Name: 小鼠结肠直肠炎癌症模型的建立及中药治疗效果评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-13T12:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: 了解如何使用氧化偶氮甲烷和硫酸葡聚糖钠建立小鼠结肠直肠炎癌症模型，并评估六君子汤的预防效果。该方法为研究中药在肿瘤防治中的应用提供了可靠的实验基础。

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本工作由吉林省科学技术厅（YDZJ202201ZYTS181）资助。

动物实验已获得长春中医药大学伦理委员会的批准（记录编号：2021214）。使用特定病原体-free C57BL/6J小鼠（8–10周龄，体重18–22 g），雌雄均有，饲养于独立通风笼具中，环境温度为22 °C，相对湿度为65%。小鼠在适应性喂养7天后开始实验，期间可自由饮水和进食。
1. 药物制备
<ol>
	<li>LJZD 的制备 
	&#8203;注意：所用中药购自长春中医药大学附属医院，并经鉴定为正品中药（见表1）。
	<ol>
		<li>将党参（12 g）、白术（12 g）、甘草（6 g）、陈皮（12 g）、姜半夏（9 g）放入专用陶瓷锅中（见材料表）。加入 1000 mL 蒸馏水，在室温下浸泡 1 h（见图1A）。</li>
		<li>将 12 g 茯苓用研磨机研成细粉，置于另一容器中，加入 300 mL 蒸馏水，在室温下浸泡 1 h。</li>
		<li>将上述中药混合于专用陶瓷锅中，煮沸后改用中火持续加热，直至药液体积浓缩至 300 mL。使用医用纱布过滤，滤液于室温下保存。</li>
		<li>加入 1000 mL 蒸馏水，重复上述煎煮操作一次，再次用医用纱布过滤。合并两次滤液并加热煮沸，直至剩余体积为 150 mL。</li>
		<li>将浓缩液在 10,000 × g 条件下离心 5 min，取上清液于中等加热条件下进一步浓缩至 30 mL。将最终浓缩液转移至培养皿中，使用电热干燥箱干燥，直至仅剩溶质呈粉末状。</li>
		<li>称量上述固体，溶于无菌蒸馏水中，配制成每 0.2 mL 含 22.85 mg 药物的溶液（即 114.16 mg/mL），此为小鼠每日给药剂量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>5-氨基水杨酸的制备 
	&#8203;注意：5-氨基水杨酸（5-ASA；见材料表）对 UC-CRC 具有良好的预防作用，本研究中将其作为阳性对照药物23。
	<ol>
		<li>将 64 mg 5-ASA 粉末溶于 200 mL 无菌蒸馏水中，配制成 1.82 mg/mL 的 5-ASA 溶液。单只小鼠每日给药量为 0.2 mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>AOM 注射液的制备
	<ol>
		<li>向 25 mg AOM 粉末中加入 2.5 mL 无菌蒸馏水（见材料表），使用涡旋混合器（见材料表）混匀，配制成 10 mg/mL 的 AOM 储备液，-20 °C 保存备用。</li>
		<li>用无菌蒸馏水将 AOM 储备液按 10:1 比例稀释，得到 1 mg/mL 的 AOM 注射液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. UC-CRC 模型的建立
注意：实验分为4组：对照组、模型组、LJZD组和5-ASA组，每组10只小鼠。除对照组外，其余各组均采用AOM和DSS处理。
<ol>
	<li>腹腔注射 AOM 注射液 
	注意：小鼠适应性喂养 7 天后，通过腹腔注射给予 AOM 注射液（1 mg/mL）（见图 1B）。
	<ol>
		<li>将小鼠腹部朝上、头部略向下固定。抓住背部皮肤以绷紧腹部皮肤，使用 1 mL 注射器在腹部中线与双侧大腿根部连线交点右侧约 1 cm 处刺入皮肤（见材料表）。</li>
		<li>将 1 mL 注射器针头推进至皮下 3–5 mm 深处，保持与腹中线平行，然后以 45° 角将针头插入腹腔内 0.3–0.5 mm。</li>
		<li>当针尖穿过腹肌时，操作者会感到阻力突然消失。随后向外、向后轻拉注射器，观察是否有液体渗漏。若无渗漏，则以 0.1 mL/10 g 的速度缓慢将 AOM 注射液注入小鼠体内。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>2% DSS 溶液的周期性刺激 
	&#8203;注意：每只 AOM 诱导的小鼠在第 3、6 和 9 周时给予 500 mL DSS 溶液，此期间小鼠可自由饮用。
	<ol>
		<li>通过将 10 g DSS 加入 500 mL 无菌蒸馏水中配制 2% DSS 溶液（见材料表）。使用涡旋混合器混匀，并于 4 °C 保存至使用前。</li>
		<li>每只经 AOM 诱导的小鼠在 AOM 诱导后的第 3、6 和 9 周分别自由饮用 2% DSS 溶液 500 mL，持续 7 天。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 药物处理
注意：成年人每天需要 63 g LJZD。根据实验小鼠与人用药剂量换算公式，小鼠等效实验剂量（mg/kg）= 人体剂量（mg/kg）/ 体重（60 kg）× 9.1，计算得小鼠每日剂量约为 9.6 g/kg。
<ol>
	<li>分别于第7周和第15周，通过灌胃给予LJZD组和5-ASA组小鼠0.1 mL/10 g的配制好的LJZD溶液和5-ASA溶液。
	<ol>
		<li>小鼠胃内给药操作步骤如下：用左手固定小鼠，右手持胃灌注装置。将注射器针头插入小鼠口腔，沿咽后壁缓缓下滑。随着小鼠吞咽动作继续推进，当感到轻微阻力且注射器可顺利推入时，表明已进入食管，此时完成推注后抽出针头即可。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对照组和模型组给予等量生理盐水处理（见材料表）。</li>
	<li>在给药期间，每天于同一时间对各组小鼠进行一次相应药物的给药处理。</li>
</ol>
4. UC-CRC 模型的评估及 LJZD 疗效评价
<ol>
	<li>疾病活动指数评分 
	注意：根据表2，疾病活动指数（DAI）评分通过结合小鼠的体重减轻、粪便黏稠度和粪便出血情况进行评估。
	<ol>
		<li>从适应性喂养开始至药物治疗结束，每天记录小鼠体重。</li>
		<li>仔细观察每只实验小鼠的粪便性状，并将排便情况记录为以下三种状态之一：正常、稀便和水样腹泻。</li>
		<li>将实验动物的粪便出血情况记录为以下三种状态之一：无出血、少量出血和粪便中可见血液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>血清中IL-6水平的检测
	<ol>
		<li>用LJZD或5-ASA处理小鼠9周。用左手捏住小鼠颈部皮肤，轻轻按压在实验台上使其呈侧卧位，固定小鼠。用剪刀剪除小鼠胡须（参见材料表），小心操作以防止血液污染。 
		注意：若小鼠无法自由扭动，则视为固定成功。若未达到此状态，应重新固定。</li>
		<li>通过吸入2%异氟烷对小鼠进行麻醉。用乙醇（参见材料表）消毒眼球周围皮肤。轻压一侧眼睑皮肤，使眼球充血并突出。</li>
		<li>用弯头镊夹住眼球，准确而迅速地摘除眼球。让血液滴入离心管（参见材料表）。在此过程中，轻拍小鼠心脏以加快采血速度。</li>
		<li>将采集的血液在室温下静置30分钟，然后在3,500 × g 条件下离心10分钟。收集上清液，并根据IL-6含量检测试剂盒说明书检测IL-6水平（参见材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>结直肠组织的分离
	<ol>
		<li>按照动物伦理要求，在采血后通过吸入5%过量异氟烷并实施颈椎脱臼法处死小鼠（参见材料表）。</li>
		<li>将小鼠置于低温解剖环境中。使其仰卧位固定。用剪刀剪去下腹部毛发，并用乙醇消毒。</li>
		<li>用眼睑镊夹住两后肢根部与腹中线的交点处（参见材料表），用剪刀横向剪开约1-1.5 cm的切口。</li>
		<li>从横切口的中点沿腹部正中线向上剪开纵向切口至剑突。</li>
		<li>沿肛门方向剥离结直肠周围的组织，将结直肠与周围组织分离。注意避免损伤结直肠。</li>
		<li>将腹部皮肤向两侧推开，充分暴露结直肠。用眼睑镊将结直肠从腹腔中取出，从肛门至盲肠（不包括盲肠）剪下肠段，总长约10 cm。将获得的结直肠组织保存于4 °C生理盐水中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>直肠长度与重量的评估
	<ol>
		<li>使用5 mL注射器吸取4 °C生理盐水（参见材料表），冲洗结直肠内部。然后将结直肠置于吸水纸上，吸去组织表面水分。</li>
		<li>称量结直肠组织重量，随后将其平铺于A4纸上测量其长度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>结直肠内肿瘤数量的测定
	<ol>
		<li>将结直肠沿纵轴剪开，充分展开后观察结直肠内肿瘤的数量和大小。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>结直肠的病理学分析
	<ol>
		<li>将结直肠组织置于4%多聚甲醛中固定24小时。将固定后的直肠组织包埋于熔化的石蜡中，使用组织冷冻切片机连续切片，厚度为5 µm。</li>
		<li>按照Hou等24所述步骤，用二甲苯脱蜡，再用梯度乙醇脱水。苏木精溶液染色5分钟后，用纯水冲洗切片。随后用0.5%伊红溶液复染1分钟（参见材料表）。</li>
		<li>再次进行梯度脱水和二甲苯透明处理。封片后，按照Xie等25所述方法在光学显微镜下观察并拍照（参见材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>结直肠的免疫组织化学分析
	<ol>
		<li>按照上述方法进行脱蜡和脱水处理。采用高压热修复法对切片中的抗原进行修复，操作参照Gok等26所述方法。</li>
		<li>将切片在室温下浸入内源性过氧化物酶阻断剂中15分钟。用羊血清（参见材料表）封闭切片。</li>
		<li>向切片上加入一抗ZO-1（1:1000）、Occludin（1:1000）和KI67（1:500；参见材料表），于4 °C孵育过夜。用PBS缓冲液（参见材料表）冲洗切片后，加入通用型二抗（1:5000；参见材料表），37 °C孵育30分钟。</li>
		<li>向切片加入DAB溶液（参见材料表）进行显色。用苏木精溶液复染切片。</li>
		<li>再次进行脱水、透明和封片处理。在光学显微镜下观察蛋白表达情况。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Liujunzi Decoction: An Effective Treatment for UC-CRC Prevention

作者无任何利益冲突需要披露。

结直肠癌（CRC）是全球最常见的癌症之一，每年约有 1,148,000 例新发病例和超过 576,000 例死亡病例。根据病因不同，CRC 可分为遗传性、散发性和 UC-CRC 三种类型31。患有溃疡性结肠炎（UC）等炎症性肠病的患者，其结直肠癌发病率显著高于普通人群。UC 通过炎症-癌症通路促进结直肠癌的发生，这与典型的腺瘤-腺癌通路不同6。目前，UC-CRC 的病因尚不明确，主要由长期反复的慢性炎症引起，死亡率高达 60%32,33。针对 UC-CRC 尚无有效治疗方法，近年来已成为研究热点。阐明 UC-CRC 的分子机制对于其早期发现和精准治疗至关重要。
目前，构建 UC-CRC 动物模型的方法有很多，其成瘤机制各不相同。IL-10 或 Muc2/4 基因敲除可导致上皮屏障缺陷，从而在小鼠中诱发自发性结肠炎，因此常用于构建基于与 ...

结直肠癌（CRC）是一种常见的消化道恶性肿瘤，为全球第三大常见恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第二大原因，占全球癌症发病总数的10%和癌症相关死亡总数的9.4%1,2。遗传因素、慢性炎症、高脂饮食、糖尿病以及肠道菌群失调是结直肠癌的危险因素3,4。其中，炎症性肠病，尤其是溃疡性结直肠炎（UC），是结直肠癌明确的危险因素5,6。与UC相关的结直肠癌（UC-CRC）是在结直肠慢性炎症基础上，由炎症、异型增生发展为癌症的过程，不同于典型的结直肠癌腺瘤-腺癌发展模型7,8。与一般人群相比，炎症性肠病患者的结直肠癌风险约高出10至40倍9。
目前，手术仍是结直肠癌（CRC）的标准治疗方法，根据肿瘤的位置和分期，可辅以放疗、全身药物治疗或两者联合治疗10。尽管这些传统治疗手段已取得显著进展，但由于结直肠癌具有高度异质性和高复发率，患者预后较差，治疗效果仍不理想11,12。因此，早期发现、早期诊断和综合治疗是提高结直肠癌患者生存率的关键，尤其应重视溃疡性结肠炎（UC）向结直肠癌的转化。多年来，由于中药副作用小且疗效显著，在治疗UC-CRC或慢性胃炎方面受到广泛关注。历代中医名家基于辨证论治原则，创立了大量经典方剂，如黄芪建中汤13、四君子汤14和四神丸15。
六君子汤（Liujunzi decoction，LJZD）源自明代《医学正传》的记载，是中医的经典方剂16。如表1所示，LJZD由六味传统中药材组成，包括党参（Codonopsis pilosula (Franch.) Nannf.）、茯苓（Poria cocos (Schw.) Wolf）、白术（Atractylodes macrocephala Koidz.）、甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）、陈皮（Citrus reticulata Blanco）和半夏（Pinellia ternata (Thunb.) Breit），具有补气健脾、燥湿化痰的功效。在现代临床实践中，常用于治疗慢性胃炎、胃溃疡及十二指肠溃疡。现代药理学研究表明，LJZD及其加减方在溃疡性结肠炎和消化道肿瘤的辅助治疗中具有较高的应用价值17,18,19。
目前，构建溃疡性结肠炎相关结直肠癌（UC-CRC）小鼠模型的方法有多种，但最广泛应用的是氧化偶氮甲烷（AOM）联合葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠模型；临床症状、形态学及病理学观察已证实，该模型与人类UC-CRC具有高度相似性20,21。其基本原理是先使用化学致癌剂AOM诱导癌变，随后持续给予DSS造成炎症刺激环境，模拟肠道黏膜上皮的反复损伤与修复过程，从而建立UC-CRC小鼠模型22。本研究旨在通过短期腹腔注射AOM并结合DSS的周期性刺激，建立UC-CRC小鼠模型，并进一步评价药物LJZD对UC-CRC的作用效果及其分子机制，为UC-CRC的治疗提供科学依据。

<table><tbody><tr><td>偶氮甲烷</td><td>Sigma</td><td>A5486</td><td></td></tr><tr><td>5-氨基水杨酸</td><td>葵花药业集团佳木斯鹿灵制药有限公司</td><td>3819413</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J 小鼠</td><td>辽宁长生生物技术股份有限公司</td><td>NO 210726210100853716</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>江苏世泰实验器材有限公司</td><td>10212432C</td><td></td></tr><tr><td>DAB 显色试剂盒</td><td>江苏世泰实验器材有限公司</td><td>2005289</td><td></td></tr><tr><td>脱水机&amp;nbsp;</td><td>武汉俊杰电子有限公司</td><td>JJ-12J</td><td></td></tr><tr><td>葡聚糖硫酸钠</td><td>大连美仑生物技术有限公司</td><td>MB5535</td><td></td></tr><tr><td>包埋机</td><td>武汉俊杰电子有限公司</td><td>JB-P5</td><td></td></tr><tr><td>苏木精-伊红染液</td><td>武汉佰度生物技术有限公司</td><td>B1000</td><td></td></tr><tr><td>IL-6</td><td>江苏美因生物科技有限公司</td><td>MM-0163M2</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>RWD 生命科学有限公司</td><td>R510-22-10</td><td></td></tr><tr><td>KI67 一抗</td><td>Google 生物科技公司</td><td>GB121141</td><td></td></tr><tr><td>中性树胶</td><td>武汉佰度生物技术有限公司</td><td>10004160</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>江苏世泰实验器材有限公司</td><td>10212432A</td><td></td></tr><tr><td>Occludin 一抗</td><td>Affnity</td><td>DF7504</td><td></td></tr><tr><td>正置光学显微镜</td><td>Nikon</td><td>Nikon Eclipse CI</td><td></td></tr><tr><td>病理切片机</td><td>上海徕卡仪器有限公司</td><td>RM2016</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 一抗</td><td>Abcam</td><td>ab221547</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠结直肠炎癌模型的建立及中药治疗效果评价

Establishment of Coloproctitis Cancer Model in Mice and Evaluation of Therapeutic Effect of Chinese Medicine

结直肠癌（CRC）是消化系统常见的恶性肿瘤，已成为全球第三大常见恶性肿瘤，以及恶性肿瘤相关死亡的第二大原因。溃疡性结肠直肠炎（UC）是一种癌前病变，与UC相关的结直肠癌（UC-CRC）是CRC最常见的亚型。因此，建立合理的UC-CRC模型是新药研发的基础和保障。由于疗效良好，中药（TCM）已被广泛用于UC-CRC的治疗。六君子汤（LJZD）作为中药的经典补益方剂，已在UC-CRC治疗中得到广泛应用。本研究通过联合使用偶氮甲烷和葡聚糖硫酸钠建立UC-CRC模型，并给予LJZD干预。实验数据证实，LJZD可通过小鼠体重、结直肠长度、病理学与炎症因子、结直肠屏障功能及癌症标志物等指标，有效抑制UC-CRC的癌变进程。该方案为评价中药在UC-CRC防治中的疗效提供了一个系统性研究体系。

LJZD汤剂根据方中药物的配伍比例制备 表1 以及中药的煎煮方法 图1A. 根据所指示的时间点 图1B，小鼠在第7天通过腹腔注射1 mg/mL AOMth 天，小鼠可自由饮用含有 2% DSS 的饮用水rd, 6th，和 9th 周。已成功建立UC-CRC小鼠模型于15th 周。同时，从第7周到第15周，通过灌胃给予小鼠LJZD治疗。数据显示，与对照组相比，UC-CRC模型组小鼠体重显著下降，而LJZD治疗可缓解该体重下降情况（图2A，P &lt; 0.01）。试验结束时，与UC-CRC模型组相比，LJZD治疗改善了DAI评分（图2B）。与对照组相比，UC-CRC模型组的结直肠长度较短，而经LJZD处理后该长度增加（图...

本方案提供了一种由偶氮甲烷联合硫酸葡聚糖钠诱导的溃疡性直肠结肠炎相关性结直肠癌的小鼠模型。该模型用于评价中药复方在结直肠癌预防和治疗中的有效性。

结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是消化系统常见的恶性肿瘤，已成为全球第三大常见恶性肿瘤和第二大癌症致死原因……

本研究旨在探讨中医药对结直肠炎癌变的预防与治疗作用。我们拟建立结直肠炎癌变的小鼠模型，并评价中医药的固定指标。研究证实，中药六君子汤是预防结直肠炎癌变的有效治疗方法。未来，我们将致力于寻找结肠癌和直肠癌更敏感的生物标志物，并筛选六君子汤的治疗靶点。首先，将丹参、白术、当归、陈皮和姜半夏放入专用的陶瓷锅中。加入1000毫升蒸馏水，在室温下浸泡一小时。使用研磨机将12克茯苓研磨成细粉。然后将研磨后的茯苓粉末放入另一个容器中，加入300毫升蒸馏水，在室温下浸泡1小时。将制备好的中药混合物放入特制的陶瓷锅中混合。将混合物煮沸，并用中火维持加热，直至煎液体积减少至300毫升。合并煎液滤液，继续煮沸，直至体积减少至150毫升。随后将浓缩液在10,000G条件下离心5分钟。将获得的上清液在中等加热条件下浓缩至30毫升。将浓缩后的液体转移至培养皿中，使用电热干燥箱干燥，直至仅剩溶质呈粉末状。称量所得粉末，并将其溶解于无菌蒸馏水中，配制成小鼠每日剂量溶液。为了配制5-氨基水杨酸溶液，称取64毫克5-氨基水杨酸粉末，溶于200毫升无菌蒸馏水中。首先，将小鼠轻轻置于仰卧位，头部略低于身体。抓住背部皮肤以固定腹部区域，将1毫升注射器的针头插入腹中线右侧1厘米处，即两侧大腿连线的交点位置。将1毫升注射器的针头逐渐插入皮下，深度为3至5毫米。以约45度角将针头插入腹腔约0.3至0.5毫米。当针尖穿过腹肌时，会感觉到阻力突然降低。按每10克体重0.1毫升的剂量，缓慢向小鼠注射偶氮甲烷注射液。随后轻柔地拔出注射器。然后将10克DSS加入500毫升无菌蒸馏水中，配制2% DSS溶液。使用涡旋混合器混匀溶液，随后在4°C保存直至使用。在第7周和第15周，通过灌胃每日于固定时间向各相应组别小鼠给予制备好的LJZD和5-氨基水杨酸溶液。首先，建立UC-CRC小鼠模型，并向各相应组别给予含有LJZD的5-ASA溶液。药物处理后，从适应性喂养开始至药物处理结束，每天监测小鼠的体重。仔细观察并记录每只实验小鼠的粪便性状，将其分类为正常、稀便或水样腹泻。认真记录实验动物中观察到的任何粪便出血情况，将其分为无出血、微量出血或粪便中可见血液。为分离结肠直肠组织，将已实施安乐死的小鼠置于低温解剖环境中。将小鼠固定于仰卧位，使用剪刀修剪下腹部毛发，并用乙醇对局部区域进行消毒。使用眼睑镊子轻轻夹住两腿根部与腹中线的交点处，然后用剪刀做一条1至1.5厘米长的横向切口。从横向切口的中点开始，沿腹部正中线向剑突方向做纵向切口。仔细向肛门方向分离直肠周围组织，将结直肠与周围组织分开。轻柔地推开腹壁皮肤，充分暴露结直肠。使用眼睑镊将结直肠从腹腔中取出，并从肛门向盲肠方向进行切取。将收集的结直肠组织置于4°C的生理盐水中保存。与对照组相比，UC-CRC模型组体重显著下降，而LJZD治疗可缓解该症状。与UC-CRC模型组相比，L

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小鼠结肠直肠炎癌症模型的建立及中药治疗效果评价

建立该模型可采用两种技术：将癌细胞悬液注射至盲肠壁，或将皮下肿瘤组织块移植到盲肠。该模型可用于研究结直肠癌的自然进展过程，以及评估针对结直肠癌的新型治疗药物。...

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