的桥梁，弥补物种特异性的转化差距。
- 通过体内功能验证，促进经风险评估调整的疼痛靶点的推进。
- 通过将神经元活动与损伤诱导的表型相关联，支持生物标志物的开发。
流程与工作流整合
这种体内成像工作流程整合了从早期发现到临床前验证的全过程，可支持疼痛研究项目中的假设验证、靶点风险评估以及转化一致性分析。
- Discovery Biology：通过量化刺激诱发的活性，阐明外周疼痛机制并验证候选靶点。
- Screening：为感觉神经元群体中的化合物评价提供标准化、可重复的检测结果。
- Analytics：生成定量荧光数据，支持在不同条件下对神经元反应进行统计学比较。
- Translational Research：通过在比小鼠更具转化相关性的物种中建立颅面疼痛模型，增强研究连续性。
- Enterprise Reuse：提供一个可重复使用的平台，用于对多种疼痛靶点和干预手段进行功能评估。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点验证的预测可信度，减少疼痛通路中的机制模糊性。
- 操作价值：标准化体内成像方案，实现不同研究团队间的可重复性和可扩展性。
- 战略价值：通过提供关于靶点结合和通路相关性的可靠功能数据，优化“推进/终止”决策。
- 项目组合影响：实现基于风险调整的疼痛靶点优先排序，并以与转化研究一致的数据支持推进决策。
实施注意事项
- 需要具备活体成像、三叉神经节外科暴露以及病毒载体递送方面的专业技术。
- 需要配备高灵敏度荧光显微镜和定量成像分析软件。
- 需要跨团队对刺激方案和数据分析流程进行标准化。
- 可能需要针对不同物种或疼痛模型进行调整，以确保具有转化应用价值。
- 潜在局限性包括技术复杂性，以及对群体水平数据进行严格统计分析的需求。
