Name: 果蝇菌株的原始生殖细胞冷冻保存和复兴 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T12:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: 了解果蝇原始生殖细胞冷冻保存与移植技术，实现果蝇品系的长期保存与复兴。该方法可避免频繁传代导致的遗传突变，为遗传工程研究提供可靠解决方案。

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感谢京都果蝇资源中心提供果蝇品系。同时感谢Wanda Miyata女士对本文稿进行的英文语言编辑，以及Edanz公司（https://jp.edanz.com/ac）的Jeremy Allen博士对本文初稿的编辑。本研究得到了日本医学研究开发署（AMED）向T.T.-S.-K.提供的资助（JP16km0210072、JP17km0210146、JP18km0210146），向S.K.提供的资助（JP16km0210073、JP17km0210147、JP18km0210145），以及向T.T.-S.-K.和S.K.共同提供的资助（JP20km0210172）；此外，还获得了日本学术振兴会（JSPS）向T.T.-S.-K.提供的科学研究费补助金（C类）（JP19K06780）和向S.K.提供的创新领域科学研究费补助金（JP18H05552）&#160;的支持。

1. 仪器设备准备
<ol>
	<li>显微操作系统的组装：组装显微操作系统以用于细胞的收集与移植（图1A）。</li>
	<li>原始生殖细胞（PGC）收集用载玻片（图2A）
	<ol>
		<li>制备正庚烷胶：剪取约30 cm长的双面胶带，将其浸泡于7 mL技术级（普通级）正庚烷溶液中过夜。</li>
		<li>在载玻片背面绘制两条平行参考线，用于胚胎排列对齐。</li>
		<li>使用巴斯德移液管将上述正庚烷胶液滴加至载玻片表面（无标记线的一侧），并让其自然风干至表面呈白色。</li>
		<li>重复滴加并铺展正庚烷胶液滴，再次干燥载玻片。 
		注意：该胶可防止液体在平面上扩散，有助于将水溶液更顺利地加载至针尖中。</li>
		<li>制作胚胎池框架：将三层厚度为0.2 mm的标准乙烯基胶带（如电工胶带）粘贴于切割板上，将其裁剪成1.5 cm宽的矩形，然后去除中间部分，仅保留2至3 mm宽的边框。 
		注意：胚胎池框架在胚胎排列对齐后粘附固定，用于形成容纳胚胎的液池。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>移植用微针 
	注意：在本研究进行时，所有市售微针的口径均过窄或过宽，不适用于原始生殖细胞（PGC）的冷冻保存。
	<ol>
		<li>使用玻璃毛细管和拉针仪制作微针。我们采用NARISHIGE&#160;PN-31拉针仪，加热器设定为85.0–98.4，主磁铁设定为57.8，副磁铁设定为45.0。</li>
		<li>为获得管壁厚度约1 µm、针尖长约200 µm、内径约10–12 µm的微针，需按以下三步抛光程序对针尖进行处理（图3）。首先，以30°角、780 rpm转速研磨针尖，直至其内径达到10–12 µm。此第一步研磨过程约需1小时。 
		注意：为避免针尖断裂，应先启动磨石旋转，再将针尖轻柔下移接触磨石表面。</li>
		<li>在针体顶部画一条线以标记所需角度。将针体逆时针旋转90°，再以180 rpm转速进行抛光，持续约5分钟。</li>
		<li>将针体顺时针旋转45°，以180 rpm转速抛光1秒。</li>
		<li>将含有铬酸混合液液滴（警告：有毒）的收集载玻片置于显微镜载物台上。将微针以相对于载玻片表面10°–13°的角度固定于毛细管夹持器中（图1D），小心下移针体，使针尖浸入铬酸混合液中。</li>
		<li>通过反复推拉活塞（图1B），多次机械性地向针内加载并排出溶液，以清除针道内的玻璃碎屑。务必同时清洁针体外壁。</li>
		<li>用蒸馏水彻底冲洗针体内外壁两次&#160;，以完全去除残留的铬酸。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 原始生殖细胞的收集与冷冻保存
<ol>
	<li>收集胚胎
	<ol>
		<li>将适量的供体品系果蝇（每种性别约450只）转移至含有胚胎收集板的胚胎收集杯中图1E）并在25 °C下孵育。我们通常使用在室温（23–25 °C）下低密度培养的3至5日龄亲代果蝇。</li>
		<li>进行两次30分钟的预收集，并丢弃所产的任何卵。由于雌性能保留已在输卵管内发育的受精卵，因此该步骤对于在2.1.3步骤中同步产卵是必需的。图4).</li>
		<li>两次预收集后，收集胚胎50分钟，然后将收集的胚胎置于25 °C的湿润培养箱中孵育，使其发育至囊胚期（早期5期）17）。孵育时间通常为100分钟，但可根据菌株延长至120分钟（图4). 
		注意：湿润盒可通过在塑料盒底部放置一张湿润的纸巾，并在使用前喷洒水雾制成。在5期早期胚胎中，原始生殖细胞（PGC）的形成已完成，但体细胞的细胞化尚未完成。胚胎的具体发育阶段将在步骤2.4中通过复式显微镜下观察确定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脱卵膜胚胎
	<ol>
		<li>在不锈钢网筛（150目，109 µm孔径，60 µm丝径）上滴加一滴蒸馏水； 图1F). 用镊子从胚胎收集板上收集胚胎，并将其放入水滴中。</li>
		<li>从下方将滤纸按压在筛网上以吸收水分。向胚胎中加入新鲜的5%（以Cl计）次氯酸钠溶液滴液，并持续轻敲筛网10秒。</li>
		<li>用蒸馏水直接冲洗胚胎，并从滤网下方按压纸巾以吸去水分。重复此步骤3次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对去壳胚胎进行排列
	<ol>
		<li>在体视显微镜下，使用镊子转移胚胎。将去壳胚胎沿载玻片上的两条参考线排列成两排，置于PGC收集玻片上。图 2A胚胎的前部朝右（待操作的一侧），腹面朝上。 
		注意：此步骤应在20分钟内完成，期间通常可排列约40个胚胎。</li>
		<li>在 PGC-收集玻片上的胚胎周围固定一个胚胎池框架。滴加 1 µL 冷冻保护剂溶液（1x Ephrussi-Beadle Ringer 溶液，EBR，含 20% 乙二醇和 1 M 蔗糖；1x EBR：130 mM NaCl，5 mM KCl，2 mM CaCl₂，4 mM NaHCO₃，pH 6.4），覆盖胚胎。2，以及pH 6.9的10 mM Hepes）滴加到框内区域的两个不同位置，并用硅油充满该区域，以防止胚胎干燥（图2A). 
		注意：配制 CPA 溶液时，将 10.26 g 蔗糖完全溶解于约 20 mL 蒸馏 H2O 含有 3 mL 10 x EBR 溶液。加入 6 mL 乙二醇，然后加入蒸馏 H2最多加水至 30 mL。充分混匀后，通过 0.22 mm 一次性滤膜过滤溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收集原始生殖细胞
	<ol>
		<li>将2.3.2步骤中的PGC收集玻片置于配有显微操作系统的显微镜载物台上。将针头固定至毛细管夹持器，调节使左侧第一枚胚胎与针尖处于同一焦平面。向针头内注入硅油2-3秒。</li>
		<li>从左侧一排的胚胎开始收集原始生殖细胞（PGC）。使用20倍物镜，轻轻将针尖移至胚胎前端表面，并通过移动显微镜载物台（而非移动针）使针尖从前端向后端穿透胚胎。</li>
		<li>当针尖到达后端时，稍微回撤针头，并将针内所有卵黄完全排出至体细胞层内侧。</li>
		<li>在保持针头压力恒定的同时，将针尖移至位于后极内部的原始生殖细胞（PGCs）处，并轻柔但迅速地加载PGCs。</li>
		<li>迅速将针头从胚胎中抽出，并将卵黄及其他污染物排入硅油池中，同时保留原始生殖细胞（PGCs）在针头内。随后，从硅油池中吸入洁净的硅油。</li>
		<li>重复步骤 2.4.2 至 2.4.5，处理左侧一行中的其余胚胎。在从下一个新胚胎收集 PGC 之前，应尽可能将步骤 2.4.5 中吸入的硅油释放至体细胞层内，同时确保已吸入的 PGC 保留在针尖中。此操作可保证新收集的 PGC 与先前收集的 PGC 相邻，且二者之间无任何介质隔开。</li>
		<li>完成左侧一列胚胎的 PGC 收集后，尽可能将 PGC 与卵黄及其他污染物分离。为此，将针头中的所有 PGC 沉积到某个胚胎表面，并将卵黄或其他污染物移至相邻的另一个胚胎上。</li>
		<li>接下来，从右侧一排的胚胎中收集原始生殖细胞（PGCs）。将从左侧和右侧两排收集的PGCs合并。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向原始生殖细胞（PGCs）添加冷冻保护剂（CPA）
	<ol>
		<li>用 CPA 洗涤针头一次后，加入新鲜的 CPA&#160;再向针头中加入一滴，将CPA添加到沉积在胚胎上的PGCs上。CPA的体积应与PGCs的体积相等。</li>
		<li>在添加CPA后1-2秒内，尽可能去除PGC簇中的CPA。添加CPA后，PGC会立即轻微收缩并变为方形。</li>
		<li>排空针头，然后吸入硅油，持续5秒或更长时间。将所有收集的原始生殖细胞（PGCs）吸入，再次吸入硅油，持续5秒或更长时间。此时，PGCs已被夹在两层硅油之间。图2B). 
		注意：必须尽可能去除卵黄、CPA 及其他污染物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>冻存原始生殖细胞
	<ol>
		<li>打开三通旋塞阀（图1C）然后将针头从显微操作仪上取下。用柔软的纸巾轻轻吸去针头表面的油，切勿用纸巾直接触碰针尖。</li>
		<li>将针头连接到持针器上，并使用乙烯基胶带在基部固定锁紧图1H将标签贴在支架管上。</li>
		<li>将夹持有针头朝下的载网支架浸入液氮中，快速冷冻。在液体停止从支架中冒泡前，不要松开支架。</li>
		<li>将支架存放在液氮储存罐的液相区域，而非气相区域。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 原始生殖细胞的解冻与移植
<ol>
	<li>收集、去壳并排列无生殖细胞宿主果蝇的胚胎
	<ol>
		<li>按照步骤2的方法，收集并去除无生殖细胞宿主果蝇的胚胎外壳。</li>
		<li>将发育至5期的无生殖细胞宿主胚胎排列在移植用玻璃载片上。但此次需将胚胎后端朝右（即将进行操作的一侧），腹面朝上（图5）。在20分钟内将约30个胚胎排成两行。</li>
		<li>在排列胚胎过程中，若室内湿度较低，可开启加湿器运行2–10分钟（表1）。理想湿度范围为30%至40%，但具体数值可能因温度条件而异。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>解冻并移植原始生殖细胞（PGCs）至宿主胚胎
	<ol>
		<li>为快速解冻冷冻保存的PGCs，将装有针头的 holder 插入室温的1×EBR溶液中，针头朝下，并保持浸没状态10秒。</li>
		<li>将移植用玻璃载片置于显微镜载物台上。将经冻融处理的针头安装至毛细管 holder 上，并调节使左侧第一行的第一个胚胎与针尖处于同一焦平面。</li>
		<li>使用20倍物镜，轻柔地将针尖移至胚胎后端表面。</li>
		<li>轻触每个胚胎外壁，确认其能缓慢恢复原状。此操作可验证胚胎内部&#160;压力是否适中，既不过高也不过低。&#160;</li>
		<li>轻柔移动针头，从胚胎后极刺入。</li>
		<li>在后极内侧、卵黄膜与胚胎体细胞层之间精确注入约10–20个PGCs。避免将细胞注入体细胞层内。若发现卵周隙液体外泄，应立即将泄漏液体吸入针内并移除。</li>
		<li>将针头从胚胎中撤出。对后续胚胎重复步骤3.2.5和3.2.6。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 胚胎孵育与供体品系的恢复
<ol>
	<li>移除未接收到移植原始生殖细胞（PGCs）的胚胎，并将剩余胚胎置于25 °C的湿润培养箱中孵育（图1G）。</li>
	<li>移植后24小时或更长时间，并在孵化后尽快使用镊子拾取孵化的幼虫，转移至标准的Drosophila培养基小瓶中，并在25 °C下继续孵育。</li>
	<li>为恢复品系，将新羽化的雌蝇与雄蝇进行杂交（图6）。 
	&#8203;注意：无生殖细胞的宿主可实现整个基因组的一次性恢复，无需与平衡染色体品系杂交。在培养小瓶中即使存在无生殖细胞的雄蝇也不会产生影响，因为雌蝇即使与之交配，也不会表现出长期的交配后反应，包括对再次交配的接受度降低18,19。</li>
</ol>

Cryopreservation of PGCs for Long-Term Preservation of Drosophila Strains

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<li>Steinmann-Zwicky, M., Schmid, H., Nöthiger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+and+inductive+signals+can+determine+the+sex+of+the+germ+line+of+Drosophila+by+regulating+the+gene+Sxl%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous and inductive signals can determine the sex of the germ line of Drosophila by regulating the gene Sxl.</a> Cell. 57 (1), 157-166 (1989).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

PGC 冷冻保存与复苏成功的关键因素之一是使用优质的胚胎。应选用年轻的雌性个体（例如 3 至 5 日龄）进行胚胎采集。供体和受体胚胎均需通过显微镜检查，仅选用处于胚盘期（5 期）的胚胎12。在采集 PGC 时，我们通常在 20 分钟内排列约 40 个供体胚胎，并从约 30 个处于早期 5 期的胚胎中收集 PGC；不使用年龄较大或有缺陷的胚胎。冷冻保存并解冻后，PGC 应保持其形态；若保存失败，PGC 会发生破裂。受体胚胎也应处于 5 期，并具有适中的内部&#160;压力；经轻微触碰后应能缓慢恢复至原有形状。过于干燥或干燥不足的胚胎在移植后无法正常发育。由于 PGC 的异性别移植在 Drosophila 中无法产生配子5,10，将多个供体胚胎的 PGC 移植到一个受体胚胎中更有可能获得可育成虫。为此，我们通常每根针采集约 30 个胚胎的 PGC。
作为冷冻保护剂，我们尝试了乙二醇、二甲基亚砜和甘油，并与不同浓度的蔗糖联合使用。我们确定含有20%乙二醇和1 M蔗糖的EBR效果最佳13；然而，使用不同的冷冻保护剂可能会改善原始生殖细胞（PGC）的保存效果22。
该种原始生殖细胞（PGC）冷冻保存方法需要具备处理PGC的专业技能，通常需要约6周的培训才能熟练掌握PGC的采集与移植。为评估和提升操作技能，可将培训分为六个步骤：1）在玻璃载片上排列胚胎；2）操控显微操作仪；3）在不进行冷冻保存的情况下，将PGC从一个胚胎移植至另一胚胎；4）将10个或更多胚胎中的PGC移植至5至10个胚胎中；5）在应用冷冻保护剂（CPA）后进行PGC移植；6）在冻融后进行PGC移植。每个步骤大约需要1周时间。第3步的短期目标包括孵化率达到40%，胚胎至成虫的存活率为10%–20%，以及可育果蝇出现频率达到20%。
原始生殖细胞（PGC）的冷冻保存需要昂贵的仪器设备和高度熟练的技术人员，因此该方法可能难以被许多实验室采用。然而，现有的PGC保存方法具有几个重要优势。首先，PGC的体积远小于胚胎，且对冷冻保护剂具有很高的通透性。相比之下，果蝇（Drosophila）胚胎的蜡质层严重限制了冷冻保护剂的渗透，这是胚胎冷冻保存中最严重的问题。事实上，以往的研究已投入大量努力，试图寻找一个胚胎存活率较高且蜡质层较薄的时间窗口。其次涉及不同品系之间的发育和形态差异。PGC通常取自早期第5阶段的胚胎（产卵后2小时30分钟至3小时20分钟），而胚胎冷冻保存则通常在第16阶段的胚胎（产卵后14至22小时）进行。因此，用于胚胎冷冻的胚胎年龄更大，在不同品系间冷冻保存的最佳时间窗口差异也更为显著，相比之下PGC冷冻保存的时间窗口更为稳定。事实上，Asaoka等人研究的五个品系之间，产生供体来源后代的宿主频率并无显著差异13，尽管这些宿主并非无生殖细胞。此外，PGC还具有应用于基因工程的潜力，例如基因组编辑14,15,16。

Drosophila 品系通过将成虫转移至新的培养管中进行维持，不可避免地会随着时间推移积累突变和表观遗传改变。因此，亟需建立一种可避免此类变化的 Drosophila 品系长期保藏替代方法，特别是对于需要完整保留全基因组的参考品系而言尤为重要。已有若干成功冷冻保存 Drosophila 胚胎或卵巢的尝试被报道1,2,3。然而，由于可重复性较低，这些方法目前仍缺乏实际应用价值。事实上，早期胚胎因富含卵黄，阻碍了冷冻保护剂（CPA）的渗透与扩散，导致冻存后存活率较低2,3。而晚期胚胎的蜡质层也严重限制了 CPA 的通透性。寻找特定品系中胚胎存活率高且蜡质层较薄的时间窗口既困难又耗时。最近，Zhan 等人4改进了胚胎通透化、CPA 加载及玻璃化冻存的方法，并成功实现了多个品系胚胎的冷冻保存。然而，由于通透化处理后的胚胎活力通常较差，该方法仍难以广泛应用。因此，仍需进一步优化并开发替代性策略。采用原始生殖细胞（PGCs）冻存的方法，是实现 Drosophila 品系长期保藏的一种可行替代途径。
PGC（也称为极细胞）移植已被用于产生生殖系嵌合体，尤其是雌性个体，以研究合子致死突变的母体效应以及生殖细胞的性别决定等过程5,6,7,8,9,10,11,12原始生殖细胞（PGCs）比胚胎小得多，且对大多数冷冻保护剂具有较高的通透性。此外，不同品系间的发育和形态差异影响较小，且无生殖细胞的宿主可实现全基因组的快速重建。我们近期开发了一种新的PGCs冷冻保存方法13，这可以防止原本不可避免的遗传和表观遗传改变 果蝇 菌株。本文中，我们提供了详细的实验方案。
该冷冻保存方法需要掌握特定的原始生殖细胞（PGC）操作技术和仪器使用技能。尽管分步操作法对于不熟悉该技术的研究者而言可能是一种高效的解决方案，但由于对仪器设备的要求较高，该方法可能不适用于小型实验室。与胚胎冷冻保存方案相比，该PGC冷冻保存方案更容易适用于不同的果蝇（Drosophila）物种及其他昆虫物种，原因在于PGC在发育和形态上的差异较小。此外，PGC还可能用于基因工程应用，例如基因组编辑14,15,16。总之，该方法可用于保种中心及其他实验室，以长期维持果蝇及其他昆虫品系，且不会发生遗传变异。

<table><tbody><tr><td>乙酸</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>017-00256</td><td>用于胚胎收集</td></tr><tr><td>琼脂粉</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>010-08725</td><td>用于胚胎收集</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>038-24985</td><td>用于EBR溶液</td></tr><tr><td>毛细管</td><td>Sutter Instrument</td><td>B100-75-10-PT</td><td>硼硅酸盐玻璃；外径：1.0 mm，内径：0.75 mm，长度：10 cm，225支/包</td></tr><tr><td>毛细管夹持器</td><td>Eppendorf</td><td>5196 081.005</td><td>毛细管夹持器4型；用于显微操作</td></tr><tr><td>铬酸混合液</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>037-05415</td><td>用于针头清洗</td></tr><tr><td>冷冻保护剂溶液（CPA溶液）</td><td></td><td></td><td>含20%乙二醇和1 M蔗糖的1×EBR溶液</td></tr><tr><td>双面胶带</td><td>3M</td><td>Scotch w-12</td><td>用于胶水提取</td></tr><tr><td>Ephrussi&amp;ndash;Beadle Ringer溶液（EBR）</td><td></td><td></td><td>130 mM NaCl，5 mM KCl，2 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，以及10 mM Hepes，pH 6.9</td></tr><tr><td>乙醇（99.5）</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>057-00451</td><td>用于胚胎收集</td></tr><tr><td>乙二醇</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>054-00983</td><td>用于CPA溶液</td></tr><tr><td>Falcon 50 mm × 9 mm 细菌培养用培养皿</td><td>Corning Inc.</td><td>351006</td><td>用于胚胎收集</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Vigor</td><td>Type5 Titan</td><td>用于胚胎操作</td></tr><tr><td>葡萄汁</td><td>Asahi Soft Drinks Co., LTD.</td><td>Welch's Grape 100</td><td>用于胚胎收集</td></tr><tr><td>葡萄汁琼脂平板</td><td></td><td></td><td>50%葡萄汁，2%琼脂，1%乙醇，1%乙酸</td></tr><tr><td>正庚烷</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>084-08105</td><td>用于胶水提取</td></tr><tr><td>加湿器</td><td>APIX INTERNATIONAL CO., LTD.</td><td>FSWD2201-WH</td><td>用于胚胎制备</td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Leica Microsystems GmbH</td><td>Leica&amp;nbsp;DM IL LED</td><td>用于显微操作</td></tr><tr><td>鲁尔锁紧式玻璃注射器</td><td>Tokyo Garasu Kikai Co., Ltd.</td><td>0550 14 71 08</td><td>活塞涂覆硅油（FL-100-450CS）；用于显微操作</td></tr><tr><td>机械式显微操作仪</td><td>Leica Microsystems GmbH</td><td></td><td>用于显微操作</td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Matsunami Glass Ind., Ltd.</td><td>S-2441</td><td>用于胚胎排列</td></tr><tr><td>微电极研磨仪</td><td>NARISHIGE Group</td><td>定制订单</td><td>EG-401-S组合EG-401和MF2（配备目镜MF2-LE15）；用于针头制备</td></tr><tr><td>显微镜相机</td><td>Leica Microsystems GmbH</td><td>Leica MC170 HD</td><td>用于显微操作</td></tr><tr><td>针头夹持器</td><td>Merck KGaA</td><td>Eppendorf TransferTip (ES)</td><td>用于冷冻保存</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>28514-75</td><td>用于EBR溶液</td></tr><tr><td>拉针仪</td><td>NARISHIGE Group</td><td>PN-31</td><td>用于针头制备；加热器设定值为85.0–98.4，主磁铁设定值为57.8，副磁铁设定值为45.0</td></tr><tr><td>聚氯乙烯电工绝缘胶带</td><td>Nitto Denko Corporation</td><td>&amp;nbsp;J2515</td><td>用于胚胎池框架</td></tr><tr><td>硅油</td><td>Shin-Etsu Chemical, Co, Ltd.</td><td>FL-100-450CS</td><td>用于胚胎操作</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>31320-05</td><td>用于EBR溶液</td></tr><tr><td>次氯酸钠溶液</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>197-02206</td><td>未稀释且新鲜配制；用于胚胎破膜</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>30404-45</td><td>用于CPA溶液</td></tr></tbody></table>

原始生殖细胞冷冻保存与drosophila品系的复苏

Primordial Germ Cell Cryopreservation and Revival of Drosophila Strains

果蝇 菌株必须通过频繁地将成年果蝇转移至新试管中进行维持，这一过程存在突变退化和表型改变的风险。因此，建立一种可避免此类变化的长期保存替代方法势在必行。尽管此前已有成功尝试，果蝇的低温冷冻保存仍面临挑战。 黑腹果蝇 胚胎的冷冻保存仍因可重复性较低而缺乏实际应用价值。本文介绍了一种原始生殖细胞（PGC）的冷冻保存方案，以及通过将冻存的PGC移植至无生殖细胞的受体中实现品系复苏的技术流程。 黑腹果蝇 (D. melanogaster）宿主胚胎。原始生殖细胞（PGCs）对冷冻保护剂（CPAs）具有高度通透性，且不同品系间的发育和形态差异相较于胚胎冷冻保存而言问题较小。该方法中，从约30个供体胚胎收集PGCs，经CPA处理后装入针管，随后在液氮中冷冻保存。为获得供体来源的配子，将针管中冷冻保存的PGCs解冻后注入约15个&#160;无生殖细胞的受体胚胎。采用本方案获得的可育果蝇频率至少为15%，每对可育果蝇产生的后代数量始终足以重建原始品系（平均后代数为77.2 ± 7.1），表明冻存的原始生殖细胞（PGCs）具有发育为生殖系干细胞的能力。平均每根移植针可获得1.1 ± 0.2只可育果蝇，26根针中有9根产生了两只或更多可育后代。研究发现，使用11根移植针即可获得6只或更多可育后代，其中很可能包含至少一只雌性和一只雄性。利用无生殖细胞的受体，只需将新羽化的雌雄果蝇进行交配，便可快速重建目标品系。此外，原始生殖细胞还具有应用于基因工程（如基因组编辑）的潜力。

Asaoka 等人13报道了冷冻保存的原始生殖细胞（PGC）移植效率，表2列出了在液氮中冷冻保存1天或更长时间后PGC移植的结果。孵化率为168/208个移植胚胎（80.8%），胚胎至成虫的存活率为87/208（41.8%）。可育果蝇的比例为28/87（32.2%）。在冷冻保存8至30天与31至150天的PGC之间，可育后代频率无显著差异（20/57 vs. 8/30，G' = 0.63，p > 0.1，自由度 = 1）。每对果蝇平均产生后代数为77.2 ± 7.1（n = 18，范围28–122），表明冷冻保存的PGC具有发育为生殖系干细胞的能力。在26根移植针中，10根未产生可育后代，7根产生1只可育后代，7根产生2只可育后代，2根产生3或4只可育后代。每根针平均产生的可育果蝇数量为1.1 ± 0.2。根据该数据，在95%置信水平下，使用11根针足以获得6只或更多后代，其中很可能至少包含一只雌性和一只雄性。
在上述实验中，我们使用在原始生殖细胞（PGCs）中表达ovo-A mRNA 的胚胎（nanos&gt;ovo-A，即 OvoA_OE 胚胎）作为无生殖细胞的宿主。由移植后的nanos&gt;ovo-A配对所获得的 669 只 F1 雌性和 720 只 F1 雄性中，未发现源自宿主原始生殖细胞的逃逸个体。若干oskar（osk）突变体也具有温度敏感性的无生殖细胞表型20,21。由于具有高纯合存活率且呈现无生殖细胞表型的osk突变体目前已无法获得，我们通过 CRISPR/Cas9 辅助的基因组编辑技术重新构建了osk[8]错义突变体20。这些果蝇在 25 °C 下完全表现为无生殖细胞（230 只雌性和 192 只雄性中均无逃逸个体），但在 23 °C 时出现少量逃逸个体（248 只雌性中有 1 只，290 只雄性中有 1 只）。因此，推荐使用nanos&gt;ovo-A作为无生殖细胞宿主胚胎。UASp-ovo-A和nanos-Gal4品系13将很快由京都果蝇品系中心（KYOTO Drosophila Stock Center）提供。
<img alt="电生理学和细胞记录实验装置；包括显微镜、流体系统和膜片钳设备。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65985/65985fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：所需设备。（A）用于细胞采集与移植的显微操作仪系统。i）倒置显微镜，ii）机械式显微操作器，iii）注射器，iv）毛细管固定器，v）三通旋塞阀，vi）加湿器，以及vii）体视显微镜。（B）注射器。（C）三通旋塞阀和硅胶管连接注射器与毛细管固定器。（D）针头和毛细管固定器安装在显微操作器上。（E）带有胚胎收集板的胚胎收集杯（直径6 cm，高7.7 cm）。（F）不锈钢网筛。（G）用作保湿室的容器，内含载玻片。为保持湿度，将湿润的滤纸置于底部并盖上盖子。（H）用于冷冻保存的持针器及配套针头。（I）冷冻保存用储存架及装有针头的盒子。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65985/65985fig01largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="原始生殖细胞分离装置；含硅油、胚胎固定框、庚烷胶细节的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65985/65985fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：原始生殖细胞收集载玻片与冷冻保存针。（A）涂有胶液的原始生殖细胞（PGC）收集载玻片。去壳胚胎排列成两行，头端朝右（操作侧），腹面朝上。安装胚胎池框架后，加入两滴冷冻保护剂（CPA）溶液，并用硅油填充整个池体。（B）针头应尽可能减少卵黄及其他污染物的携带量。在液氮中进行冷冻保存时，PGC被夹在两层硅油之间。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65985/65985fig02largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="磨石技术示意图：三步法科学针尖 sharpening 工艺，包含详细的研磨角度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65985/65985fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图 3：制备针头。 三步法尖端抛光工艺，用于制备具有合适孔径和锋利尖端的针头。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65985/65985fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="胚胎收集时间线，包括原始生殖细胞收集、孵育、冷冻；流程图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65985/65985fig04v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：胚胎收集方案。 经过两次预收集后，我们通常每天收集三到四次。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65985/65985fig04largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="静态平衡；显示生物系统前后方向的示意图；标注的坐标轴。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65985/65985fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：宿主胚胎的排列。 宿主胚胎在玻璃载片上的排列方式。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65985/65985fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="果蝇生殖系传递示意图，显示了生殖细胞的冷冻保存、原始生殖细胞移植以及F1代子代发育过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65985/65985fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 6"> 
图6：原始生殖细胞（PGC）冷冻保存方法的概述。 本图展示了实施原始生殖细胞（PGC）冷冻保存所涉及的全部步骤。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65985/65985fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">室内湿度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>&lt; 30%</td>
			<td>~ 30%</td>
			<td>&gt; 30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>摆放宿主胚胎 
			（约20分钟）</td>
			<td>使用加湿器处理2–10分钟</td>
			<td>间歇使用加湿器，每次1分钟</td>
			<td>不要使用加湿器</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>解冻供体原始生殖细胞（PGC）</td>
			<td>不适用</td>
			<td>不适用</td>
			<td>不适用</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>空气干燥PGC</td>
			<td>省略此步骤</td>
			<td>省略此步骤</td>
			<td>5分钟</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>添加硅油</td>
			<td>不适用</td>
			<td>不适用</td>
			<td>不适用</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>移植PGC</td>
			<td>不适用</td>
			<td>不适用</td>
			<td>不适用</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">所有这些步骤应在50分钟内完成。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：胚胎在胚胎排列和原始生殖细胞解冻过程中的干燥处理。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>供体品系</td>
			<td>冷冻保存时间</td>
			<td>移植胚胎数 (A)</td>
			<td>孵化幼虫数 (B) 
			(孵化率, B/A)</td>
			<td>羽化成虫数 (C) 
			(卵至成虫存活率, C/A)</td>
			<td>可育成虫数 (D) 
			(可育果蝇频率, D/C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M17</td>
			<td>8 - 30 天</td>
			<td>134</td>
			<td>108 
			(80.6%)</td>
			<td>57 
			(42.5%)</td>
			<td>20 
			(35.1%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M17</td>
			<td>31 - 150 天</td>
			<td>74</td>
			<td>60 
			(81.1%)</td>
			<td>30 
			(40.5%)</td>
			<td>8 
			(26.7%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="6">M17: yw; TM6B, P{Dfd-GMR-nvYFP}4, Sb[1] Tb[1] ca[1]/ Pri[1]</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：冷冻保存的原始生殖细胞移植效率。 本表格改编自13。所有数据均来自无生殖细胞的宿主。

一种长期保存方法 果蝇 使用菌株作为频繁将成年果蝇转移至新鲜食物小瓶的替代方法非常理想。本方案描述了果蝇的冷冻保存方法 果蝇 原始生殖细胞及其通过移植至无生殖细胞宿主胚胎实现品系复苏

原始生殖细胞冷冻保存与Drosophila品系的复苏

果蝇品系必须通过频繁地将成虫转移至新试管来维持。这存在突变退化的风险，并且……

果蝇品系必须通过频繁地将成虫转移至新试管来维持，这可能导致突变退化和遗传变异。我们旨在建立一种长期保存果蝇品系的替代方法，以避免此类遗传变化。与体内编辑相比，原始生殖细胞（PGCs）的基因组编辑可能提高基因敲入效率，并实现更复杂的基因组改造。因此，PGC操作的广泛应用将促进多个领域的遗传工程研究。目前，我们重点关注异种移植。利用黑腹果蝇作为替代宿主，我们已成功复苏了黑腹果蝇种组中多个细胞品系。通过解决异种移植中的障碍并探索可能的解决方案，我们希望进一步研究原始生殖细胞（PGC）移植与冷冻保存的潜在应用价值。在组装好显微操作系统后，开始从果蝇胚胎中收集原始生殖细胞（PGCs）。在体视显微镜下操作时，使用镊子转移胚胎。将去壳的胚胎沿载玻片上的两条参考线排列成两排，放置于PGC收集玻片上。调整胚胎方向，使其头部朝右，腹面朝上。轻轻将移植针尖移至胚胎的前端。通过移动显微镜载物台使针尖穿透胚胎，当针尖到达胚胎后端时，略微回撤针头。将针内任何卵黄释放至体细胞层内。将针尖移至胚胎后极，轻柔地将原始生殖细胞（PGCs）吸入针内，操作过程应迅速。快速将针从胚胎中抽出。排出针内的卵黄及其他污染物，同时保留原始生殖细胞（PGCs）。将洁净的硅油从储液池吸入针头中。在从一个新的胚胎收集原始生殖细胞（PGCs）之前，尽可能将硅油注入体细胞层内，同时保持针头中已加载的PGCs不被排出。在按顺序完成一排所有胚胎的PGCs收集后，将收集到的PGCs接种至另一个胚胎表面，并将针头中残留的卵黄或其他污染物卸载到邻近的其他胚胎上。以类似方式，收集并合并第二排胚胎中的原始生殖细胞（PGCs）。随后进行原始生殖细胞（PGCs）的冷冻保存。在从供体胚胎收集并将其PGCs沉积于另一胚胎表面后，继续后续操作。用冷冻保护剂（CPA）清洗移植针，并将新鲜的CPA装入针中。将装有CPA的针头加入已沉积在胚胎上的原始生殖细胞（PGCs）中，同时确保CPA的体积与PGCs的体积相等。在添加CPA后1至2秒内，去除PGCs团块中多余的CPA。接下来，排空针管，并吸入硅油，持续五秒或更长时间。将所有收集的原始生殖细胞（PGCs）吸入针管，随后再次吸入硅油，持续五秒或更长时间。确保PGCs被夹在两层硅油之间。将针头从显微操作器上取下。使用柔软的纸巾轻轻吸去针头表面的油，注意不要让纸巾接触到针尖。将针头安装到针头夹持器上，并使用乙烯基胶带将其在基座位置固定牢固。将带有针头的载具针尖朝下浸入液氮中进行速冻。在液体停止从架子中冒泡之前，请勿松开载具。将载具存放在液氮储存罐的液相区域中。首先，将五龄无生殖细胞的黑腹果蝇宿主胚胎排列在移植用的玻璃载片上。将胚胎的后端朝右、腹面朝上，在20分钟内将约30个胚胎排列成两行。通过将装有针头的持针器针尖朝下浸入室温的EBR溶液中，使针头内冷冻保存的原始生殖细胞（PGCs）解冻。保持浸没10秒。将移植玻片放置在显微镜载物台上。将冻融后的针头连接到毛细管固定器上，并将第一个胚胎移至左侧一排，针尖移至同一焦平面。使用 20X 物镜，将针尖轻柔地置于胚胎后端表面。轻轻触碰每个胚胎的外部，确认其缓慢恢复至原始形状。用针从胚胎的后极刺入胚胎。轻轻地将大约10至20个原始生殖细胞（PGCs）注入胚胎后极，在卵黄膜与体细胞层之间，随后将针头从胚胎中退出，再对后续胚胎重复相同操作。最后，通过交配新羽化的雌性和雄性个体来恢复品系。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

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