Name: 实时高通量技术量化人中性粒细胞中性粒细胞胞外陷阱的形成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: 学习利用双染料活细胞成像技术实时高通量量化人中性粒细胞胞外陷阱（NETs）的形成。该方法通过膜通透性差异实现精准追踪，为炎症性疾病靶向治疗研究提供可靠工具。

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感谢美国国立卫生研究院下属的国立关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所科学与技术办公室的光成像部门。本研究由美国国立卫生研究院下属的国立关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所内部研究计划（项目编号：ZIA AR041199）资助。

在获得国家卫生研究院（NIH）机构审查委员会（IRB）批准的方案下，经受试者知情同意后采集健康人来源的中性粒细胞。该方案遵循NIH人类研究伦理委员会的指导原则。
1. 中性粒细胞染色及检测板的制备
<ol>
	<li>根据各机构的指南，在获得适当的书面知情同意后采集外周血，并使用任意所需方法分离中性粒细胞。例如，Ficoll-葡聚糖法10,11 是一种常用于从人外周血中分离中性粒细胞的方法。 
	注意：尽管本文讨论的方法使用人中性粒细胞，小鼠中性粒细胞也可采用类似方案进行分析。</li>
	<li>将中性粒细胞重悬于 Roswell Park Memorial Institute (RPMI；见 材料表) 1640 培养基中，浓度为 2.0 × 106 个中性粒细胞/mL，并将细胞悬液转移至 1.5 mL 离心管中。 
	注意：我们通常不在培养基中添加胎牛血清（FBS），因为 FBS 中的白蛋白会抑制 NET 的形成12，而 FBS 中耐热的核酸酶可降解 NET13。</li>
	<li>每 1.5 mL 中性粒细胞悬液中加入 1 µL 可穿透细胞膜的红色 DNA 染料（见 材料表）。</li>
	<li>室温避光孵育 5 分钟，然后在室温下以 2500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用 1 mL RPMI 重悬中性粒细胞，室温下以 2500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。重复此步骤两次（共洗涤三次）。</li>
	<li>将中性粒细胞重悬于 1 mL RPMI 中，使用细胞计数仪进行计数，并将细胞悬液稀释至 1.5 × 105 个中性粒细胞/mL。</li>
	<li>每 1 mL 中性粒细胞悬液中加入 4 µL 已预先稀释至 1:100 的不可穿透细胞膜的绿色 DNA 染料（见 材料表）。</li>
	<li>将 100 µL 中性粒细胞悬液加入透明的组织培养处理的 96 孔板（见 材料表）的每个孔中。每种实验条件设三个复孔。 
	注意：我们先前已证明7，无论是否使用多聚-L-赖氨酸包被，采用本方法检测 NET 的形成和定量结果无差异。因此，使用组织培养处理的 96 孔板已足够满足本实验要求。</li>
	<li>向各孔中分别加入含刺激剂、抑制剂或其他目标试剂的 RPMI 培养基各 100 µL。始终设置阳性对照孔，加入 500 nM 佛波酯-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯（PMA）或 2.5 µM 钙离子载体（A23187）；本实验中使用了 30 µM AKT 抑制剂。</li>
	<li>将 96 孔板放入置于 5% CO2 培养箱内的活细胞分析系统中（见 材料表）。 
	注意：此步骤数分钟后，孔板顶部和底部可能出现冷凝水，可能影响成像效果。在开始扫描前应彻底擦拭并去除冷凝水。将孔板放入仪器后启动软件并输入扫描程序，在首次扫描前再次擦拭孔板。</li>
</ol>
2. 扫描培养板以观察中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成的中性粒细胞
<ol>
	<li>启动软件（软件详细信息参见材料表）。点击左上角的 + 号，启动添加容器功能。</li>
	<li>选择按计划扫描，然后选择新建。 
	注意：创建后，可通过选择复制先前并在下一屏幕中选择已存储的协议，来运行相同的扫描程序。</li>
	<li>选择标准模式。设置扫描参数如下：逐细胞选项：无；图像通道：明场（Phase）、绿色（Green，采集时间：200 ms）、红色（Red，采集时间：400 ms）；物镜：20x。</li>
	<li>从列表中选择正在使用的培养板。选择将培养板放置在活细胞成像系统托盘上的具体位置。</li>
	<li>选择含有样品的孔，并决定每个孔拍摄的图像数量。根据每孔图像数量，生成该板的预计扫描时长。通常每孔拍摄4张图像已足够；但具体数量可能因实验条件和扫描频率而异。</li>
	<li>点击创建板图，输入各孔相关信息（如细胞类型和化合物），并为研究命名。 
	注意：可提前使用软件中的板图编辑器准备并保存板图。保存的板图数据可在本步骤中导入。如需要，也可跳过此步骤，稍后补录。即使不输入板布局信息，也可获取数据。但建议输入板图信息，以便后续分析更加便捷。</li>
	<li>在下一屏幕中，选择基础分析器作为分析类型，并从下拉列表中选择分析协议，该列表将显示先前使用过的分析定义（非扫描协议）。绿色和红色通道的光谱分离值均可设为 0.0%。 
	注意：如需要，此步骤可跳过。</li>
	<li>安排扫描计划。本实验中，每15–20分钟扫描一次，持续8小时。通过拖动屏幕顶部的白色和灰色条来设定扫描开始时间。 
	注意：避免扫描过于频繁，否则设备可能因过热而运行异常。每24小时内扫描时间不应超过12小时。若扫描频率过高，系统可能会发出警告。</li>
	<li>在下一屏幕中检查扫描设置，然后点击添加到计划以开始扫描。等待初始图像扫描完成，以确认所有设置正常运行。
	<ol>
		<li>有时细胞可能无法正确聚焦。此时应检查是否存在冷凝水（如有则相应擦拭）、培养板是否正确放置在托盘上，或培养板位置是否准确指定等。若细胞仍在漂浮且未沉降至孔底，可等待约5分钟后再次扫描。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 设置分析定义以定量中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）
<ol>
	<li>在“查看”选项卡中打开要分析的研究（容器）。按屏幕左侧的启动分析，然后选择创建新分析定义。
	<ol>
		<li>如果此前已进行过分析，可通过选择复制现有分析定义并稍作修改来重复使用相同的分析定义。在此情况下，请跳至步骤 3.3。如果无需任何修改而直接使用现有分析定义，请选择使用现有分析定义；但不推荐此做法，因为不同日期实验之间的荧光强度可能存在差异，通常需要进行一些微小调整。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>选择基础分析器。使用所有图像通道：相位、绿色、红色和重叠。 
	注意：尽管我们通常使用绿色和红色对象掩膜来计数 NETs，但在碎片干扰显著时，重叠对象掩膜非常有用。在这种情况下，将使用重叠对象计数作为分子，而非绿色对象计数（见步骤 3.9）。如果使用重叠对象计数代替绿色对象计数，则必须准确计数所有红色信号。请调整红色信号设置，以确保在后期时间点拍摄的图像中能正确计数所有弱红色信号的对象，同时避免将碎片计入。</li>
	<li>选择 6–8 张具有代表性的样本图像用于训练。本实验应包括以下图像： 
	0 至 20 分钟内拍摄的图像，用于优化绿色信号设置，以补偿非 NET 形成性中性粒细胞可能产生的微弱绿色信号； 
	使用阳性对照在 3–6 小时内拍摄的 NET 数量达到最大值的图像（具体时间取决于所用刺激方式），用于优化绿色信号设置以定义 NET 形成性中性粒细胞； 
	约 1 小时时间点拍摄的图像，用于计数总细胞数（以红色染料染色），因为此时细胞核的红色信号最强（所有细胞均已沉降至孔底），随后因细胞死亡而逐渐减弱； 
	包含碎片的图像，用于排除碎片被误计的情况。</li>
	<li>设置分析定义。绿色对象和红色对象分别对应所有中性粒细胞的细胞核以及正在形成 NETs 的中性粒细胞。可参考以下示例参数，点击预览当前或预览全部，并调节各参数以优化结果： 
	绿色通道设置：分割 - 背景扣除：Top-Hat；半径：100 µM；阈值：0.3 GCU；边缘分割：开启；边缘敏感度：-20；清理 - 填孔：100 µm2；调整大小：0 像素；滤波器 - 面积：最小 20 µm2，最大 500 µm2；偏心率：最大 0.97；平均强度：最小 1.00； 
	红色通道设置：分割 - 背景扣除：Top-Hat；半径：10 µM；阈值：1.0 GCU；边缘分割：开启；边缘敏感度：-50；清理 - 填孔：50 µm2；调整大小：0 像素；滤波器 - 面积：最小 20 µm2，最大 400 µm2；平均强度：最小 1.5。
	<ol>
		<li>如果在本不应形成 NETs 的中性粒细胞中出现过强的绿色信号（例如，在 0 分钟未受刺激且细胞核呈分叶状的中性粒细胞），可能是由于绿色通道检测到了红色信号的溢出。此时应返回步骤 3.1，在屏幕左侧打开图像图层，并通过使用光谱解混功能从绿色通道中去除红色信号。</li>
		<li>另一种方法是设置一个仅用细胞核红色染料单染的孔，以明确应从绿色通道中去除多少红色信号。另一方面，绿色信号渗入红色通道通常不会影响分析结果。 
		注意：在较晚时间点（如 6 小时）拍摄的图像中，即使红色信号的灵敏度较低且未能捕获全部红色信号也无妨。每张图像中红色对象的最大计数值将被视为该图像中性粒细胞的总数，并在步骤 3.9 中作为分母使用。通常，细胞核红色信号在约 1 小时时间点达到峰值，随后因细胞死亡而逐渐减弱（图 1B）。因此，请根据红色信号最强的图像调整红色信号设置，以确保红色对象被准确计数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>选择要分析的扫描时间和孔位。通常应分析所有时间点和孔。为分析定义提供一个标签。</li>
	<li>检查摘要后启动分析。分析完成需要数小时（耗时取决于时间点和孔的数量）。启动后，分析定义的名称将显示在“查看”选项卡中研究名称下方，完成后会显示完成日期。</li>
	<li>分析完成后，通过双击分析定义名称打开已分析的研究。在屏幕左侧打开图层，检查每个细胞是否被正确标记。若标记不正确，请返回步骤 3.1 并重复后续步骤。</li>
	<li>点击屏幕左侧的图形指标以导出数据。选择绿色计数、红色计数或重叠计数（每张图像），然后选择要导出的时间点和孔。若需分组，请在扫描时已正确指定所有孔的情况下选择板图重复。</li>
	<li>导出数据。使用适当的软件，根据以下公式计算每种条件/时间点下 NET 形成细胞的百分比。 
	<img alt="NETs 百分比计算公式，绿色/红色对象计数比，教学用公式。" src="/files/ftp_upload/66051/66051eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1"> 
	注意：分母采用最大红色对象计数的原因是，红色对象数量在约 1 小时时间点达到峰值，随后因细胞死亡而逐渐减少。</li>
</ol>

Quantifying NET Formation Using Dual-Dye Live Cell Analysis

<ol><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Wigerblad, G., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+in+systemic+autoimmune+and+autoinflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps in systemic autoimmune and autoinflammatory diseases.</a> Nat Rev Immunol. 23 (5), 274-288 (2022).</li>
<li>Wagner, D. D., Heger, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thromboinflammation%3A+From+atherosclerosis+to+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Thromboinflammation: From atherosclerosis to COVID-19.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 42 (9), 1103-1112 (2022).</li>
<li>Njeim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NETosis+contributes+to+the+pathogenesis+of+diabetes+and+its+complications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">NETosis contributes to the pathogenesis of diabetes and its complications.</a> J Mol Endocrinol. 65 (4), R65-R76 (2020).</li>
<li>De Meo, M. L., Spicer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neutrophil+extracellular+traps+in+cancer+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of neutrophil extracellular traps in cancer progression and metastasis.</a> Semin Immunol. 57, 101595(2021).</li>
<li>Nakabo, S., Romo-Tena, J., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+as+drivers+of+immune+dysregulation+in+autoimmune+diseases+with+skin+manifestations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils as drivers of immune dysregulation in autoimmune diseases with skin manifestations.</a> J Invest Dermatol. 142 (3 Pt B), 823-833 (2022).</li>
<li>Gupta, S., Chan, D. W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+real-time+imaging+technique+to+quantify+NETosis+and+distinguish+mechanisms+of+cell+death+in+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils.</a> J Immunol. 200 (2), 869-879 (2018).</li>
<li>Nakabo, S., Kaplan, M. J., Gupta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+neutrophils+undergoing+NET+formation+and+distinguishing+mechanisms+of+neutrophil+cell+death+by+use+of+a+high-throughput+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantification of neutrophils undergoing NET formation and distinguishing mechanisms of neutrophil cell death by use of a high-throughput method.</a> Methods Mol Biol. 2543, 129-140 (2022).</li>
<li>Singh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moonlighting+chromatin%3A+when+DNA+escapes+nuclear+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Moonlighting chromatin: when DNA escapes nuclear control.</a> Cell Death Differ. 30 (4), 861-875 (2023).</li>
<li>Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+quantification+of+NETosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction and quantification of NETosis.</a> Curr Protoc Immunol. 115, 14.41.11-14.41.14 (2016).</li>
<li>Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+neutrophils+from+whole+blood+and+buffy+coats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats.</a> J Vis Exp. (175), 62837(2021).</li>
<li>Neubert, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+and+serum+albumin+inhibit+in+vitro+formation+of+neutrophil+extracellular+traps+%28NETs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Serum and serum albumin inhibit in vitro formation of neutrophil extracellular traps (NETs).</a> Front Immunol. 10, 12(2019).</li>
<li>von Kockritz-Blickwede, M., Chow, O. A., Nizet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+calf+serum+contains+heat-stable+nucleases+that+degrade+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Fetal calf serum contains heat-stable nucleases that degrade neutrophil extracellular traps.</a> Blood. 114 (25), 5245-5246 (2009).</li>
<li>Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+image-based+quantitative+method+for+the+characterization+of+NETosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis.</a> J Immunol Methods. 423, 104-110 (2015).</li>
<li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).</li>
</ol>

作者无竞争性财务利益。

量化NETs的现有方法 离体 存在多种局限性，限制了我们以无偏倚且高通量的方式研究中性粒细胞、中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）及潜在治疗靶点的能力10,14例如，免疫荧光染色后直接计数形成NET的细胞被认为是NET定量的金标准，但该方法通量低且依赖于操作者的主观判断。通过微孔板检测膜非通透性DNA染料荧光强度的方法可客观、高通量地将胞外DNA作为NET的替代标志物进行定量，但由于该方法无法获得形态学信息，其他类型细胞死亡所释放的DNA可能被误判为NET。另一方面，该方法可实现NET的高通量和客观定量。7鉴于能够获取中性粒细胞形态学变化及其时间进程的信息，可准确区分中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）与其他类型的细胞死亡。近期多项研究提示NETs在多种疾病中具有致病作用2,3,4</sup...

中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）是中性粒细胞在多种炎症刺激下释放出的网状染色质结构。NETs 由 DNA、组蛋白以及多种抗菌蛋白/肽组成，可捕获并杀灭病原微生物，同时引发炎症反应1。
尽管中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）在宿主防御病原体方面具有积极作用，但其作为多种自身免疫性疾病2、血栓形成3、代谢性疾病4以及癌症转移性生长5潜在驱动因素的作用已引起广泛关注。因此，抑制NET的形成可能是治疗这些疾病的一种潜在治疗策略。然而，尽管目前有一些前景良好的靶向NETs的分子正在研发中6，但至今尚无特异性作用于该机制的获批疗法。这一现状至少部分归因于缺乏客观、无偏倚、可重复且高通量的NET形成定量检测方法。
我们建立并报道了一种利用双色活细胞成像平台的新方法7,8。通过该软件分析用膜通透性核染料和膜不通透性DNA染料染色的中性粒细胞的时间推移图像，并在多个时间点统计NET形成前和形成后的中性粒细胞数量。由于在NET形成过程中，PKCα介导的Lamin B和CDK4/6介导的Lamin A/C解聚调控导致细胞质膜完整性丧失9，因此NET形成的中性粒细胞可被膜不通透性DNA染料染色，而健康的中性粒细胞则不能。该方法克服了以往报道的NET形成定量技术存在的问题，能够以自动化方式实现无偏倚、高通量、可重复且准确的NET定量。

<table><tbody><tr><td>AKT抑制剂</td><td>Calbiochem</td><td>124028</td><td></td></tr><tr><td>透明96孔板</td><td>Corning</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>活细胞分析系统</td><td>Sartorius</td><td>N/A</td><td>Incucyte软件（v2019B）</td></tr><tr><td>膜不通透性DNA绿色染料&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>细胞核红色染料</td><td>Enzo</td><td>ENZ-52406</td><td>染色后中性粒细胞沉淀呈现蓝紫色。</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11835030</td><td>含酚红的RPMI可用于实验。</td></tr></tbody></table>

实时高通量技术定量人中性粒细胞中性粒细胞胞外诱捕网的形成

Real-Time High Throughput Technique to Quantify Neutrophil Extracellular Traps Formation in Human Neutrophils

中性粒细胞是髓系细胞，构成先天免疫系统的重要组成部分。过去十年的研究揭示了中性粒细胞在癌症、自身免疫性疾病以及多种急性和慢性炎症性疾病的发病机制中发挥的其他关键作用，其通过多种机制促进免疫失调的启动和持续，其中包括形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），这种结构在抗微生物防御中至关重要。由于目前在无偏倚、可重复且高效地定量NET形成的检测技术方面存在局限性，限制了我们进一步理解中性粒细胞在健康与疾病中的作用。本文描述了一种自动化的、实时的、高通量的方法，利用活细胞成像平台结合依赖膜通透性的双荧光染料策略，使用两种不同的DNA染料分别标记细胞内和细胞外的DNA，从而定量发生NET形成的中性粒细胞。该方法有助于评估中性粒细胞的生理状态，并可用于筛选靶向NET形成的分子。

该方法可在每个时间点提供相差图像、红色荧光（膜通透性染料）和绿色荧光（膜不通透染料）图像。随着中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成过程的进行，在相差图像和红色荧光图像中可观察到细胞形态的变化；一旦细胞膜破裂，即可观察到绿色荧光（图1）。在本实验中，形成NET的中性粒细胞通常呈圆形，而非网状结构。这是因为成像设备的分辨率不足以捕捉精细的网状结构，且当细胞膜破裂后，膜不通透的绿色染料会在染色质释放前即对其染色。我们此前已证实7，可通过共聚焦成像对孵育4小时后回收的96孔板中的NET进行可视化观察。
当分析定义设置适当时，图像中的所有中性粒细胞均被标记为红色对象，而形成 NET 的中性粒细胞则被标记为绿色对象（图 2）。机器会统计每个时间点的红色和绿色对象的数量。通过绘制每个时间点形成 NET 的中性粒细胞所占的百分比，可直观展示 NET 形成的时间进程（图 3）。...

我们介绍一种利用活细胞分析系统结合膜通透性依赖性双染料方法的自动化高通量中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）定量技术。

中性粒细胞是髓系细胞，构成先天免疫系统的关键部分。过去十年的研究揭示了中性粒细胞在……中的其他重要作用。

我们的研究聚焦于中性粒细胞，这类细胞是免疫系统中重要的第一反应者，在多种疾病中发挥关键作用。过去二十年的研究表明，中性粒细胞通过破坏免疫调节，参与癌症、免疫性疾病及其他炎症性疾病的发病过程。其中包括形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），即响应炎症反应的网状结构，这类结构有望成为这些疾病的治疗靶点。然而，尽管目前有一些靶向NETs的分子正处于研发阶段并展现出一定前景，但尚无专门针对这一机制的获批疗法。这至少部分归因于缺乏一种客观、无偏倚、可重复且高通量的NET形成定量方法。本方案采用双色活细胞成像技术，通过使用膜通透性和非通透性染料，精确追踪中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的形成，从而分析中性粒细胞的行为。该方法基于细胞膜完整性区分中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成细胞与健康中性粒细胞，并通过相差成像中观察到的形态学变化，清晰区分不同类型的细胞死亡。该方法克服了以往报道技术在定量NET形成方面的局限性，能够以自动化方式实现高效、可重复且准确的NET定量。该方法将有助于以中性粒细胞为靶点的药物开发，具备高通量筛选多种针对NET形成的治疗靶点的能力。从人外周血中分离中性粒细胞后，将其重悬于1.5毫升离心管中的RPMI 1640培养基中。向1.5毫升中性粒细胞悬液中加入1微升膜通透性红色DNA染料，避光孵育5分钟。将中性粒细胞悬液在室温下以2,500G离心5分钟。离心后，取出含有中性粒细胞沉淀的离心管，吸除上清液。将中性粒细胞重悬于 1 毫升 RPMI 培养基中，再次离心。最后一次洗涤后，将中性粒细胞重悬于 1 毫升 RPMI 培养基中。取少量中性粒细胞悬液加入血细胞计数板，在显微镜下进行计数。用RPMI将中性粒细胞悬液稀释至每毫升含1.5 × 10⁵个中性粒细胞。向1毫升中性粒细胞悬液中加入4 µL已按1:100预先稀释的膜不透性绿色DNA染料。每孔加入100微升中性粒细胞悬液至透明的组织培养处理过的96孔板中。向相应的孔中加入100微升含有刺激剂试剂的RPMI培养基，可选择性添加或不添加抑制剂。将该板放入置于5%二氧化碳培养箱中的活细胞分析系统中。首先，启动活细胞分析系统软件。按下屏幕左上角的加号符号，以开始添加容器。选择“按计划扫描”，然后选择“新建”以运行扫描程序。选择“标准”模式，然后将扫描设置中的逐细胞选项设为“无”，图像通道设为相位、绿色和红色，并分别设置相应的采集时间。将物镜设为 20X。从列表中选择培养板，并选择容器位置以将培养板放置于成像系统的托盘上。选择含有样品的孔，并确定每孔需采集的图像数量。此信息将自动为该孔板生成估计的扫描时长。单击“创建孔板图”以输入每个孔的信息，例如细胞类型和化合物。然后，为研究命名。在下一个界面中，选择“基础分析仪”作为分析类型，并从下拉列表中选择分析定义，该列表显示先前使用过的分析定义。绿色和红色的光谱分离均保持为 0.0。将扫描计划设置为每 15 至 20 分钟进行一次，持续八小时。拖动屏幕顶部的白色和灰色条以设置扫描的起始时间。在下一个界面中，检查扫描设置，然后按“添加到计划”以开始扫描。扫描完成后，在“查看”选项卡中打开血管进行分析，点击屏幕左侧的“启动分析”，然后选择“创建新的分析定义”。选择基础分析器，并使用相位、绿色、红色及重叠图像通道。选取六到八张具有代表性的样本图像用于训练。为配置分析定义，将绿色对象设为形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的中性粒细胞，红色对象设为所有中性粒细胞的细胞核。按“预览当前”或“预览全部”，并调整每个参数以优化结果。选择用于分析的扫描时间和孔板孔位，然后为分析定义提供一个标签。查看摘要并启动分析。分析完成后，双击分析定义的名称以打开已分析的研究。在屏幕左侧打开图层，并检查每个细胞是否被正确标记。单击屏幕左侧的“图形指标”，然后为绿色计数选择“每张图像的计数”。选择要导出的时间点和孔位。在选择分组时，选择“板图重复”以确认扫描过程中所有孔位均已正确指定，然后单击“导出数据”。同样，导出红色计数和重叠计数的数据。根据给定公式，计算每种条件和每个时间点的NET形成细胞百分比。通过绘制每个时间点NET形成中性粒细胞的百分比，可直观展示NET形成的动态过程。加入AKT抑制剂可阻断经PMA或钙离子载体刺激的中性粒细胞的NET形成，表明利用该方法可高通量地检测靶向NET形成的潜在分子。

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Immunology and Infection

免疫学与感染

实时高通量技术量化人中性粒细胞中性粒细胞胞外陷阱的形成

一种体外生成人中性粒细胞胞外诱捕网的技术

本视频展示了利用含有抗中性粒细胞胞质抗体的患者血清，在预标记的中性粒细胞中诱导并可视化中性粒细胞胞外陷阱（NETs）的方法。此外，通过使用不可穿透细胞膜的DNA染料结合荧光显微镜，可实现对NETs的可视化观察。...

预标记中性粒细胞中中性粒细胞胞外诱捕网的诱导与可视化

本文介绍了高通量检测方法，这些方法联合使用可有效定量人中性粒细胞中NET的释放。...

高通量检测人中性粒细胞胞外DNA释放及中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成的定量分析 体外

我们描述了从全血中分离犬中性粒细胞的方法，并利用荧光显微镜观察活体中性粒细胞中NET的形成。同时还介绍了使用免疫荧光显微镜定量NET形成及瓜氨酸化组蛋白H3（citH3）表达的实验方案。...

体外 犬中性粒细胞胞外诱捕网形成：基于荧光显微镜的动态与定量分析

本文介绍了一种生成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的实验方案，以及NETQUANT的操作方法；NETQUANT是一种用于定量免疫荧光图像中NETs的全自动软件工具。...

基于图像的中性粒细胞胞外诱捕网自动化定量分析：采用 NETQUANT 方法

本方案描述了一种高灵敏度、高通量的中性粒细胞胞外诱捕网（NET）检测方法，可通过免疫荧光三维共聚焦显微镜对离体NET的形成进行半自动定量分析。该方案可用于评估不同刺激条件下NET的形成与降解过程，并可用于研究潜在的靶向NET治疗策略。...

一种用于评估和定量中性粒细胞胞外诱捕网形成的高通量检测方法

本文介绍了一种诱导与分析的方法方案 体外...

由微生物和化学刺激物诱导的中性粒细胞胞外诱捕网的形态学与成分分析

本明确的实验方案描述了一种实时高通量显微镜技术，用于在体外可视化并定量人中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的释放。in vitro...

实时、高通量显微定量人中性粒细胞胞外诱捕网释放及拮抗剂药理学评估

中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）是一种重要的先天免疫机制，可抵御致病性细菌、真菌和寄生虫。本文描述了从人血液中分离中性粒细胞并激活其形成NETs的方法。我们还介绍了在光学显微镜和电子显微镜下观察NETs的制备技术。...

中性粒细胞胞外诱捕网：如何产生并可视化观察

本文报道了一种荧光活体显微技术，用于在活体小鼠的血管炎症和血栓形成过程中，可视化活化内皮上血小板与中性粒细胞之间的异型相互作用。该显微技术将有助于研究血管疾病的分子机制，并可在病理生理条件下评估药理学试剂的作用。...

活体小鼠血管炎症和血栓形成过程中活化内皮上血小板-中性粒细胞异型相互作用的实时成像

学习利用双染料活细胞成像技术实时高通量量化人中性粒细胞胞外陷阱（NETs）的形成。该方法通过膜通透性差异实现精准追踪，为炎症性疾病靶向治疗研究提供可靠工具。

实时高通量技术定量人中性粒细胞中性粒细胞胞外诱捕网的形成

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