原始生殖细胞冷冻保存与Drosophila品系的复苏

果蝇品系必须通过频繁地将成虫转移至新试管来维持，这可能导致突变退化和遗传变异。我们旨在建立一种长期保存果蝇品系的替代方法，以避免此类遗传变化。

与体内编辑相比，原始生殖细胞（PGCs）的基因组编辑可能提高基因敲入效率，并实现更复杂的基因组改造。因此，PGC操作的广泛应用将促进多个领域的遗传工程研究。目前，我们重点关注异种移植。

利用黑腹果蝇作为替代宿主，我们已成功复苏了黑腹果蝇种组中多个细胞品系。通过解决异种移植中的障碍并探索可能的解决方案，我们希望进一步研究原始生殖细胞（PGC）移植与冷冻保存的潜在应用价值。在组装好显微操作系统后，开始从果蝇胚胎中收集原始生殖细胞（PGCs）。

在体视显微镜下操作时，使用镊子转移胚胎。将去壳的胚胎沿载玻片上的两条参考线排列成两排，放置于PGC收集玻片上。调整胚胎方向，使其头部朝右，腹面朝上。

轻轻将移植针尖移至胚胎的前端。通过移动显微镜载物台使针尖穿透胚胎，当针尖到达胚胎后端时，略微回撤针头。将针内任何卵黄释放至体细胞层内。

将针尖移至胚胎后极，轻柔地将原始生殖细胞（PGCs）吸入针内，操作过程应迅速。快速将针从胚胎中抽出。排出针内的卵黄及其他污染物，同时保留原始生殖细胞（PGCs）。

将洁净的硅油从储液池吸入针头中。在从一个新的胚胎收集原始生殖细胞（PGCs）之前，尽可能将硅油注入体细胞层内，同时保持针头中已加载的PGCs不被排出。在按顺序完成一排所有胚胎的PGCs收集后，将收集到的PGCs接种至另一个胚胎表面，并将针头中残留的卵黄或其他污染物卸载到邻近的其他胚胎上。

以类似方式，收集并合并第二排胚胎中的原始生殖细胞（PGCs）。随后进行原始生殖细胞（PGCs）的冷冻保存。在从供体胚胎收集并将其PGCs沉积于另一胚胎表面后，继续后续操作。

用冷冻保护剂（CPA）清洗移植针，并将新鲜的CPA装入针中。将装有CPA的针头加入已沉积在胚胎上的原始生殖细胞（PGCs）中，同时确保CPA的体积与PGCs的体积相等。在添加CPA后1至2秒内，去除PGCs团块中多余的CPA。

接下来，排空针管，并吸入硅油，持续五秒或更长时间。将所有收集的原始生殖细胞（PGCs）吸入针管，随后再次吸入硅油，持续五秒或更长时间。确保PGCs被夹在两层硅油之间。

将针头从显微操作器上取下。使用柔软的纸巾轻轻吸去针头表面的油，注意不要让纸巾接触到针尖。将针头安装到针头夹持器上，并使用乙烯基胶带将其在基座位置固定牢固。

将带有针头的载具针尖朝下浸入液氮中进行速冻。在液体停止从架子中冒泡之前，请勿松开载具。将载具存放在液氮储存罐的液相区域中。

首先，将五龄无生殖细胞的黑腹果蝇宿主胚胎排列在移植用的玻璃载片上。将胚胎的后端朝右、腹面朝上，在20分钟内将约30个胚胎排列成两行。通过将装有针头的持针器针尖朝下浸入室温的EBR溶液中，使针头内冷冻保存的原始生殖细胞（PGCs）解冻。

保持浸没10秒。将移植玻片放置在显微镜载物台上。将冻融后的针头连接到毛细管固定器上，并将第一个胚胎移至左侧一排，针尖移至同一焦平面。

使用 20X 物镜，将针尖轻柔地置于胚胎后端表面。轻轻触碰每个胚胎的外部，确认其缓慢恢复至原始形状。用针从胚胎的后极刺入胚胎。

轻轻地将大约10至20个原始生殖细胞（PGCs）注入胚胎后极，在卵黄膜与体细胞层之间，随后将针头从胚胎中退出，再对后续胚胎重复相同操作。最后，通过交配新羽化的雌性和雄性个体来恢复品系。