Name: Ex Vivo （体外 ）黑色素瘤患者脑脊髓液中循环肿瘤细胞的培养以研究黑色素瘤相关的软脑膜疾病 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-29T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: 学习从黑色素瘤相关软脑膜疾病患者脑脊液中培养循环肿瘤细胞的方法，建立体外和体内临床前模型。该技术有助于深入研究M-LMD病理机制并开发新治疗策略。

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我们衷心感谢患者及其家属为本项科学研究慷慨捐赠组织样本。本研究得到了美国国立卫生研究院基金 P50 CA168536、R21 CA256289、R21 CA216756（资助对象：KSMS 和 PAF）以及 K99 CA226679（资助对象：IS）的资助。此外，还获得了莫菲特基金会研究加速基金（资助对象：BC 和 PAF）以及莫菲特化学生物学项目的支持。 &amp;#38; 分子医学项目（PAF 和 DD），莫菲特基金会（PAF）。分子基因组学、组织与生物信息学 &amp;#38; 莫菲特生物统计学共享资源中心部分由美国国家癌症研究所通过癌症中心支持拨款（P30-CA076292）和莫菲特基金会资助。

去标识化的患者脑脊液标本采集已获得南佛罗里达大学机构审查委员会（IRB）（MCC 50103、50172 和 19332）的批准。M-LMD 患者的诊断可通过多种方式进行，包括脑脊液细胞学阳性、具有特征性的脑部和/或脊髓磁共振成像（MRI），或临床表现与提示性 MRI 发现相结合。这些 M-LMD 患者的脑脊液作为其标准临床护理的一部分被常规采集。除非存在临床指征，否则不进行任何操作。已从患者处获得知情同意，允许采集样本并将其用于科研和发表。该研究的生成过程 体内 小鼠-LMD模型已获得南佛罗里达大学机构动物护理和使用委员会（IACUC# IS00010398）的批准。本方案的整体流程总结如下 图1研究中所用试剂与设备的详细信息列于下文 材料表.
1. HMC 条件培养基的制备
<ol>
	<li>用浓度为 2 µg/cm2 的多聚-L-赖氨酸预包被 T175 培养瓶。</li>
	<li>将培养瓶置于 37 °C 培养箱中孵育 1 小时。</li>
	<li>使用无菌血清移液管吸除多聚-L-赖氨酸溶液。无需冲洗培养瓶，即可用于硬脑膜细胞（HMC）培养。</li>
	<li>将约 1.0 × 106 个 HMC 细胞接种于 30 mL 完全脑膜细胞培养基（MenCM）中，每瓶培养基含 5% 胎牛血清、1% 脑膜细胞生长添加剂和 100 I.U./mL 青霉素-链霉素抗生素溶液。将细胞置于标准组织培养条件下（37 °C、5% CO2）的细胞培养箱中培养。</li>
	<li>每 3 天更换一次培养基。</li>
	<li>当细胞融合度达到约 75%–80% 时，收集并保存 HMC 培养上清液至 50 mL 锥形管中。</li>
	<li>如需更多 HMC 培养上清液，可将 HMC 细胞传代至新的 T175 培养瓶，并加入新鲜的完全 MenCM 培养基。</li>
	<li>向 HMC 培养上清液中加入等体积的完全 MenCM 培养基。</li>
	<li>加入终浓度为 20 ng/mL 的成纤维细胞生长因子（FGF）和 20 ng/mL 的表皮生长因子（EGF），配制成用于 CSF-CTC 培养的 HMC 条件培养基。 
	注意：建议在 CTC 细胞准备培养时再加入新鲜的 FGF 和 EGF。</li>
	<li>将 HMC 条件培养基分装为每管 50 mL，于 4 °C 保存。 
	注意：建议分装后的 HMC 条件培养基在 4 °C 保存，且不超过 4 周。</li>
</ol>
2. 脑脊液采集与样本处理
<ol>
	<li>将离心机预冷，设置温度为 4 °C。</li>
	<li>从患者体内采集脑脊液（CSF）后，立即将样本置于冰上的 15 mL 圆锥形离心管中，以保持低温。 
	注意：本研究经机构审查委员会（IRB）批准的方案允许从知情同意的患者体内采集 7.5 mL 脑脊液。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 257 x g 离心 5 分钟，处理脑脊液样本。</li>
	<li>小心移除上清液，保留并分装脑脊液上清，避免扰动管底的细胞沉淀。如需进一步分析，脑脊液上清分装后可于 -80 °C 冷冻保存。 
	注意：沉淀可能肉眼不可见，因此建议在管底保留约 40–50 µL 液体。</li>
	<li>在同一离心管中加入 1 mL 无菌磷酸盐缓冲液（PBS），重悬并清洗细胞，然后在 4 °C 条件下以 257&#160;x g 再次离心 5 分钟。 
	注意：（可选）若样本存在血液污染，可进行红细胞（RBC）裂解。但需注意，此过程可能导致部分细胞丢失，包括循环肿瘤细胞（CTCs）。循环肿瘤细胞可在不进行红细胞裂解的情况下进行扩增培养。</li>
	<li>移除并弃去 PBS，避免扰动细胞沉淀，管底保留约 50 µL。</li>
	<li>进行细胞计数以评估细胞活力。此后有两种方案可用于脑脊液循环肿瘤细胞（CSF-CTCs）的扩增培养：体外培养（步骤 3）或尝试体内患者来源异种移植扩增（步骤 4）。 
	注意：若计划后续培养脑脊液循环肿瘤细胞（CSF-CTCs），可将细胞用细胞冻存液冷冻保存，待需要时再进行扩增。细胞冻存液可由 90% 胎牛血清（FBS）加 10% 二甲基亚砜（DMSO）配制。若有额外脑脊液样本（例如来自同一患者的多次采集或尸检时采集），可将样本送检进行循环肿瘤细胞计数分析17，或进行黑色素瘤标志物免疫荧光（IF）染色（如抗 MLANA 抗体），以评估循环肿瘤细胞的数量和活性。这些实验完成后细胞无法回收。因此，若无患者备用脑脊液样本，不建议进行此类检测。</li>
</ol>
3. 体外 脑脊液循环肿瘤细胞的培养与扩增
<ol>
	<li>将CSF-CTCs重悬于HMC条件培养基中。若CSF-CTCs为冻存细胞，则先将细胞解冻，离心后用PBS轻柔洗涤。</li>
	<li>在96孔板中，每孔加入150 µL体积，将细胞分至三个复孔中。只有活细胞会在过夜后轻微贴附于表面。 
	注意：单个患者样本中的CSF-CTCs数量可能存在显著差异（表1）。对于CTC数量较少的患者，可直接使用96孔板作为起始培养容器，且不进行细胞计数，将全部细胞沉淀接种以避免CTC丢失。然而，若脑脊液（CSF）样本量较大（例如来自尸检），则可对细胞进行计数。并非所有肿瘤细胞均能生长 离体；有些在传代数次后才会逐渐扩增并最终趋于稳定。目前，培养黑色素瘤脑脊液循环肿瘤细胞（CSF-CTCs）的成功率 离体 约为60%7.</li>
	<li>每隔3天，通过添加新鲜的HMC条件培养基进行补充；或者，将移液枪头轻轻靠在孔壁上吸除部分培养基，注意保留部分液体且不扰动孔底，随后更换为新鲜的HMC条件培养基。</li>
	<li>当 离体 CSF-CTCs 扩增至90%融合时，用胰蛋白酶消化并将整个孔转移至24孔板中的新孔。当24孔板中的孔达到融合状态时，转移至12孔板，随后转移至6孔板，依此类推。 
	注意：在胰蛋白酶消化后，可考虑将少量循环肿瘤细胞（CTCs）用细胞冻存液（10% DMSO + 90% FBS）进行冷冻保存，作为后续接种的备份。</li>
	<li>继续培养CTCs。部分细胞可能在短期内增殖，随后逐渐停止生长。然而，一个或多个克隆可能发生转化并呈指数级扩增。图2A）。挑选这些克隆，它们将成为 体外 患者来源的脑脊液循环肿瘤细胞（PD-CSF-CTCs）培养 
	注意：如果这些克隆过于密集或发生聚团，需用胰蛋白酶消化，并将细胞重新接种至新的组织培养板/培养瓶中。</li>
</ol>
4. 在体 将脑脊液循环肿瘤细胞接种以建立细胞系来源的异种移植模型（CDX）或患者来源的异种移植模型（PDX）
注意：PDX 模型涉及将癌细胞直接从癌症患者（未经 离体 培养），而CDX模型则使用癌细胞系，或在本例中，使用已扩增并永生化的循环肿瘤细胞（CTCs）18.
<ol>
	<li>使用6-8周龄雌性免疫缺陷型NOD SCID gamma（NSG）小鼠进行脑脊液循环肿瘤细胞（CSF-CTCs）接种。NSG小鼠因其具有严重免疫缺陷特性，对人源肿瘤细胞的移植具有高度接受性，故被选用。19由于其免疫缺陷，这些小鼠应饲养在严格控制的无菌环境中，并与其他品系小鼠隔离饲养。小鼠激光显微切割（murine-LMD）的方法已在其他文献中详细描述。20. 
	注意： 离体 细胞（仅经过步骤2处理而未进行培养的患者脑脊液循环肿瘤细胞）用于建立PDX模型；需通过动物体征观察及脑部MRI检查来确定软脑膜转移进展。另一方面，使用CDX模型时 体外 PD-CSF-CTCs 可用荧光素酶报告基因标记，并通过生物发光成像（BLI）评估 LMD 状态。本报告所用的细胞标记系统为 NanoLuc（NL）报告系统，以furimazine为底物，该系统已被证明可随肿瘤生长而相应提高检测灵敏度21CTC 细胞生长的干扰体外 或 体内未观察到由NL表达引起的现象。</li>
	<li>使用以下方法检查LMD进展的迹象：体格观察：体重减轻、头部倾斜和弓背；MRI：脑室扩大和脑积水迹象图2B). BLI：中枢神经系统区域的阳性生物发光信号（图2C).</li>
</ol>
5. 通过激光显微切割从大鼠脑脊液中收集样本以进行后续克隆扩增
<ol>
	<li>使用4%异氟烷（依据机构批准的方案）对LMD的NSG小鼠进行麻醉，直至其失去翻正反射迹象。</li>
	<li>用剃毛工具剃除小鼠头部腹侧表面的全部毛发，并采用无菌技术对皮肤进行处理。</li>
	<li>使用立体定位仪的改良L形鼻夹固定鼻部，确保鼻孔通畅无阻。用胶带轻轻将双侧耳廓腹面的皮肤向前牵拉，固定于鼻夹上，随后将颈部弯曲至约90°并固定。通过吸入1.5%–3%异氟烷维持麻醉状态。</li>
	<li>完全伸展颈部，从耳廓之间开始，将手术剪尖端沿枕骨向下移动，施加轻微压力。 
	注意：在此正中位置，当剪刀尖进入枕大池上方的凹陷区域时，可观察到轻微的凹陷。</li>
	<li>在可触及的凹陷处上方做一长约5-7 mm的正中切口。</li>
	<li>使用尖端为1-2 mm的钝头镊子轻轻按压小脑延髓池。将镊子尖端闭合状态下插入，然后在对硬脑膜施加向下压力的同时打开镊子。</li>
	<li>重复步骤6所述的钝性分离操作，直至硬脑膜清晰可辨，并且暴露区域内的相关血管可见。</li>
	<li>在保持镊子张开以牵拉周围肌肉组织的同时，将连接1 mL注射器的27–29 G针头插入硬膜下方，以观察针尖斜面。确保针头穿透深度仅略超过斜面。缓慢回抽注射器活塞。</li>
	<li>在小鼠安乐死前，尽可能收集更多的脑脊液（通常为15–30 µL）。 
	注意：安乐死应按照机构批准的方案实施，通过使受试对象暴露于逐渐增加浓度的压缩 CO₂ 气体中完成。2 气体。例如，采用每分钟置换30%至70%腔室容积的置换速率，以防止或减轻动物不适或痛苦。随后，在室温空气中持续观察超过10分钟，以确认心肺活动完全停止。</li>
	<li>将脑脊液从注射器推入微量离心管中，并置于冰上。</li>
	<li>以 257 x g 离心样品 g 4 °C下离心5分钟，轻轻移除上清液（如需进一步分析，将小鼠脑脊液样本于-80 °C保存），切勿扰动细胞沉淀。</li>
	<li>加入500 µL无菌PBS重悬细胞沉淀，洗涤；重复离心，257 x g g 室温下孵育5分钟。</li>
	<li>在96孔板中，用HMC条件培养基重悬细胞。 
	注意：已移植的CSF-CTCs 体内 并成功生长为LMD的细胞应能像正常细胞培养物一样生长。每3天更换一次培养基以继续扩增。当细胞达到汇合时，用胰蛋白酶消化并转移至更大的细胞培养装置中。这些细胞将成为 在体 PD-CSF-CTC 培养在本报告中，CDX模型的成功率为100%，尚未建立PDX M-LMD模型。</li>
</ol>

Murine Model for Studying Leptomeningeal Disease Using Circulating Tumor Cells

<ol><li>Glitza, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptomeningeal+disease+in+melanoma+patients%3A+An+update+to+treatment%2C+challenges%2C+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Melanoma+Res%22%5BJournal%5D)">Leptomeningeal disease in melanoma patients: An update to treatment, challenges, and future directions.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 33 (4), 527-541 (2020).</li>
<li>Khaled, M. L., Tarhini, A. A., Forsyth, P. A., Smalley, I., Pina, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptomeningeal+disease+%28LMD%29+in+patients+with+melanoma+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Leptomeningeal disease (LMD) in patients with melanoma metastases.</a> Cancers (Basel). 15 (6), 1884(2023).</li>
<li>Smalley, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+CSF+from+patients+with+leptomeningeal+melanoma+metastases+identifies+signatures+associated+with+disease+progression+and+therapeutic+resistance%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of CSF from patients with leptomeningeal melanoma metastases identifies signatures associated with disease progression and therapeutic resistance).</a> Clin Cancer Res. 26 (9), 2163-2175 (2020).</li>
<li>Larkin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five-year+survival+with+combined+nivolumab+and+ipilimumab+in+advanced+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Five-year survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma.</a> N Engl J Med. 381, 1535-1546 (2019).</li>
<li>Boire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+component+3+adapts+the+cerebrospinal+fluid+for+leptomeningeal+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Complement component 3 adapts the cerebrospinal fluid for leptomeningeal metastasis.</a> Cell. 168 (6), 1101-1113 (2017).</li>
<li>Chi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cells+deploy+lipocalin-2+to+collect+limiting+iron+in+leptomeningeal+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer cells deploy lipocalin-2 to collect limiting iron in leptomeningeal metastasis.</a> Science. 369 (6501), 276-282 (2020).</li>
<li>Law, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+preclinical+model+of+patient-derived+cerebrospinal+fluid+circulating+tumor+cells+for+experimental+therapeutics+in+leptomeningeal+disease+from+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">A preclinical model of patient-derived cerebrospinal fluid circulating tumor cells for experimental therapeutics in leptomeningeal disease from melanoma.</a> Neuro Oncol. 24 (10), 1673-1686 (2022).</li>
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<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+and+characterization+of+breast+cancer+CTCs+competent+for+brain+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">The identification and characterization of breast cancer CTCs competent for brain metastasis.</a> Sci Transl Med. 5 (180), (2013).</li>
<li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+therapy%3A+Ex+vivo+culture+of+circulating+breast+tumor+cells+for+individualized+testing+of+drug+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer therapy: Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility.</a> Science. 345 (6193), 216-220 (2014).</li>
<li>Mohamed, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+expansion+of+circulating+tumour+cells+%28CTCs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Ex vivo expansion of circulating tumour cells (CTCs).</a> Sci Rep. 13 (1), 3704(2023).</li>
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<li>Stylianopoulou, F., Herbert, J., Soares, M. B., Efstratiadis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+insulin-like+growth+factor+II+gene+in+the+choroid+plexus+and+the+leptomeninges+of+the+adult+rat+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Expression of the insulin-like growth factor II gene in the choroid plexus and the leptomeninges of the adult rat central nervous system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (1), 141-145 (1988).</li>
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</ol>

Peter Forsyth 在提交本研究之外，担任 Abbvie Inc、Bayer、Bristol Meyers Squib、BTG、Inovio、Novocure、Tocagen 和 Ziopharm 的咨询委员会成员。其余所有作者均无任何利益冲突可披露。

M-LMD 是一种破坏性极强且 invariably 致命的疾病，迫切需要寻找更有效的治疗策略。研究 M-LMD 的主要障碍之一是无法获取足够的脑脊液循环肿瘤细胞（CSF-CTCs）以开展分子和功能研究。1,7尽管已有从外周血和其它癌症类型（如乳腺癌和卵巢癌）的脑脊液中培养循环肿瘤细胞（CTCs）的方法11,31,32这些CTC扩增方法通常为短期培养，且目前尚未见成功培养黑色素瘤脑脊液CTC（CSF-CTCs）的报道。此外，现有的CTC扩增技术均局限于短期培养 离体 设置，但尚未产生 体内 源自患者LMD细胞的LMD模型。本文介绍了一种培养这些细胞的新方案 体外 和 体内，从而获得独特的患者来源细胞系。目前，在该研究的11例M-LMD患者中，成功扩增M-LMD脑脊液循环肿瘤细胞（CSF-CTCs）的概率约为60%（7/11） 体外 并且这一比例降至约20%（11例中的2例） 体内 使用 CDX 方法7. 
显然 体外 条件无法重现脑脊液的微环境。然而，此前已有研究采用蛋白质组学方法分析脑脊液中的蛋白质成分，并揭示了支持循环肿瘤细胞生长所需的一些关键因子 离体3例如，研究发现，在M-LMD患者中促进CTC存活的主要通路之一与IGF相关活性的增强有关3,7此外，研究表明，软脑膜会向脑脊液中分泌多种细胞因子和生长因子，包括FGF-2、EGF、GM-CSF以及与IGF信号通路相关的蛋白质。12事实上，这在与HMCs共培养的培养基中得到了重现，支持这些生长因子在促进CSF-CTC生长中的潜在作用。 
建立PDX（或CDX）模型的一个主要优势在于能够更深入地了解疾病的病理学特征，这一点是 体外 条件不足。理想情况下，首选PDX方法，因为CSF-CTCs可直接来源于患者，无需 离体 培养。最初曾尝试采用此方法建立M-LMD模型，但迄今为止尚未成功。PDX小鼠模型构建困难可能与起始材料的数量和完整性有关（即临床常规采集的患者脑脊液中可存活的CTC数量极少）。这或许可以解释为何我们从尸检时采集的脑脊液中培养CTC获得了更高的成功率。7. 为提高概率 体内 扩增，本方案经过修改以提供一种替代的CDX方法。首先可对CSF-CTCs进行扩增 体外 （步骤3）以生成具有长期性和更强生长潜力的PD-CSF-CTC细胞系。随后将这些细胞接种至小鼠体内以建立M-LMD模型。尽管当前方法仅获得了有限数量的 体内 CDX M-LMD（约20%）模型的成功率可能反映了CSF-CTCs的转录多样性、脑脊液微环境的复杂性，以及总体上培养这些细胞的困难。我们认为，未来开发人源化小鼠模型可能有助于提高移植成功率，鉴于微环境在支持癌细胞存活方面具有重要作用。33. 
CDX 方法的一个局限性在于，仅从患者样本中筛选出特定的克隆，且癌细胞在传代过程中可能发生遗传漂变 离体 培养后可能不再反映原始来源的转录谱。然而，已有报道指出，尽管如此 体外 培养的PD-CSF-CTC细胞系与分离的未经培养的患者CSF-CTC在基因表达上保持约97%的相似性7在该研究中，单细胞RNA测序分析揭示了未经培养的样本之间存在重叠的富集基因特征， 体外 PD-CSF-CTCs 和 体内 PD-CSF-CTCs，例如 SOX9、ErbB3 和 IGF-1R7，表明这些基因可能是潜在的治疗靶点。此外，这些共同富集的基因参与了与转录调控和代谢相关的生物通路7综上所述，这凸显了PD-CSF-CTC培养物在深入理解M-LMD生物学特性、鉴定可靶向的驱动疾病进展的分子机制与通路，以及在未来研究中设计合理治疗策略方面的转化价值。
尽管目前的方法学仍不完善，因为无法预先确定M-LMD患者脑脊液循环肿瘤细胞（CSF-CTCs）的状态和存活能力，但已有一些观察结果可提高实验成功率，尤其是考虑到这些CTCs数量稀少且极为脆弱。关键步骤包括：与临床团队协调，确保脑脊液样本采集后立即置于冰上，并迅速转运至实验室，以维持细胞完整性；随后应立即处理CSF-CTCs，可通过将其接种于培养体系中或进行细胞冻存来实现。
总体而言，脑脊液循环肿瘤细胞（CSF-CTCs）的培养与扩增是一个反复试验的过程，但本实验方案的建立使得研究人员能够获得源自患者的M-LMD细胞，从而具备了利用患者样本开展此前无法实施的实验研究的资源。未来的主要目标之一是利用M-LMD来源的PD-CSF-CTCs进行分子特征分析、高通量药物筛选以及 在体内 药物疗效研究旨在设计合理的治疗方案以治疗M-LMD。该方法有望显著降低与晚期转移性黑色素瘤这一目前致命性并发症相关的发病率和死亡率。

软脑膜疾病（LMD）是指循环肿瘤细胞（CTCs）播散至脑脊液（CSF）中，并在包绕大脑和脊髓的脑膜中定植所致1,2。LMD 可发生于多种癌症，但在黑色素瘤中尤为常见。在黑色素瘤的晚期阶段，约有 5% 的患者会发展为黑色素瘤相关的 M-LMD2,3。尽管与其他转移部位相比发生率相对较低，但 M-LMD 的后果极为严重，患者总体生存期仅为数周至数月，且是导致患者发病的重要因素1,3,4。这主要归因于目前缺乏有效的治疗手段，同时对黑色素瘤细胞如何定植软脑膜仍存在重大知识空白2。因此，深入理解 M-LMD 的生物学机制将有助于设计新的治疗方法，以改善临床预后。
近期研究报告揭示了循环肿瘤细胞（CTCs）定植于独特的脑脊液微环境的机制。例如，补体C3可促进肿瘤细胞侵入脑脊液 通过 脉络丛，位于脑室每个脑室中的一团复杂血管网络5此外，为了应对脑脊液中微量营养素的匮乏，循环肿瘤细胞可上调铁螯合蛋白脂质运载蛋白-2（lipocalin-2）及其受体SLC22A17，以增强其存活能力。6使用 基于组学的 脑脊液分析显示，我们研究团队还发现脑脊液富含调控胰岛素样生长因子（IGF）信号通路以及先天免疫的蛋白质3上述数据共同强调了液体活检中脑脊液循环肿瘤细胞（CSF-CTCs）在研究软脑膜转移瘤（M-LMD）中的重要价值。
尽管脑脊液中的循环肿瘤细胞有时可通过采集患者的脑脊液样本进行识别 通过 腰椎穿刺、Ommaya 储液囊或快速尸检，一个主要的局限在于获取足够数量的这些稀有且脆弱的细胞1,7例如，使用CTC计数技术，每例患者的脑脊液样本中仅可识别出数百至数千个肿瘤细胞7，这使得进行分子和功能分析变得困难 体外 或 体内尽管已有短暂培养CTCs成功的报道 离体 来自外周血（即乳腺癌循环肿瘤细胞）8,9,10这些细胞通常只能短期培养，且目前尚无成功培养脑脊液中黑色素瘤循环肿瘤细胞（CTCs）的报道。因此，探索黑色素瘤脑脊液-CTCs或广义CTCs的扩增方法，将对M-LMD的生物学研究具有重要意义7,11.
首次建立一种从M-LMD患者中扩增CSF-CTCs的新技术 离体 在此报告中，我们建立了一种详细的方案，可用于培养和扩增来自软脑膜转移（M-LMD）患者的脑脊液循环肿瘤细胞（CSF-CTCs）。由于脑膜会分泌多种生长因子，如FGF、IGF、VEGF-A和IGFBPs，这些因子可支持其周围环境中的细胞生长12,13,14,15,16，可以合理推断脑脊液中的循环肿瘤细胞（CSF-CTCs）生长可能需要这些组分 离体 条件。因此，本方案采用通过培养人脑膜细胞（HMCs）获得的条件培养基 体外。对于 体内 接种，将患者来源的细胞接种至免疫缺陷小鼠体内以建立患者来源的脑脊液循环肿瘤细胞（PD-CSF-CTCs）系。患者来源的软脑膜转移癌（M-LMD）细胞的获得将支持开展细胞、分子及功能学检测，用于研究M-LMD并为这一致命性疾病提出新的治疗策略。

<table><tbody><tr><td>1 mL 注射器，27 - 29 G 针头</td><td>任意供应商</td><td>n/a</td><td>0.1 mm 无菌过滤</td></tr><tr><td>1.5 mL Eppendorf 离心管</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL 和 50 mL 聚苯乙烯离心管</td><td>任意供应商</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>6 -&amp;nbsp; 8 周龄雌性 NOD SCID gamma (NSG) 小鼠</td><td>Charles River</td><td></td><td>雄性可选</td></tr><tr><td>缓释型布托啡诺（Bup-SR）</td><td>Zoopharm&amp;nbsp;</td><td></td><td>受美国缉毒局（DEA）管制</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>ScienCell</td><td>#0010</td><td></td></tr><tr><td>气体吸入麻醉系统</td><td>VeteEquip</td><td>#901812</td><td>COMPAC5</td></tr><tr><td>Hamilton 微量注射器</td><td>Hamilton</td><td>10、25、50 和 100 µL</td><td>小脑延髓池注射使用 30 G 针头</td></tr><tr><td>人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）</td><td>Milipore Sigma（或任意供应商）</td><td>#F0291</td><td></td></tr><tr><td>人表皮生长因子（EGF）</td><td>Milipore Sigma（或任意供应商）</td><td>#SRP3027</td><td></td></tr><tr><td>自人软脑膜分离的人脑膜细胞（HMCs）</td><td>ScienCell</td><td>#1400</td><td></td></tr><tr><td>IVIS 200 成像系统</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>带光源的放大镜</td><td>任意供应商</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>脑膜细胞培养基（MenCM）</td><td>ScienCell</td><td>#1401</td><td></td></tr><tr><td>脑膜细胞生长添加剂（MCGS）</td><td>ScienCell</td><td>#1452</td><td></td></tr><tr><td>MRI 成像</td><td>Bruker</td><td>BioSpec 系列</td><td>可选</td></tr><tr><td>P1000、P200、P20 移液器及吸头</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素抗生素溶液</td><td>ScienCell（或任意供应商）</td><td>#0503</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>任意供应商</td><td>n/a</td><td>0.1 mm 无菌过滤</td></tr><tr><td>啮齿类动物手术器械（剪刀、镊子）</td><td>Roboz Surgical Instrument（或任意供应商）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>带螺帽的冻存管&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌蓝色手术纸/铺巾</td><td>任意供应商</td><td>n/a</td><td>n/a</td></tr><tr><td>无菌棉签</td><td>任意供应商</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>组织培养板/瓶（96 孔、24 孔、12 孔、6 孔、T175 等）</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

体外 黑色素瘤患者脑脊液中循环肿瘤细胞的培养以研究黑色素瘤相关性软脑膜病

关键词：黑色素瘤，软脑膜病，循环肿瘤细胞，脑脊液，体外培养，人脑膜细胞，条件培养基，胰岛素样生长因子结合蛋白，vegf-a，igf信号通路，mapk信号通路，小鼠模型，分子表征，功能分析，体内接种&#45;相关性软脑膜疾病

Ex Vivo Culture of Circulating Tumor Cells in the Cerebral Spinal Fluid from Melanoma Patients to Study Melanoma&#45;Associated Leptomeningeal Disease

黑色素瘤相关性软脑膜病（M-LMD）是指循环肿瘤细胞（CTCs）进入脑脊液（CSF），并在保护脑和脊髓的膜层——脑膜中定植所致。一旦发病，M-LMD患者的预后极差，总体生存期仅为数周至数月。这主要归因于对疾病机制的认识不足，进而导致有效治疗手段极为有限。明确M-LMD的潜在生物学机制将显著提升我们针对该致命性疾病调整现有疗法或设计新型抑制剂的能力。然而，一个主要障碍在于难以从患者来源的脑脊液（CSF-CTCs）中获取足够数量的CTCs，以开展分子表征、功能分析等临床前实验研究。 体内 疗效研究。脑脊液循环肿瘤细胞（CSF-CTCs）的培养 离体 也已被证明具有挑战性。为解决这一问题，本文提出了一种新型的患者来源M-LMD CSF-CTCs培养方案 离体 和 体内 已开发出该方法。研究发现，加入人脑膜细胞（HMCs）产生的条件培养基对该实验步骤至关重要。细胞因子阵列分析显示，HMCs分泌的因子，如胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBPs）和血管内皮生长因子A（VEGF-A），在支持脑脊液循环肿瘤细胞（CSF-CTC）存活方面具有重要作用。 离体在此，通过使用分离得到的患者来源的脑脊液循环肿瘤细胞（CSF-CTC）细胞系，验证了其在评估靶向胰岛素样生长因子（IGF）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路抑制剂疗效方面的实用性。此外，这些细胞还可用于鞘内接种 体内 建立可用于已批准或新型疗法临床前测试的小鼠M-LMD模型。这些工具有助于揭示驱动脑膜中CSF-CTC形成的潜在生物学机制，并识别可降低M-LMD相关发病率和死亡率的新型治疗方法。

了解成功培养脑脊液循环肿瘤细胞（CSF-CTCs）的条件 离体 是一项持续进行的工作。为此，提供能够模拟脑脊液微环境的关键因子被认为至关重要22人脑膜细胞（HMCs）可向脑脊液（CSF）中分泌多种生长因子，包括FGF-2、EGF、IGFBP2和IGFBP6，已知可支持循环肿瘤细胞（CTC）的生长12,13,14,23,24因此，对HMC条件培养基进行了人细胞因子阵列分析，以鉴定可能对CTC存活至关重要的成分。事实上，在HMC培养的培养基中，多种生长因子表达上调图 3A例如，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、VEGF-A 和胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBP2、3、4 和 6）。
患者的脑脊液细胞成分可能包含多种细胞类型，例如循环肿瘤细胞（CTC）、免疫细胞和成纤维细胞。非CTC细胞最终会随着时间推移而停止传代。通常，能够成功增殖并持续处于增殖状态的细胞为癌细胞（M-LMD细胞）。培养中生长的细胞确为M-LMD细胞的验证可通过IF检测MLANA表达以及转录组学分析完成，此前已有研究证实7。
作为概念验证，以展示已建立方法的潜在用途和应用 体外 和 体内 PD-CSF-CTC细胞系采用单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析，结果显示多个基因在未培养的患者脑脊液循环肿瘤细胞（CSF-CTCs）中富集并保留7其中两种为受体酪氨酸蛋白激酶ErbB3和IGF-1R，它们在黑色素瘤进展及化疗耐药中具有重要意义25,26,27.
为了检测IGFBP2和IGF-1R是否在CSF-CTC存活中发挥作用，对PD-CSF-CTC细胞使用美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物图卡替尼（tucatinib）和色瑞替尼（ceritinib）进行结晶紫增殖实验，这两种药物分别靶向ErbB28和IGF-1R7,29。实验中将抗IGFBP2抗体作为阳性对照，预期其会抑制PD-CSF-CTC细胞培养物的生长。结果显示，缺失IGFBP2或IGF-1R均能有效抑制PD-CSF-CTC的增殖（图3B）。鉴于MAPK信号通路位于IGF-1R的下游，研究人员还对三个M-LMD来源的PD-CSF-CTC细胞系进行了钙黄绿素-AM活细胞染色和MTT细胞存活实验，分别用色瑞替尼、MAPK抑制剂达拉非尼（dabrafenib）和曲美替尼（trametinib），或三者联合处理。实验数据显示，色瑞替尼显著降低了三个细胞系的细胞活力，而达拉非尼和曲美替尼则表现出不一致的效果（图3C）。达拉非尼和曲美替尼的处理结果令人意外。这三个PD-CSF-CTC细胞系均来源于携带BRAFV600E突变的M-LMD患者7。该结果可能提示CSF-CTC具有获得性化疗耐药效应，这有待未来进一步研究。
接下来，以PD-CSF-CTCs的应用为例说明其用途 体内，通过鞘内注射不同数量的PD-CSF-CTC建立小鼠M-LMD模型，并测定小鼠的中位生存时间（图3D）。为了可视化M-LMD进展，使用生物发光标记物（如NL报告系统）对PD-CSF-CTC细胞系进行标记21，由BLI捕获（图2C）。LMD转移灶的位置还通过黑色素-A蛋白（MLANA）的免疫组织化学染色得以证实30 作为黑色素瘤细胞的标记物（图3E）。作为概念验证，用于测试针对M-LMD的治疗策略 体内，小鼠M-LMD队列每日接受口服单药治疗，药物为色瑞替尼或曲美替尼，或联合使用达拉非尼与曲美替尼，或色瑞替尼与曲美替尼。对照（未治疗）队列口服生理盐水作为比较。结果显示显著延长的生存期（图3F）以及疾病检测的延迟（图 3G) 在接受色瑞替尼和曲美替尼治疗的队列中（未经治疗的M-LMD中位生存期：28.5天 与色瑞替尼和曲美替尼治疗的M-LMD中位生存期：38.5天； P 值 = 0.0052）。这些数据凸显了所建立的 M-LMD PD-CSF-CTC 细胞系在开展临床前研究以评估新型治疗药物疗效方面的潜在应用价值。
<img alt="患者脑脊液循环肿瘤细胞处理流程；腰椎穿刺、脑脊液采集、PDX/CDX模型构建及体外培养示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66071/66071fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1建立患者来源的脑脊液循环肿瘤细胞（PD-CSF-CTCs）的流程示意图。 可采集患者的脑脊液 通过 腰椎穿刺、Ommaya 储液囊或快速尸检。通过一系列 体外 和 体内 传代，每一步均产生一个中间的脑脊液-循环肿瘤细胞培养物（即患者脑脊液-循环肿瘤细胞， 体外 培养 体内 培养）直至建立 PD-CSF-CTC 细胞系。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66071/66071fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="脑部轴向 MRI 分析，小鼠预标记 CSF-CTCs 注射示意图，第 6 周及第 9 周的肿瘤生长情况" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66071/66071fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：示例 体外 和 体内 源自M-LMD患者的脑脊液循环肿瘤细胞（CSF-CTCs）培养 (A代表性明场图像显示 体外 M-LMD CSF-CTC 细胞集落在 HMC 条件培养基中培养 6 周和 9 周的生长情况。比例尺： 1000 µm. (B) 注射PD-CSF-CTCs后4周和8周的小鼠MRI图像；成功建立了小鼠M-LMD模型。黄色箭头指示该M-LMD小鼠脑室扩大及可能存在的脑积水。C小鼠M-LMD发育的代表性BLI可视化图像。该图改编自Law等人的研究。7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66071/66071fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质表达图谱、生存曲线、显微镜图像；肿瘤治疗分析、细胞活力检测" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66071/66071fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3PD-CSF-CTC细胞系被用于多种临床前实验以研究M-LMD。 (A人脑膜细胞（HMCs）存在下，培养基（MenCM）中多种分泌型生长因子（如IGFBPs、VEGF-A和GM-CSF）水平升高的细胞因子阵列结果。B) 通过结晶紫细胞增殖实验的扫描图像，评估抗IGFBP2抗体、图卡替尼和色瑞替尼对一条PD-CSF-CTC细胞系的抑制效果。对照组给予溶剂处理。实验重复三次。C三种已建立的PD-CSF-CTC细胞系（来自患者09、12和16）的细胞存活率检测 体外细胞经ceritinib（cer）、dabrafenib（dab）与trametinib（tra）联用、cer与tra联用，或三者联合处理。处理72小时后收集细胞。采用Calcein-AM染色法观察细胞活力，并通过MTT法检测细胞存活率。配对样本 t-test 用于统计分析。比例尺： 20 µm. (D) 小鼠M-LMD模型的生存曲线。NSG小鼠通过鞘内接种（通过 小脑延髓池）分别接种10,000、20,000和50,000个PD-CSF-CTC细胞系细胞。测定M-LMD小鼠的中位生存期。（E) M-LMD 小鼠脑组织切片中黑色素瘤标志物 MLANA 的免疫组化检测。MLANA 阳性信号位于脑膜（红色染色，黄色箭头指示），而正常（健康）脑组织未见肿瘤生长（MLANA 阴性）。比例尺： 200 µm. (F) 对给予每日口服生理盐水、cer、tra、dab/tra 或 cer/tra 的小鼠 M-LMD 队列进行的代表性疗效实验。通过测定小鼠存活率评估疗效，统计分析采用 log-rank（Mantel-Cox）检验。G5周内M-LMD进展的代表性BLI图像，比较对照组（生理盐水）处理 与经cer/tra处理的小鼠M-LMD队列。图（C图的该部分改编自 Law 等人。7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66071/66071fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
表1：临床脑脊液循环肿瘤细胞（CSF-CTCs）获取情况汇总 离体 M-LMD 患者的培养 11例M-LMD患者的汇总表，这些患者的脑脊液CTC已尝试进行扩增。表中患者此前已在Law等人的研究中进行过特征描述。7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66071/66071_Table%201.xlsx" target="_blank">请点击此处下载此表格。</a>

本文介绍了一种从黑色素瘤相关软脑膜病（M-LMD）患者脑脊液中分离循环肿瘤细胞（CSF-CTCs）并进行扩增的实验方案，旨在建立用于研究M-LMD的临床前模型。

体外 黑色素瘤患者脑脊液中循环肿瘤细胞的培养以研究黑色素瘤相关性软脑膜病

关键词：黑色素瘤，软脑膜病，循环肿瘤细胞，脑脊液，体外培养，人脑膜细胞，条件培养基，胰岛素样生长因子结合蛋白，VEGF-A，IGF信号通路，MAPK信号通路，小鼠模型，分子表征，功能分析，体内接种&#45;相关性软脑膜疾病

黑色素瘤相关性软脑膜病（M-LMD）发生时，循环肿瘤细胞（CTCs）进入脑脊液（CSF）并在软脑膜定植……

黑色素瘤所致的软脑膜疾病（M-LMD）是一种侵袭性的脑膜转移形式，循环肿瘤细胞（CTCs）会侵入脑脊液。遗憾的是，目前尚无针对 M-LMD 的有效治疗方法，因此了解其生物学特性将有助于开发疗法以降低死亡率。近期的研究报道了 CTCs 如何在营养匮乏的脑脊液环境中定植，例如利用铁摄取能力增强其存活，并通过补体 C3 促进经脉络丛侵入脑脊液。因此，CTC 是研究 M-LMD 的极佳工具。研究脑脊液 CTC 所面临的最大挑战在于缺乏临床前模型以及这些细胞的稀有性。探索从患者体内培养这些稀有且脆弱的细胞并建立异种移植模型的方法，将极大有助于研究人员深入理解 M-LMD 的病理机制，并设计出合理的治疗方案。我们已建立一种方法，成功在体外和体内扩增了来自黑色素瘤软脑膜转移（M-LMD）患者的脑脊液循环肿瘤细胞（CSF CTCs），使我们能够对M-LMD细胞进行分子和功能分析，并在异种移植模型中开展疗效研究。尽管当前的方法尚不完善，但首次实现黑色素瘤患者脑脊液CTCs的培养与扩增，使我们深入认识到理解脑脊液微环境的重要性。开始实验前，需用多聚-L-赖氨酸预包被T175培养瓶。将烧瓶置于37摄氏度的培养箱中孵育一小时。然后使用无菌刻度移液管吸除赖氨酸溶液。用移液管向烧瓶中加入30毫升含有人脑膜细胞的完全脑膜培养基。将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。当细胞融合度达到约75%至80%时，收集人脑膜细胞（HMC）培养基，并保存于50毫升锥形管中。随后按1:1比例向管中加入完全脑膜培养基。最后，用移液器将生长因子加入试管中，以制备HMC条件培养基。处理脑脊液时，首先将其置于冰上预冷的15毫升锥形管中进行冷却。然后在预冷的离心机中以257 × g在4°C下离心5分钟。用移液器小心吸出上清液，避免扰动细胞沉淀，并将上清液分装至不同的离心管中。向细胞沉淀中加入1 mL PBS以重悬细胞。在4 °C条件下，以1,500 × g离心5分钟。吸弃 PBS 上清液，保留约 50 微升于管底。在培养细胞前，对细胞悬液进行细胞计数。在人脑膜细胞培养的培养基中，多种生长因子表达上调。首先，在4°C条件下，以257 × g离心力离心冻存的脑脊液循环肿瘤细胞（CSF CTCs）解冻后的培养物5分钟。用移液器吸除上清液。加入1毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞沉淀，再次吸除上清液。接下来，将细胞重悬于3个独立的96孔板孔中的450微升HMC条件培养基中。将150微升细胞悬液分别移入96孔板的另外3个不同孔中。每隔三天用新鲜培养基补充HMC条件培养基。当细胞培养达到90%融合度时，将消化后的细胞从一个孔转移至24孔板中的空孔内。在肿瘤细胞的持续培养过程中，筛选出发生转化并呈指数扩增的细胞克隆用于后续实验。首先，鉴定患有软脑膜病（leptomeningeal disease, LMD）的雌性免疫缺陷型NSG小鼠。将麻醉后的小鼠置于手术台上。将小鼠的鼻部放入立体定位仪的改良L型鼻锥中，确保鼻孔通畅无阻。轻轻牵拉双侧耳廓腹面的皮肤向前。然后用胶带将其固定在鼻锥上。将手术剪刀尖端从耳廓向下沿着枕骨引导。在可触及的凹陷处上方正中线位置做一个5至7毫米的小切口。使用一对尖端为1至2毫米的钝头镊子，轻轻按压小脑延髓池。将镊子尖端闭合后插入，同时向下按压硬脑膜并逐渐张开。继续进行钝性分离，直至清晰可见硬脑膜及其暴露区域内的相关血管。保持镊子张开以牵拉周围肌肉组织。然后将27至29号针头连接到1毫升注射器上。将注射器插入硬脑膜下方，以观察针尖斜面。缓慢回抽注射器活塞，尽可能多地收集脑脊液。立即将液体转移至微量离心管中，并置于冰上。在4°C条件下，以257 × g离心样品5分钟。吸除上清液后，向细胞沉淀中加入500微升无菌PBS。在室温下，以257 × g再次离心沉淀5分钟。弃去上清液，然后将沉淀转移至含有HMC条件培养基的96孔板中。

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Cancer Research

癌症研究

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