Name: 在超短自组装肽基质中制备和表征来自 SW1222 细胞系的结直肠癌类器官 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T13:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 了解超短自组装肽基质中结直肠癌类器官的制备与表征方法。本研究使用SW1222细胞系评估类器官形态、存活率及生物功能化效果，为再生医学提供优化方案。

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本工作由沙特阿拉伯阿卜杜拉国王科技大学提供资金支持。作者感谢由阿卜杜拉国王科技大学创新与经济发展部门授予的KAUST种子基金资助和KAUST创新基金资助。作者谨此感谢阿卜杜拉国王科技大学生物科学与成像核心实验室在生物学表征和显微镜分析方面提供的支持。

1. 缓冲液与溶液的配制
注意：所有列出的浓度均为终浓度。
<ol>
	<li>向Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM）中加入胎牛血清（FBS）和青霉素-链霉素，使其终浓度分别为10%和1%，配制完全IMDM培养基。4 °C避光保存，可保存长达1个月。</li>
	<li>在磷酸盐缓冲液（PBS）中混合MgCl2（3 mM）、蔗糖（300 mM）和Triton X-100（0.5%），配制透化缓冲液。4 °C保存，可保存长达2个月。</li>
	<li>在PBS中加入牛血清白蛋白（BSA，1%）、甘氨酸（0.3 M）和Tween-20（0.1%），配制封闭缓冲液。4 °C保存，可保存长达2个月。</li>
	<li>在无菌条件下，用超纯水将10x PBS稀释至2x PBS。室温保存，可保存6个月以上。</li>
	<li>将3 mg肽粉在紫外线下灭菌30分钟。加入500 µL超纯水，使用涡旋振荡器溶解。 
	注意：最终浓度应为目标浓度的两倍，即6 mg/mL，因为1x浓度为3 mg/mL。</li>
</ol>
在肽中由SW1222制备结直肠癌类器官
<ol>
	<li>在4 °C下过夜解冻一份等分试样，并在使用前保持在冰上，以制备基底膜基质对照。</li>
	<li>在24孔板的每个孔中央加入10 µL的2倍浓度肽溶液。将培养板在室温下孵育10分钟。或者，在6孔板的每个孔中加入8-10滴。 
	注意：用于共聚焦显微镜和电子显微镜的样品，若接种在无菌盖玻片上，则更便于操作。</li>
	<li>加入10 µL的2倍浓度PBS。用移液枪头轻轻混合PBS溶液。让凝胶稳定至少20分钟，确保液滴基本保持完整。 
	注意：添加PBS并轻柔混合的目的是维持液滴的完整性，避免水凝胶扩散成一层。</li>
	<li>使用0.125%胰蛋白酶-EDTA溶液（5 mL）消化SW1222细胞。在37 °C孵育5-10分钟，直至细胞从培养瓶脱落。避免敲击培养瓶，以防细胞结团。</li>
	<li>加入5 mL完全培养基以中和胰蛋白酶活性。使用30 µm细胞筛过滤细胞悬液。或者，使用带有25 G针头的注射器破坏细胞聚集体。</li>
	<li>制备浓度为0.4 × 106 个细胞/mL的细胞悬液，并使用10 µL微量移液器向每个肽液滴中加入2 µL细胞悬液。</li>
	<li>将液滴在37 °C、5% CO2条件下孵育30分钟。孵育后，向每孔加入0.5 mL补充培养基。</li>
	<li>在等待期间，通过使用补充培养基将主储备液（8-12 mg/mL，根据批次而定）稀释至终浓度3 mg/mL，制备基底膜基质对照。向该溶液中加入细胞（每25 µL含800个细胞）。 
	注意：基底膜的操作必须始终在冰上进行。移液枪头在接触水凝胶前必须用预冷的PBS冲洗，否则会在枪头内部发生聚合。</li>
	<li>在每个孔中加入20 µL基底膜溶液液滴。在37 °C孵育20分钟，使液滴形成凝胶。材料凝胶化后，加入0.5 mL完全培养基。</li>
	<li>每3-4天更换一次培养基。从第4天起观察细胞排列并出现腔体形成的迹象。</li>
	<li>在第1天、第4天和第7天进行明场成像，以评估类器官的生长情况。</li>
</ol>
3. 存活率与增殖
<ol>
	<li>为活力检测准备三块黑孔板，为增殖检测准备三块黑孔板。每孔加入 25 µL 的 2x 肽溶液，并用等体积的 2x PBS 进行凝胶化。按上述方法接种细胞。</li>
	<li>为增殖检测板中每种肽水凝胶配方准备三个孔作为空白对照孔。这些孔不接种细胞。</li>
	<li>从活力检测用孔板中移除培养基，并用 1x PBS 洗涤，每次 5 分钟，共洗 3 次。</li>
	<li>从哺乳动物细胞活力/细胞毒性检测试剂盒（见材料表）中将 Calcein-AM 和乙碘化物同型双聚体（ethidium homodimer）稀释至 8 µM，加入同一避光锥形管中。为配制 2 mL 该溶液，在避光锥形管中加入 2 mL PBS、4 µL Calcein-AM 原液和 8 µL Ethidium homodimer-1 原液。</li>
	<li>将步骤 3.4 中配制的 Calcein/乙碘化物同型双聚体溶液加入 96 孔板中，每孔 100 µL。避光并在室温下孵育 30 分钟。</li>
	<li>用 1x PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。使用荧光显微镜观察时，若使用 4x 物镜，则至少拍摄三个视野（中心、上、下）；若使用 10x 或 20x 物镜，则至少拍摄五个视野（中心、左上、右上、左下、右下）。</li>
	<li>从增殖检测用孔板中移除培养基，确保最终体积为 90 µL。</li>
	<li>加入 10 µL Alamar Blue 溶液（见材料表），使其终浓度为 10%。</li>
	<li>避光并在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 2–4 小时。</li>
	<li>使用酶标仪检测荧光（激发/发射 = 530–560/590 nm/nm）或吸光度（570 nm）。对空白孔测得的数值取平均值，并从各含细胞孔的数值中扣除该平均值。</li>
	<li>通过计算每组条件信号的平均值并减去相应空白组的平均值，得到增殖数值。通过生成相对吸光度/荧光信号随时间变化的索引箱线图来绘制图表。</li>
</ol>
4. 细胞对基质的黏附实验
<ol>
	<li>在两个独立的96孔板中分别制备100 µL肽水凝胶。</li>
	<li>在每个孔中接种20,000个细胞，并加入100 µL培养基。将培养板在37 °C、5% CO2条件下孵育90分钟。</li>
	<li>孵育结束后，仅取其中一个培养板，使用P200移液器轻轻重悬培养基20–30秒。注意避免移液枪头接触凝胶，以免破坏水凝胶结构。或者，如果水凝胶的机械性能允许（G' &#62; 8,000 Pa），可通过移动涡旋振荡器轻敲培养板四周。 
	注意：重悬培养基（或使用涡旋振荡器轻敲培养板）可去除未贴壁细胞以及与基质表面黏附较弱的细胞。细胞贴附通常在90分钟内发生，但贴附强度会因特定肽水凝胶及其黏附与结合特性而异。已知结直肠类器官在刚度低于2,000 Pa的基质中生长更佳。因此，由于本方案中使用的水凝胶质地较软且易碎，我们特别强调使用温和的机械应力处理。</li>
	<li>从两个培养板中各移除100 µL培养基，并用1× PBS洗涤一次。</li>
	<li>配制1 µg/mL的DAPI溶液。向所有孔中加入100 µL DAPI溶液，在室温下孵育5分钟。</li>
	<li>在荧光显微镜下拍摄具有代表性的视野图像。确保所有图像均使用相同物镜获取，以保持像素/距离比例恒定。 
	注意：使用10倍物镜时拍摄9个视野，使用20倍物镜时拍摄15个视野。</li>
	<li>将荧光图像导入图像分析软件（例如ImageJ），并对所有图像进行颗粒分析。
	<ol>
		<li>在图像菜单中，选择类型，然后点击8位。</li>
		<li>在图像菜单中，选择调整，然后点击亮度/对比度。点击自动按钮 | 应用。</li>
		<li>在图像菜单中，选择调整，然后点击阈值。点击自动按钮后关闭窗口。</li>
		<li>在分析菜单中，点击分析颗粒。勾选“汇总”选项，然后点击确定。</li>
		<li>在汇总窗口中，将鼠标悬停于文件菜单，点击保存以保存汇总数据。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将所有图像的分析结果导出至标准统计分析软件。</li>
	<li>计算施加应力前后细胞覆盖面积的百分比。以每种条件为分组，绘制覆盖面积百分比的索引箱线图。</li>
</ol>
5. 肽水凝胶中类器官的免疫染色
<ol>
	<li>按照步骤 2.1–2.10 所述，将 800 个细胞接种于 20 µL 肽水凝胶液滴中，培养 4 天。</li>
	<li>第 4 天，吸去培养基，用 1× PBS 洗涤每个孔 2 次。</li>
	<li>加入 400 µL 4% 甲醛溶液，在室温下孵育 30 分钟。</li>
	<li>用 P1000 移除甲醛溶液，并用 1× PBS 洗涤 1 次。</li>
	<li>加入 1 mL 通透缓冲液，在室温下孵育 5 分钟。</li>
	<li>用 P1000 移除通透缓冲液，并用 1× PBS 洗涤 1 次。</li>
	<li>加入 0.5 mL 封闭缓冲液，在室温下孵育 30 分钟。</li>
	<li>用 P1000 移除封闭缓冲液，并用 1× PBS 洗涤。</li>
	<li>根据生产商说明书（见材料表），用封闭缓冲液稀释一抗，将 200 µL 稀释液加入两个孔中。</li>
	<li>在 4 °C 下孵育过夜。</li>
	<li>用 P200 移除染色液，并用 1× PBS 洗涤 1 次。</li>
	<li>根据生产商说明书（见材料表），用封闭缓冲液稀释二抗；在二抗溶液中以 1:40 的比例加入鬼笔环肽偶联物。</li>
	<li>避光，在室温下孵育不超过 3 小时；用 P200 移除染色液，并用 1× PBS 洗涤 1 次。</li>
	<li>用封闭缓冲液配制 1 µg/mL 的 DAPI 溶液，每孔加入 300 µL。</li>
	<li>避光，在室温下孵育 5 分钟。</li>
	<li>用 P200 移除染色液，并用 1× PBS 洗涤 1 次。</li>
	<li>避光，于 4 °C 下保存，最长可保存 7 天。</li>
</ol>
6. 类器官在基质中的成像与图像分析
<ol>
	<li>使用10倍物镜在落射荧光显微镜下对染色样本进行成像。仅使用鬼笔环肽（phalloidin）和DAPI通道。</li>
	<li>打开Cellopose软件，按ctrl + L加载图像。由于软件将访问所选图像所在位置的所有文件，请确保将所有荧光图像保存在相同目录下，且不包含任何子文件夹。</li>
	<li>在分割面板中输入类器官菌落的平均直径，然后按ENTER键。</li>
	<li>选择适用于结肠类器官的自定义模型，然后点击运行模型按钮。 
	注意：此处建议在Cellpose2.0中使用两个从头训练的模型29,30</li>
	<li>按ctrl + s将分割掩膜保存为.npy文件。</li>
	<li>使用键盘方向键浏览文件夹中的图像，并对文件夹内所有图像运行结肠类器官模型。</li>
	<li>复制该文件夹，并使用针对结肠类器官腔的模型重复步骤6.2–6.6。</li>
	<li>打开ImageJ，点击插件 | 宏 | 运行…，运行来自Cellpose GitHub网站的imagej_roi_converter.py文件，并等待窗口出现。</li>
	<li>从结肠类器官文件夹中选择第一个文件，然后点击打开。</li>
	<li>选择与第一个文件对应的seg.npy文件，然后点击打开。 
	注意：ImageJ会将掩膜转换为感兴趣区域（ROI），并将其与相应的荧光图像叠加。</li>
	<li>在ROI管理器窗口中点击全选，然后点击测量。</li>
	<li>在结果窗口中点击文件 | 另存为…，保存测量结果。 
	注意：这将生成一个.csv文件，其中包含视野中每个菌落的所有形态学参数。</li>
	<li>对结肠类器官腔文件夹中的同一图像重复步骤6.8–6.12。</li>
	<li>加载OriginPro软件，按ctrl + 3打开导入向导。点击三个点按钮，选择与同一图像对应的类器官和腔形态参数的两个.csv文件。</li>
	<li>将腔形态参数的结果复制并粘贴到菌落结果相邻的一列中，确保每个腔的测量值与其对应的菌落配对。</li>
	<li>在新列中，将腔的面积除以菌落的面积，得到腔相对于其所在菌落的相对面积。</li>
	<li>选择对应于每个菌落圆形度和腔面积的列，点击绘图 | 基本2D | 散点图。</li>
	<li>在图表窗口中右键单击，选择图表详情。点击质心(PRO)选项卡，勾选显示子集质心点、连接至数据点和显示椭圆选项。</li>
</ol>

Evaluating Biofunctional Self-Assembling Peptides for Cell Adhesion and Morphology

<ol><li>Susapto, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrashort+peptide+bioinks+support+automated+printing+of+large-scale+constructs+assuring+long-term+survival+of+printed+tissue+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Ultrashort peptide bioinks support automated printing of large-scale constructs assuring long-term survival of printed tissue constructs.</a> Nano Letters. 21 (7), 2719-2729 (2021).</li>
<li>Loo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemically+well-defined%2C+self-assembling+3D+substrate+for+long-term+culture+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Bio+Materials%22%5BJournal%5D)">A chemically well-defined, self-assembling 3D substrate for long-term culture of human pluripotent stem cells.</a> ACS Applied Bio Materials. 2 (4), 1406-1412 (2019).</li>
<li>Loo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+proteins+and+peptides+as+scaffolds+for+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Self-assembled proteins and peptides as scaffolds for tissue regeneration.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (16), 2557-2586 (2015).</li>
<li>Loo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+bioink%3A+self-assembling+nanofibrous+scaffolds+for+three-dimensional+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Peptide bioink: self-assembling nanofibrous scaffolds for three-dimensional organotypic cultures.</a> Nano Letters. 15 (10), 6919-6925 (2015).</li>
<li>Ho, B. X., Pek, N. M. Q., Soh, B. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+modeling+using+3D+organoids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Disease modeling using 3D organoids derived from human induced pluripotent stem cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), 936(2018).</li>
<li>Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+based+personalized+medicine%3A+from+bench+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Organoid based personalized medicine: from bench to bedside.</a> Cell Regeneration. 9 (1), 21(2020).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+extracellular+matrix+hydrogels+as+alternatives+to+Matrigel+for+culturing+gastrointestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tissue extracellular matrix hydrogels as alternatives to Matrigel for culturing gastrointestinal organoids.</a> Nature Communications. 13 (1), 1692(2022).</li>
<li>Kaushik, G., Ponnusamy, M. P., Batra, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+current+status+of+three-dimensional+organoids+as+preclinical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: current status of three-dimensional organoids as preclinical models.</a> Stem Cells. 36 (9), 1329-1340 (2018).</li>
<li>Gjorevski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+matrices+for+intestinal+stem+cell+and+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture.</a> Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).</li>
<li>Hauser, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+tri-+to+hexapeptides+self-assemble+in+water+to+amyloid+beta-type+fiber+aggregates+by+unexpected+alpha-helical+intermediate+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Natural tri- to hexapeptides self-assemble in water to amyloid beta-type fiber aggregates by unexpected alpha-helical intermediate structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1361-1366 (2011).</li>
<li>Lakshmanan, A., Zhang, S., Hauser, C. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+self-assembling+peptides+as+building+blocks+for+modern+nanodevices%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Short self-assembling peptides as building blocks for modern nanodevices.</a> Trends in Biotechnology. 30 (3), 155-165 (2012).</li>
<li>Rauf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+tetrameric+peptides+allow+in+situ+3D+bioprinting+under+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Self-assembling tetrameric peptides allow in situ 3D bioprinting under physiological conditions.</a> Journal of Materials Chemistry B. 9 (4), 1069-1081 (2021).</li>
<li>Bilalis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dipeptide-based+photoreactive+instant+glue+for+environmental+and+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Dipeptide-based photoreactive instant glue for environmental and biomedical applications.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 15 (40), 46710-46720 (2023).</li>
<li>Abdelrahman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+mechanical+cues+on+the+metabolomic+and+transcriptomic+profiles+of+human+dermal+fibroblasts+cultured+in+ultrashort+self-assembling+peptide+3D+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">The impact of mechanical cues on the metabolomic and transcriptomic profiles of human dermal fibroblasts cultured in ultrashort self-assembling peptide 3D scaffolds.</a> ACS Nano. 17 (15), 14508-14531 (2023).</li>
<li>Moretti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectively+positioned+catechol+moiety+supports+ultrashort+self-assembling+peptide+hydrogel+adhesion+for+coral+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Selectively positioned catechol moiety supports ultrashort self-assembling peptide hydrogel adhesion for coral restoration.</a> Langmuir. 39 (49), 17903-17920 (2023).</li>
<li>Alhattab, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+a+three-dimensional+bone+marrow+niche-like+acute+myeloid+Leukemia+disease+model+by+an+automated+and+controlled+process+using+a+robotic+multicellular+bioprinting+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+Research%22%5BJournal%5D)">Fabrication of a three-dimensional bone marrow niche-like acute myeloid Leukemia disease model by an automated and controlled process using a robotic multicellular bioprinting system.</a> Biomaterials Research. 27 (1), 111(2023).</li>
<li>Abdelrahman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+mechanical+cues+on+the+metabolomic+and+transcriptomic+profiles+of+human+dermal+fibroblasts+cultured+in+ultrashort+self-assembling+peptide+3D+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">The impact of mechanical cues on the metabolomic and transcriptomic profiles of human dermal fibroblasts cultured in ultrashort self-assembling peptide 3D scaffolds.</a> ACS Nano. 17 (15), 14508-14531 (2023).</li>
<li>Habibi, N., Kamaly, N., Memić, A., Shafiee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+peptide-based+nanostructures%3A+smart+nanomaterials+toward+targeted+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Today%22%5BJournal%5D)">Self-assembled peptide-based nanostructures: smart nanomaterials toward targeted drug delivery.</a> Nano Today. 11 (1), 41-60 (2016).</li>
<li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+osteogenesis+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+by+a+functionalized+silk+fibroin+hydrogel+for+bone+defect+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Enhanced osteogenesis of bone marrow-derived mesenchymal stem cells by a functionalized silk fibroin hydrogel for bone defect repair.</a> Advanced Healthcare Materials. 8 (3), 1801043(2018).</li>
<li>Kisiday, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+peptide+hydrogel+fosters+chondrocyte+extracellular+matrix+production+and+cell+division%3A+implications+for+cartilage+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Self-assembling peptide hydrogel fosters chondrocyte extracellular matrix production and cell division: implications for cartilage tissue repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (15), 9996-10001 (2002).</li>
<li>Hogrebe, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+control+of+matrix+adhesiveness+and+stiffness+within+a+3D+self-assembling+peptide+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Independent control of matrix adhesiveness and stiffness within a 3D self-assembling peptide hydrogel.</a> Acta Biomaterialia. 70, 110-119 (2018).</li>
<li>Wu, F. J., Lin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+self-assembly%2C+and+cell+responses+of+aromatic+IKVAV+peptide+amphiphiles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Synthesis, self-assembly, and cell responses of aromatic IKVAV peptide amphiphiles.</a> Molecules. 27 (13), 4115(2022).</li>
<li>Cringoli, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioadhesive+supramolecular+hydrogel+from+unprotected%2C+short+d%2Cl-peptides+with+Phe-Phe+and+Leu-Asp-Val+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Bioadhesive supramolecular hydrogel from unprotected, short d,l-peptides with Phe-Phe and Leu-Asp-Val motifs.</a> Chemical Communications. 56 (20), 3015-3018 (2020).</li>
<li>Pulat, G. O., Gökmen, O., Çevik, Z. B. Y., Karaman, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+functionalized+self-assembled+peptide+hydrogels+in+in+vitro+vasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Role of functionalized self-assembled peptide hydrogels in in vitro vasculogenesis.</a> Soft Matter. 17 (27), 6616-6626 (2021).</li>
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作者声明无利益冲突。

通过生物功能化，自组装肽（SAPs）在生物医学研究中的巨大潜力得以凸显，其可塑性和适应性为研究提供了广阔空间。面对如此众多的可能组合，如何高效地测试并确定特定应用（尤其是在类器官研究中）最具前景的构型，成为一项挑战，亟需一种快速且经济高效的解决方案。源自人结直肠腺癌的SW1222细胞系，成为此类高强度评估的关键候选模型。本文介绍了一种用于评估和表征在基于肽的基质中生长的类器官的方法。该方案提出了一种整合性强且成本效益高的策略，聚焦于通过细胞活力与增殖评估、黏附实验、形态学分析以及免疫细胞化学等手段对类器官进行监测与分析。在细胞培养实验中选择不同浓度的肽，其背后有严谨的科学依据，旨在契合特定的实验目标，并显著推动我们对肽基质环境下类器官培养机制的理解。我们的研究历程随时间不断演进，因而需要采用多样化的策略来探索不同的配方。首先，我们采用了1.5 mg/mL至4.5 mg/mL范围内的多种肽浓度，目的在于系统性地探究潜在结果的谱系。通过使用较低浓度，我们旨在评估支持类器官生长和发育所需的最低肽浓度，这一信息对于理解低成本、低资源消耗应用的可行性至关重要。相反，选择较高浓度则是为了探究肽浓度的上限及其对类器官行为的潜在影响，从而回答有关饱和效应以及过高肽浓度可能带来的不利影响的问题。
其次，具体实验目标指导了我们的选择。例如，在研究细胞黏附时，采用较高的肽浓度以减少水凝胶在受力条件下的断裂。相反，在关注长期存活率和组织成熟的研究中，则使用较低的肽浓度，以在仍能形成凝胶的前提下达到尽可能低的流变学数值。此外，选择不同的增殖数值是为了展示在类器官培养中，使用相似配方随时间推移所获得的多种生长特征。这种多样化策略的意义在于能够获得一个涵盖广泛条件与结果的综合性数据集。通过考察不同肽浓度对类器官培养的影响，我们可以更深入地理解基质特性与类器官行为之间的复杂相互作用。
初始评估包括在24孔板中通过明场成像对SW1222细胞为期一周的生长过程进行监测。对类器官细胞系的形态学特征和细胞密度进行常规分析是一项标准技术9，本研究已将其应用于该细胞系。该方案的非侵入性特点使得细胞培养过程可被持续观察，从而能够获取每个特定克隆在形态变化和细胞密度方面的关键数据。这一初步分析可为超短自组装肽基质的适用性提供有价值的参考信息。这些观察结果为进一步深入分析奠定了基础，证明了该肽基质可作为支持结直肠癌类器官发育和生长的有效支架。此外，在监测各克隆生长及变化过程中，可能发现一些有趣的现象。例如，在图4中可以观察到，在Matrigel中生长的克隆可能发生相互碰撞，但似乎始终维持着明确的边界。然而，在肽基质中培养的细胞会重新组织肽材料，导致到第7天时，细胞的位置已不再与最初完全相同。如果将本方案应用于可标记并追踪类器官生长的自动化系统，这一点需特别注意。
后续检测包括使用基于钙黄绿素（calcein）和碘化乙啶同源二聚体（ethidium homodimer）的活力检测方法来评估细胞活力和增殖情况。该活力检测可提供活细胞与死细胞群体之间的定性信息。增殖检测则可提供有关细胞代谢状态的定量信息，用于评估细胞分裂情况31。这些是细胞培养中广泛使用的标准检测方法，可总体反映细胞的增殖状态。尽管自组装肽（SAP）基质已被充分证明具有良好的生物相容性，但类器官在次优培养条件下（包括其所嵌入的基质）常表现出活力下降。此外，肽基质的力学性能也会影响细胞活力。若基质过于坚硬或刚性，可能对细胞造成机械应力，进而导致细胞损伤；反之，若基质过于柔软或不稳定，则可能无法为细胞黏附和存活提供足够的支撑。同时，肽中所含的生物活性基序或功能基团可能与特定细胞受体或信号通路相互作用，从而引发细胞死亡。因此，持续监测细胞活力和增殖状态至关重要。
在早期研究中25，肽1和肽2诱导的细胞死亡水平与Matrigel相比相似（图5）。然而，在不同浓度的母体肽中，细胞增殖曲线出现了波动。值得注意的是，从第4天到第7天，细胞增殖速率保持稳定而非上升，提示细胞可能进入了一个活性较低的阶段。此外，第4天至第7天之间观察到的细胞活力变化也相对稳定，暗示细胞的生长与增殖可能已达到潜在的平台期。
为了进行评估和表征，我们采用了一种适用于三维培养的黏附实验方法，该方法依赖机械应力来评估细胞脱离效应32。诱导机械应力的方法应根据水凝胶的力学特性进行选择。该方法的有效性本质上取决于所选的模型系统，所得结果的解释也依赖于该系统对生物学背景的模拟程度。黏附特性和类器官特征的变异性可能源于多种物理和化学相互作用，这些相互作用可能受到水凝胶成分以及纳米纤维黏附性能等因素的影响。这些因素可能会影响我们研究结果的普适性33。然而，如果读者将本方案应用于更坚硬或延展性更高的水凝胶，建议采用更为强健的施加应力方法。
我们利用该技术评估了生物功能基序为SAP提供的整体黏附性（图6）。我们观察到两种现象。首先，这些肽表现出不同的初始黏附特性。具体而言，IKVAV基序以及含有高浓度生物功能化肽的水凝胶能够在其表面面积超过40%的区域上黏附细胞。其次，在施加诱导应力后，某些肽出现了显著的黏附细胞丢失现象。值得注意的是，含有高浓度非生物功能化肽的肽段具有相对较高的细胞保留能力。因此，IKVAV配体与SAP为细胞在基质上的黏附提供了不同类型的黏附作用。该方法有助于发现黏附模式，并阐明材料的黏附机制。此外，还可采用其他技术，例如利用原子力显微镜测量黏附性，该技术可在纳米尺度上探测探针尖端与样品表面之间的黏附力，从而提供有关材料和生物样品黏附特性的宝贵信息。
通过评估类器官在不同肽材料水凝胶中生长后的集落圆形度及相对管腔面积，来检验这些肽材料诱导类器官形成的能力。圆形度用于描述物体的圆整程度或形状特征。在类器官研究中，圆形度可用于评价其结构的形态学特征与对称性。已有多个研究提及类器官呈现圆形形态。例如，乳腺癌类器官通常具有高度规则的圆形形态，并伴有绳索状的基底外侧边缘34。这表明圆形度可作为评估类器官形状的一个参数。管腔大小指的是类器官内部的中央腔隙或空间，是反映类器官分化与成熟程度的重要特征。在分化过程中，类器官的管腔尺寸会减小，同时上皮层厚度增加35。这说明管腔大小可作为判断类器官发育阶段的指标。对圆形度和管腔大小的评估可提供有关类器官结构与功能特征的重要信息。具有清晰界定管腔的圆形类器官更接近天然组织的结构架构，能够更真实地模拟器官功能36。
这些特性可通过获取先前染色样本的细胞骨架和细胞核的荧光图像进行评估。使用 Cellpose 对图像进行分割，并利用 ImageJ 获取所得掩膜的形态学测量数据。对培养 4 天后的细胞骨架染色样本进行形态学分析，进一步揭示了类器官的特征。类似的方法主要基于明场成像，已用于通过形态分析及图像分析确定类器官对其环境的响应及其特性36,37,38。最后，我们采用免疫细胞化学方法，利用多种极性标志物评估细胞极性。值得注意的是，使用肽水凝胶可减少样本操作步骤，因为无需去除基质或回收类器官39。
该方法的重要性在于，相比于其他动物来源的基质，生物功能化自组装多肽（SAP）水凝胶具有更高的多功能性，可用于开发将多肽水凝胶转化为类器官培养基质的技术。与Matrigel或胶原蛋白等传统基质相比，超短自组装多肽基质展现出诸多优势。首先，多肽基质具有更优异的可重复性，因为多肽序列可以精确控制并合成，从而确保不同批次间性能的一致性40。此外，该基质在力学性能和抗降解性方面表现出高度稳定性，能够长期维持结构完整性，为类器官生长提供稳定的微环境41。进一步地，超短多肽基质能够实现对微环境的精确调控和精细优化。通过修饰多肽序列，可引入特定的生物活性基序或功能基团，从而为细胞分化提供所需的信号刺激42。
总之，该方法的意义在于其有望为设计用于促进类器官培养的多肽基水凝胶提供理论依据。通过系统评估细胞行为，本方案有助于筛选出可优化类器官生长的潜在多肽组合。这些研究发现有望拓展至更广泛的研究领域，推动基于类器官的研究及再生医学方法的发展。

近年来，自组装肽（SAPs）已成为组织工程应用中极具前景的生物材料。SAPs具有独特的性质，包括可自发形成纳米纤维、良好的生物相容性、可生物降解性以及无免疫原性，使其成为支架开发的理想候选材料1。此前，SAPs已与多种细胞联合使用，特别是已有报道的超短自组装肽能够实现干细胞的包封，同时在超过30代的长期培养过程中维持其多能性，且染色体异常的发生率极低2,3,4。因此，将SAPs应用于类器官培养成为一项合理的后续发展方向。
类器官是由单个多能细胞发育而来的复杂三维结构。这些结构可分化为多种细胞类型，并通过自我组织模拟胚胎和组织发育过程。 体外5这一创新性框架已发展成为一种强大的工具，用于 体外 研究，高效地保存了特征性的遗传、表型和行为特征 在体 器官6然而，类器官研究从实验室向临床转化的一个主要障碍在于其可重复性的需求。7结果的差异主要归因于难以将人多能干细胞完全分化为特定的细胞谱系，加之类器官模型中缺乏真实的组织结构以及固有的复杂性。随着基于干细胞和类器官的研究日益流行8，对于具有动态力学性能和类似整合素的黏附位点的生物材料，或具有可控降解性的支架，其需求日益增加7,9这些特性可以通过战略性地利用生物功能化自组装多肽（SAPs）进行有效调控。
自组装肽（SAPs）是一类较短的氨基酸序列，具有自发组织成明确定义结构的内在能力10。这些肽通常含有交替排列的疏水性和亲水性残基，通过非共价相互作用（包括氢键、静电相互作用和疏水效应）驱动其自组装过程11,12。这些肽的自组装过程主要由系统自由能最小化的需要所驱动。在水环境中，疏水残基倾向于聚集在一起以减少与水的接触，而亲水残基则与周围的水分子相互作用。这一现象导致多种纳米结构的形成。在此情况下，超短自组装肽会形成纳米纤维，其特性取决于肽序列和环境条件2,12,13,14,15,16。这些肽采用β-转角构象，单个肽链彼此平行或反平行排列，并通过氢键稳定（图1）。阳离子的存在可加速导致纳米纤维形成的自组装过程。
多肽纳米纤维被证实具有天然截留大量水分的能力。这一特性有助于形成水凝胶，进而构建出一种生物相容且可生物降解的三维空间，有利于细胞的增殖与生长。这些自组装多肽纳米纤维精细地模拟了天然细胞外基质（ECM）环境固有的拓扑结构1。这种相似性为细胞提供了仿生生理环境，进一步促进细胞的最佳生理活动17。此外，这些多肽具有高度的可调变性4，通过改变多肽序列，可调节基质的硬度、凝胶动力学和孔隙率等特性。因此，自组装多肽（SAPs）已成为现代生物材料科学中的关键组分，广泛用作组织再生和细胞培养的支架材料13,17。
自组装肽的一个关键优势在于其能够在分子水平上轻松合成和修饰。这一优势使得特定的功能基团或生物活性基序能够被引入肽序列中，从而设计出具有定制特性和功能的肽18,19,20（图1B）。例如，可设计经生物功能化的SAP以模拟细胞外基质（ECM），并通过RGD肽促进细胞分化19,21。已有报道表明，肽Ben-IKVAV因其配体特异性基序可显著提高神经元特异性标志物的表达水平22。这些肽还可被改造以展示生物活性分子，如整合素结合肽，从而增强细胞存活能力23。最后，其他一些经生物功能化的SAP已被开发用于促进血管生成，其结构中包含了IKVAV和YIGSR基序24。
先前发表的研究报道了生物功能化的自组装肽（SAP），表明可通过加入衍生出该生物功能化SAP的原始肽段，进一步修饰其自组装特性25。这些SAP混合物还可提供多种SAP配方，其生化活性和理化性质各不相同。例如，两亲性肽IIFK是一种超短自组装肽，可耐受多种功能基序的生物功能化修饰，其中以引入IKVAV基序为例（图1B）。这两种肽段无论单独存在或共同存在时，均可形成纳米纤维。每种配方均能形成具有不同物理特性的水凝胶（图2）
然而，由于自组装肽（SAPs）生物功能化后可能产生大量排列组合和替代方案，因此需要提供一种快速且经济高效的类器官检测方法。SW1222细胞系是进行此类高通量、低成本类器官评估的候选之一，该细胞系来源于人结直肠腺癌26,27。SW1222细胞具有聚集形成类似类器官的三维结构的特性，使其成为研究组织发育和再生医学应用的理想模型。已发现SW1222细胞能够生成类器官，这归因于其内在高表达LGR5基因27。此前已有研究充分证实，单个LGR5+干细胞可形成类器官，同时SW1222细胞也表现出形成结直肠癌类器官形态特征的倾向28。
在本方法学论文中，我们介绍了利用SW1222细胞评估和表征多种生物功能肽对细胞黏附和管腔形成影响的详细实验方案（图3）。通过提供逐步操作流程和成像分析方法，我们希望为类器官的生物制造以及简化自组装肽基质在类器官培养中的评价提供有价值的参考。

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>6孔板，经组织培养处理</td><td>Corning</td><td>07-200-83</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS，无钙，无镁</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>16% 甲醛（w/v），无甲醇</td><td>Thermo Scientific</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>24孔板，经组织培养处理</td><td>Corning</td><td>09-761-146</td><td></td></tr><tr><td>96孔黑色板，经组织培养处理</td><td>Corning</td><td>07-200-565</td><td></td></tr><tr><td>alamarBlue 细胞活力检测试剂</td><td>Invitrogen</td><td>DAL1025</td><td></td></tr><tr><td>抗Ezrin抗体，兔单克隆</td><td>Abcam</td><td>ab40839</td><td>二抗使用：抗兔DyLight 633</td></tr><tr><td>抗pan-Cadherin抗体，兔多克隆</td><td>Abcam</td><td>ab16505</td><td>二抗使用：抗兔Alexa 488</td></tr><tr><td>抗ZO1紧密连接抗体，山羊多克隆</td><td>Abcam</td><td>ab190085</td><td>二抗使用：抗山羊Alexa 488</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Cellpose 2.0</td><td>NA</td><td>NA</td><td>从 https://github.com/MouseLand/cellpose 获取</td></tr><tr><td>配备Airyscan的共聚焦激光扫描显微镜</td><td>ZEISS</td><td>LSM 880</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>驴抗山羊IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 488标记</td><td>Invitrogen</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Cytiva</td><td>GE17-1323-01</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG（H+L）二抗，Alexa Fluor 488标记</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG（H+L）二抗，DyLight 633标记</td><td>Invitrogen</td><td>35562</td><td></td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清（HI FBS）</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 1.54f</td><td>NIH</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>12440079</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 细胞活力/细胞毒性检测试剂盒（适用于哺乳动物细胞）</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁六水合物（MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 6 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>类器官培养用Matrigel，无酚红</td><td>Corning</td><td>356255</td><td>文中简称为Matrigel或基底膜基质。</td></tr><tr><td>明场显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EVOS显微镜</td><td>Thermo Scientific</td><td>EVOS M7000</td><td></td></tr><tr><td>OriginPro 2023 (64位) 10.0.0.154</td><td>OriginLab Corp</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>肽P（Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, NH2）</td><td>实验室自制</td><td>NA</td><td>可由Bachem等多肽制造商定制合成。</td></tr><tr><td>肽P1（Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Arg, Gly, Asp, Ser, NH2）</td><td>实验室自制</td><td>NA</td><td>可由Bachem等多肽制造商定制合成。</td></tr><tr><td>肽P2（Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Ile, Lys, Val, Ala, Val, NH2）</td><td>实验室自制</td><td>NA</td><td>可由Bachem等多肽制造商定制合成。</td></tr><tr><td>罗丹明鬼笔环肽</td><td>Invitrogen</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>圆形盖玻片，直径10 mm</td><td>VWR</td><td>631-0170</td><td></td></tr><tr><td>扫描电子显微镜</td><td>Thermo Fisher - FEI</td><td>TENEO VS</td><td></td></tr><tr><td>无菌30 &amp;mu;m滤网</td><td>Sysmex</td><td>04-004-2326</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1888</td><td></td></tr><tr><td>SW1222细胞系</td><td>ECACC</td><td>12022910</td><td></td></tr><tr><td>吐温-100</td><td>Thermo Scientific</td><td>85111</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>吐温20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure水</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr></tbody></table>

利用超短自组装肽基质从sw1222细胞系构建和表征结直肠癌类器官

关键词：类器官，结直肠癌，sw1222细胞系，自组装肽，三维细胞培养，肿瘤模型，细胞外基质，癌症研究

Fabrication and Characterization of Colorectal Cancer Organoids from SW1222 Cell Line in Ultrashort Self&#45;Assembling Peptide Matrix

超短自组装肽（SAPs）可自发形成类似于细胞外基质的纳米纤维。这些纤维能够形成具有生物相容性、可生物降解且无免疫原性的水凝胶。我们先前已证实，当SAPs被蛋白来源的基序进行生物功能化修饰后，可模拟支持结直肠类器官形成的细胞外基质特性。这些生物功能化肽水凝胶在保留原始母体肽的力学性能、可调控性和可打印性的同时，引入了促进细胞-基质相互作用的信号，从而增强细胞黏附。本文提供了利用一种可高效形成结直肠癌类器官的腺癌细胞系，评估和表征多种生物功能化肽水凝胶对细胞黏附和管腔形成影响的实验方案。这些方案将通过免疫染色和荧光图像分析，帮助评估生物功能化肽水凝胶对细胞黏附及管腔结构形成的作用。本研究中所使用的细胞系此前已被用于在动物来源基质中生成类器官。

首先，我们通过明场成像评估了在24孔板中培养7天的细胞。在培养的一周内，我们观察到细胞逐渐聚集成类器官的小细胞簇，如图4所示。采用受控扫描方法可追踪不同天数之间细胞和类器官的移动情况。总体而言，我们观察了整个一周内细胞形态的演变过程。SW1222来源的类器官应呈现圆形形态和较明亮的外观。较暗的外观则提示细胞密度过高，属于不理想状态，如使用多肽P培养的部分克隆在第7天所见（图4）。
图5展示了细胞活力（图5A）和增殖实验（图5B）的结果，分别反映了死细胞与活细胞的数量以及代谢活性。本研究采用基于钙黄绿素和碘化乙啶同源二聚体的细胞活力检测方法，发现在Matrigel中培养至第7天时，这些细胞中仅有少量死细胞。这一现象在所有基于多肽的水凝胶中也均存在，但在2D培养中未观察到。增殖实验结果显示，从第1天到第7天，代谢活性总体上升。此外，我们发现多种条件下在第4天至第7天期间代谢活性略有下降。该现象与活力检测中观察到的死细胞数量增加相一致（图5A）。
为了初步评估细胞与多肽水凝胶生物功能化之间的相互作用，我们进行了基于机械应力诱导细胞脱离的黏附实验。如图6所示，使用不同浓度的生物功能多肽P2显著影响了脱离过程前后所保留的细胞数量。本实验中，我们采用仅包含多肽P2生物功能基序的多肽作为阳性对照，同时使用非生物功能多肽P作为阴性对照。从图中可以看出，在多肽P中接种的细胞初始黏附率较低，且保留率也较低。此外，生物功能多肽P2比例的变化与应力后保留细胞数量呈相关性。因此，通过该实验可得出结论：P2多肽影响了细胞黏附，这种影响可能由生物功能基序介导，也可能并非由其驱动，但与混合物中生物功能多肽的含量相关。
接着，我们研究了基质对所构建类器官的影响。通过对接种培养4天的细胞骨架染色样本进行形态学分析，评估了细胞集落的圆度以及腔室大小相对于集落大小的相对面积。数据点在x轴和y轴上呈现出特定的分布模式，每种实验条件下均有一个代表圆度和相对腔室面积特定值的中心点。图7显示，在2D培养条件下的细胞集落圆度具有很高的变异性。相比之下，在Matrigel中培养的细胞在腔室相对大小上表现出更广泛的分布。
有趣的是，所有含肽水凝胶的质心值位置非常相似。然而，数据点之间的距离显示出不同的分布特征。例如，在三种肽水凝胶中，P3肽的分布范围较小，而来自非生物功能性肽P的数据点则表现出更大的分布范围。这些数据表明，含有P1和P3的两种水凝胶均有潜力被优化用于类器官培养。
最后，我们通过免疫细胞化学方法检测了标记顶端结构的ZO-1和ezrin的样本，评估了特定标志物的表达情况。这些标志物可用于评估每个类器官内细胞的极化状态。我们还检测了泛钙黏蛋白标志物以观察细胞间连接，并使用细胞骨架特异性标志物（鬼笔环肽）来显示管腔结构。图8A展示了在第4天和第7天时，非生物功能化肽P、生物功能化肽P1以及Matrigel中培养的类器官。ZO-1和ezrin标志物应定位于类器官的顶端膜和基底外侧膜；若细胞极化正常，则在第4天即可在管腔区域附近观察到这两种分子的表达，否则该表达不可见。事实上，如图8所示，在Matrigel中培养的类器官中，ZO-1和ezrin标志物定位于顶端膜。有趣的是，在非生物功能化肽P中，ezrin标志物几乎不可见。据此我们推断，细胞极化效率低下导致了肽P中这些分子的表达水平较低。
此外，细胞核在多肽水凝胶中的分布往往不规则，而包埋在Matrigel中的类器官则形成单层且不对称的细胞核排列。这种描述符合结直肠类器官的理想形态；然而，尽管在多肽水凝胶中细胞核的取向并非完全不对称，但在非生物功能化多肽P中主要观察到具有多层细胞核的更致密的克隆。相比之下，细胞间连接必须垂直定位于顶膜和基底外侧膜（图8B）。该标志物使我们能够观察到克隆内所有细胞的边缘。在Matrigel中培养至第7天时，细胞的泛钙黏蛋白（细胞间连接）呈现出近乎完美的放射状分布。相反，非极性化的克隆（如多肽P中的克隆）则表现出细胞排列紊乱，并且在基底膜和顶膜附近出现细胞间连接的表达。
<img alt="通过纳米纤维组装形成水凝胶；肽序列示意图；生物合成过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：自组装超短肽形成纳米纤维。（A）脂肪族超短肽自组装过程示意图。（B）与IKVAV配体生物功能化的超短SAP IIFK的化学结构。该图改编自Loo等人的研究4。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="多肽凝胶化；化学结构；凝胶化结果；显微镜图像；光谱学，图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：多肽的结构与性质。（A）母体多肽 IIFK 和生物功能多肽 P2 的化学结构如图所示。（B）倒置小瓶实验结果揭示了临界凝胶浓度（CGC）和凝胶化时间的差异。P2 形成半透明凝胶，其 CGC 高于母体多肽 IIFK。值得注意的是，IIFK:P2（1:1）混合物的 CGC 更高，凝胶化时间比单独的任一多肽更长。（C）扫描电子显微图像提供了 IIFK、P2 及 IIFK:P2（1:1）混合物结构特征的直观信息。（D）原子力显微镜高度形貌图像展示了在 8 mM 浓度下凝胶化多肽的表面特征，提供了其表面结构的详细视图。（E）圆二色光谱揭示了 IIFK:P2 混合物在不同浓度下的构象变化，阐明了其二级结构的改变。（F）流变学分析测量了不同浓度下凝胶化多肽的刚度，为其机械性能提供了有价值的见解。本图引自 Perez-Pedroza 等人25。比例尺 = 1 µm（C），200 nm（D）。缩写：CGC = 临界凝胶浓度。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="多肽凝胶化过程示意图：多肽溶液制备、液滴凝胶化、细胞接种、培养基添加。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图3：示意图展示用于类器官构建及在多肽水凝胶中通过活性、黏附性、类器官形成能力与免疫染色进行表征的多肽制备与细胞接种过程。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="7天内Matrigel、Peptide P和Peptide P1中的细胞生长；显微镜实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图4：SW1222细胞在标记为P和P1的多肽水凝胶中培养，并与Matrigel对照组进行比较的明场显微镜图像。 有趣的是，培养在多肽水凝胶中的类器官到第7天主要呈现出球形形态。相比之下，位于Matrigel中的类器官表现出较低的细胞密度，这可通过其明亮的结构体现，而自组装多肽（SAP）中培养的类器官结构则较暗（黑色箭头所示）。然而，Matrigel中的类器官相邻克隆之间表现出明显的聚集现象。此外，细胞在Matrigel环境中的迁移能力明显减弱。比例尺 = 650 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="三维基质和二维条件下细胞增殖的荧光显微镜图像，以及7天内的柱状图分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图5：SW1222细胞在不同浓度生物功能化SAP中的活力与增殖检测。（A）在生物功能化肽P1和P2中培养的细胞活力评估，与Matrigel及二维培养条件进行比较。（B）在非生物功能化肽P1和生物功能化肽P2中培养的细胞增殖评估，与Matrigel及二维对照组进行比较。在此，活/死细胞染色实验显示，细胞在Matrigel中的行为与之相似。在多种条件下均观察到死细胞略有增加（黄色箭头），主要出现在Matrigel组。在增殖方面，趋势随肽的类型和浓度而异，但总体呈现正向趋势。比例尺 = 250 µm。本图改编自Perez-Pedroza等人的研究25。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜图像和柱状图展示了IKAV和P2化合物对面积覆盖率（%）的影响。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：多肽对脱落细胞数量的影响。（A）使用DAPI染色的细胞在机械应力前后荧光图像。本实验中使用了多肽P、修饰后的多肽P2以及IKVAV基序。（B）通过ImageJ测量覆盖面积来确定细胞黏附的变化。比较分析显示，经生物功能化修饰的多肽P2相较于非生物功能化多肽P具有更强的细胞滞留能力。比例尺 = 100 µm。本图改编自Perez-Pedroza等人的研究25。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="腔面积与类器官圆形度关系图（2D、P1、Matrigel）；数据比较与统计分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 7"> 
图7：通过腔相对面积与圆形度的质心计算评估类器官形成能力。 不同处理组的数据质心和离散程度存在差异。如预期所示，表现最差的是2D条件，其圆形度值分布范围广泛，且腔的相对面积最低。Matrigel不仅具有最高的圆形度，还形成了最大的腔。肽类条件在这两个参数上的数值略有差异，其中P3条件的数据变异最小。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞培养荧光显微镜；ZO1、Ezrin、DAPI、Phalloidin、Cadherin；第4天、第7天；生物材料支架比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 8"> 
图8：类器官在第4天和第7天针对多种标志物的共聚焦显微镜图像。（A）使用ZO-1（绿色）、ezrin（红色）和DAPI（蓝色）标志物检测类器官内细胞的顶膜分布。如Matrigel对照组所示，这些分子通常定位于顶膜和基底外侧膜。非生物功能肽P仅在第7天显示出这些分子的表达。（B）使用泛-cadherin（绿色）抗体染色细胞间连接标志物，其应垂直于类器官的基底外侧膜和顶膜。细胞核（蓝色）和细胞骨架（红色）用作复染。与另外两种处理（P3和Matrigel）相反，非生物功能肽P诱导了基底外侧膜上的细胞间连接表达。比例尺 = 100 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本实验方案旨在通过免疫染色评估生物功能化自组装肽在细胞黏附、类器官形态及基因表达方面的作用。我们将使用结直肠癌细胞系，以提供一种经济高效的方法来获取用于高强度检测的类器官。

利用超短自组装肽基质从SW1222细胞系构建和表征结直肠癌类器官

关键词：类器官，结直肠癌，SW1222细胞系，自组装肽，三维细胞培养，肿瘤模型，细胞外基质，癌症研究

超短自组装肽（SAPs）可自发形成类似细胞外基质的纳米纤维。这些纤维能够支持……

本研究旨在评估超短自组装肽作为结直肠癌类器官培养基质的应用。我们探讨了类器官形态与存活率、增殖能力、黏附特性以及生物功能化影响相关的问题。目标是优化肽基质的组成，以实现有效的类器官生长，并为再生医学做出贡献。本领域的前沿技术包括用于精确有机制造的3D生物打印、用于动态培养环境的微流控平台，以及原子力显微镜和多光子显微镜等先进成像工具。CRISPR-Cas9基因编辑技术可实现精准的遗传修饰，而单细胞RNA测序则提供深入的分子层面洞察。当前的实验挑战主要包括提高类器官的可重复性、优化大尺寸结构的血管化，以及模拟复杂的组织架构。克服长期培养中的这些局限性，并将免疫组分整合到模型中，是当前活跃的研究方向。建立标准化操作流程以及解决伦理问题，仍是该领域持续面临的挑战。本领域的重要发现包括证实超短自组装肽适用于类器官培养。我们已展示了这些多肽的多功能性、可重复性和稳定性，为微环境的精细调控提供了一个平台。这有助于推动基于类器官的研究、再生医学以及生物功能化水凝胶研究的发展。本实验方案通过提供一种系统性方法来评估超短自组装多肽基质中的类器官，填补了该领域的研究空白。该方法针对在这些基质中评估细胞行为所需的标准方法，有助于合理设计基于肽的水凝胶以实现类器官的最佳生长，并推动再生医学研究。首先，将20微升（10 µL）的2倍浓度肽溶液滴加到24孔板各孔的中央。孵育后，向每孔加入10微升（10 µL）的2倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS）。用移液枪枪头轻轻混合溶液。让凝胶液滴稳定至少20分钟，确保液滴保持完整。接着，将2.5毫升0.0125%胰蛋白酶-EDTA加入含有两百万个SW1222人结直肠腺癌细胞的培养瓶中。将细胞在37摄氏度下与胰蛋白酶孵育5至10分钟，直至其从培养瓶上脱落。加入5毫升完全培养基以灭活胰蛋白酶。然后使用30微米细胞筛过滤细胞悬液。使用10微升微量移液器，向每个肽液滴中加入2微升细胞悬液。将SW1222细胞系的800个细胞接种至每个孔中，培养四天。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育液滴30分钟。然后向每个孔中加入 0.5 毫升的完全培养基。制备对照时，用完全培养基稀释基底膜基质对照储备液。将细胞悬液加入稀释后的基底膜溶液中。用移液器将20微升稀释的基底膜基质加入含细胞的每个孔中。在37摄氏度下孵育细胞20分钟。待液滴凝固后，加入0.5毫升完全培养基。在第1天、第4天和第7天使用明场显微镜对细胞进行成像，以评估类器官的生长情况。细胞培养一周后的明场成像显示，小的细胞簇正在组装形成类器官。在多肽水凝胶中培养的SW1222来源类器官呈圆形形态，外观较亮。颜色较深的外观表明密度过高，这是不理想的，如第七天肽 P 中菌落所见。首先，将 20 µL 肽水凝胶液滴移入 24 孔板中。将 SW1222 细胞系的 800 个细胞接种至每个孔中，培养四天。第4天，用移液器吸出培养基。用PBS洗涤每个孔两次。然后向孔中加入400微升4%甲醛溶液。孵育完成后，使用 P-1000 移液器吸头吸除甲醛溶液。随后用 PBS 再洗涤一次孔板。将细胞在 1 毫升破膜缓冲液中于室温孵育 30 分钟。吸出缓冲液并用 PBS 洗涤孔板后，加入 0.5 毫升封闭缓冲液。随后去除封闭缓冲液，再用 PBS 洗涤孔板。然后向孔板中加入 200 微升稀释后的一抗溶液。将培养板在4°C下孵育过夜。使用P-200移液枪头吸除溶液，然后用PBS溶液洗涤各孔。接下来，按1:40的比例将鬼笔环肽偶联物加入已稀释的二抗小管中。用移液器将此混合液加入到板的各孔中。然后在避光条件下于室温孵育三小时。吸出溶液并用 PBS 洗涤孔板后，每孔加入 300 微升 DAPI 溶液。孵育后，吸出溶液，再次用 PBS 洗涤孔板。将孔板置于 4 摄氏度保存，最长可保存 7 天。免疫染色显示，在非生物功能化肽P、生物功能化肽P1和Matrigel中发现的类器官均定位于顶膜和基底外侧膜。非生物功能化肽P可诱导基底外侧膜处的细胞间连接表达。首先，使用10倍物镜的落射荧光显微镜对SW1222来源的类器官染色样本进行成像。仅使用 RHOD 和 DAPI 通道。启动 ImageJ 软件，依次点击 Plugin（插件）、Macros（宏），然后运行来自 CellPose GitHub 网站的 imagej_roi_converter.py 文件。当窗口出现时，从结肠类器官文件夹中选择第一个文件，然后单击“打开”。接着选择与该文件对应的 seg.npy 文件，然后单击“打开”。接下来，在 ROI 管理器窗口中点击“全选”，然后点击“测量”。随后在结果窗口中依次点击“文件”→“另存为”，以保存结果。对文件夹中结肠类器官管腔的同一图像重复上述图像转换操作。然后加载 OriginPro 软件。点击“数据”（Data），接着选择“导入文件”（Import File）以找到导入向导。选择与同一图像对应的类器官和管腔形状特征的两个 CSV 文件。将管腔形状的属性复制到菌落结果列中，以将每个管腔测量值与其对应的菌落配对。在新列中，将管腔面积除以菌落面积，得到相应菌落的相对管腔面积。选择对应于每个菌落圆形度的列以及管腔面积的列。然后依次点击“绘图”、“基础2D图”和“散点图”。右键单击绘图窗口，选择“绘图细节”。点击“质心图”选项卡，选中“显示子集的质心点”、“连接至数据点”和“显示椭圆”选项。在二维培养的细胞中，克隆的圆形度表现出很高的变异性。在Matrigel中培养的细胞，其管腔相对大小的分布更为广泛。

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科研

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生物工程

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