Name: 使用腺相关病毒 （AAV） 和 2 细胞胚胎电穿孔对大鼠胚胎进行 CRISPR-Cas9 基因组编辑 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-15T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: 学习利用腺相关病毒（AAV）和2细胞胚胎电穿孔技术对大鼠胚胎进行CRISPR-Cas9基因组编辑的方法。该技术通过同源定向修复实现高效基因敲入，为神经科学和遗传工程研究提供优化的动物模型制备方案。

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作者谨此感谢 Nolan Davis 在视频拍摄和视频编辑方面提供的协助。

所有实验程序均经密苏里大学机构动物护理和使用委员会批准（ACUC方案编号#25580），并依照《实验动物护理和使用指南》中规定的原则进行。
1. 腺相关病毒介导的DNA修复模板递送
<ol>
	<li>设计DNA载体，使目标敲入序列位于两个同源臂之间。典型的同源臂长度为300-500 bp。通过将载体克隆至合适的质粒骨架中，并包装成重组单链AAV1或单链AAV6（血清型1或6），确保整个DNA修复模板（同源臂 + 目标敲入序列）两侧均被反向末端重复序列（ITRs）所包围。 
	注意：如果DNA修复模板中包含sgRNA靶序列，必须引入沉默突变以破坏该序列，从而防止CRISPR-Cas9对已正确靶向的等位基因进行再次编辑。 
	警告：重组AAV病毒载体为非整合型，属于生物安全等级1级（BSL-1）。对接触过病毒的胚胎进行移液和操作时，应采用标准的无菌技术。</li>
	<li>将携带DNA修复模板的工程化单链AAV1或单链AAV6加入35 mm培养皿中含矿物油的30 µL KSOM-R培养基中，终浓度为3 × 107 基因组拷贝（GC）/µL。27,28</li>
	<li>将可见原核的受精卵移入含有工程化单链AAV的KSOM-R培养基中。 
	注意：采用本方案时无需对透明带进行薄化处理，因为AAV血清型1和6可高效穿透透明带，实现DNA修复模板的有效递送。</li>
	<li>在37 °C、5% CO2及最大湿度条件下孵育18-20小时，以确保充分的病毒感染与转导。</li>
</ol>
2. 电穿孔准备
<ol>
	<li>次日，在无菌无RNase的离心管中配制电穿孔混合液，其中包含浓度为100 ng/µL的sgRNA和浓度为100 ng/µL的Cas9蛋白，用Opti-MEM培养基稀释，轻轻混匀。</li>
	<li>室温孵育10分钟，以促进RNP复合物的形成。</li>
	<li>孵育期间，打开电穿孔仪，并将导线连接至间距为1.5 mm的玻璃滑片电极。</li>
	<li>按照表1中所述设置电穿孔参数。</li>
</ol>
3. 二细胞胚胎电穿孔
<ol>
	<li>轻柔吹打 5 µL 将CRISPR电穿孔混合液加样至载玻片上两个电极之间，注意避免在溶液中引入气泡。</li>
	<li>将2细胞期胚胎从AAV溶液中取出。将2细胞期胚胎排列在混合液中，避免其接触电极的侧壁，以防止细胞裂解。</li>
	<li>按压 欧姆 按下按钮以测量阻抗。检查并确保阻抗值在0.100至0.300 kΩ之间。反应体积会影响阻抗（增加体积可降低阻抗，减少体积可提高阻抗）。</li>
	<li>按压 开始该过程只需几秒钟即可完成。</li>
	<li>电穿孔后立即取出胚胎，并用新鲜溶液洗涤3次 30 µL KSOM-R 培养基液滴</li>
	<li>将胚胎重新放回 37 °C 5% CO₂ 培养箱2 最大湿度 体外 培养中 500 µL KSOM-R 培养基液滴覆盖石蜡油中。或者，通过手术将胚胎移植至交配后1.5天（dpc）的假孕雌性大鼠体内，以获得活产子代。</li>
</ol>
<img alt="基因编辑过程；rAAV DNA递送、胚胎电穿孔、CRISPR、啮齿类动物模型；示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66069/66069fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：AAV介导的DNA递送与2细胞期胚胎电穿孔在CRISPR-Cas9基因组编辑中的流程示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66069/66069fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

CRISPR-Cas基因组编辑系统通过在多种动物物种中高效地实现简单和复杂、定制化的遗传修饰，彻底改变了基因工程领域。与基因组编辑相关技术的不断优化和改进进一步提升了其多功能性。本文介绍了一种新方法，即利用ssAAV介导的DNA递送，结合CRISPR-Cas9试剂对2细胞期啮齿类胚胎进行2细胞胚胎电穿孔。我们已证明，这是一种构建靶向敲入动物模型的有效方法。
使用腺相关病毒（AAV）的一个主要优势在于，它能够将较大的DNA修复模板递送至胚胎中，而无需显微注射技术。AAV介导的递送还能在一定程度上克服单独使用电穿孔时对DNA模板大小的限制。然而，使用AAV时也存在一些重要考虑因素。透明带是包绕受精卵的硬化糖蛋白基质，作为一种物理屏障，常常阻碍核酸的递送。对透明带进行减薄是一种常用的技术，以改善对胚胎的可及性。然而，有研究报道，在透明带预先减薄的胚胎中，使用较高剂量（1 × 107 GC/µL 至 1 × 109 GC/µL）的AAV感染会阻碍胚胎发育22。不过，某些AAV血清型能够穿透透明带29。本方案不涉及透明带减薄，并采用浓度为3 × 107 GC/µL的AAV血清型1和6，实现了高于以往已发表报道的敲入效率。在这些条件下，我们未观察到胚胎发育能力下降。
通过电穿孔将外源基因导入2细胞期胚胎所获得的高敲入效率，很可能归因于该发育阶段胚胎具有较长的G2期，因此这一阶段是进行电穿孔操作的理想发育时期。然而，一个潜在的问题是在电穿孔过程中部分2细胞期胚胎中观察到的细胞融合现象。考虑到电融合技术常用于哺乳动物细胞的融合，这一现象并不意外，且通过谨慎地将电极沿水平方向而非垂直方向对齐，可能避免细胞融合的发生30,31。此外，当基因组编辑发生在较晚的发育阶段（如2细胞期而非1细胞期）时，嵌合体的发生率可能更高。在采用我们的2细胞期电穿孔方法时，与原核显微注射相比，我们确实观察到嵌合体比例略有上升（AAV方法为86%，PNI方法为67%），但在所有经检测的首建系动物中仍成功实现了修饰等位基因的种系传递。另一个潜在担忧是AAV来源的DNA模板可能发生串联多联体整合。尽管本方案所描述的模型未进行长读长测序，但我们已通过微滴数字PCR（ddPCR）拷贝数变异分析，确认了所有模型中DNA模板均为单拷贝整合。
最后，尽管我们的方法涉及使用腺相关病毒（AAV）递送目的DNA序列，但也可将其他病毒或非病毒介导的DNA递送方法与胚胎电穿孔技术结合，以成功实现对胚胎的遗传操作。总之，将单链AAV介导的DNA递送与CRISPR-Cas9核糖核蛋白（RNP）电穿孔技术联合应用于2细胞期胚胎，是一种高效且易于推广的方法，可用于高效构建基因敲入大鼠模型。

基于CRISPR的基因组编辑工具的发展极大地加快了我们高效构建新型且更为复杂的遗传工程大鼠模型的能力。将单导向RNA（sgRNA）与Cas9核酸酶结合，可形成核糖核蛋白（RNP）复合物，靶向基因组中特定的DNA序列，并导致双链DNA断裂。由于细胞的DNA修复机制具有易错性，修复过程中会引入插入和缺失（INDELs），从而可能破坏目标基因的功能。当基因组编辑试剂与设计好的工程化DNA序列（修复模板）共同递送时，修复模板会通过一种称为同源定向修复（HDR）的过程插入到含有双链DNA断裂的区域。这是一种构建具有靶向DNA插入/替换（敲入）的动物模型的有效策略。其中一个局限性在于，敲入序列通常较大，已被证明会降低基因编辑效率，从而使所需模型的构建更加困难1。提高敲入效率的策略包括对双链DNA（dsDNA）和单链DNA（ssDNA）修复模板进行线性化处理，以及对DNA修复模板进行化学修饰2,3,4。此外，还尝试了原核显微注射联合HDR促进化合物、显微注射过程中施加电脉冲，以及在特定时间点向2细胞期胚胎进行显微注射等方法5,6,7。尽管其中一些方法已取得一定成功，但将大于1.0 kb的DNA序列整合仍面临较大的技术挑战。
电穿孔是一种将试剂导入培养细胞系的常用方法，也可作为显微注射的替代方案，用于将CRISPR-Cas9组分递送至胚胎中。胚胎电穿孔最初在大鼠胚胎中实现8，此后已成功应用于小鼠9,10,11,12,13、猪14,15及其他动物模型生物16,17,18。将悬浮于含有CRISPR-Cas9试剂培养基中的胚胎置于电穿孔杯或载玻片上两个电极之间，并施加直流电脉冲。该过程会在透明带和胚胎质膜上形成瞬时孔隙，使CRISPR-Cas9组分得以进入胚胎。通常先使用中等强度的电穿孔脉冲（&#34;poring&#34;）形成临时孔隙，随后施加较低强度的电转移脉冲（&#34;transfer pulses&#34;），以促进带负电荷的基因组编辑组分的迁移。胚胎电穿孔效率高、通量大且操作简便。然而，尽管已有研究表明该方法在导入较小（&#60;200 bp）的单链DNA修复模板方面非常成功，但关于成功电穿孔较大（&#62;1.0 kb）修复模板的报道仍较少13,19。这种尺寸限制成为利用胚胎电穿孔构建需要大片段插入的基因敲入动物模型的主要障碍。
在基因治疗领域，腺相关病毒（AAVs）长期以来被用作递送遗传物质的载体，因其对分裂和非分裂细胞均具有高效的体内感染能力，且无致病性，基因组整合频率极低20,21。近年来，越来越多的研究将AAVs与CRISPR-Cas9技术相结合，用于递送DNA修复模板和CRISPR试剂22,23,24。该策略可在无需显微注射技术的情况下递送较大的DNA修复模板。
HDR 通路在细胞周期的 S 期晚期和 G2 期更为活跃25,26在所进行的研究中 体外通过将CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合物（RNPs）和DNA修复模板递送至G2期同步化的细胞，或利用Cas9-Geminin融合蛋白将Cas9蛋白的存在限制在S晚期和G2期，显著提高了敲入效率2此外，合子基因组激活（ZGA）的主要事件发生在2细胞期胚胎的延长G2期，且与开放的染色质状态相关。据推测，这使得CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合物（RNPs）和修复模板对基因组DNA具有更高的可及性。
我们的目标是结合腺相关病毒（AAV）方法与胚胎电穿孔技术，在胚胎发育的2细胞阶段引入CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合物（RNPs），从而在上述所有观察结果的基础上进一步优化基因编辑策略。该策略充分利用了AAV在递送较大DNA修复模板方面的优势、电穿孔技术的操作简便性，以及在胚胎发育过程中2细胞阶段基因组可及性更佳的特点，从而建立一种高效靶向插入DNA序列的基因工程方法。如本实验方案所述，我们优化后的方法能够在无需显微注射技术的情况下，成功构建携带1.2至3.0 kb大小DNA序列插入的靶向敲入大鼠模型。

<table><tbody><tr><td>用于电极的鳄鱼夹导线</td><td>NepaGene</td><td>C117</td><td></td></tr><tr><td>矿物油</td><td>MilliporeSigma</td><td>M5310</td><td></td></tr><tr><td>NepaGene21 Super Electroporator&amp;nbsp;</td><td>NepaGene</td><td>NEPA21</td><td></td></tr><tr><td>载玻片上的铂金板电极</td><td>NepaGene</td><td>CUY501P1-1.5</td><td></td></tr><tr><td>PURedit Cas9 蛋白</td><td>MilliporeSigma</td><td>PECAS9</td><td></td></tr><tr><td>sgRNA（化学修饰型）</td><td>Synthego</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ssAAV1 或 ssAAV6 包装的 DNA 修复模板</td><td>Vectorbuilder</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

利用腺相关病毒（aav）和2细胞胚胎电穿孔技术对大鼠胚胎进行crispr-cas9基因组编辑

CRISPR-Cas9 Genome Editing of Rat Embryos using Adeno-Associated Virus (AAV) and 2-Cell Embryo Electroporation

基因组编辑技术被广泛用于制备转基因动物，包括大鼠。将DNA修复模板和CRISPR-Cas试剂通过胞质或原核显微注射导入胚胎是目前最常用的递送方法。然而，这类显微操作需要使用专业设备，操作繁琐，且要求具备一定的技术水平。此外，显微注射技术常因对胚胎造成机械性损伤而导致胚胎存活率降低。在本实验方案中，我们开发了一种优化的方法，可在无需显微注射的情况下将较大的DNA修复模板递送至胚胎，与CRISPR-Cas9基因组编辑技术协同作用。该方案结合了腺相关病毒（AAV）介导的单链DNA供体模板递送与CRISPR-Cas9核糖核蛋白（RNP）的电穿孔递送，用于修饰2细胞期胚胎。利用这一新策略，我们已成功构建了携带1.2至3.0 kb大小DNA序列插入的靶向基因敲入大鼠模型，编辑效率介于42%至90%之间。

按照本方案，通过电穿孔将CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合物导入2细胞期胚胎后，可实现腺相关病毒介导的DNA修复模板高效递送，从而在胚胎中实现高效的同源定向修复（HDR）。如视频所示，成功的电穿孔过程会在每个电极上形成气泡（图2C），且阻抗保持在0.100至0.300 kΩ范围内。电穿孔后，胚胎出现肿胀、充满透明带内卵周隙的现象并不少见（图3），这种肿胀通常在培养数小时后逐渐消退。此外，对2细胞期胚胎进行电穿孔后，也可能观察到少量细胞融合事件（比例不超过20%）（图3）。通过谨慎地将胚胎沿电极水平轴方向排列而非垂直轴排列，可能有助于避免细胞融合（图2B）。然而，我们通常在电穿孔后直接弃除所有发生融合的胚胎。
我们采用腺相关病毒（AAV）介导的DNA递送结合2细胞胚胎CRISPR-Cas9 RNP电穿孔技术，在构建具有靶向插入的基因敲入大鼠模型方面已证明极为高效。在大鼠胚胎中测试该方法，并通过培养囊胚筛选含有工程化短人工内含子（包含loxP位点）的插入事件时，基于下一代测序（NGS）分析结果发现，超过60%的囊胚携带正确靶向的敲入等位基因（图4）。进一步为验证该方法在获得活体基因敲入大鼠中的可行性，我们设计了一项将Cre重组酶编码序列靶向插入大鼠Drd2基因起始密码子（ATG）位点的研究。AAV包装的DNA供体模板包含AAV包装所需的ITR序列、一段5'同源臂（长度为422 bp）、一段Cre-pA序列（长度为1,339 bp）以及一段3'同源臂（长度为477 bp）（图5A）。在出生的11只子代中，有10只通过PCR分析确认在大鼠Drd2基因ATG起始位点处成功插入了Cre-pA序列（图5B-D），后续通过DNA测序分析进一步验证了靶向插入的准确性。综合7个不同项目的实验结果，通过PCR检测同源臂连接区域并结合DNA序列验证，我们在 founder 动物中实现了平均76%的基因敲入成功率（Table 2）。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>电压 [V]</td>
			<td>脉冲时长 [msec]</td>
			<td>脉冲间隔 [msec]</td>
			<td>脉冲次数</td>
			<td>衰减率 [%]</td>
			<td>极性</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>穿孔脉冲</td>
			<td>40</td>
			<td>3.5</td>
			<td>50</td>
			<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>转导脉冲</td>
			<td>5</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>5</td>
			<td>40</td>
			<td>+/-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：电穿孔参数。电穿孔过程中务必开启电流限制。
<img alt="用于流体动力学研究的微流控装置示意图，显示通道中液滴形成过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66069/66069fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2： 二细胞胚胎电穿孔过程。 （A）载玻片电极。 （B）胚胎悬浮于CRISPR-Cas9基因编辑试剂中，并在电穿孔前加载至载玻片电极内。 （C）电穿孔过程中每个电极上形成气泡。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66069/66069fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞融合、胚胎肿胀；显微镜图像显示早期发育阶段。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66069/66069fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图3：电穿孔后胚胎形态。 在电穿孔后的2细胞期胚胎中，最多有20%出现细胞融合现象。胚胎细胞还可能在透明带内肿胀，充满卵周隙。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66069/66069fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="基因敲入效率柱状图；经编辑的囊胚百分比 vs. 处理组；AAV+EP组显示最高。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66069/66069fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图4：AAV介导的DNA递送与2细胞胚胎电穿孔在培养大鼠囊胚中的基因敲入效率。 数据以通过下一代测序（NGS）检测到正确敲入等位基因的囊胚百分比表示。N=28个囊胚（仅培养对照组），N=37个囊胚（仅电穿孔（EP）对照组），N=35个囊胚（AAV+EP组）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66069/66069fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="靶向 Drd2 的基因编辑示意图及 ssAAV6 供体质粒整合；包含凝胶电泳结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66069/66069fig5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：构建Drd2-Cre 基因敲入大鼠模型。（A）大鼠 Drd2 基因的靶向策略。RNP 复合物设计用于靶向包含编码起始位点的第 2 外显子。AAV 供体模板包含病毒反向末端重复序列（ITR）、5' 和 3' Drd2 基因同源臂（HA）以及带有 polyA 序列的 Cre 基因。供体模板成功整合后，将 Cre 基因插入至第 2 外显子起始位点的 3' 端，从而使 Cre 基因受 Drd2 启动子调控，同时使 Drd2 基因失活。用于确认成功敲入的 PCR 引物位置以紫色箭头标示。（B）对潜在基因组编辑动物（泳道 B10–C8）进行跨越 5' 同源臂的 PCR 分析。泳道 C9：野生型（阴性对照）；泳道 C10：无模板对照（阴性对照）。敲入阳性动物的预期扩增片段大小为 601 bp。（C）对潜在基因组编辑动物（泳道 D8–E6）进行跨越 3' 同源臂的 PCR 分析。泳道 E7：野生型；泳道 E8：无模板对照。敲入阳性动物的预期扩增片段大小为 676 bp。（D）Cre 基因检测。预期扩增片段大小为 381 bp。泳道 C7–D5：潜在 Founder 动物；泳道 D6：野生型；泳道 D7：无模板对照。PCR 产物通过毛细管电泳分析，使用 15 bp–3 kb 的比对标记（绿色标示）。每个图像左侧显示 QX DNA 片段大小标记物，其峰大小对应于以碱基对（bp）为单位的 PCR 扩增片段大小。本图经参考文献24许可修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66069/66069fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>项目描述</td>
			<td>插入阳性后代 (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oprm1-P2A-Flp (1.7 kb 插入)</td>
			<td>5/5 (100%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drd2-Cre (1.3 kb 插入)</td>
			<td>10/11 (91%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triml2-P2A-Cre (1.3 kb 插入)</td>
			<td>9/16 (56%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cxcl15-iCre (1.3 kb 插入)</td>
			<td>6/6 (100%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opn4-P2A-Cre (1.2 kb 插入)</td>
			<td>6/8 (75%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vipr1-FLEX-EGFP (1.4 kb 插入)</td>
			<td>5/12 (42%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosa26-FLEX-MTS-KillerRed (3.1 kb 插入)</td>
			<td>5/7 (71%)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：基因敲入模型成功率

本方案介绍了一种优化的遗传修饰大鼠模型制备方法。利用腺相关病毒（AAV）递送DNA修复模板，并通过电穿孔技术将CRISPR-Cas9试剂递送至2细胞期胚胎，以完成基因组编辑过程。

利用腺相关病毒（AAV）和2细胞胚胎电穿孔技术对大鼠胚胎进行CRISPR-Cas9基因组编辑

基因组编辑技术广泛用于制备转基因动物，包括大鼠。通过细胞质或原核显微注射DNA修复……

基于CRISPR的基因组编辑工具极大地促进了基因工程化动物模型的构建。CRISPR系统由一个与Cas9核酸酶结合的单链向导RNA组成，可通过编程靶向基因组内特定序列，从而产生双链DNA断裂。通过共递送DNA修复模板，该DNA断裂可被精确修复，并通过一种称为同源定向修复（Homology Directed Repair）的过程插入任何所需的工程化DNA序列。正是通过这一过程，我们能够生成具有靶向DNA插入或替换的基因敲入大鼠模型。本方案介绍了一种经过改进的方法，即利用腺相关病毒将DNA修复模板递送至大鼠胚胎，随后通过双细胞胚胎电穿孔技术递送CRISPR Cas9复合物。将AAV血清型1或6与一种经过设计的DNA修复模板包装在一起，该模板旨在通过CRISPR介导的同源定向修复过程整合到大鼠基因组中。将AAV加入30微升大鼠KSOM培养基液滴中，终浓度为每微升3 × 10⁷个基因组拷贝。随后，将新鲜采集的、可见原核的一细胞期胚胎转移至含有AAV的培养基中，以实现病毒转导。根据我们的方案，无需对透明带进行薄化处理，因为AAV血清型1和6能够顺利穿过透明带，高效递送DNA修复模板。胚胎在37摄氏度、5%二氧化碳及最大湿度条件下，与AAV共同孵育过夜。次日，配制电穿孔混合液，其中包含浓度为100纳克/微升的单导向RNA和浓度为100纳克/微升的Cas9蛋白，用OptiMIM培养基稀释。将该混合液在室温下孵育10分钟，以促进CRISPR核糖核蛋白复合物的形成。孵育期间，打开电穿孔仪并将导线连接至玻片电极。RNP复合物形成完成后，用移液器吸取5 µL电穿孔混合液，小心地将其加至电极之间，注意避免在溶液中引入气泡。此时已发育至二细胞期的胚胎从含有AAV的培养基中取出，并小心转移至电极之间的电穿孔混合液中。将胚胎排列整齐，确保没有任何胚胎接触电极，因为这会在电穿孔过程中导致细胞裂解。以下是通过显微镜观察该操作步骤的示意图。还需注意，电极间体积增大时，阻抗会随之降低。因此，为避免稀释电穿孔混合物，应连同胚胎一起转移最少量的培养基。接着，通过按下一个带有欧姆符号的按钮来测量阻抗。阻抗值应在 0.18 至 0.3 欧姆范围内。如果在有效范围内，则通过按下启动按钮开始电穿孔。该过程仅需几秒钟，通过显微镜观察时情况如下所示：你会注意到每个电极上迅速形成气泡。电穿孔后应立即从玻片上收集胚胎，并用新鲜的大鼠KSOM培养基清洗三次。随后可将胚胎用于体外培养研究，或移植到代孕雌鼠体内以获得活产仔鼠。需要注意的是，电穿孔后胚胎出现肿胀是常见现象。这种肿胀在培养数小时后应会消退。电穿孔后，多达20%的双细胞胚胎出现细胞融合现象也是常见的。通过仔细调整胚胎在电极之间的水平轴对齐，通常可以避免细胞融合。在大鼠胚胎中测试我们的实验方案，并对培养的囊胚进行筛选，以检测是否插入了包含两个 loxP 位点的工程化短人工内含子序列。根据下一代测序分析结果，我们发现超过 60% 的囊胚含有正确靶向的基因敲入等位基因。接下来，为进一步验证该方案能否用于产生活体基因敲入大鼠，我们设计了一个项目，旨在将 Cre 重组酶编码序列靶向大鼠 DRD2 基因的 ATG 起始位点。在出生的11只后代中，有10只通过PCR分析在5'同源臂、3'同源臂以及内部Cre重组酶检测PCR实验中呈阳性。在总计七个不同项目中的汇总结果显示，通过PCR检测同源臂连接区域并结合DNA序列验证，我们在 founder 动物中实现了平均76%的基因敲入成功率。采用这种由AAV介导的DNA递送结合二细胞胚胎电穿孔的技术流程，我们在长度达3 KB的DNA插入片段中所获得的基因敲入效率显著高于传统方法。还需要注意的是，尽管我们在大鼠胚胎中演示了该方法的应用，但它也可有效地应用于其他物种，以实现靶向DNA插入。

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科研

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Genetics

遗传学

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