实时高通量技术定量人中性粒细胞中性粒细胞胞外诱捕网的形成

我们的研究聚焦于中性粒细胞，这类细胞是免疫系统中重要的第一反应者，在多种疾病中发挥关键作用。过去二十年的研究表明，中性粒细胞通过破坏免疫调节，参与癌症、免疫性疾病及其他炎症性疾病的发病过程。其中包括形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），即响应炎症反应的网状结构，这类结构有望成为这些疾病的治疗靶点。

然而，尽管目前有一些靶向NETs的分子正处于研发阶段并展现出一定前景，但尚无专门针对这一机制的获批疗法。这至少部分归因于缺乏一种客观、无偏倚、可重复且高通量的NET形成定量方法。本方案采用双色活细胞成像技术，通过使用膜通透性和非通透性染料，精确追踪中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的形成，从而分析中性粒细胞的行为。

该方法基于细胞膜完整性区分中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成细胞与健康中性粒细胞，并通过相差成像中观察到的形态学变化，清晰区分不同类型的细胞死亡。该方法克服了以往报道技术在定量NET形成方面的局限性，能够以自动化方式实现高效、可重复且准确的NET定量。该方法将有助于以中性粒细胞为靶点的药物开发，具备高通量筛选多种针对NET形成的治疗靶点的能力。

从人外周血中分离中性粒细胞后，将其重悬于1.5毫升离心管中的RPMI 1640培养基中。向1.5毫升中性粒细胞悬液中加入1微升膜通透性红色DNA染料，避光孵育5分钟。将中性粒细胞悬液在室温下以2,500G离心5分钟。

离心后，取出含有中性粒细胞沉淀的离心管，吸除上清液。将中性粒细胞重悬于 1 毫升 RPMI 培养基中，再次离心。最后一次洗涤后，将中性粒细胞重悬于 1 毫升 RPMI 培养基中。

取少量中性粒细胞悬液加入血细胞计数板，在显微镜下进行计数。用RPMI将中性粒细胞悬液稀释至每毫升含1.5 × 10⁵个中性粒细胞。向1毫升中性粒细胞悬液中加入4 µL已按1:100预先稀释的膜不透性绿色DNA染料。

每孔加入100微升中性粒细胞悬液至透明的组织培养处理过的96孔板中。向相应的孔中加入100微升含有刺激剂试剂的RPMI培养基，可选择性添加或不添加抑制剂。将该板放入置于5%二氧化碳培养箱中的活细胞分析系统中。

首先，启动活细胞分析系统软件。按下屏幕左上角的加号符号，以开始添加容器。

选择“按计划扫描”，然后选择“新建”以运行扫描程序。选择“标准”模式，然后将扫描设置中的逐细胞选项设为“无”，图像通道设为相位、绿色和红色，并分别设置相应的采集时间。

将物镜设为 20X。从列表中选择培养板，并选择容器位置以将培养板放置于成像系统的托盘上。选择含有样品的孔，并确定每孔需采集的图像数量。

此信息将自动为该孔板生成估计的扫描时长。单击“创建孔板图”以输入每个孔的信息，例如细胞类型和化合物。然后，为研究命名。

在下一个界面中，选择“基础分析仪”作为分析类型，并从下拉列表中选择分析定义，该列表显示先前使用过的分析定义。绿色和红色的光谱分离均保持为 0.0。将扫描计划设置为每 15 至 20 分钟进行一次，持续八小时。

拖动屏幕顶部的白色和灰色条以设置扫描的起始时间。在下一个界面中，检查扫描设置，然后按“添加到计划”以开始扫描。扫描完成后，在“查看”选项卡中打开血管进行分析，点击屏幕左侧的“启动分析”，然后选择“创建新的分析定义”。

选择基础分析器，并使用相位、绿色、红色及重叠图像通道。选取六到八张具有代表性的样本图像用于训练。为配置分析定义，将绿色对象设为形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的中性粒细胞，红色对象设为所有中性粒细胞的细胞核。

按“预览当前”或“预览全部”，并调整每个参数以优化结果。选择用于分析的扫描时间和孔板孔位，然后为分析定义提供一个标签。

查看摘要并启动分析。分析完成后，双击分析定义的名称以打开已分析的研究。在屏幕左侧打开图层，并检查每个细胞是否被正确标记。

单击屏幕左侧的“图形指标”，然后为绿色计数选择“每张图像的计数”。选择要导出的时间点和孔位。在选择分组时，选择“板图重复”以确认扫描过程中所有孔位均已正确指定，然后单击“导出数据”。

同样，导出红色计数和重叠计数的数据。根据给定公式，计算每种条件和每个时间点的NET形成细胞百分比。通过绘制每个时间点NET形成中性粒细胞的百分比，可直观展示NET形成的动态过程。

加入AKT抑制剂可阻断经PMA或钙离子载体刺激的中性粒细胞的NET形成，表明利用该方法可高通量地检测靶向NET形成的潜在分子。