老年邓金-哈特利豚鼠膝关节内注射后膝关节的微型计算机断层扫描分析

骨关节炎（OA）是一种退行性关节疾病，影响着3250万美国成年人。通常，骨关节炎的症状仅在疾病发展到严重阶段后才出现。由于对引发和推动该疾病发展的机制了解不足，目前尚无能够改变疾病进程的药物。

因此，临床上迫切且持续需要更有效的药物来治疗骨关节炎（OA）。Dunkin-Hartley 豚鼠是一种公认的 OA 动物模型，因其可自然发生该疾病，为研究通过关节内注射给药的新型治疗药物对疾病进展的影响提供了可靠的模型。由于矿化骨在显微CT（micro-CT）上具有良好的对比度，该成像技术可用于评估三维结构特征，并对与 OA 相关的改变进行定量分析。其中两个特别相关的定量指标是骨矿物质密度和骨小梁厚度，二者均随着疾病进展而增加。本文所述的豚鼠关节内注射方法及后续的显微CT数据分析流程，将有助于降低研究中的变异性，并提高数据分析的效率。

使用电动剃须刀剃除膝部毛发。对动物进行麻醉，并通过夹捏脚趾无反应来确认麻醉深度足够。在双眼内放置无菌眼用润滑剂，以防止角膜干燥和损伤。

使用稀释的消毒液和酒精溶液，以环形动作交替擦拭注射部位三次。应使用无菌手套。本视频中包含了使用高压灭菌硝基手套的操作。

整个操作过程中应采用无菌技术。将膝关节屈曲至90度，将手指移至髌骨远端，通过屈伸后肢来定位关节腔远端的沟槽。胫骨可被感知为位于髌骨远端的骨性结构。

确定胫骨和髌骨的位置后，关节即位于二者之间。将胰岛素针头小心地沿中线插入髌骨远端的关节腔内，针头应刺入皮肤下方1至2毫米处。

缓慢注射该体积。通过屈伸关节数次以按摩膝关节，确保药物充分分布。将含甲醛的样本置于相容的容器中。

根据制造商的建议，对微型CT设备进行暗场和亮场曝光校准。使用铝铜滤光片以18微米的分辨率扫描样品。采用0.7度的旋转步进，进行360度扫描，并配合偏移相机。

从微计算机断层扫描（micro-CT）图像中选择一个切片。检查错位补偿。在设置中，应用平滑、束硬化校正、中心旋转校正和环形伪影校正。

选择“开始”以启动重建。选择感兴趣区域（VOI）并调整样本方向，使其垂直对齐，以便后续分析更便捷。将编辑后的感兴趣区域保存为新文件夹。

选择要分析的图像范围，起始于软骨下骨板。建议将软骨下骨板与松质骨的分析分开，因为它们具有不同的骨结构特征。为每幅图像选择感兴趣区域，以确保其包含全部骨组织。

选择二值化分割。调整直方图，使骨组织中的背景完全分离。选择骨矿物质密度标签页。

将数据保存到一个新的分析数据文件夹中。选择自定义处理。首先，进行阈值设定，选择“自动”，然后运行。

然后选择去斑点，并选择去除黑色斑点。重复执行去斑点操作，并选择去除白色斑点。选择三维分析，然后选择基本值和附加值。

A 显示一个解剖后的膝关节，关节腔内可见亚甲蓝染料，表明注射位置正确。B 显示注射过浅，导致皮下组织内形成水疱。C 显示关节腔内无亚甲蓝染料，表明注射位置错误。

将软骨下骨板（如图A所示）和小梁骨（如图B所示）的分析分别进行可能会更有帮助，因为有时它们在不同骨分析中具有不同的参数。在骨密度方面，我们观察到12月龄豚鼠的平均值相较于5月龄豚鼠有所增加，这一趋势在软骨下骨板和小梁骨中均存在，表明骨密度随时间推移而增加。此外，在小梁厚度方面，我们发现12月龄豚鼠相较于9月龄和5月龄豚鼠的小梁厚度（以毫米计）均有所增加，说明小梁厚度也随时间逐渐增加。

随着豚鼠年龄增长，改良Mankin评分逐渐升高，如图A所示。图B至图D显示了甲苯胺蓝染色结果。B为5月龄豚鼠，C为9月龄豚鼠，D为12月龄豚鼠。图C中的黑色星号表示蛋白聚糖丢失，图D中的黑色星号表示裂隙，图D中的白色星号表示细胞稀少。

目前，严重骨关节炎（OA）的唯一治愈方法是关节置换，但该方法成本高昂、具有侵入性，且可能导致患者出现并发症甚至死亡。因此，迫切需要继续利用OA动物模型开展研究，并持续推进新型治疗手段的开发。尽管关节内注射在豚鼠OA研究中至关重要，但该操作流程尚未得到系统性的详细描述。

正确的注射操作对于保障动物福利并减少总体动物使用数量至关重要，尤其是在需要在数月内进行多次注射的研究中。为了系统评估骨关节炎（OA）相关变化，我们介绍了显微计算机断层扫描（micro-CT）分析方法。相较于仅对一两个组织切片进行组织学评估，micro-CT 能对整个样本的扫描数据进行分析，从而提供更为深入的 OA 变化评估。

尽管 Dunkin-Hartley 豚鼠为研究骨关节炎（OA）进展及新型治疗手段的效果提供了可靠的模型，但该模型也存在局限性。与手术或化学诱导OA后快速出现的病理变化相比，自发性模型通常需要更长的研究周期。此外，研究人员可通过在每只动物的一侧肢体施加处理，使对侧肢体作为内部对照，从而降低个体间差异的影响。